DE2754645C2

DE2754645C2 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE2754645C2
Application number: DE19772754645
Authority: DE
Inventors: C.L. Kraainem Cambiaso; F. Brüssel De Steewinkel; A. Diegem Leek; P. Brüssel Masson
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-12-10
Filing date: 1977-12-08
Publication date: 1986-11-20
Also published as: DE2754645A1; JPS6217188B2; CA1089360A; FR2392387B1; GB1590525A; FR2392387A1; JPS53104726A

Description

Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem

so Oberbegriff des Patentanspruches 1. Im folgenden werden mit "Ag" Antigene einschließlich Haptenen und andere Substanzen, die durch Antikörper oder ähnliche bindende Proteine gebunden werden können, mit "Ab" Antikörper einschließlich ähnlicher bindender Proteine und mit "Ab : Ag" Komplexe aus Antikörper und Antigen bezeichnet

Bekanntlich reagiert ein Antigen mit einem geeigneten Antikörper zu einem Komplex Ab: Ag, und von dieser Umsetzung machen die meisten Immunoassay-

Methoden Gebrauch,

Aus der Literaturstelle "Deutsche Apothckcr-Zcitung" 114, S. 1743 (1974) ist ein Agglutinations-Hemmtest bekannt, bei dem die Agglutinations-Reaktion eines Antigens mit seinem Antikörper durch die Anwesenheit eines nachzuweisenden Antigens in der Probe gehemmt wird. Bei diesem Test läßt man HCG-beladenc Latcxpartikel mit dem HCG-Antiserum reagieren. Bei Anwesenheit von HCG im Urin unterbleibt eine Auiiluiin:i-

Ferner ist es bekannt, teilchenförmige Materialien, wie Polystyrol (im allgemeinen als Latex bezeichnet) mit einem Antikörper oder Antigen zu überziehen und die beschichteten Teilchen einer zu untersuchenden Probelösung auszusetzen, um festzustellen, ob und ggf. in weiehern Ausmaß die Teilchen agglutiniert werden. Die Agglutination weist auf die Anwesenheit eines Antikörpers bzw. Antigens in der Probe hin, der bzw. das in der Lage ist mit zwei oder mehreren beschichteten Latexteilchen unter Agglutination zu reagieren.

Wenngleich die Methode der Beobachtung der Agglutination von beschichteten Teilchen in vielerlei Hinsicht zufriedenstellend ist treten doch Schwierigkeiten auf, wenn man kleine Antigene, d.h. Antigene, deren Molekulargewicht unter etwa 4000 liegt, bestimmen will. Derartige Antigene sind im Verhältnis zu den verwendeten teilchenförmigen Materialien so klein, daß häufig eine sichtbare Agglutination nicht oder in nicht nennenswertera *Jmfang erfolgt Das Verfahren ist daher für die Bestimmung kleiner Antigene nicht völlig zuverlässig.

Es wurde nun ein verbessertes Verfahren zum Nachweis und gewünschtenfalls zur Bestimmung von Antikörpern und Antigenen in einer Flüssigkeit gefunden, das sich insbesondere zur Bestimmung kleiner Antigene oder Antikörper eignet und außerdem auch zur Bestimmung größerer Antigene oder Antikörper verwendet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahrer

Erfindungsgemäß werden also zv«"i verschiedene teilchenförmige Trägermaterialien (im folgenden als teilchenfönmige Reagenzien bezeichnet gleichzeitig verwendet während bei den bisherigen Verfahren lediglich ein ieilchenförmiges Reagenz verwendet wird Diese beiden Reagenzien werden derart ausgewählt daß sie beim Vermischen agglutinieren, jedoch vordem Vermisehen nicht agglutiniert bleiben. Beispielsweise kann ein teilchenförmiges Reagenz ein Antigen oder Antigenkonjugat und das andere einen Antikörper enthalten, der sich an das Antigen oder Antigenkonjugat bindet. Nach dem Vermischen der beiden Reagenzien bindet sich der Antikörper an das Antigen oder Antigenkonjugat unter Agglutination der Teilchen. Mindestens eines der teilchenförmigen Reagenzien wird jedoch derart gewählt, daß es sich auch an den Antikörper oder das Antigen bindet, der bzw. das in der Flüssigkeit bestimmt werden soll. Die Bindung des teilchenförmigen Reagenzes an den freien Antikörper oder das freie Antigen, die bestimmt werden sollen, blockiert die Bindungsstellen an dem teilchenförmigen Reagenz, so daß es nicht mehr in der Lage ist sich an das andere teilchenförmige Reagenz unter Agglutination zu binden. Das Ausmaß der Aggluination in dem Gemisch wird auf diese Weise im Vergleich zu dem Betrag, der erhalten würde, wenn das Antigen oder der Antikörper nicht in der Flüssigkeit enthalten wäre, um einen Betrag verringert, der von der Menge des Antigens oder Antikörpers abhängt, das bzw. der in der Flüssigkeit bestimmt werden soll. Durch Beobachten dieser Erscheinung kann das Vorhandensein des einzelnen Antikörpers oder Antigens bestätigt werden, und durch Messen des Ausmaßes der Agglutination oder Nichtagglutination kann die Menge des einzclnen Antikörpers oder Antigens bestimmt werden. Dies wird gewöhnlich am zweckmäßigsten dadurch bewerkstelligt, daß man eine Standardkurve aufgrund von Krgcbnissen aufstellt, die bei Anwendung bekannter Konzentrationen von bestimmten Antikörpern oder Antigenen erhalten worden sind, und anschließend die Kurve zur Bestimmung der vorher unbekannten Menge an Antikörper oder Antigen in einer zu untersuchenden Probe verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vermutlich für jedes Antigen angewandt werden, und es erfordert keinen spezifischen Antikörper auf dem teilchenförmigen Material, da die Spezifität durch das mit Antigen überzogene teilchenförmige Material eingeführt werden kann. Wenn beispielsweise die Antikörperbeschichtung auf einem teilchenförmigen Reagenz unspezifisch ist, so daß sie mit drei verschiedenen Antigenen reagieren könnte und es erwünscht ist, in einer Flüssigkeitspiobe lediglich eines dieser Antigene, nämlich Ag' zu bestimmen, dann kann die Bestimmung von Ag⁷ dadurch bewirkt werden, daß man ein mit Ag' überzogenes teilchenförmiges Material zusammen mit dem mit dem Antikörper beschichteten Material verwendet. Dieses Vorgehen kann auch in analoger Weise für den Nachweis und die Bestimmung von Antikörper in einer Probe angewandt werden.

Die teilchenförmigen Reagenzien, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind von mikroskopischer oder submikroskopischer Größe, d. h. sie sind im allgemeinen kleiner als 15 μ und üblicherweise von der- Größenordnung einiger Micron oder unter einem Micron. Latexteilchen solcher Größen sind im Handel erhältlich. Es ist bekannt daß sich Antikörper oder Antigene an mikroskopische teilchenförmige Materialien, wie Latex, binden. Dies wird normalerweise dadurch bewirkt daß man das Teilchen mit einem reaktionsfähigen Oberzug versieht und an diesen den Antikörper oder das Antigen chemisch bindet oder adsorbiert In bestimmten Fällen ist es auch möglich, den Antikörper oder das Antigen unmittelbar an das Teilchen ohne dazwischenliegenden Überzug zu binden. Die Herstellung der teilchenförmigen Reagenzien ist bekannt und bildet keinen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Beispiele für die Antigene und Antikörper, die an teilchenförmige Materialien, wie beispielsweise Latex, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gebunden werden können, sind: als Antikörper Immunglobulin G (IgG) aus menschlichem, Kaninchen-, Ziegen- und Schafserum sowie ihre Fragmente F (ab)2^#; Immunglobulin (M (IgM) von Kaninchen und als Antigene menschliches immunglobulin M (IgM), menschliches placentares Laciogen, menschliches «-Fetoprotein, menschliches Lactoferrin, menschliches Serumalbumin, menschliches Transferrin, menschliches C-reaktives Prolin und das Fc-Fragment von menschlichem IgG; Rinder-IgG und Rinderserumalbumin, Pferdeferritin, IgG vom Menschen, der Maus, der Ratte und dem Meerschweinchen sowie die gereinigten Unterklassen 1, 2,3 und 4 von menschlichem IgG. Ferner wurden gebunden: Thyroxinkonjugate von menschlichem Serumalbumin, IgG und Transferrin, Rinderalbumin und -fibrinogen und Pferdeferritin; ferner Digoxinkonjugate von menschlichem und Rinderalbumin und Rinder-IgG, Thyroxin kann unmittelbar an Polystyrollatexteilchen gebunden werden, die an ihrer Oberfläche reaktionsfähige Carboxylgruppen tragen.

Vorzugsweise ist die Teilchengröße jedes teilchenförmigen Reagenzes praktisch gleichmäßig und. wie weiter unten genauer beschrieben, die Teilchengröße des ersten Reagenzes vorzugsweise mindestens das Zweifaehe derjenigen des zweiten Reagenzes.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines bestimmten Antigens oder Antikörpers ist es lediglich notwendig, festzustellen, ob eine Inhibierung der Agglutination erfolgt ist Wenn in der Probe verhältnismäßig große Mengen an nachzuweisendem Antigen oder Antikörper vorhanden sind, ist es möglich, die Inhibierung der Agglutination mit dem bloßen Auge durch ein Mikroskop festzustellen, wobei das Gemisch auf einem Objektträger ausgebreitet ist Eine besonders bevorzugte Methode gemäß der Erfindung zum Nachweis von Progesteron in Kuhmilch besteht darin, daß man ein Gemisch aus der Milch, einem mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz mit einem Gehalt an Progesteron oder einem Progesteronkonjugat und einem mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz mit einem Gehalt an einem Antikörper, der sich sowohl an das Progesteron als auch an das Progesteronkonjugat bindet herstellt Die Untersuchung des Gemisches mit dem bloßen Auge läßt normalerweise feststellen, ob eine inhibierung der Agglutination vorliegt Es ist natürlich bei den Verfahren zum Nacnweis der Agglutinationsinhibierung auch möglich sich eines der Verfahren zu bedienen, die im folgenden in Verbindung mit den quantitativen Bestimmungen beschrieben werden.

Bei den quantitativen Bestimmungen gemäß der Erfindung ist es erforderlich, das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination der teilchenförmigen Reagenzien zu bestimmen. Das kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. Beispielsweise können die agglutinierten Teilchen von den nicht agglutinierten abgetrennt und die Anzahl der letzteren bestimmt werden. Die Abtrennung kann beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren oder durch Säulenchromatografie erfolgen. Die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen kann danach beispielsweise durch Abzählen oder durch Anwendung einer identifizierenden Markierung, wie beispielsweise mit Hilfe eines radioaktiven Atoms an dem teilchenförmigen Reagenz oder den teilchenförmigen Reagenzien oestimmt werden.

Im allgemeinen wird jedoch eine Abtrennungsstufe vermieden, da sie zeitraubend ist und leicht zur Einführung von Irrtümern Gelegenheit gibt Es wird daher bevorzugt, die Messungen an dem Reaktionsgemisch durchzuführen, um das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination festzustellen. Dies kann zweckmäßig dadurch bewerkstelligt werden, daß man sich bekannter selektiver Zähltechniken bedient Auf diese Weise ist es beispielsweise möglinh, die Zahl an Teilchen in einem gegebenen Größenbereich zu zählen, wobei Teilchen, die eine Größe außerhalb dieses Bereiches aufweisen, nicht mitgezählt werden

Eine bekannte Vorrichtung zur Durchführung dieser Art von Zählung ist der Technicon Autocounter". In seiner Grundform besteht diese Vorrichtung aus einem optischen System, bei dem Licht durch eine Fließzelle geleitet wird, durch die die verdünnte Probe rechtwinklig zu dem Lichtstrahl hindurchgepurr.pt wird. Am anderen Ende des optischen Systems befindet sich eine Fotozelle, und unmittelbar hinter der Fließzelle ist eine Linse mit einem zentralen schwarzen Fleck angeordnet, um zu verhindern, daß das Licht, das direkt durch die Fließzelle hindurchtritt, die Fotozelle erreicht. Wenn sich ein Teilchen in dem Lichtstrahl befindet, wird ein Anteil des einfallenden Lichtes derart gestreut, daß es an dem schwarzen Fleck vorbeitritt und die Fotozelle erreicht. Diese registriert einen elektronischen Impuls und durch Addition dieser Impulse kann eine Zählung der Teilchen in der Probe durchgeführt werdf-.n.

Wichtig ist bei einer selektiven Zähltechnik, daß die beiden teilchenförmigen Reagenzien eine unterschiedliche Größe besitzen, so daß sie vom Zähler voneinander unterschieden werden können. Zu diesem Zweck und bei Verwendung von Teilchen der Größenordnung von Micron oder unter einem Micron genügt normalerweise eine Größendifferenz um den Faktor 2. Im folgenden wird eine Erläuterung in Form eines Betriebsbeispiels ίο für das erfindungsgemäße Verfahren Verwendung der seiektiven Zählung gegeben. Die das zu bestimmende Antigen enthaltende Probe wird mit dem ersten und dem zweiten teilchenförmigen Reagenz versetzt deren Teilchengrößen 1 bzw. 0,1 μ betragen. Die Menge an zugesetztem ersten Reagenz ist bekannt und beträgt mehr als die zur Bindung sämtlichen Antigens in der Probe notwendige Menge. Ein Teil des ersten Reagenzes bindet sich an das Antigen und wird dadurch daran gehindert, sich an das zweite teilchenformige Reagc-nz zu binden. Diejenigen Teilcher. -les ersten Reagenzes jedoch, die nicht an das Antigen in dir Probe gebunden sind, binden sich an das zweite teilchenformige Reagenz unter Agglutination. Das Gemisch enthält danach (1) Teilchen aus dem ersten Reagenz, die im nicht aggluti nieren Zustand an das Antigen aus der Probe gebunden sind, (2) überschüssiges zweites Reagenz (ebenfalls nicht agglutiniert) und (3) agglutinierte Teilchen. Da eine Größendifferenz zwischen den nicht agglutinierten Teilchen des ersten und des zweiten Reagenzes besteht kann die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen des ersten Reagenzes bestimmt werden, und aus der Zählung (und Standardergebnissen) kann die Menge an Antigen in der Probe errechnet werden. Es ist auch möglich, die Gesamtzahl der Teilchen oder gewünschtenfalls die agglutinierten Teilchen in dem Gemisch zu zählen, wenngleich die Reproduzierbarkeit der beim Zählen von Agglutinaten erzielten Ergebnisse nicht immer sehr zufriedenstellend ist Das Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders vorteilhaft zur Bestimmung von kleinen Antikörpern und Antigenen. In diesem Zusammenhang sind Bestimmungen von Steroiden und Pharmaka von größter Bedeutung. Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Bei spielen näher erläutert

Beispiel 1

Bestimmung von Digoxin a) Herstellung eines mit Antikörper beschichteten I atcx

Latexteilchen von 0,09 μ Durchmesser aus Polystyrol der Dow Chemical Co_n die in Form einer lOgew-°/oigcn Suspension, wie geliefert vorlagen, wurden auf das Zwanzigfache mit verdünnter, mit Glycin gepufferter Kochsalzlösung (dGBS-20 m-molar in bezug auf Glycin, 34 m-molar in hezug auf NaCl, pH 9) mit einem Gehalt von 0,2 mg/ml an der in Rivanol löslichen Fraktion (her gestellt nach dem Verfahren von Stastny und Horejsi, Clin, Chim, Acta (1961), 6, 782) vom Antidigoxinserum von Schafen, und 30 min bei Raumtemperatur bebrütet Danach wurde 1/10 Volumenteil von 10 mg Rinderserumalbumin (bSA) je ml verdünnter Glycinpufferlösung zugesetzt, um sicherzustellen, daß der Latex vollständig mit Protein überzogen war, und nach weiteren 30 min Bebrütungszeit wurde der beschichtete Latex zweimal durch Zentrifugieren gewaschen und erneut in verdünn-

tcr Glycinpufferlösung suspendiert. Schließlich wurde der beschichtete Latex erneut zu einer O,5^o/oigen Suspension in Glycinpufferlösung (0,1 Mol Glycin, 0,17 Mol Kochsalz, pH 9) mit einem Gehalt von 1 mg Rinderserumalbumin/ml suspendiert.

b) Hersteilung von mit Antigen beschichtetem Latex

Das gleiche Verfahren, wie unter a) beschrieben, wurde mit der Abweichung durchgeführt, daß der verwendete Latex einen Durchmesser von 1,1 μ besaß und die Bebrütung bei einer Antigenkonjugat-Konzentration von 4 μg/ml durchgeführt wurde, wonach 1/10 Volumenteil von 10 mg/ml Transferrin zugegeben wurde.

Das Antigenkonjugat wurde hergestellt, indem man Digoxin und Ethylenglycol oxidativ kuppelte und anschließend diesen Komplex reduktiv an das Protein kuppeite. 5ö m Digoxin, in 2 mi absolutem Aikohoi gelöst, wurden 25 min mit 2 ml 0,1 molarer Natriumper- chloratlösung bebrütet, wonach 60 μΙ Ethylenglycol zugesetzt wurden und das Ganze weitere 5 min bebrütet wurde. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann einer Lösung von 60 mg menschlichem Transferrin in 2 ml Wasser, die durch Zusatz von 5%iger Sodalösung auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht worden war, zugesetzt und das Ganze 45 min bebrütet Danach wurden 30 mg Natriumborhydrid, die frisch in 2 ml Wasser gelöst worden waren, zugegeben und das Ganze weitere 3 h bebrütet Am Ende dieser Periode wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zusatz von 1 molarer Ameisensäure auf 6,5 erniedrigt um nicht umgesetztes Natriumborhydrid zu zerstören, und nach einer weiteren Stunde Bebrütungsdauer wurde 1 molare Ammoniumhydroxidlösung zugesetzt um den pH-Wert auf 8,5 zu erhöhen, wonach das Ganze zwei Tage lang bei 4° C gegen fließendes Wasser dialysicri würde. (Sämtliche anderen Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt).

c) Bestimmung

Die für die Bestimmung von Digoxin verwendeten Seren wurden zunächst mit Säure erhitzt um die Störung durch das Serum zu vermindern. 25 μΐ Serum wurden mit 25 μΐ 0,1 η Salzsäure 10 min auf 56° C erhitzt und anschließend durch Zugabe von 10 μΐ 2 molarer Sodalösung alkalisch gemacht Diese erhitzten Seren wurden mit 25 μΙ Ab-Latex (verdünnt 1 :10 mit Glycinpufferlösung mit einem Gehalt von 1 mg Rinderserumalbumin/ ml) sowie mit 23 μΙ Konjugatlatex (verdünnt 1:4 mit Glycinpufferlösung mit einem Gehalt von 1 mg menschlichem Transferrin/ml) versetzt Sie wurden anschließend in senkrecht gestellten Röhren, die horizontal auf einem Schüttelbebrüter geschüttelt wurden, 15 min bei Raumtemperatur bebrütet Am Ende dieser Periode wurde der Inhalt der Gläser mit 5 ml Glycinpufferlösung verdünnt und nach weiterer 2Ofacher Verdünnung mit Glycinpufferlösung, die 0,01% SorbimacrogoUaurat (Tween 20) enthielt durch die Fließzelle eines Technicon Autocounter mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/ min geleitet Die relative Anzahl an nicht agglutinierten (monomeren) Latexteilchen in jeder Probe wurde durch selektive optische Zählung bestimmt, wie es auch mit der relativen Anzahl an agglutinierten Teilchen geschehen kann. In der folgenden Tabelle I sind die erhaltenen Werte angegeben.

45

Tabelle I

Inhibierung der Agglutination durch Digoxin im Serum

Digoxinkonzentration	Nichtagglutinierte
im Serum	Teilchen
(ng/ml)	(in % des Höchsswertes)
0	35
031	40
0,625	44
1.25	63
2,5	90
5,0	100

40 Dieses Verfahren wurde ebenfalls mit Erfolg für die Bestimmung von Dinitrophenol (DNP) unter Verwendung von Äntigenkonjugaten des Haptcns mit Kinderserumalbumin angewandt.

Beim selektiven optischen Auszählen der Teilchen hängt die Menge an von einem Teilchen gestreutem Licht von der Teilchengröße ab; der in der Fotozelle erzeugte elektronische Impuls ist wiederum proportional der Teilchengröße, und Teilchen verschiedener Größe können getrennt voneinander gezählt werden. Aus der folgenden Tabelle II geht die Verbesserung der Genauigkeit der bestimmung (durch Schaffung eines größeren Bereichs für die Standardkurve) hervor, die dadurch erzielt werden kann, daß man anstatt sämtliche Teilchen nur die nichtagglutinierten (monomeren) Teilchen zählt. Aus der Tabelle geht weiter hervor, daß eine große Erhöhung der Empfindlichkeit erzielt werden kann, indem man das Verhältnis von nicht agglutinierten zu agglutinierten Teilchen (Verhältnis Monomer/Polymer) ermittelt Durch Zählen der Teilchen ganz allgemein kann eine Erhöhung der Empfindlichkeit und der Genauigkeit erzielt werden, verglichen mit anderen Methoden der Endpunktbestimmung.

Tabelle II

Vergleich der Zählmethoden für den Lateximmunoassay von menschlichem Placentarlactogen (hPL)

ng hPL/ml

Gesamt	Monomere	Monomer/
teilchen		Polymer-
zahl		Verhältnis
100	100	100
100	100	81
100	98	+ 68
97	94	55
90	82	30
78	62	13
67	46	8
57	36	6
50	30	5
40	22	5

50 5 10 20

40

60

80

100

160

60 Jeder Wert ist als Prozentsatz von dem Wert ausgedrückt der in Abwesenheit von hPL erhalten wurde. In der folgenden Tabelle III ist ein Vergleich der Ergebnisse wiedergegeben, die durch Teilchenzählung (nur Monomere) einerseits und Trübungsmessung (optische Dichte bei 400 nm) andererseits für eine Reihe von Proben erhalten wurden, die eine Standardkurve für Digoxin repräsentieren.

Tabelle HI

Vergleich von Zählung gegenüber Trübungsmessung für Lateximmunoassay von Digoxin

Digoxinkonzentration	Teilchenzählung	Trübung
im Serum	(Monomere)
(ng'rc»)
0	35	68
0,31	40	74
0,625	44	71
1,25	63	82
2,5	90	100
5,0	100	100

10

Jeder Wert ist in Prozenten des Wertes ausgedrückt, der in Anwesenheit von 5 ng Digoxin/al (maximale Inhibicrüng) gefunder, wurde.

Beispiel 2

20

diethylbarbituratlösung vom pH 9,2 vermischt. 50 μΙ dieses verdünnten Serums wurden danach mit 25 μΙ 0,01%iger Aufschlämmung von Ab-Latex in glycingepufferter Salzlösung mit einem Gehalt von 1% Rinderserumalbumin sowie 25 μΐ 0,1 %iger Suspension von Ag-Latex in demselben Puffer in der gleichen Weise bebrütet, wie in Beispiel 1 für die Bestimmung von Digoxin beschrieben. In der folgenden Tabelle IV sind bei Anwendung dieses Systems erhaltene typische Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle IV

ng T4/1T1I Serum

15 Teilchenkonzentration (% des Höchstwertes)

48 51,5 59,5 89

Bestimmung von Thyroxin a) Herstellung von mit Thyroxin gekuppeltem Latex

Latexteilchen von 0,857 μ Durchmesser aus mit Carboxylat modifiziertem Polystyrol der Dow Chemical Co. wurden ir Form einer 10gew.-%igen Suspension, wie geliefert, auf das Zwanzigfache mit phosphatgepufferter Sa^lösung (PBS: 50 mM in bezug auf Natriumphosphat, 0,17 molar in bezug auf Kochsalz, pH 6) verdünnt, 10 min bei 4° C und 12 000g zentrifugiert und in frischer phosphatgepufferter Salzlösung zu einer Suspension mit einer Konzentration von 2 Gew.-% erneut suspendiert. Eine Lösung aus 25 μg Thyroxin und 50 μg 1 - EthyU-iS-dimethylatninopropylJ-carbodiimid-Hydrochlorid in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung wurde bei 0°C hergestellt und mit 250 μΙ der gewaschenen Latexsuspensionen versetzt. Nach einstündiger Bebrütung bei 0°C wurden 250 μΐ einer 25%igen Lösung von Ethanolamin in phosphatgepufferter Salzlösung hinzugesetzt und die Bebrütung 30 min weitergeführt Danach wurde der Latex zweimal durch Zentrifugieren und erneutes Suspendieren in frischer phosphatgepufferter Salzlösung (jedesmal 1 ml) gewaschen und danach 16 h bei 4° C gegen 1 I phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert. Schließlich wurde er zentrifugiert und erneut in 1 ml glycingepufferter Salzlösung mit einem Gehalt von 1% Rinderalbumin (bSA) suspendiert

b) Bestimmung von Thyroxin durch gemischte Agglutination

(I) Herstellung von mit Antikörper überzogenem Latex

Das Verfahren der Latexherstellung war genau dasselbe wie das in Beispiel 1 für die Bestimmung von Digoxin beschriebene mit der Abweichung, daß der Antikörper von Antithyroxinserum (T₄) von Kaninchen stammte.

(II) Herstellung des mit Antigen beschichteten Latex

Siehe unter (a)

(III) Bestimmung Die auf T₄ zu untersuchenden Seren wurden zunächst

mit dem gleichen Volumen einer 1 mM Lösung von l-Anilinonaphthalin-8-sulfonsäure in 75 mM Natrium- Der Höchstwert war in diesem Falle der Wert für den Ag-Latex allein; sämtliche oben aufgeführten Werte wurden in Gegenwart von Ag-Latex ebenso gefunden.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß Latexteilchen der gleichen Größe und nicht von verschiedener Größe verwendet wurden. Dabei wurden die in der folgenden Tabelle V zusammengefaßten Ergebnisse erhalten.

Tabelle V	Agglutination durch Digoxin	mit unter
Inhibierung der		schiedlicher
in Serum		Teilchengröße
Digoxin-	Nichtagglutinierte Teilchen	21
konzentration	(in % des Höchstwertes)	30
im Serum	Latex gleicher	76
(ng/ml)	Teilchengröße	100

0	60
1	78
4	95
10	100

Claims

1 Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung eines bestimmten Antigens oder Antikörpers in einer Flüssigkeit durch einen Agglutinations-Hemmtest, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Gemisch aus den folgenden Komponenten bildet:

(I) einer Probe der Flüssigkeit, die das bestimmte Antigen oder den bestimmten Antikörper enthält,

(II) einem ersten Reagenz, das an ein erstes teilchenförmiges Trägermaterial gebunden ist, und

(III) einem zweiten Reagenz, das an ein zweites teilchenförmiges Trägermaterial von der Größe des ersten Trägermaterials verschiedener Größe gebunden ist,

wobei das erste Reagenz in der Lage ist, sich unter Agglutination des ersten und zweiten teilchenförmigen Materials spezifisch an das zweite Reagenz zu binden, und mindestens das erste Reagenz ebenfalls in der Lage ist, sich unter Inhibierung der Agglutination des ersten und des zweiten teilchenförmigen Materials an das bestimmte Antigen oder den bestimmten Antikörper zu binden,

(b) daß man das Gemisch bebrütet, um die !competitive Bindung des ersten Reagenzes an das bestimmte Antigen bzw. den bestimmten Antikörper sowie an das zweite Reagenz zu ermöglichen, und

(c) daß man das Ausmaß der Agglutination des ersten und zweiten teilchenförmigen Materials mißt und gegebenenfalls daraus die Menge an bestimmtem Antigen bzw. Antikörper in der Probe ermittelt

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes Reagenz einen Antikörper bzw. ein Antigen wählt, der bzw. das sich an das bestimmte Antigen oder an ein Konjugat davon bzw. an den bestimmten Antikörper binden kann, und daß man als zweites Reagenz praktisch dasselbe Antigen oder Antigen-Konjugat bzw. denselben Antikörper wie das zu bestimmende bzw. den zu bestimmenden wählt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für jedes teilchenförmiges Trägermaterial eine Teilchengröße wählt, die praktisch gleichförmig ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als eines oder als beide der teilchenförmigen Materialien ein solches bzw. solche wählt, die einen Latex enthalten.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen oder einen Antikörper bestimmt, das bzw. der ein Molekulargewicht von unter 4000 aufweist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Teilchengröße für das erste und zweite Trägermaterial eine um den Faktor 2 unterschiedliche Teilchengröße wählt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man nicht agglutiniertes erstes teilchenförmiges Trägermaterial in dem Gemisch selektiv zählt und in Stufe (a) eine bekannte Menge an erstem teilchenförmigen Trägermaterial in dem Gemisch vorhanden ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination durch Auszählen der agglutinierten oder nichtagglutinierten Teil- chen bestimmt

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet daß man das Auszählen der Teilchen durchführt, während sie als Gemisch vorliegen.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man nichtagglutinierte Teilchen se lektiv durch optische Methoden zählt

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) die agglutinierten Teilchen von den nicht agglutinierten abtrennt

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder als erstes oder als zweites teilchenförmiges Trägermat^iVil ein solches wählt, das eine identifizierende Markierung trägt und man das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination durch Bestimmung der Markierung in den abgetrennten Teilchen mißt

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c\ das Gemisch auf einem Mikroskop-Objektträger ausbreitet und das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination durch Beobachtung mit dem bloßen Auge oder durch ein Mikroskop bestimmt

14. Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von Progesteron in Kuhmilch, dadurch gekenn zeichnet, daß man in Stufe (a) ein Gemisch aus der Milch, einem mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz mit einem Gehalt an Progesteron oder an einem Progesteronkonjugat sowie einem mikroskopischen oder sub- mikroskopischen teilchenförmigen Reagenz bildet, das einen Antikörper enthält, asr sich sowohl an das Progesteron als auch an das Progesteron konjugat bindet

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen ein Steroid oder ein

Arzneimittel bestimmt

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip automatisch durch- führt