DE68926479T2

DE68926479T2 - Testverfahren für antigene oder antikörper

Info

Publication number: DE68926479T2
Application number: DE68926479T
Authority: DE
Inventors: Michio Ito; Hideki Kohno; Minoru Ogura; Masanobu Sawai
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1988-01-29
Filing date: 1989-01-27
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2009-01-28
Also published as: JPH01193647A; EP0357786A4; JP2603843B2; NO893837D0; WO1989007270A1; DE68926479D1; EP0357786B1; NO175835B; EP0357786A1; DK476489A; ATE138203T1; DK476489D0; NO893837L; NO175835C

Description

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Mengenbestimmung eines Antigens und Antikörpers

Technisches Gebiet:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mengenbestimmung eines Antigens und/oder Antikörpers, das auf der Antigen-Antikörper- Reaktion beruht. Sie bezieht sich unter Ausnutzung der Antigen- Antikörper-Reaktion insbesondere auf ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Mengenbestimmung von Proteinen und damit verwandten Substanzen, die in klinischen Laborproben wie Serum, Plasma und Urin enthalten sind, in der Medizin.

Stand der Technik:

Derzeit werden bei der immunologischen Diagnose gewöhnlich vier Analysemethoden angewandt, d.h. der Radioimmunoassay (RIA), der Enzymimmunoassay (EIA), der turbidimetrische Immunoassay (TIA) und der Latexagglutinationsreaktions-Assay oder der Latexpartikelimmuno-Assay (LPIA).
Zu diesen gehören Methoden, bei denen eine Menge an Antigen oder Antikörper in einer Probe bestimmt werden kann, indem man einen Antikörper oder ein Antigen auf unlöslichen Trägerpartikeln wie Latexpartikeln mit dem Antigen oder dem Antikörper in der Probe reagieren läßt, d.h.:
(a) Nachdem sich die bei der Reaktion gebildeten Aggregate abgeschieden haben (gewöhnlich innerhalb von 1 bis 2 Tagen), wird zum Nachweis der Menge der nichtumgesetzten Latexpartikel die Turbidität der überstehenden Lösung gemessen, so daß die Menge an Antigen oder Antikörper in der Probe bestimmt werden kann (zZ.B. N. Dezelic et al., Croatica Chemica Acta, 42, 457 (1970);
(b) An dem Reaktionsgemisch wird ohne Abtrennung der Aggregate aus demselben nach Bestrahlung mit Licht spezifischer Wellenlänge die Intensität des Streulichts oder des Durchlichts gemessen, so daß die Menge von Antigen oder Antikörper in der Probe durch die Änderungen der gemessenen Intensität von Streulicht oder Durchlicht bestimmt werden kann (beispielsweise japanische Patentveröffentlichung No. 58-11575).
Bei Methode (a) ist jedoch zwischen der Initiierung der Reaktion und der Messung eine lange Zeitdauer erforderlich, während bei Methode (b) das Problem entsteht, daß sie für die Messung einer Substanz, bei der eine hochempfindliche Analyse erforderlich ist, nicht immer ausreichend ist.
Weiter ist eine Analysemethode für Antikörper und Antigene unter Ausnutzung der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem Antigen oder einem Antikörper auf unlöslichen Trägern vorgeschlagen worden, bei dem ein Teil der unlöslichen Trägerpartikel magnetische Substanzen sind (beispielsweise japanische offengelegte Patentanmeldung No. 61-128168). Bei diesem bekannten Verfahren muß trotzdem ein Reaktionsprodukt abgetrennt werden, indem man den Magnetismus der Trägerpartikel ausnutzt, wobei eine Menge eines präkonjugierten fluoreszierenden Farbstoffs oder Enzyms in dem Reaktionsprodukt gemessen wird, was ein mühsames Verfahren erfordert.
Indessen ist in neuerer Zeit eine Methode zur Analyse einer Komponente in einer Vielzahl von Proben entwickelt worden, das nun verbreitet angewandt wird. Diese Analysemethode ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Vielzahl von Vertiefungen einer Platte Farbreaktionen ablaufen läßt und die optische Dichte des Reaktionsgemisches in jeder Vertiefung direkt bestimmt.
Beispielsweise besitzt eine sogenannte "Mikrotiterplatte" mit einer Größe von etwa 8 cm x 12 cm 96 Vertiefungen, in denen gleichzeitig 96 Proben analysiert werden können, wobei innerhalb von 30 bis 40 Sekunden mit einem elektronischen Anzeigegerät für die Exklusivbenutzung deren optische Dichte gemessen werden kann. Wenn nach der obigen Methode (a) unter Verwendung einer solchen Vorrichtung eine Antigen-Antikörper-Reaktion durch Latexaggregation durchgeführt wird, unterbrechen die am Boden der Vertiefung abgeschiedenen Aggregate einen Lichtweg, was eine optische Messung unmöglich macht. In einem solchen Fall muß deshalb die optische Dichte von der Seite her gemessen werden (was jedoch nahezu undurchführbar ist), oder sie kann erst dann gemessen werden, wenn jedes Reaktionsgemisch in einen geeigneten Behälter überführt worden ist.
Kürzlich benutzten Giaever et al. gemäß dem US-Patent 4,115,535 ein Gemisch von verschiedenen Partikelarten mit unterschiedlichen Eigenschaften: die erste Art schafft Eigenschaften, die die Trennung von der Lösung erleichtern, während die zweite die Eigenschaften zur Erleichterung des Nachweises schafft. Beide Partikelarten agglutinieren in Gegenwart des nachzuweisenden Proteins, wobei die Bestimmung der Menge der zweiten Partikelart in den Agglutinaten die Menge des in der Probe nachzuweisenden Proteins reflektiert. Bei der Methode von Giaever et al. ist eine Stufe zur Abtrennung der ersten Partikelart von der Flüssigkeit und die Verwendung einer Vorrichtung zum Nachweis der nachweisbaren Eigenschaften der zweiten Partikelart in dem Agglutinat erforderlich.

Beschreibung der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mengenbestimmung eines in einem flüssigen Medium enthaltenen Antigens oder Antikörpers oder eines Gemisches daraus, umfassend die Umsetzung des Antigens, des Antikörpers oder des Gemisches daraus mit unlöslichen Trägerpartikeln, die beschichtet sind mit Antikörpern oder Antigenen, die für das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper spezifisch sind, bis zur Einstellung des Gleichgewichts, und ist dadurch gekennzeichnet,
daß die unlöslichen Trägerpartikel aus einem Gemisch aus magnetische Substanzen enthaltenden Partikeln und nicht-magnetischen Partikeln, die einen Farbstoff enthalten können, bestehen,
daß ein magnetisches Feld angelegt wird, um die die magnetische Substanz enthaltenden umgesetzten und nicht-umgesetzten Partikel abzutrennen,
und daß man die verbleibenden unlöslichen Trägerpartikel, die die magnetische Substanz nicht enthalten, durch eine turbidimetrische Methode nachweist und das Ergebnis mit einer Standardeichkurve vergleicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Mengenbestimmung von Antigen oder Antikörper wird nachfolgend im einzelnen erläutert.
Als die magnetische Substanz enthaltende unlösliche Trägerpartikel können organische Polymermaterialien und anorganische feine Pulver verwendet werden.
Als organisches Polymermaterial kann ein durch Emulsionspolymerisation erhaltener organischer Polymerlatex wie von Polystyrol- und Styrol-Butadien-copolymerpartikeln verwendbar sein, wobei Polystyrollatex besonders geeignet ist. Als anorganisches feines Pulver können keramische Feinpartikel, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid, feine Metallpulver oder Aktivkohlepulver verwendet werden.
Als magnetische Substanz in den unlöslichen Trägerpartikeln sind Eisen und magnetisches Eisenoxid verwendbar, wobei die verwendeten Trägerpartikel so hergestellt werden, daß sie 5 bis 100 % dieser magnetischen Substanz enthalten.
Es werden unlösliche Trägerpartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 5 µm verwendet, wobei solche mit einem Durchmesser zwischen 0,2 und 2 µm bevorzugt sind.
Das organische Polymermaterial und das anorganische feine Pulver, die oben beschrieben sind, können auch als die magnetische Substanz nicht enthaltende unlösliche Trägerpartikel verwendet werden, wobei solche bevorzugt sind, die sich, wenn sie in einem flüssigen Medium dispergiert werden, nicht spontan abscheiden, sondern in dem flüssigen Medium in suspendiertem Zustand verbleiben, bis sie der optischen Messung unterzogen werden.
Weiter können als unlösliche Trägerpartikel, die die magnetische Substanz nicht enthalten, solche verwendet werden, die rot, blau, grün, gelb oder andersfarbig sind.
Die unlöslichen Trägerpartikel, die irgendeine dieser Farben aufweisen, werden bei der Messung von zwei oder mehr Arten von Antikörpern oder Antigenen verwendet. In dem Fall beispielsweise, daß Antigen A und Antigen B gleichzeitig gemessen werden sollen, werden als unlösliche Trägerpartikel, die die magnetische Substanz enthalten, Gemische von unlöslichen Träperpartikeln, die mit einem Antikörper für das Antigen A sensibilisiert sind (Antikörper A), und solchen, die mit einem Antikörper für das Antigen B sensibilisiert sind (Antikörper B), verwendet. Als unlösliche Trägerpartikel, die die magnetische Substanz nicht enthalten, werden andererseits Gemische von gelben unlöslichen Trägerpartikeln, die mit Antikörper A sensibilisiert sind, und von blauen unlöslichen Trägerpartikeln, die mit Antikörper B sensibilisiert sind, verwendet.
In dem Fall, daß weder Antigen A noch Antigen B in dem zu messenden wäßrigen Medium vorhanden sind, verbleiben deshalb sowohl gelbe als auch blaue unlösliche Trägerpartikel in dem Medium, so daß das Reaktionsgemisch grün aussieht. Wenn Antigen A in großer Menge vorhanden und Antigen B nicht anwesend ist, bleibt das Reaktionsgemisch blau, während es im umgekehrten Fall gelb aussieht. Wenn die Antigene A und B beide in einem bestimmten Verhältnis anwesend sind, zeigt das Reaktionsgemisch eine entsprechende, aus gelb und blau kombinierte Farbe.
Die farbigen unlöslichen Trägerpartikel können hergestellt werden, indem man beliebige Farbstoffe mit verschiedenen Farben in organische Polymerpartikel oder anorganische feine Pulverpartikel einarbeitet, die Oberfläche der Partikel durch physikalische Adsorption oder chemische Kopplung mit dem obigen Farbstoff beschichtet oder ein Protein wie Albumin, auf das der Farbstoff durch physikalische Adsorption oder chemische Kopplung aufgetragen ist, an die Oberfläche der unlöslichen Partikel bindet.
Das Verfahren, nach dem Antikörper oder Antigen auf die unlöslichen Trägerpartikel aufgetragen werden, wird gewöhnlich auf die die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel und auf die die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel angewandt. Es wird durch physikalische Adsorption oder chemische Kopplung des Antikörpers oder des Antigens, die das Antigen bzw. den Antikörper in der zu bestimmenden Testprobe binden, an die unlöslichen Trägerpartikel durchgeführt.
Der auf die Partikel aufgetragene Antikörper kann γ-Globulin, IgG, IgM, F(ab')&sub2;, F(ab') und dergleichen sein. Wenn ein Antigen auf die Partikel aufgetragen wird, können Zellfragmente, Haptene, Antigenproteine, Immunkomplexe und dergleichen als Antigen verwendet werden.
Die auf die Partikel aufgetragene Menge von Antigen oder Antikörper beträgt gewöhnlich 0,01 bis 10 mg/ml, vorzugsweise 0,05 bis 1 mg/ml.
Die mit Antigen oder Antikörper beschichteten unlöslichen Trägerpartikel werden in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.-% in einem wäßrigen Lösungsmittel wie 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) oder 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dispergiert und suspendiert.
Die die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel können mit den die magnetische Substanz nicht enthaltenden unöslichen Trägerpartikeln in einem Verhältnis zwischen 1:20 und 20:1, vorzugsweise zwischen 1:4 und 4:1, gemischt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend ausführlicher erläutert:
(1) Verfahren, nach dem die die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel und die, welche die magnetische Substanz nicht enthalten, zuvor gemischt werden:
Zunächst werden die die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel in dem obigen Kombinationsverhältnis mit denen gemischt, die die magnetische Substanz nicht enthalten.
Das erhaltene Suspensionsgemisch wird dann für die Umsetzung mit Antigen oder Antikörper, die in einer Probe wie Plasma, Serum oder Urin (nachstehend als Prüfsubstanz bezeichnet) enthalten sind, inkubiert. Die Prüfsubstanz kann mit einer Pufferlösung wie 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) oder 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) verdünnt werden. Die Inkubation wird bei Raumtemperatur durchgeführt, bis ein Gleichgewichtszustand erreicht ist. Die Inkubation kann stattdessen auch in einem Thermostaten bei 25 bis 50ºC durchgeführt werden, um die Rate der obigen Reaktion zu erhöhen. Zum Erreichen eines Gleichgewichtszustands der Reaktion durch Inkubation bei Raumtemperatur werden gewöhnlich etwa 30 Minuten benötigt.
(2) Verfahren, nach dem die die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel oder die die magnetische Substanz nicht enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel mit einer Prüfsubstanz umgesetzt werden, gefolgt von dem Zusatz der die magnetische Substanz nicht enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel oder der die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel zu dem Reaktionsgemisch:
Zunächst werden die sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel, die die magnetische Substanz enthalten (oder die, welche die magnetische Substanz nicht enthalten) mit einer Prüfsubstanz umgesetzt, die unverdünnt oder mit einer Pufferlösung verdünnt ist. Diese Inkubation wird gewöhnlich etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Diese Bedingungen können in Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Antigen oder Antikörper variieren. Die Inkubationsdauer wird so ausgewählt, daß der Gleichgewichtszustand der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem Antikörper oder dem Antigen, die auf die die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel (oder auf die die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel) aufgetragen sind, und dem in der Prüfsubstanz vorhandenen Antigen oder Antikörper noch nicht erreicht ist. Anschließend werden die die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel (oder die die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel) bei dem obengenannten Kombinationsverhältnis zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt, welches dann für die Antigen-Antikörper-Reaktion bei Raumtemperatur weiter inkubiert wird, bis ein Gleichgewichtszustand erreicht ist. Die Inkubation kann stattdessen in einem Thermostaten bei 25 bis 50ºC durchgeführt werden, um die Reaktion zu beschleunigen.
Die Umsetzung wird sowohl nach Methode (1) als auch nach Methode (2) gewöhnlich in einer spektrophotometrischen Küvette oder in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Wenn die Umsetzung einen Gleichgewichtszustand erreicht hat, werden die Aggregate von die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikeln und die magnetische Substanz nicht enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikeln ebenso wie die nicht-umgesetzten, die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel entweder durch Anlegen eines Magnetfeldes außerhalb des Behälters oder durch Einbringen oder Einsetzen von winzigen Magnetkugeln oder -stäben in das Reaktionsgemisch an einem solchen Ort gesammelt, daß ein Meßlichtweg durch einen Reaktionsbehälter nicht unterbrochen wird. Ein für diesen Zweck verwendeter Magnet kann ein Permanentmagnet, ein Elektromagnet oder dergleichen sein. Die die magnetische Substanz nicht enthaltenden sensibilisierten unlöslichen Trägerpartikel verbleiben schließlich in dem Reaktionsmedium suspendiert. Die Menge der in dem Reaktionsmedium verbleibenden Trägerpartikel hängt von der Menge des in der auf Antigen untersuchten Prüfsubstanz vorhandenen Antigens oder von der Menge des in der auf Antikörper untersuchten Prüfsubstanz vorhandenen Antikörpers ab. Diese in dem Reaktionsmedium verbliebene Menge der Trägerpartikel kann durch Messung der Streulichtintensität oder des Absorptionsvermögens von Licht bei einer Wellenlänge zwischen 0,3 und 1,0 µm von außerhalb des Behälters her ermittelt werden. Bei der Erfindung kann die Konzentration von Antigen oder Antikörper in einer gegebenen Prüfsubstanz aus dem Absorptionsvermögen oder der Streulichtintensität quantitativ ermittelt werden, bezogen auf eine Eichkurve, die zuvor auf der Basis der für das Absorptionsvermögen oder die Streulichtintensität von Prüfsubstanzen, die bekannte und verschiedene Konzentrationen an dem zu messendem Antigen oder Antikörper enthalten, ermittelten Werte erstellt wurde.
Alternativ ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch möglich, die Menge an Antigen oder Antikörper durch visuellen Nachweis der Menge der die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel, die im Reaktionsmedium verbleiben, qualitativ nachzuweisen.
In Fig. 1 sind Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit V-förmigem Boden dargestellt, in denen in jeder Reihe der Platte an Reaktionsgemische mit seriell zweifachen Verdünnungen von Antigenprüfsubstanzen nach der Inkubation vom Boden der Platte her ein Magnetfeld angelegt wird. Die die magnetische Substanz enthaltenden Trägerpartikel und die aggregierten Trägerpartikel haben sich rasch auf dem V-förmigen Boden der Vertiefungen abgeschieden. Folglich ist die erhaltene überstehende Lösung in den Vertiefungen bei den Prüfsubstanzen mit hohen Antigen-Konzentrationen vollkommen klar, während mit abnehmender Antigen- Konzentration die überstehende Lösung fortschreitend an Turbidität zunimmt, so daß die Präzipitate auf dem V-förmigen Boden der Vertiefung (die Präzipitate erscheinen tatsächlich bräunlich bis gelblich) zunehmend dunkler werden. Es macht dann entsprechend dem Grad der Sichtbarkeit der Präzipitate in der Vertiefung keine Schwierigkeiten mehr, hinsichtlich der Antigen- Menge zwischen plus und minus zu entscheiden. Je nach den Umständen kann es auch möglich sein, unter Verwendung von mit einem Standard hergestellten Vergleichsproben Antigen oder Antikörper bis zu einem bestimmten Niveau quantitativ zu bestimmen.
Indessen ist allgemein angenommen worden, daß es schwierig ist, monoklonale Antikörper dem Latexagglutinationsassay zu unterziehen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jedoch Antigen, das mit einem monoklonalen Antikörper ebenso wie mit einem polyklonalen Antikörper reagieren kann, qualitativ oder quantitativ auf die oben beschriebene Weise nachgewiesen werden, indem man die magnetische Substanz nicht enthaltende unlösliche Trägerpartikel, die mit monoklonalem Antikörper sensibilisiert sind, und die magnetische Substanz enthaltende unlösliche Trägerpartikel, die mit dem polyklonalen Antikörper sensibilisiert sind, verwendet.
Somit unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren von den bekannten Verfahren, bei denen eine magnetische Substanz enthaltende Partikel eingesetzt werden, in folgenden Punkten:
1. Da das erfindungsgemäße Verfahren nicht die Verwendung von in irgendeiner Weise markierten unlöslichen Trägerpartikeln umfaßt, sind Verfahrensschritte wie die Entfernung der überstehenden Lösung nach dem magnetischen Abscheiden der magnetischen Substanzpartikel und Aggregate, die die magnetisierten Partikel enthalten, in dem Reaktionsbehälter und das Waschen überflüssig. Dies heißt, daß das Verfahren einfach ist, wobei das gesamte Verfahren von der Umsetzung bis zur Messung in ein und demselben Reaktionsbehälter durchgeführt werden kann. Dies bedeutet einen großen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Automatisierung des Analyseverfahrens.
2. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden keinerlei fluoreszierende Farbstoffe oder Radioisotope verwendet, so daß keine spezielle Vorrichtung oder Installation erforderlich ist. Die Messung kann mit einem gewöhnlichen Spektrophotometer oder einem Mikroplatten-Anzeigegerät durchgeführt werden.
3. Bei der Erfindung werden die die magnetische Substanz nicht enthaltenden Trägerpartikel, die in dem Reaktionsmedium verblieben sind, nachgewiesen, während die aggregierten Partikel nicht nachgewiesen werden. Dies bedeutet, daß das Absorptionsvermögen oder die Streulichtintensität, die gemessen werden, bei Abwesenheit von Antigen oder Antikörper in der Prüfsubstanz maximal sind, während das Absorptionsverrnögen oder die Streulichtintensität der die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel mit zunehmender Menge an Antigen oder Antikörper in der Prüfsubstanz fortschreitend abnehmen.
Deshalb kann die Konzentration der die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel zuvor eingestellt werden, um die Messung des Absorptionsvermögens oder der Streulichtintensität bei der maximalen Empfindlichkeit durchzuführen. Dadurch wird es möglich, Antigen oder Antikörper mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, insbesondere bei niedriger Konzentration in der Nähe des Null-Werts.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht zeitraubend, da die aggregierten Partikel sofort entfernt werden können, wodurch sich eine weitgehende Verringerung der für die Messung erforderlichen Zeit ergibt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung:

Fig. 1 zeigt eine Mikrotiterplatte mit Vertiefungen mit V-förmigem Boden, wobei jede Reihe die die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel und die daraus bestehenden Aggregate enthält, welche nach Inkubation mit seriell zweifachen Verdünnungen von Choriongonadotropin (HCG) als Probe am Boden der Vertiefungen magnetisch abgeschieden wurden. In Fig. 1 enthalten die Vertiefungen der Reihe H Gemische, die 9000 mIE/ml HCG enthalten, während die der nachfolgenden Reihen Reaktionsgemische enthalten, die seriell zweifache Verdünnungen von HCG, absteigend bis Null in Reihe A, enthalten.

Beste Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens:

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele näher erläutert. Die Beispiele dienen jedoch nur der Erläuterung und bedeuten keinerlei Einschränkung des Erfindungsbereiches.

Beispiel 1: Nachweis von AFP

(Herstellung der Reagentien)

Herstellung des die magnetische Substanz enthaltenden Anti- AFP-sensibilisierten Latex

Zu 10 ml einer 1 %igen Suspension von Latexpartikeln, die aus einer 10 %igem (Gew./Vol.) Lösung von 0,7-µm-Magnetlatex (Estapor SML266, Rhone-Poulenc) abgeschieden worden sind, in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurde 1 mg eines Anti-AFP-spezifischen Antikörpers, erhalten durch Immunisierung von Lebewesen mit α-Fetoprotein (AFP), zugesetzt und das erhaltene Gemisch zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt. Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert und die überstehende Lösung verworfen. Der so abgetrennte Latex wurde in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der mit 0,3 % Rinderserumalbumin ergänzt worden war, redispergiert. Diese Latexsuspension wurde 1 Stunde gerührt, dann noch einmal 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen zentrifugiert und die erhaltene überstehende Lösung entfernt. Das Latexpräzipitat wurde in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) redispergiert.

Herstellung des die magnetische Substanz nicht enthaltenden Anti-AFP-sensibilisierten Latex

Zu 1 ml einer 1 %igen Suspension von Latex, der aus einer 10 %igeit (Gew./Vol.) Lösung von 0,497-µm-Polystyrollatex (Dow Chemical) abgeschieden worden war, in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0 ) wurde 1 mg des Anti-AFP-spezifischen Antikörpers zugesetzt und das erhaltene Gemisch zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt. Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert und die erhaltene überstehende Lösung verworfen. Der so abgetrennte Latex wurde in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,3 % Rinderserumalbumin enthielt, redispergiert. Diese Latexsuspension wurde 1 Stunde gerührt und dann erneut 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Lösung wurde entfernt und das Latexpräzipitat in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) redispergiert.

(Verfahren)

Eine 1 %ige Suspension des die magnetische Substanz enthaltenden Anti-AFP-sensibilisierten Latex wurde im Verhältnis von 1:1 mit einer 1 %igen Suspension des die magnetische Substanz nicht enthaltenden Anti-AFP-sensibilisierten Latex gemischt und die Mischung mit 0,1 m Phosphatpuffer um das achtfache verdünnt. Diese verdünnte Mischung war als Latexpräparationsreagens vorgesehen.
Unter Verwendung von AFP-freiem Humanserum als Prüfsubstanz wurden seriell zweifache Verdünnungen eines AFP-Standard (250 ng/ml, DIA IATRON) hergestellt.
In jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen mit flachem Boden aufweisenden Mikrotiterplatte (Flexible Assay-Platte, Falcon) wurden 50 µl der Prüfsubstanz, 50 µl Pufferlösung (0,1 m Tris-HCl, pH 8,0) und 50 µl des Latexpräparationsreagens gegeben, gründlich vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde an die Seite der Vertiefungen der Mikrotiterplatte von außen her ein Permanentmagnet angelegt, wodurch sich die Aggregate des die magnetische Substanz enthaltenden Latex und des nicht-umgesetzten, die magnetische Substanz enthaltenden Latex an der entsprechenden Innenseite der Vertiefungen ansammelten. Dieser Präzipitationsprozeß dauerte gewöhnlich etwa 5 Minuten. Dann wurde die Konzentration der die magnetische Substanz nicht enthaltenden unlöslichen Trägerpartikel, die in dem flüssigen Medium in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte verblieben waren, durch Messung der optischen Dichte der Flüssigkeit in den vertiefungen bei einer Wellenlänge von 620 nm mit einem Mikroplatten-Anzeigegerät (NJ2000, Intermed Japan mcl.) spektrophotometrisch ermittelt.
Die Eichwerte für die optische Dichte und die AFP-Konzentrationen sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 - AFP-Eichwerte

Beispiel 2: Nachweis von thermolabilem E. coli-Enterotoxin

(Herstellung der Reagentien)

Herstellung des die magnetische Substanz enthaltenden Anti- Enterotoxin-sensibilisierten Latex

Da Vibrio cholerae-Enterotoxin in der Antigenität mit thermolabilem Escherichia coli-Enterotoxin immunologisch gleich ist, wurden 0,1 mg/ml thermolabiler Anti-E.-coli-Enterotoxin-Antikörper, der durch Immunisieren von Lebewesen mit V. cholerae- Enterotoxin erhalten worden war, zu 1 ml einer 1 %igen Suspension eines Latex, der aus einem 10 % magnetische Substanz enthaltenden Latex (Estapor SML266, Rhone-Poulenc) abgetrennt worden war, in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt und dann 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Lösung wurde verworfen. Das Latexpräzipitat wurde in einem 0,1 % Rinderserumalbumin enthaltenden 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) redispergiert, etwa 1 Stunde gerührt und 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Lösung wurde entfernt und das Präzipitat erneut in 0,1 m Phosphatpuffer redispergiert.

Anti-Enterotoxin-sensibilisierter, die magnetische Substanz nicht enthaltender Latex

Als die magnetische Substanz nicht enthaltender Latex wurde ein sensibilisierter Latex in einer handelsüblichen Analyse-Ausrüstung (Ausrüstung für den Nachweis von V.-cholerae-Enterotoxin und thermolabilern E.-coli-Enterotoxin, Denka Seiken Co., Ltd.) verwendet.

(Verfahren)

Eine 1 %ige Suspension des die magnetische Substanz enthaltenden sensibilisierten Latex wurde mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) im Verhältnis von 1:8 verdünnt und im Verhältnis von 1:2 mit dem die magnetische Substanz nicht enthaltenden sensibilisierten Latex gemischt. Das Gemisch war als Latexpräparationssuspension vorgesehen.
Seriell zweifache Verdünnungen einer 40-ng/ml-Lösung von Enterotoxin in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurden unter Verwendung von 0,1 m Tris-HCl-Puffer pH 8,0) als Verdünnungsmittel hergestellt und dienten als Analyse-Prüfsubstanz.
In jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen mit flachem Boden aufweisenden Mikrotiterplatte (Flexible Assay-Platte, Falcon) wurden 50 µl der Prüfsubstanz und 100 µl der Latexpräparationssuspension eingegeben, gründlich vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde an die Seite der Vertiefungen der Mikrotiterplatte von der Außenseite her ein Permanentmagnet angelegt, um die Aggregate des die magnetische Substanz enthaltenden Latex und des nicht-umgesetzten, die magnetische Substanz enthaltenden Latex an der entsprechenden Innenseite der Vertiefungen anzusammeln. Dieser Präzipitationsprozeß dauerte etwa 5 Minuten. Dann wurde die optische Dichte der Flüssigkeit in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte bei einer Wellenlänge von 620 nrn mit einem Mikrotiter-Anzeigegerät (NJ2000, Intermed Japan Inc.) ermittelt. Die Eichwerte der optischen Dichte und die Enterotoxin-Konzentrationen sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 - Eichwerte der Enterotoxin-Analyse

Beispiel 3: Gleichzeitiger Nachweis von AFP und CEA

(Herstellung der Reagentien)

3-1. Herstellung des die magnetische Substanz enthaltenden Anti-AFP-sensibilisierten Latex

Zu 1 ml einer 1 %igen Suspension des Latex, der aus einer 10 %igen (Gew./Vol.) Lösung von Magnetlatex mit 0,7 µm mittlerem Teilchendurchmesser (Estapor SML266, Rhone-Poulenc) abgetrennt worden war, in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurde 1 mg eines Anti-AFP-spezifischen Antikörpers, erhalten durch Immunisieren von Lebewesen mit α-Fetoprotein (AFP), zugesetzt und das erhaltene Gemisch zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt. Dann wurde 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert, die überstehende Lösung entfernt und das Latexpräzipitat in 0,3 % Rinderserumalbumin enthaltendem 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) redispergiert. Nachdem 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert worden war, wurde die überstehende Lösung verworfen und das Präzipitat erneut in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) redispergiert.

3-2. Herstellung des die magnetische Substanz enthaltenden Anti-CEA-sensibilisierten Latex

Zu 1 ml einer 1 %igen Suspension eines Latex, der aus einer 10 %igen (Gew./Vol.) Lösung von Magnetlatex mit 0,7 µm mittlerem Teilchendurchmesser (Estapor SML266, Rhone-Poulenc) abgeschieden worden war, in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurden 0,5 mg eines Anti-CEA-spezifischen Antikörpers, erhalten durch Immunisieren von Lebewesen mit karcinoembryonalem Human- Antigen (CEA), zugesetzt und das erhaltene Gemisch zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt. Dann wurde 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert, die überstehende Lösung entfernt und das Latexpräzipitat in 0,1 % Rinderserumalbumin enthaltendem 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) redispergiert. Nachdem nochmals 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert worden war, wurde die überstehende Lösung verworfen und das Latexpräzipitat erneut in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) redispergiert.

3-3. Herstellung des die magnetische Substanz nicht enthaltenden Anti-AFP-sensibilisierten Latex

Zu 1 ml einer 1 %igen Suspension des Latex, der aus einer 10 %igen (Gew./Vol.) Lösung von blauem Polystyrollatex mit einem Teilchendurchmesser von 0,45 bis 0,55 µm (Estapor K050 Blue, Rhone-Poulenc) abgetrennt worden war, wurde 1 mg eines Anti-AFP-spezifischen Antikörpers zugesetzt und das erhaltene Gemisch zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt. Dann wurde 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert, die überstehende Lösung entfernt und das Latexpräzipitat in 0,3 % Rinderserumalbumin enthaltendern 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) redispergiert und 1 Stunde gerührt. Nachdem erneut 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert worden war, wurde die überstehende Lösung verworfen und das Latexpräzipitat erneut in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) redispergiert.

3-4. Herstellung des die magnetische Substanz nicht enthaltenden Anti-CEA-sensibilisierten Latex

Zu 1 ml einer 1 %igen Suspension eines Latex, der aus einer 10 %igen (Gew./Vol.) Lösung von gelbem Polystyrollatex mit einem Teilchendurchmesser von 0,45 bis 0,55 µm (Estapor K050 Gelb, Rhone-Poulenc) abgeschieden worden war, in 0,1 m Tris- HCl-Puffer wurden 0,5 mg eines Anti-CEA-spezifischen Antikörpers zugesetzt und das erhaltene Gemisch zum Sensibilisieren des Latex mit dem Antikörper etwa 1 Stunde gerührt. Dann wurde 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert, die überstehende Lösung entfernt und das Latexpräzipitat in 0,1 % Rinderserumalbumin enthaltendem 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) redispergiert und 1 Stunde gerührt. Nachdem erneut 10 Minuten bei 16 000 Umdrehungen/min zentrifugiert worden war, wurde die überstehende Lösung verworfen und das Latexpräzipitat erneut in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) redispergiert.
Jede der oben unter 3-1, 3-2, 3-3 und 3-4 beschriebenen vier Latexsuspensionen wurde zweifach mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt, und gleiche Volumina dieser vier Verdünnungen wurden kombiniert und gründlich vermischt, wodurch eine Suspension für den gleichzeitigen Nachweis von AFP und CEA erhalten wurde.

(Verfahren)

Unter Verwendung von AFP- und CEA-freiem Humanserum wurden seriell zweifache Verdünnungen von AFP-Standard (250 ng/ml, DIA IATRON) hergestellt. Desgleichen wurden seriell zweifache Verdünnungen von CEA-Standard (160 ng/ml, MITSUBISHI KASEI Corp.) unter Verwendung von AFP- und CEA-freiem Humanserum hergestellt. Eine 125 ng/ml AFP und 80 ng/ml CEA enthaltende Lösung wurde durch Kombinieren des AFP-Standards (250 ng/ml) und des CEA-Standards (160 ng/ml) in einem Verhältnis von 1:1 hergestellt. Diese Lösung wurde mit 0,1 m Tris-HCl-Puffer seriell zweifach verdünnt, wodurch Prüfsubstanz-Muster mit bekannten Konzentrationen sowohl von AFP als auch von CEA erhalten wurden. Diese drei Reihen von seriellen Zweifachverdünnungen wurden als Prüfsubstanzen der Analyse unterzogen.
In die Vertiefungen einer 96 Vertiefungen mit flachem Boden aufweisenden Mikrotiterplatte (Flexible Assay-Platte, Falcon) wurden 50 µl der Prüfsubstanz, 50 µl 0,2 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 50 µl der hergestellten Suspension für den gleichzeitigen Nachweis von AFP und CEA zugesetzt, gründlich vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde an der Seite der Vertiefungen der Mikrotiterplatte von außen her ein Permanentmagnet angelegt, um die Aggregate des die magnetische Substanz enthaltenden Latex und des nicht-umgesetzten, die magnetische Substanz enthaltenden Latex an den entsprechenden Innenseiten der Vertiefungen anzusammeln. Dieser Abscheidungsprozeß dauerte etwa 10 Minuten. Die Mikrotiterplatte wurde zum Nachweis von AFP und CEA durch visuelle Beurteilung der Farbe der Flüssigkeit in den Vertiefungen abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Die Prüfsubstanz ist positiv für AFP, wenn die Farbe des Reaktionsgemisches in der Vertiefung der Mikrotiterplatte gelb ist, positiv für CEA, wenn die Farbe blau ist, negativ für sowohl AFP als auch CEA, wenn die Farbe grün ist, oder positiv für sowohl AFP als auch CEA, wenn das Reaktionsgemisch farblos ist.

Technische Anwendbarkeit:

Das durch die Erfindung bereitgestellte Verfahren zum Bestimmen von Antigen und/oder Antikörper zeichnet sich dadurch aus, daß extrem kleine Mengen von Antikörper oder Antigen rasch qualitativ oder quantitativ analysiert werden können, da die Aggregate von umgesetzten Trägerpartikeln nicht nur in jeder gewünschten Richtung abgeschieden werden können, sondern auch kaum redispergiert an der Behälterwandoberfläche verbleiben, so daß das erfindungsgemäße Verfahren einfach und mühelos ist. Es wird deshalb zur Messung von Spurenmengen von Substanzen auf verschiedenen Gebieten der Wissenschaft wie Medizin, Biochemie, Hygiene und Epidemologie angewandt.

Claims

1. Verfahren zur Mengenbestimmung eines in einem flüssigen Medium enthaltenen Antigens oder Antikörpers oder eines Gemisches daraus, umfassend die Umsetzung des Antigens, des Antikörpers oder des Gemisches daraus mit unlöslichen Trägerpartikeln, die beschichtet sind mit Antikörpern oder Antigenen, die für das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper spezifisch sind, bis zur Einstellung des Gleichgewichts, dadurch gekennzeichnet,

daß die unlöslichen Trägerpartikel aus einem Gemisch aus magnetische Substanzen enthaltenden Partikeln und nichtmagnetischen Partikeln, die einen Farbstoff enthalten können, bestehen,

daß ein magnetisches Feld angelegt wird, um die die magnetische Substanz enthaltenden umgesetzten und nicht umgesetzten Partikel abzutrennen,

und daß man die verbleibenden unlöslichen Trägerpartikel, die die magnetische Substanz nicht enthalten, durch eine turbidimetrische Methode nachweist und das Ergebnis mit einer Standardeichkurve vergleicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendeten unlöslichen Trägerpartikel Eisen und/oder magnetisches Eisenoxid als magnetische Substanz enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das für die unlöslichen Trägerpartikel verwendete Material unter organischen Polymeren oder anorganischen feinen Pulvern ausgewählt werden kann.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Polystyrollatex oder ein Styrol-Butadien-Copolymer für die unlöslichen Trägerpartikel verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei keramische Feinpartikel, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid, Aktivkohle oder feine Metallpulver für die unlöslichen Trägerpartikel verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die unlöslichen Trägerpartikel, die die magnetische Substanz enthalten, und diejenigen, die die magnetische Substanz nicht enthalten, in einem Verhältnis von 1:20 bis 20:1 kombiniert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge an Antigen oder Antikörper in einer Probe durch visuellen Nachweis der Menge an verbleibenden unlöslichen Trägerpartikeln, die die magnetische Substanz nicht enthalten, bestimmt wird.