DE2816830A1

DE2816830A1 - Antikoerper-doppelbeschichtetes testroehrchen und seine verwendung im radioimmunassay

Info

Publication number: DE2816830A1
Application number: DE19782816830
Authority: DE
Inventors: Jan-I Tu
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1977-04-18
Filing date: 1978-04-18
Publication date: 1978-10-19
Also published as: IT1105009B; IT7848906A0; GB1597556A; FR2388276B1; FR2388276A1; JPS53130425A; US4166844A; CA1088422A

Description

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u.Z.: M 660
Case: Τ-788

E. R. SQUIBB & SONS, INC»
Princeton, N.J., V.St.A.
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¹¹ Antikörper-doppeltbeschichtetes Teströhrchen und seine Verwendung im Radioimmunassay" '

Biologisch aktive Substanzen werden in weitem Umfang.im Radiο-immunas3%';'mit Hilfe von Radioimmunbestecken (Kurzbezeichnung Kit) bestimmt, beispielsweise Adrenoeortieotropin (ACTH), Aldosteron, Angiotensinl, Angiotensin II, Barbiturate, o-AMP, c-Gi^vIP, Digoxin, Polsäure, Follicel stimulierendes Hormon (FSH), Gastrin, Hepatitis-assoziiertes Antigen (HB₀Ag), humanes Wachstumshormon (HGH), Insulin, Thyreotropin (TSH), Thyroxin (TO, Trijodthyronin (T3) und Vitamin B₁₂.

R.S. Yalow, und S.A. Berson haben in dem Buch"In Vitro Procedures with Radioisotopes In Medicine",, International Atomic Energy Agency, Wien, 197°» S. 455, das Prinzip des Radioimmunassays folgendermaßen definiert: Ein unmarkiertes Antigen in einer unbekannten Probe konkurriert mit einem radioaktiv markierten Antigen (Tracer) bei der Bindung an einen Antikörper und vermindert dadurch die Bindung des markierten Antigens» Das Ausmaße der kömpetitiven Hemmung, das bei der unbekannten Probe beobachtet wird, wird verglichen mit dem Ergebnis einer

^⁵ bekannten Standardlösung und danach die Antigenkonzentration der unbekannten. Substanz bestimmt.

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Der vorstehend beschriebene Typ des Radioimmunassays ist als indirekte Methode bekannt. Alternativ kann die direkte Methode des Radioimmunassajs verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Antigens in einer unbekannten Substanz zu bestimmen. Bei der direkten Methode wird radioaktiv markierter Antikörper mit der unbekannten Probe vermischt. Sofern diese Probe das fragliche Antigen enthält, bindet es den radioaktiv markierten Antikörper,

Bei sämtlichen Methoden des Radioimmunassays ist es erforderlich, den Antigen-Antikörper-Komplex vom freien radioaktiv markierten Antikörper bzw. Tracer abzutrennen. Die wichtigsten Trennmethoden sind die Elektrophorese, die Chromatographie, die Gelfiltration, die Adsorption an mit Dextran beschichteter Aktivkohle, Talkum oder Cellulose, sowie Methoden der Bindung des Antikörpers an eine feste Phase,

Zwei der allgemein anerkannten Methoden zur Trennung von Antikörper-gebundenem und freiem Aneigen durch Bindung des Antikörpers an eine feste Phase sind die chemische Bindung eines Antikörpers an ein unlösliches Polymer oder die physikalische Adsorption eines Antikörpers an ein unlösliches Polymer; vgl. z. B. Gurvich u.' Mitarb., Nature, Bd. 203 (1964), S. 648; Wide u. Mitarb., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 130 (1966), S.

257; Catt u. Mitarb., Biochem. J., Bd. 100 (1966), S. 31c; Catt u. Mitarb., J. Lab. Clin. Med., Bd. 70 (I967), S. 820; Catt u. Mitarb., Nature, Bd. 213 (1967), S. 285; Axen u. Mitarb., Nature, Bd. 214 (1967), S. 1302; Catt u. Mitarb., Science, Bd. 158 (1967), S. 1570; Wide u. Mitarb., Lancet, Bd. 2 (I967),

S. 1105; Salmon u. Mitarb., J. Immunol., Bd. 103 (1969), S. 129;. US-PS 3 ShG 346 und US-PS 3 645 852.

Der Hauptvorteil der Trennung von freiem Antikörper und an das Antigen gebundenem Antikörper durch Bindung des Antikörpers an eine feste Phase im Radioimmunassay ist darin zu erblicken, daß sie die Isolierung von gebundenem und freiem radioaktiv markiertem

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Tracer auf relativ einfache Weise nach Beendigung der Immunreaktion erlaubt» In der Praxis erfordert diese Stufe jedoch mehrere Manipulationen. .

In der US-PS 3 646 346 ist ein mit Antikörpern beschichtetes Teströhrchen beschrieben, mit dem die Trennung von Antikörpergebundenem und freiem Antigen durch Bindung des Antikörpers an eine feste Phase durchgeführt werden kann. Die Teströhrchen werden so hergestellt, daß man sie mit Antikörpern des zu untersuchenden. Antigens adsorptiv beschichtet. Zu diesem Zweck wird-eine gepufferte Lösung der Antikörper bei Raumtemperatur mehrere Stunden in den Röhrchen inkubiert. Nach den klassischen Prinzipien, wie sie von Yalow und Berson, a.a.O., beschrieben worden sind, wird eine Lösung von radioaktiv markiertem Antigen und eine Lösung von nicht markiertem Antigen in den mit Antikörpern adsorptiv beschichteten Teströhrchen in.kubiert. Die radioaktiv markierten und die nicht markierten Antigene konkurrierer, um eine begrenzte und konstante Zahl von Bindungsplätzen des Antikörpers. Hierbei entsteht ein zweiphasiges System, nämlich eine feste Phase, die das Antigen gebunden enthält, sowie eine flüssige.Phase, die freies Antigen enthält. Die mit Antikörper adsorptiv beschichteten Teströhrchen haben mehrere Vorteile, jedoch auch einige schwerwiegende Nachteile. Aufgrund der ungünstigen sterischen Konfiguration des auf der Innenfläche des Teströhrchens beschichteten Antikörpers ist die Empfindlichkeit des Tests nicht so gut wie in einigen anderen Systemen. Ferner ist es bei der Herstellung der mit Antikörper beschichteten Teströhrchen sctoiierig, eine

gleichmäßige Beschichtung der Teströhrchen zu erreichen. 30

Eine andere Methode zur Trennung von Antikörper-gebundenem und freiem Antigen durch Bindung des Antikörpers an eine feste Phase ist die Doppelantikörper-Solid-Phase-Technik. Diese Methode ist von Parker in dem Buch "Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds", 1976, S. I56 bis 159, und von Holländer u. Mitarb, in dem Buch "Radioimmunoassay Methods",

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1971, S. 419 bis 422, beschrieben. Das Prinzip dieser Methode besteht darin, einen ersten Antikörper mit einem markierten Antigen und unmarkiertem Antigen nach der klassischen Methode zu inkubieren. Nach der anfänglichen Inkubation wird dem Inkubationsgemisch ein zweiter Antikörper in unlöslich gemachter Form zugesetzt. Dieser zweite Antikörper ist von solcher Art, daß er sich mit dem bei der ersten Inkubation erhaltenen löslichen Antigen-Antikörper-Komplex verbindet und eine Fällung des gesamten Komplexes bewirkt, d.h. Antigen und doppelter Antikörper. Der zweite Antikörper ist ein unspezifischer Antikörper, der mit dem Antigen-Antikörper-Komplex an den Bindungsstellen des stärker spezifischen Antikörpers reagiert, die nicht reaktionsfähig sind gegenüber dem Antigen.

Parker führt in dem Buch "Radiοimmunoassay of Biologically Active Compounds", a.a.O., S. 157, aus, daß in einigen Systemen zuerst Antikörper-ⁿzweite" Antikörper-Komplexe gebildet v/erden, die sich wirkungsvoll mit dem Antigen verbinden und damit eine raschere Bestimmung erlauben. Dies hat aber eine Verminderung der Empfindlichkeit zur Folge.

Bosma u. Mitarb., J. Immunol., Bd. 115 (1975), S. 138I, beschrdfcb " einen direkten Radioimmuntest, bei dem die Sandivich- Technik angewendet wird. Bei diesem Test wird ein

Kunststoffröhrchen zunächst mit einem Antigen und sodann mit einem divalenten Antikörper beschichtet. Der Antikörper ist mittels Glutardialdehyd chemisch an das Antigen gebunden. Die Konkurrenzreaktionen zwischen markiertem Antigen und unterschiedlichen Konzentrationen von unmarkiertem Antigen werden in dem beschichteten Teströhrchen durchgeführt,

Immunochemische Reaktionen wurden in Tests zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern auch nach anderen Methoden als nach dem Radioimmunassaydurchgeführt. Beispiele hierfür sind Agglutinationstests. In der US-PS 3 551 555 ist die Herstellung von beschichteten immunochemischen Reagenspartikeln zur

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Verwendung in Agglutinationsreaktionen beschrieben. Das Reagens besteht aus fein verteilten festen Trägerteilchen, an deren Oberfläche ein Protein adsorbiert ist, das gegenüber der Bestimmungsmethode inert ist.Dänach wird an die Oberfläche das Antigen oder der Antikörper adsorptiv gebunden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Antikörper-doppelt beschichtetes Teströhrchen zu schaffen, mit dessen Hilfe die Trennung von Antikörper-gebundenem und freiem Antigen im Radtotamunasssgr mit ··, hoher Genauigkeit und einfach durchgeführt werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Mit dem Teströhrchen der Erfindung läßt sich eine Trennung von Antikörper-gebundenem und freiem Antigen in fester Phase durchführen. Das Testrohrchen ist auf seiner Innenoberfläche mit zwei Antikörperschichten beschichtet, nämlich einer ersten Schicht von unspezifischen Antikörpern, die chemisch oder physikalisch an die innere Oberfläche des Teströhrchens gebunden sind, sowie einer zweiten Schicht von spezifischen Antikörpern, die chemisch oder physikalisch an die unspezifischen Antikörper gebunden sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Antigens besteht aus folgenden Schritten:

(a) Ein Gemisch eines radioaktiv markierten Antigens und einer unbekannten Probe wird in einem Teströhrchen inkubiert, das mit zwei Schichten von Antikörpern beschichtet ist, nämlich einer ersten Schicht von unspezifischen Antikörpern, die chemisch oder physikalisch an die innere Oberfläche des Teströhrchens gebunden sind, sowie einer zweiten Schicht von spezifischeren Antikörpern, die chemisch oder physikalisch an die unspezifischen Antikörper

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gebunden sind;

(b) das radioaktiv markierte Antigen (und mit ihm natürlich das unmarkierte Antigen), das an die spezifischen Antikörper gebunden ist, wird von dem freien ' radioaktiv markierten Antigen (und dem unmarkierten Antigen) getrennt;

(c) die Radioaktivität des gebundenen radioaktiv markierten Antigens, die Radioaktivität des freien radioaktiv markierten Antigens oder die Radioaktivität der beiden wird bestimmt;

(d) die Menge des gebundenen radioaktiv markierten Antigens, die Menge des freien radioaktiv markierten Antigens oder das Verhältnis von gebundenem zu freiem oder freiem zu gebundenem radioaktiv markierten Antigen wird in Beziehung gesetzt zu den entsprechenden Vierten, die bei Durchführung der Stufen (a), (b) und (c) mit einer Probe mit bekannten Mengen von Antigen erhalten worden ist;

(e) die Menge des Antigens in der unbekannten Probe wird mit der in (d) erhaltenen Beziehung bestimmt.

Die Antikörper-doppeltbeschichteten Teströhrchen der Erfindung sind auf ihrer inneren Oberfläche zumindest teilweise mit zwei bestimmten Schichten von Antikörpern beschichtet. Die unmittelbar auf der Oberfläche des Teströhrchens aufgebrachte Schicht wird nachstehend als Schicht der unspezifischen Antikörper bezeichnet. Der Ausdruck" unspezifisch" bedeutet, daß die Antikörper mit dem zu bestimmenden Antigen praktisch keine Bindung eingehen. Die Schicht der Antikörper, die auf die unspezifischen Antikörper gebunden ist, wird nachstehend als Schicht spezifischer Antikörper bezeichnet. Der Ausdruek"spezifiseh"bedeutet, daß die Antikörper mit dem unbekannten Antigen eine Bindung eingehen. Verfahren zur Herstellung sowohl spezfischer als auch unspezifischer Antikörper sind bekannt. Die unspezifischen Antikörper können durch Immunisierung einer Tierart, die verschieden ist von der Tierart, die zur Herstellung der spezifischen Antikörper verwendet wird, mit gereinigtem unspezifischem Gammaglobulin, das von der Tierart erhalten wird,

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das als Quelle der spezifischen Antikörper dient, erhalten werden.

Als Teströhrchen kommen die üblichen, im Laboratorium verwendeten Teströhrchen, in Frage. Ein besonders geeignetes Material für die Teströhrchen ist Polystyrol. Die Teströhrchen können Jedoch auch aus anderen Polymerisaten bestehen, wie Polyäthylen, Polypropylen, Polycarbonaten oder Äthylen-Tetrafluoräthylen-Copolymerisaten. Diese Materialien müssen in der Lage sein, die Schicht der unspezifischen Antikörper physikalisch oder chemisch zu binden. Die vorliegende Erfindung wird zwar anhand von Anti-, körper-doppeltbeschichteten Teströhrchen beschrieben, doch ist ersichtlich, daß verschiedene andere Gefäße ebenfalls verwendet werden können, beispielsweise eine Mikroti-terplatte, die mit einer doppelten Schicht von Antikörpern beschichtet sein kann.

Die Herstellung der Antikörper-doppeltbeschichteten Teströhrchen erfordert zwei bestimmte Verfahren: Die Beschichtung der Teströhrchen mit unspezifischen Antikörpern und die nachfolgende Beschichtung der mit den unspezifischen Antikörpern beschichteten Teströhrchen mit spezifischen Antikörpern. Eine Vorbehandlung der Teströhrchen mit wäßriger Kochsalzlösung verbessert die gleichmäßige Beschichtung mit den unspezifischen Antikörpern. Beide Beschichtungsverfahren können entweder auf phys-ikalisehern oder chemischem Wege durchgeführt werden. Die' physikalische Adsorption der Antikörperschicht kann beispielsweise durch Rühren einer gepufferten Lösung des Antikörpers in Teströhrchen oder in dem bereits mit dem unspezifischen Antikörper beschichteten Teströhrchen erreicht werden; vgl. beispielsweise Catt u. Mitarb., Science, Bd. 158 (1967), S. 1570 bis 1572. Eine chemische Verankerung der unspezifischen Antikörper an die innere Oberfläche des Teströhrchens oder des spezifischen Antikörpers an den unspezifischen Antikörper ist ebenfalls möglich, wenn das Teströhrchen aus einem Polymer mit reaktionsfähigen funktionellen Gruppen hergestellt worden ist, oder wenn funktioneile Gruppen in das Polymer eingeführt werden können» Vorzugsweise wird der unspezifische Antikörper

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an das Teströhrchen adsorbiert und der spezifische Antikörper an den unspezifischen Antikörper chemisch gebunden.

Die chemische Bindung einer Antikörperschicht an eine andere Antikörperschicht kann mit Hilfe von Glutardialdehyd erreicht werden. Eine gepufferte Lösung eines spezifischen Antikörpers wird zunächst in das Teströhrchen gegeben, das vorher mit dem unspezifischen Antikörper beschichtet worden ist. Das Gemisch wird bei tiefen Temperaturen, vorzugsweise bei etwa 2 bis 8°C, während mindestens 18 Stunden inkubiert. Sodann wird das Teströhrchen geleert und hierauf mit einer gepufferten Lösung von Rinderserumalbumin versetzt, worauf das Teströhrchen sofort wieder entleert wird. Das Teströhrchen wird mit weiterer gepufferter Rinderserumalbuminlösung versetzt, und dieses Mal

mindestens eine Stunde bei Temperaturen von etwa 2 bis 8⁰C inkubiert, bevor es erneut entleert wird. Das Rinderserumalbumin dient zur Stabilisierung des spezifischen Antikörpers, indem es diesen in der richtigen sterischen Konfiguration hält. Es vermeidet eine Denaturierung des Antikörpers und erlaubt die Beibehaltung seiner natürlichen Konfiguration. Nach der letzten Abtrennung der gepufferten Lösung des Rinderserumalbumins aus dem Teströhrchen wird eine gepufferte Lösung von Glutardialdehyd im Teströhrchen etwa eine Stunde bei tiefen Temperaturen, vorzugsweise etwa 2 bis 8°C, inkubiert. Glutardialdehyd ist eine bifunktionelle Verbindung, die spezifisch mit den Aminogruppen in ^-Stellung von Lysylgruppen reagiert und auf diese Weise eine chemische Bindung zwischen unspezifischen und spezifischen Antikörpern über ihre Lysinreste ausbildet. Nach dem Abtrennen der gepufferten Glutardialdhydlösung werden die Teströhrchen erneut rasch mit einer gepufferten Lösung von Rinderserumalbumin und sodann mit einer zweiten gepufferten Rinderserumalbuminlösung gewaschen und bei tiefer Temperatur, vorzugsweise bei etwa 2 bis 8°C, mindestens eine Stunde stehengelassen. Sodann werden die Teströhrchen entleert und bei tie-

f_er Temperatur, vorzugsweise etwa 2 bis 8°C, an der Luft getrocknet.

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Die Antikörper-doppeltbeschichteten Teströhrchen der Erfindung können als Teil eines Radioiramunbestecks (Kit) dienen, der zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Antigens im Radi ο immunassgy- -verwendet wird. Neben dem beschichteten Teströhrchen enthält das Immunbesteck einen Vorrat an radioaktiv markiertem Antigen und einen Vorrat an unmarkiertem Antigen bekannter Konzentration, Sofern nur ein Gefäß mit unmarkiertem Antigen als Teil des Immunbestecks geliefert wird, ist es später erforderlich, mehrere Arbeitslösungen von unmarkiertem Antigen unterschiedlicher Konzentration herzustellen (oder unterschiedliche Mengen einer einzigen Konzentration unterschiedlichen Teströhrchen zuzugebenJ-Esist natürlich zweckmäßiger, wenn das Immunbesteck mehrere Gefäße mit unmarkiertem Antigen unterschiedlicher Konzentration enthält. Das Immunbesteck kann noch ein Antigen-KontroIlserum enthalten. Dies ist eine Lösung bekannter Konzentration eines Antigens in hormonfreiem Serum, und es wird als Testkontrolle verwendet.

Die Teströhrchen der Erfindung werden in einem Radioimmunassay verwendet. Bei diesem Test wird ein Gemisch eines radioaktiv markierten Antigens und eine Probe einer bekannten oder unbekannten Konzentration eines Antigens in dem Teströhrchen der Erfindung inkubiert. Zweckmäßig werden mehrere Teströhrchen gleichzeitig inkubiert. Einige der Teströhrchen enthalten unbekannte Proben, d. h. die zu untersuchende Flüssigkeit, und einige der Teströhrchen enthalten bekannte Konzentrationen des zu bestimmenden Antigens. Die Inkubationszeiten hängen vom Jeweiligen Test ab. Zur Markierung des Antigen-Tracers können die verschiedensten Radioisotope verwendet werden, beispielsweise ¹²⁵J oder ¹³¹J.

Während der Inkubationszeit bildet sich in jedem der Teströhrchen ein Zweiphasensystem, Die Phase (a) besteht aus einer festen Phase, die das gebundene (markierte und unmarkierte) Antigen enthält, das an das Teströhrchen über das doppelte Antikörpersystem gebunden - ist^ sowie einer flüssigen Phase

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(b), die das freie (markierte und unmarkierte) Antigen enthält. Die Trennung der Phasen kann nach üblichen Methoden erfolgen, beispielsweise durch.Abpipettieren oder Dekantieren. Die speziellen Maßnahmen zur Trennung hängen davon ab, ob die Radioaktivität der festen Phase (gebundenes Antigen)^der flüssigen Phase (freies Antigen) oder beider Phasen bestimmt wird. Wenn lediglich die Radioaktivität der festen Phase bestimmt wird, muß die flüssige Phase nicht genau gesammelt werden.

Nach der Trennung der festen von der flüssigen Phase in jedem Teströhrchen wird die Menge des radioaktiv markierten Antigens (d. h. die Radioaktivität in einer der beiden oder beiden Phasen) nach üblichen Methoden bestimmt. Die Menge des Antigens in jeder der unbekannten Proben läßt sich dadurch bestimmen, daß man die Menge des radioaktiv markierten Antigens in einer der beiden Phasen oder ein Verhältnis der Mengen in jeder Phase , das bei der Inkubation der unbekannten Probe anfällt, in Beziehung setzt zu entsprechenden Werten, die bei Verwendung bekannter Konzentrationen erhalten worden sind. Dieses Verfahren wird zweckmäßig so durchgeführt, daß man die Radioaktivitäten gegen die Antigen-Konzentration aufträgt.

Nachstehend wird eingehender die radioimmunologische Bestimmung unter Verwendung von Teströhrchen der Erfindung beschrieben. Es wird ein Radioimmunbesteck mit folgenden Komponenten verwendet:

a) Radioaktiv markiertes Antigen

b) Antigen-Standards mit Konzentrationen von 0, 0,5» 1»O*, 2,0, 3,0 und 5,0 ng Antigen pro ml

c) Antigen-Kontrollserum bekannter Konzentration

d) Polystyrol-Teströhrchen der Erfindung mit zwei Antikörperschichten.

Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt: 16 Teströhrchen werden mit den Zahlen 1 bis Die ersten 12 Teströhrchen sind für die Eichkurve erforder-

1. 16 Teströhrchen werden mit den Zahlen 1 bis 16 numeriert.

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lieh, die Teströhrchen 13 und 14 für das Kontrollserum und die Teströhrchen 15 und 16 für die Testprobe.

2. 50 ul des 0 ng Standards werden in die Teströhrchen 1 und 2 gegeben

50 ul des 0,5 ng Standards werden in die Teströhrchen 3 und 4 gegeben

50 ul des 1,0 ng Standards werden in die Teströhrchen 5 und 6 gegeben
50 ul des 2,0 ng Standards werden in die Teströhrchen 7 und 8 gegeben

50 ul des 3,0 ng Standards werden in die Teströhrchen 9 und 10 gegeben

50 jul des 5,0 ng Standards werden in die Teströhrchen und 12 gegeben.

3. 50 ul des Kontrollserums werden in die Teströhrchen 13 und 14 gegeben

50 ul der Testprobe werden in die Teströhrchen 15 und gegeben.

4. 1 ml der radioaktiv markierten Antigenlösung werden in sämtliche Teströhrchen gegeben.

5· Die Teströhrchen werden zum Vermischen des Inhalts vorsichtig geschüttelt.

6. Inkubation

7. Der Inhalt sämtlicher Teströhrchen wird abpipsttiert oder dekantiert.

8. Jedes Teströhrchen wird mit 1 ml η Kochsalzlösung gewaschen.

9t Jeweils 1 ml radioaktiv markiertes Antigen werden in zwei unbeschichtete Kunststoffröhrchen gegeben, die als Test-

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röhrchen zur Bestimmung der Gesamtradioaktivität verwendet werden.

10. Zur Bestimmung der Radioaktivität werden sämtliche Teströhrchen eine Hinute in eine übliche Vorrichtung zur Messung der Radioaktivität eingestellt.

Berechnungen

1. Für jede Reihe von zwei Röhrchen wird die durchschnittliche Anzahl der Impulse pro Minute (cpm) berechnet.

2. Die prozentuale Bindung für das 0 ng Teströhrchen wird nach folgender Gleichung berechnet:

lOOxdurchschnittl.com für

prozentuale Sindung für 0 ng = die 0 np; Teströhrchen

° durchschnxttl. cpm für die Teströhrchen mit der gesamten Radioaktivität

3. Berechnung der B/3_Q Werte für jede Reihe von Teströhrchen; B = durchschnittliche cpm für eine gegebene Reihe von Teströhrchen

B_Q = durchschnittliche cpm für die 0 ng Teströhrchen 25

Anm.: Der B/B_Q Wert für das 0 ng Teströhrchen beträgt immer 1,0.

4. Zeichnung einer Eichkurve mit den B/3 Werten auf der Ordinate und der ngs Werte auf der Abszisse.

5. Die Menge (ng/ml) des Antigens in der Kontrollserum-Testprobe wird anhand der Eichkurve bestimmt.

356. Die Menge des Antigens in der Testprobe wird anhand der Eichkurve bestimmt.

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- 15 Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von Antikörper-doppeltbeschichteten Teströhrchen zur Verwendung in einem Radioimmuntest zur Bestimmung von Plasmadigoxin

Polystyrol-Teströhrchen mit den Abmessungen 12 χ 75 mm werden mit wäßriger Kochsalzlösung behandelt und sodann mehrmals mit Wasser gewaschen.

Ziegen-Antikaninchenglobulin (erhalten durch Immunisieren von Ziegen mit gereinigtem unspezifischem Gammaglobulin von Kaninchen) in einer Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung wird in jedes Teströhrchen bei Raumtemperatur abgefüllt und etwa 18 Stunden bei 2 bis 8⁰C inkubiert. Sodann wird die Ziegen-Antikaninchen-Globulinlösung aus den Röhrchen abplpettiert, und es wird eine Lösung von Rinderserumalbumin bei 2 bis 8⁰C in Trisacetatpuffer (hergestellt aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Eisessig) zugegeben. Die Röhrchen werden etwa 1 Stunde bei 2 bis 8°C inkubiert. Hierauf wird der Inhalt der Röhrchen abpipettiert. Die Röhrchen werden an der Luft getrocknet un bei 2 bis 8°C aufbewahrt.

Digoxin-Antikörper (hergestellt durch Immunisieren von Kaninchen) wird mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Rinderserumalbumin vermischt, in die Teströhrchen gegeben und etwa 18 Stunden bei 2 bis 8°C inkubiert. Sodann wird der Inhalt der Röhrchen abpipettiert. Hierauf werden die Röhrchen mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Rinderserumalbumin bei 2 bis 8°C gewaschen. Sodann werden die Teströhrchen erneut mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Rinderserumalbumin versetzt, 1 Stunde bei 2 bis 8°C inkubiert und sodann abpipettiert. Hierauf wird jedes Teströhrchen mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Glutardialdehyd versetzt, 1 Stunde bei 2 bis 8°C inkubiert und sodann abpip' Sodann werden Trisacetat-Puffer-

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lösungen von Rlnderserumalbumin zum Waschen der Röhrchen verwendet. Die Röhrchen werden bei 2 bis 8°C aufbewahrt.

Beispiel 2

Herstellung von Antikörper-doppeltbeschichteten Teströhrchen in einem Radioimmuntest zur Bestimmung von Serumtrijodthyronin (T3)

Teströhrchen aus Polystyrol mit den Abmessungen 12 χ 75 werden mit wäßriger Kochsalzlösung behandelt und mit Zi Antikaninchenglobulin gemäß Beispiel 1 beschichtet.

T3-Antikörper, hergestellt durch Immunisieren von Kaninchen, wird mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Rinderserumalbumin vermischt. Das Gemisch wird in die Teströhrchen gegeben und etwa l8 Stunden bei Räumtenroeratur inkubiert. Sodann werden die Teströhrchen abpipsttierf und zweimal mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Rinderserumalbumin bei 2 bis 8°C gewaschen. Nachdem man sich überzeugt hat, daß die Pufferlösung aus den

Teströhrchen vollständig abgetrennt worden ist, werden die Teströhrchen mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Glutardialdehyd bei 2 bis 8⁰C versetzt, etwa 1 Stunde bei 2 bis 8°C inkubiert und sodann abpioettiert. Hierauf werden die Teströhrchen mit einer Trisacetat-Pufferlösung von Rinderserumalbumin gewaschen und sodann bei 2 bis 8 C aufbewahrt.

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Claims

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u.Z.: M 660 (Vo/ko)
Case: T-788 477-S

IS APh i'W

E. R. SQUIBB & SONS, INC.
Princeton, N.J. ," V.St.A.

" Antikörper-doppeltbeschichtetes Teströhrchen und seine Verwendung im Radioimmunassay"

Priorität: 18.4.1977, V.St.A., Nr. 788 477

Patentansprüche

IJ Antikörper-doppeltbeschichtetes Teströhrchen, g e κ enn.ze- lehnet durch ein zur Bindung einer Schicht von Antikörpern befähigtes Teströhrchen, an dessen Innenfläche mindestens teilweise eine Schicht von unspezifischen Antikörpern gebunden Ist und an die Schicht der unspezifischen Antikörper eine Schicht spezifischer Antikörper gebunden ist.
2. Teströhrchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht der unspezifischen Antikörper physikalisch an das Teströhrchen adsorbiert ist.
3. Teströhrchen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht der spezifischen Antikörper an die Schicht der unspezifischen Antikörper chemisch gebunden ist.

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ORIGINAL INSPECTED
4. Teströhrchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Teströhrchen aus Polystyrol besteht.
5. "Verfahren zur Bestimmung eines unbekannten Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Gemisch eines radioaktiv markierten Antigens und die zu bestimmende unmarkierte Verbindung in einem Antikörperdoppeltbeschichteten Teströhrchan gemäß Anspruch 1 inkubiert,
(b) das radioaktiv markierte, an das Teströhrchen gebundene Antigen vom freien, radioaktiv markierten Antigen abtrennt,

(c) die Radioaktivität des gebundenen, radioaktiv markierten Antigens und/oder die Radioaktivität des freien radioaktiv markierten Antigens bestimmt,

(d) die Menge des gebundenen, radioaktiv markierten Antigens, die Menge des freien, radioaktiv markierten Antigens oder das Verhältnis von gebundenem zu freiem oder freiem zu gebundenem radioaktiv markiertem Antigen mit den entsprechenden Werten in Beziehung setzt, die bei der Durchführung der Stufen (a), (b) und (c) mit einer Probe bekannter Mengen Antigen erhalten wird, und

(e) die Menge des Antigens in der zu bestimmenden Probe unter Verwendung der in (d) erhaltenen Beziehung bestimmt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation in Stufe (a) in einem Teströhrchen gemäß Anspruch 2 und 3 durchgeführt wird.
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