JP2670498B2 - 免疫複合体の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な免疫複合体（Immune Complex,以下
「IC」と略称する。）の免疫学的測定法に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

全身性紅斑性狼瘡（SLE）、慢性関節リウマチ（RA）
などの膠原病においては、その流血中にICが高率に検出
され、臨床的意義などについて詳しく検討されている
が、近年では悪性腫瘍や血液疾患などの膠原病以外の他
の多くの疾患においてもICが高率に認められ、その臨床
的意義、病態に占める役割などについて解析されつつあ
る。

生体内に侵入あるいは出現した抗原は、抗体と結合し
てICを形成するが、一般には網内系細胞によって速やか
に除去されてしまう。しかし、ICが大量に発生したり、
網内系細胞によって処理されない性状になると、ICは組
織に沈着し、その障害を引き起こす。

従ってICの血中濃度測定値は、これらの疾患の診断の
てがかりを与える情報であり、またその濃度の推移は病
態の変化を把握するうえで、また治療の指標として価値
の高い情報となる。

近年、血中に微量に存在するこのICを定量的に測定す
る方法が数多く開発され、その数はゆうに30種類を越え
ている。各種の測定法をその測定原理により大別すると ICが補体を活性化する性質を利用した方法（Clq固相
法など）。

ICの物理化学的な性質を利用し、ICを測定する方法
（ポリエチレングリコール法など）。

細胞のレセプター（補体レセプターやFcレセプター）
にICが結合する性質を利用した方法（Raji細胞法な
ど）。

などである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ICの測定方法として、このように多数の方法がある
が、各測定法による測定値には必ずしも良好な相関が得
られているわけではない。この理由としては、感度や再
現性といった技術的な問題以外にも、各測定法に特有な
被検血清による干渉作用が存在することや、検出するIC
の多様性に問題があると言われている。

しかしながら、この中でもClqを利用した方法は、自
己免疫疾患においてみられる組織障害の多くが補体結合
性ICにより惹起されることを考える時、臨床的には有用
な方法であると考えられる。原理的には古典経路（clas
sical pathway）を介して補体を活性化するICに最初に
結合する補体成分がClqであることを応用した方法で、C
lq solid−phase assay（CSP法）、Clq deviation test
（CDT法）、Clq binding assay（CBA法）などが代表的
な方法である。これらの中で特異性、操作の簡便性など
からCSP−EIA（CSP−enzyme immuno assay）法が、現在
広く用いられている。

この方法は、まず固相（プレートまたはチューブ）に
Clqを固定化する。その後、EDTA処理によりIC結合の内
因性の補体をはずした試料（血清）を加え、ICを補捉さ
せる。続いて洗浄後、酵素標識抗ヒトIgG抗体と反応さ
せ、IC中のヒトIgG成分に結合させる。更に洗浄後、こ
の結合した酵素標識IgG抗体の酵素量を、基質との反応
による発色反応により比色定量することでICを測るもの
である。この方法は、他方に比べて比較的優れた方法で
はあるが、以下に述べるような問題点を有している。

Clqを固定化する際、そのClq溶液中に夾雑物としてIg
Gが混入していた場合、そのIgGも固定化される。そして
最終的にインジケーターとして用いる酵素標識IgG抗体
は、IC中のIgG成分に結合するとともに、固定化されたI
gGにも結合する。その結果、固定化されたIgGの分だけ
発色反応は底上げされ、そのことによりこの測定系のダ
イナミックレンジは狭くなり、ひいてはICの検出幅が狭
くなる。またこの事は、この測定系の感度低下をまね
く。

ちなみに、タンパク質化学的検定法（SDS−ポリアク
リルアミド電気泳動法、ディスク電気泳動法、免疫電気
泳動法など）により、単一な標品として検定されても、
CSP法においては、タンパク質化学的検定法では検出さ
れないレベルの夾雑物IgGの影響が無視できないことが
多い。尚、現在一般に用いられているClq精製法では上
記程度のIgGが混入してくる可能性が高い。

〔問題点を解決する手段〕

本発明者は、かかる事情を鑑みてCSP−EIA法の利点を
そのまま生かし、なおかつ同法の欠点を解消すべく鋭意
考察の結果、ICにはClq結合部位が複数（最低２ヶ所）
以上存在するというICの特徴に着眼し、Clq及び酵素標
識Clq（インジケーター）でサンドウィッチするとい
う、酵素標識IgG抗体を用いない全く新規なClqサンドウ
ィッチ（CSP−EIA）法を考案するに至った。これにより
現在のCSP−EIA法の酵素標識IgG抗体使用による問題点
が、この酵素標識Clq使用に切替えることにより解消可
能と推定された。そこで鋭意研究の結果、本測定法が可
能である事を確認し本発明に至った。

即ち、本発明は、まず固相（プレートまたはチュー
ブ）にClqを固定化する。そしてEDTA処理により、IC結
合の内因性の補体をはずした試料（血清）を加え、ICを
補捉させる。続いて洗浄後、物質標識Clqと反応させ、I
C中のヒトIgG成分に結合させる。更に洗浄後、この結合
した物質標識Clqの物質を定量することでICを測るもの
である。

次に本発明を調製例および実施例によってさらに説明
するが、本発明はその要旨を越えない限り、これによっ
て限定されるものではない。

調製例１ Clqの精製 本発明の固相化Clqおよび物質標識ClqのClqの原料と
してはヒトなどの動物血清が用いられる。この製造法に
はいくつかの方法が知られているが、その中でも米増等
の方法（K.Yonemasu and R.M.Stroud:Journal of Immun
ology,106,304−,1971）が最も収量よく、しかも短時間
に精製できる。本法では更にこの精製法を改良しClqを
得た。

調製例２ ペルオキシダーゼ標識Clqの作製 I.J.Simpson等の方法（Journal of Immunological Me
thods,67,167−172,1984）により、Clqにペルオキシダ
ーゼを標識した。尚、架橋法は本法の過ヨーソ酸法にこ
だわらず、グルタルアルデヒド法あるいはマレイミド法
にてもよい。

実施例１ インジケーターとしてペルオキシダーゼ標識
Clqを用いたCSP（EIA）法 96穴マイクロプレート（ポリスチレン製）に調製例１
により精製したClqを、PBSで10μg/mlの濃度に調製した
ものを200μづつ加え、４℃で一晩放置し、コーティ
ングした。

次にClq液を吸引廃棄した後、各ウェルをPBSで３回洗
浄した。その後２％BSA含有PBSを250μ分注し、室温
で２時間放置することによりブロッキングした。

更に液を廃棄し、PBSで３回洗浄したのち、模擬的なI
CであるAHG（Aggregated human IgG）の希釈系列を150
μづつ各ウェルに分注し、室温で３時間放置した。

反応液を吸引廃棄し、PBSで３回洗浄したのち、ペル
オキシダーゼ標識Clqを150μづつ各ウェルに分注し、
４℃で一晩放置した。

反応液を吸引廃棄し、PBSで３回洗浄後、2,2′−アジ
ノージ−〔３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸
（６）〕;ABTS（ベーリンガー マンハイム社製）およ
び過酸化水素を含む基質溶液を加え、室温で90分間反応
させ、EIA−READERにてOD₄₁₅の吸光度を自動測定した
（図１）。

この結果、この測定系はAHGに対して良好な反応性を
示した。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本法は全く新規なIC測定
法であり、この測定によるICの測定が可能であることを
示した。

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は、本発明を説明するための図である。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト体液中の免疫複合体を免疫学的測定法
   により測定する方法において、固相化した補体Clqに体
   液を反応させることにより体液中の免疫複合体を捕捉さ
   せ、続いて捕捉された免疫複合体に物質標識Clqを結合
   させ、その結合した物質標識Clqの標識物質量を測定し
   て免疫複合体を検出、定量することを特徴とする免疫複
   合体測定法。
2. 【請求項２】Clqがヒト、ウサギ、ウシ、ウマ、ラッ
   ト、マウス、モルモット、カエル、ヤギ等種々の動物由
   来のものである固相化Clq及び物質標識Clqをもちいるこ
   とを特徴とする特許請求範囲第一項記載の方法。
3. 【請求項３】物質が酵素、放射性物質、補酵素、酵素の
   基質、細胞機能調節物質、色素、電子授受物質または金
   属を含む化合物ないしは組成物である物質標識Clqをも
   ちいることを特徴とする特許請求範囲第一項記載の方
   法。