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DE2522087C2 - Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Ak:Ag-Komplexen in einer biologischen Fluidprobe - Google Patents

Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Ak:Ag-Komplexen in einer biologischen Fluidprobe

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DE2522087C2
DE2522087C2 DE2522087A DE2522087A DE2522087C2 DE 2522087 C2 DE2522087 C2 DE 2522087C2 DE 2522087 A DE2522087 A DE 2522087A DE 2522087 A DE2522087 A DE 2522087A DE 2522087 C2 DE2522087 C2 DE 2522087C2
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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf eine Analyse von biologischen Fluiden, beispielsweise von Harn oder Serum, zum Nachweis oder zur Bestimmung von Antikörper : Antigen-Komplexen und in weiterer Ausgestaltung zum Nachweisen oder Bestimmen von Antikörpern und Antigenen.
  • Der Einfachheit halber werden im folgenden die Symbole "Ak", "Ag" und "Ak : Ag" für "Antikörper", "Antigen" bzw. "Antikörper : Antigen-Komplex" benutzt.
  • Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Ag, Ak und Ak : Ag-Komplexen sind zahlreiche Verfahren bekannt. Dies trifft insbesondere auch für die Bestimmung der Natur und Menge des vorhandenen Ag zu. Diese quantitativen Bestimmungsverfahren werden Immunoassays genannt. Sie sind jedoch häufig kompliziert und nicht genau genug.
  • Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines einfachen und genauen Verfahrens der eingangs genannten Art.
  • Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß eine natürlich vorkommende Substanz, nämlich der Rheumafaktor, im folgenden mit RF bezeichnet, die Eigenschaft hat, sich mit Ak : Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit einem freien Ag oder einem freien Ak. Obwohl es bereits vorgeschlagen wurde (Agnello et al, J. Exp. Med., 134, 228, 1971) diese Eigenschaft in einer besonderen Weise zur Feststellung von Ak : Ag-Komplexen auszunützen (allerdings nicht nur quantitativen Analyse oder absoluten Bestimmung), hat man bisher nicht erkannt, das RF ein potentiell außerordentlich nützliches Reagenz zur Bestimmung von Ak, Ag und Ak : Ag- Komplexen ist.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, daß Lösungen von RF in einem sehr weiten Bereich einsetzbare Reagenzien für analytische Verfahren sind, die Ak, Ag und bzw. oder Ak : Ag-Komplexe betreffen. Die Verwendung dieser Reagenzien führt zu einfachereren und genaueren Immunoassays.
  • RF ist ein bekanntes Material, und Verfahren für seine Gewinnung und Abtrennung sind bekannt. Es ist im Blut einer Anzahl von Tierarten einschließlich des Menschen vorhanden oder kann darin hervorgerufen werden. Normalerweise gewinnt man es von Ziegen oder Kaninchen durch intradermale Injektionen ihrer eigenen gereinigten Immunglobuline, die vorher durch eine zehnminütige Wärmebehandlung bei etwa 63°C angehäuft worden sind. RF wird dann aus dem von den Tieren gewonnenen Serum isoliert, indem man das Serum durch eine Säule von angehäuften Immunglobulinen leitet, an denen RF zurückgehalten wird. RF kann dann aus der Säule eluiert werden, indem man als Eluiermittel eine Lösung mit einem geeigneten pH-Wert oder einer geeigneten Salzkonzentration verwendet.
  • Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren.
  • Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
  • Die allgemeine Verfahrenstechnik, die beim Ausführen dieser Verfahren benützt wird, ist dem Fachmann geläufig, so daß eine Einzelbeschreibung nicht erforderlich ist.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Lösung von RF verwendet. Der RF bindet sich an die Ak : Ag-Komplexe, jedoch nicht an den freien Ak oder das freie Ag. Der RF ist daher dafür geeignet, die Ak : Ag-Komplexe abzutrennen bzw. zu binden, wobei RF/Ag : Ak gebildet wird.
  • Lösungen von RF vereinigen sich nicht nur mit Ak : Ag-Komplexen, sondern auch mit angehäuften Immunglobulinen. RF verursacht außerdem die Agglutination von roten Blutzellen. Ferner verursacht RF die Agglutination von Stoffen, die beispielsweise einen Überzug oder eine äußere Oberfläche aus Immunglobulinen haben, wie Polystyrolteilchen, die mit Immunglobulin überzogen sind. Solche Überzüge können durch immunologische Reaktionen zwischen Ak und Membran-Antigenen gebildet werden oder durch physikalische Adsorption oder durch chemische Reaktion. Mit Immunglobulin überzogene Polystyrolteilchen sind handelsüblich, können aber auch sehr leicht selbst hergestellt werden.
  • Wenn diese überzogenen Teilchen oder rote Blutzellen mit RF in Berührung kommen, beginnt das Auftreten der Agglutination. Wenn allerdings in der Lösung auch ein Ak : Ag-Komplex vorhanden ist, reagiert dieser mit RF verhältnismäßig schneller, so daß der RF an den in der Lösung befindlichen Ak : Ag-Komplex gebunden wird und als Folge davon keine Agglutination der überzogenen Teilchen (oder roten Blutzellen) auftritt. Das Vorhandensein von Ak : Ag-Komplexen im Serum kann man somit beispielsweise dadurch nachweisen, daß das Serum mit (löslichem) RF sowie mit Teilchen in Berührung gebracht wird, die mit Immunglobulin überzogen sind. Wenn eine Agglutination beobachtet wird, enthält das Serum keine Ak : Ag-Komplexe.
  • Dies ist ein sehr einfacher und zuverlässiger Test, der zum Nachweis von allen Ak : Ag-Komplexen angewandt werden kann. Es folgt ein Beispiel des Verfahrens:
    • 50 µl Serum werden zu 50 µl einer Lösung von löslichem RF hinzugegeben, und das Gemisch wird mit 50 µl einer Suspension von Polystyrolteilchen vereinigt, die mit Immunglobulin überzogen sind. Eine auftretende Agglutination der Teilchen kann sehr leicht festgestellt werden.

  • Der beschriebene Test kann auch zum Nachweis der Anwesenheit eines bestimmten Ag oder Ak im Serum benutzt werden. Wenn man beispielsweise eine Überprüfung auf ein bestimmtes Antigen Ag&min; vornehmen will, wird dem Serum der geeignete spezifische Antikörper Ak&min; zugesetzt, und dann wird der Test im Hinblick auf das Vorhandensein eines Ak : Ag-Komplexes, nämlich Ak&min; : Ag&min;, durchgeführt. Wenn das Serum ursprünglich andere Ak : Ag- Komplexe enthält, müssen diese zuerst entfernt werden, beispielsweise durch Verwendung von unlöslich gemachtem RF, wie es in der gleichzeitig eingerichteten Anmeldung P 25 22 086.4-52 der Anmelderin beschrieben ist.
    • Beispiel 1 Bestimmung von IgE
  • 0,1 ml einer Probe mit IgE wurde mit einer Pipette in ein 5-ml-Rohr gegeben, und es wurde 1,0 ml des Kaninchen-Antihuman-IgE-Antiserums (verdünnt 1 : 128) zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 h bei 37°C inkubiert. Es wurde 1 ml einer Lösung zugegeben, die 60 000 Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,8 µm enthielt. Die Teilchen wurden zuvor in einer physiologischen Salzlösung mit 1 mg IgG/ml inkubiert. Das Gemisch wurde geschüttelt, und es wurde 0,1 ml einer Lösung mit 600 ng Rf zugesetzt.
  • Das Gemisch wurde über Nacht inkubiert und dann in einem Teilchenzähler verarbeitet, der Teilchen, die einen Durchmesser von mehr als 1 µm haben, nicht berücksichtigt. Die Konzentration des IgE war dem Teilchenzählwert umgekehrt proportional und konnte an Hand einer zuvor aufgenommenen Eichkurve ermittelt werden, die man mit Lösungen erhalten hatte, die bekannte Konzentration von IgE enthielten.
    • Beispiel 2 Automatische Analyse auf α 1-Fetosprotein
  • Eine zu untersuchende Probe wird mit einem Durchfluß von 0,1 ml/min in ein automatisches, nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip arbeitendes Analysegerät gepumpt, und zwar zusammen mit einer denselben Durchfluß aufweisenden Suspension von 60 000 Latexteilchen/ml.
  • Die Latexteilchen hatten einen Durchmesser von 0,8 µm und waren zuvor durch Inkubation mit gegen α 1- Fetosprotein gerichteten Kaninchen-IgG-Antikörpern überzogen worden. Die vermischten Ströme wurden mit Luft segmentiert, die mit einem Durchfluß von 0,32 ml/min in das System gepumpt wurde. Nach der Zufuhr der Luft wurde eine Lösung von RF mit einem Durchfluß von 0,4 ml/min eingeführt.
  • Der luftsegmentierte Strom wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der RF durch Reduktion mit Dithiothreit (0,05 M) während 30 min bei 37°C inaktiviert. Dadurch wurden alle durch RF gebundenen Latexteilchen freigegeben. Dies trifft allerdings nicht diejenigen, die durch Ag : Ak gebunden sind.
  • Der Strom wurde dann durch einen Teilchenzähler geleitet, der Teilchen unberücksichtigt ließ, die einen Durchmesser von mehr als 1 mm hatten. Die Konzentration des α 1-Fetosproteins war umgekehrt proportional dem Teilchenzählwert und konnte an Hand von zuvor aufgenommenen Eichkurven ermittelt werden, die mit Lösungen mit bekannten Konzentrationen von α 1-Fetosprotein erstellt worden waren.

Claims (4)

1. Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Ak : Ag-Komplexen in einer biologischen Fluidprobe mittels Immunoassay, wobei der Probe eine Lösung von RF zugesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe außerdem eine bekannte Menge mit einem Immunglobulin überzogener inerter Trägerteilchen, die bei Berührung mit RF zur Agglutination veranlaßt werden, zugesetzt wird, wodurch RF an die vorhandenen Ak : Ag-Komplexe gebunden wird und die Restmenge RF Agglutination der inerten Trägerteilchen verursacht, und daß die Restmenge an RF und daraus die Menge an Ak : Ag-Komplexen bestimmt wird, indem man die agglutinierten und nicht agglutinierten inerten Trägerteilchen auszählt und das Ergebnis mit Standardergebnissen vergleicht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunglobulin IgG verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die inerten Trägerteilchen Polystyrol enthalten.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Bestimmen eines Ak oder Ag in einer Fluidprobe, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe ein gegenüber dem in der Probe befindlichen Ak spezifischer Ag oder ein gegenüber dem in der Probe befindlichen Ag spezifischer Ak zugesetzt wird, um einen Ak : Ag-Komplex zu bilden.
DE2522087A 1974-05-20 1975-05-17 Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Ak:Ag-Komplexen in einer biologischen Fluidprobe Expired DE2522087C2 (de)

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