DE69010089T2

DE69010089T2 - Submikronische teilchen, herstellung und verwendung in der immundiagnose.

Info

Publication number: DE69010089T2
Application number: DE69010089T
Authority: DE
Inventors: Jean Amiral; Pascale Laroche
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-01-20
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2010-01-23
Also published as: JP2816414B2; WO1990008321A1; EP0406404B1; US5175112A; JPH03504279A; DE69010089D1; ATE107777T1; EP0406404A1

Description

Die Erfindung betrifft submikronische, durch immunologisches Material sensibilisierte Latexpartikel (d.h. mit einem mittleren Durchmesser von weniger als einem Mikrometer), das sind Partikel, auf denen ein Antigen oder ein Antikörper mittels Kovalenz oder Adsorption fixiert ist. Diese Partikel sind bei elektromagnetischer Bestrahlung, wie sichtbares Licht oder UV, "unsichtbar" oder "transparent" und werden durch Agglutination "sichtbar", wenn sie nach Verbindung mit einem Antikörper bzw. mit einem Antigen bestrahlt werden.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf das Verfahren zur Herstellung dieser sensibilisierten Partikel und deren Verwendung zur immunologischen Dosierung beim Ausführen von Reaktionen des Typs Antigen/Antikörper.

STAND DER TECHNIK

Die immunologischen Techniken haben einen bedeutenden Platz im Rahmen der biomedizinischen Analyse eingenommen. Heute werden sie zum Quantifizieren und Dosieren von zahlreichen Stoffen, zu denen die Proteine, die Haptene, die Hormone, die Medikamente und die Antikörper zählen, verwendet.
Ihr Prinzip beruht auf der chemischen Fixierung eines Antikörpers (oder eines Antigens) auf einem Partikelträger. Der Komplex Partikelräger/Antikörper oder Antigen bildet ein Reagens; dieses Reagens, agglutiniert schnell wenn es mit dem entsprechenden Antigen (oder Antikörper) zusammengebracht wird. Diese Agglutination geht mit einer beträchtlichen Erhöhung der Absorbierfähigkeit des Milieus entsprechend der Partikelgröße einher. Der Partikel stellt also ein passives, verstärkendes Agglutinationselement dar, was sich durch eine deutliche Erhöhung der Absorbierfähigkeit bemerkbar macht.
Bei den bekannten Techniken haben sich auf dem Gebiet der Immunanalyse drei Verfahrensgruppen durchgesetzt.
Die erste Gruppe umfaßt die Verfahren der Turbidimetrie und der Nephelometrie. Dabei handelt es sich um Verfahren die der schnellen, jedoch wenig empfindlichen Anwendung dienen und zwar nur bei starken Proteinkonzentrationen, vor allem bei der Turbidinetrie, welche Proteinkonzentrationen von über 100 ug/ml voraussetzt. Die Nephelometrie ist empfindlicher (Anwendungsgebiet ca. 20 ug/ml), sie erfordert jedoch ein sehr "spezielles" Material und eine Vorbehandlung der Proben, wodurch die Anwendungsmöglichkeiten erheblich eingeschränkt werden.
Die zweite Gruppe umfaßt die sogenannten LAURELL und MANCINI Verfahren. Es handelt sich dabei um einfache, jedoch schwer realisierbare, und nicht automatisierbare Verfahren. Sie finden ihre Anwendung bei Proteinkonzentrationen von mehr als 20 ug/ml beim MANCINI Verfahren und von 5 ug/ml beim LAURELL Verfahren. Die Analysezeiten betragen mehrere Stunden und oft mehr als 24 Stunden.
Die dritte Gruppe umfaßt die sogenannten Markierungsverfahren, vor allem die immunenzymologischen (EIA) und radioimmunologischen (RIA) Verfahren. Ihre Anwendung erfordert kostspielige Apparaturen; zu den Dosierungen gehören mehrere, von Spülungen unterbrochene Reaktionsschritte, deren Automatisierung kompliziert bleibt und die Analysezeiten liegen kaum unter zwei Stunden. Diese Verfahrenerlauben allerdings Empfindlichkeiten unter 1 ng/m und lassen sich auf jede vorhandene, biologische Substanz mit Konzentrationen im günstigen Bereich von 10 ng/ml bis 1 mg/ml anwenden.
Dieser Sachverhalt rechtfertigt und erläutert die momentanen Forschungsanstrengungen hinsichtlich der Entwicklung neuer Immundosierungsverfahren zur Beseitigung der o.g. Nachteile, mit dem Ziel, die Anwendungsmöglichkeiten der Techniken aus den ersten beiden Gruppen zu verbessern, falls die hohe Empfindlichkeit der EIA und RIA Verfahren nicht unbedingt erforderlich ist.
Es ist insbesondere bekannt, daß sich die Autoren seit 1970 damit beschäftigen, die Art und Weise des Erfassens von immunologischen Reaktionen des Typs Antigen/Antikörper der ersten beiden o.g. Gruppen zu verfeinern. Daher wurde die Verwendung von mit einem Antigen oder Antikörper versehenen Latexmikropartikeln zur Entwicklung von quantitativen Dosierungen mit Hilfe von Turbidimetrie, Nephelometrie und Partikelzählung in Betracht gezogen.
Auf dem Gebiet der Turbidimetrie (durch Messung der Absorbierfähigkeit des Lichts), sind die Artikel von A.N. BERNARD, A. VYSKOLL und R.R. LAUWERYS, Clin. Chem., 27 (Nr. 6), Seite 832-837 (1981) und von A.M. BERNARD und R.R. LAUWERYS, Clin. Chim. Acta, 119, Seite 335-339, (1982), über die Anwendung von submikronischen Latexpartikeln (mittlerer Durchmesser: 0,79 Mikrometer) versehen mit Anti β&sub2;-Mikroglobulin Antikörpern zur Dosierung von β&sub2;-Mikroglobulin durch Messung der Absorbierfähigkeit bei 360 nm, bekannt; aus dem Artikel von Y. MAYNARD et al., Clin. Chem., 32 (Nr. 5), Seite 752-757, (1986), die Anwendung von monoklonaren oder polyklonaren Anti-IgG Antikörpern zur Dosierung von Immunglobulinseren in Mikroschalen.
Auf dem Gebiet der Nephelometrie (durch Messung der Lichtzerstreuung) ist aus dem Artikel von J. GRANGE et al., Journal of Immunological Methods, 18, Seite 365-375, (1977) die Verwendung von submikronischen Latexkugeln (mittlerer Durchmesser 0,3 Mikrometer), die mit einem Anti-IgG Antikörper vom Kaninchen versehen sind, bekannt, zur Dosierung des IgG vom Kaninchen. Die Latexkugeln bestehen aus Karboxylpolystyrol und enthalten die COOH Gruppen zur Fixierung des Ligand, in diesem besonderen Fall, des Anti-IgG-Antikörpers vom Kaninchen. Dieser Artikel weist vor allem daraufhin, daß "es schwierig ist, die Herstellung von Latexsphären mit adsorbierten Antigenen oder Antikörpern zu normen, da sie dazu neigen, sich selbst zu agglutinieren, bei Änderung des pH und der ionischen Kraft des Dosierungsmilieus".
Ebenfalls ist aus dem Artikel von Anne-Marie BONNEFOY et al., C.R. Acad. Sc. Paris, 283, Serie D Seite 115-118 (vom 5. Juli 1976) die Verwendung von Latexsphären (Polystyrol) mit einem Durchmesser von 300 nm bekannt, die mittels Kovalenz mit einem Antikörper verbunden sind, um nephelometrische Dosierungen zu erhalten (Ablesung bei einer Wellenlänge von 550 nm, bei einem Beobachtungswinkel von 90º). Dieser Artikel enthält keine Beschreibung und keinen Vorschlag hinsichtlich der Stabilisierungsart des immunologischen Reagens, bestehend aus den genannten an den Antikörper gebundenen und stabilisierten Latexsphären.
Auf dem Gebiet der Partikelzählung, ist die Verwendung von submikronischen Polystyrolteilchen (mittlerer Durchmesser: 0,8 Mikrometer) bekannt, die mit Human-IgG versehen sind, zum Auswerten der Agglutination bei Vorhandensein eines Agglutinationsmittels, wie dem Rheumafaktor aus dem Artikel von C.L. CAMBIASO und P.L. NASSON "automated determination of circulating immune complexes by particules counting immunoassay (PACIA)", Protides and Biological Fluids, 1-4. (1979); ebenso sind die beiden o.g. Artikel von A.N. BERNARD et al. bekannt; und das anläßlich der 30. nationalen Tage der APDILA vom 16. bis 17.November 1985 vorgelegte Exposé von J.C. MARESCHAL mit dem Titel "Une nouvelle génération de dosages immunologiques, non-isotopiques par comptage de particules de latex" , welches erneut auf die bei den Messungen aufgetretenen Schwierigkeiten in Bezug auf die Latexagglutination hinweist, wie z.B. die Schwierigkeit der Quantifizierung der Agglutinationsreaktion, die erhöhte, unspezifische Agglutinationsfrequenz und der Mangel an Empfindlichkeit.
Zusammenfassend sind die turbimetrischen, nephelometrischen und Partikelzählverfahren durch folgende Nachteile eingeschränkt:
- Schwierigkeiten beim Erzielen von stabilen und genormten Suspensionen
- Spontane Selbstagglutination des durch einen Antikörper oder ein Antigen sensibilisierten Latex,
- schwache Meßfläche der Eichungskurve (Schwankung der optischen Dichte (DO) von weniger als 0.3 bis 0.4),
-Mangel an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit,
- Behandlung des Partikelreagens vor Anwendung, in bestimmten Fällen (wegen Auflösung) und schlechte Stabilität des Reagens,
- schwierige Anwendung und manchmal komplizierte Erfassung.
Wegen dieser Nachteile wurden die Verfahren trotz ihres praktischen Interesses nicht voll ausgeschöpft.
Ebenso ist aus dem Artikel von J. WINKLES et al. "Enhanced-Latex-Agglutination Assay for C-Reactive Protein in Serum, with Use of a Centrifugal Analyzer", Clin. Chem., 33 (Nr. 5), Seite 685-689, (1987), die Verwendung von sphärischen, submikronischen Latexpartikeln aus Polystyrol (mittlerer Durchmesser : 0,057 Mikrometer), auf denen ein Antikörper adsorbiert wurde, in diesem besonderen Fall ein Anti-Protein C Reagens des Antikörpers, zum Auswerten der Partikel durch Zählen (vorzugsweise), Turbidimetrie oder Nephelometrie, der aus der Verbindung des Komplexes der Anti-Protein C reaktiven/Latexsphären mit dem C-reaktiven Protein (abgekürzt : CRP), resultierenden Agglutination. Die von J. WINKLES et al. beschriebene Technik setzt eine Behandlung mit Ultraschall voraus (auf englisch: "sonication"), die als wesentlich für die Zerstreung und Stabilisierung der Latexpartikel erachtet wird (um deren Selbstagglutination zu verhindern) und um die Verwendung dieser Partikel zur Adsorption des immunologischen Materials (in diesem besonderen Fall des Artikels, des AntiCRP Antikörpers) zu ermöglichen. Die Behandlung mit Ultraschall, die wiederum vor jeder Anwendung des immunologischen Reagens, bestehend aus dem auf den erwähnten Latexpartikeln adsorbierten, immunologischen Material, erfolgen muß, erfordert die Verwendung von kostspieligem Material (nämlich der Ultraschallgenerator und sein Gehäuse), wobei die Anwendung der komplizierten Funktionsweisen, die Reproduktionsmöglichkeiten der genannten Technik beeinträchtigt oder einschränkt. Siehe daher die Hinweise in dem genannten Artikel Seite 686, linke Spalte, Zeile 37-58, und Seite 688 rechte Spalte, Zeile 54-62.
Zusammenfassend erfordert die Technik von J. WINKLES et al., für die immunologischen Dosierungen des Typs Antigen/Antikörper die Anwendung eines Ultraschallfeldes während einer Dauer von 60 s; liegt diese Dauer über 60 s, führt sie zu einer Überhitzung und so zur Zerstörung des Komplexes Latexsphären/Antikörper, und ist die Ultraschallbehandlung unvollständig, verringert sich die Dosierungsempfindlichkeit mit dem sich ergebenden Latexsphären/Antikörper Komplex erheblich und führt zu abweichenden Dosierungsergebnissen.
Ebenso ist bekannt, daß das zum Fixieren von Membranen oder Wänden, von Antigenen oder Antikörpern, verwendete Latex in Form von Sphären, vor allem mit Hilfe von polyhydroxylierten oder eiweißartigen Substanzen oder auch mit Polyvinylpyrrolidon (Siehe vor allem EP-A-O 104 101, FR-B-2 125 000, FR-A-2 495 326, EP-A-0 140 489, EP-A-O 280 560, EP-A-O 163 393 und EP-A-O 281 327) stabilisiert werden muß.
Die Wahl des Latex ist besonders wichtig. Es wurde tatsächlich festgestellt, daß die submikronischen Latexpartikel vor allem gemäß der EP-A-O 296 883 (Latexcarboxypolypropylen), EP-A-O 286 687 (Latexcopolymere Äthylenacrylsäure und Äthylenmetacrylsäure), EP-A-O 295 402 (Latexcopolymer Styrolacrylsäure-Triäthylenglykolmetacrylat), FR-B-2 125 000 (Latex Polystyrol oder Polyacrylamid und Latex Copolymer Styrolbutadien, Styrolacrylnitrilbutadien oder Vinylacetat-Vinylacrylat), FR-A-2 495 326, EP-A-O 140 489 und EP-A-O 280 560 (Latexpolystyrol, Polyacrylamid, Polyäthylen oder Polypropylen), selbst bei Verbindung mit einem Stabilisierungsmittel, im Laufe der Zeit nicht stabil bleiben. Diese durch ein immunologisches Material wie Antigen oder Antikörper sensibilisierten Partikel, sind nach 2-4 Monaten Lagerung unter normalen Bedingungen anfällig für Selbstagglutinationprozesse.
Um eine Verbesserung der Stabilität während der Lagerung bei 4ºC zu erreichen, sollt eher ein verdünntes immunologisches Reagens herangezogen werden.

ZWECK DER ERFINDUNG

Es existiert ein Bedarf an einer relativ einfachen, von den EIA und RIA Techniken abweichenden, immunologischen Dosierungstechnik, die durch Kovalenz oder Adsorption mit submikonischen Latexpartikeln verbundene Antigene oder Antikörper, verwendet, welche die Beseitigung der o.g. Nachteile aus dem Stand der Technik ermöglicht, die eine schnelle, leicht automatisierbare und allen Analyse- oder Forschungslabors zugängliche Analyse, mit einem breiten Anwendungsgebiet, gewährleistet und es ermmöglicht eine Empfindlichkeitsschwelle von mindestens 100 ng/ml zu erzielen.
Es existiert ebenfalls ein Bedarf an einer Technik zur Herstellung von submikronischen, durch eine Substanz oder immunologisches Material sensibilisierten Latexpartikeln, die während der Lagerung stabil bleiben, ohne daß man sie in einer entsprechenden, biologischen Pufferlösung verdünnen muß.
Erfindungsgemäß wurde das Ziel gesetzt, die o.g. Erfordernisse mittels einer neuen technischen Lösung zu erfüllen, bei der einerseits besondere, submikronische Latexpartikel verwendet und andererseits die o.g. aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile beseitigt werden.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird eine neue, technische Lösung zur Herstellung von Latexpartikeln empfohlen, die durch ein immunologisches Material sensibilisiert wurden, um dementsprechend immunologische Dosierungen vom Typ Antigen/Antikörper durch Agglutination von Latexpartikeln zu schaffen, die durch Adsorption mit einem Antigen (oder einem Antikörper) versehen werden, wenn die Partikel mit dem entsprechenden Antikörper (bzw. dem Antigen) in Verbindung gebracht werden.
Diese neue technische Lösung umfaßt einerseits die Wahl eines bestimmten Latex und andererseits die Blockierung oder Einnahme der aktiven Stellen der Partikel, die nicht von dem immunologischen Antigen- oder Antikörpermaterial besetzt sind, mittels eines Stabilisierungsmittels, das aus dem gesamten Komplex, bestehend aus den hydroxylierten Substanzen, mit einer oder besser mehreren OH-Gruppen pro Molekül, aus den Eiweißstoffen, den Peptiden, den Aminosäuren, den polyosischen Substanzen, einschließlich einer oder mehrer Karboxylsäuren und/oder Karboxylatgruppen, dem Polyvinylpyrrolidon, deren Analogen und Gemischen, ausgewählt wird.
Dem ersten Aspekt der Erfindung entsprechend, wird ein Verfahren zum Fixieren von immunologischem, unter Antigenen und Antikörpern auf submikronischen Latexpartikeln ausgewähltem Material, mittels Kovalenz oder Adsorption, empfohlen, wobei das Verfahren, das die Stabilisierung des Latex beinhaltet, dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Schritte umfaßt:
(A) Verbindung, in einem geeigneten, flüssigen Milieu mit einer ionischen Kraft im Bereich von 0,01 bis 0,5 bei einem pH von 4 bis 10, und einer Temperatur von 0 bis 60º C,
(1) von Latexacrylpartikeln auf Butylpolymetacrylatbasis mit einem mittleren Durchmesser, der kleiner oder gleich 100 nm ist, wobei das Latex ein aus Styroleinheiten und aus Butylmetacrylateinheiten bestehender Copolymer ist, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 40/60 bis 45/55, bei einer Dichte von 0,9 bis 1,4 g/cm³, die aus 100 bis 450 Mikroäquivalenten der COOH-Gruppen pro Gramm Latex zusammengesetzt sind, mit
(2) dem immunologischen Material
um durch ein immunologisches Material sensibilisierte Latexpartikel zu gewinnen und wobei das immunologische Naterial mit jedem Latexpartikel verbunden ist und
(B) Stabilisierung des so gewonnenen, immunologischen Reagens, mittels eines Stabilisierungsmittels, das aus dem gesamten Komplex, bestehend aus den hydroxylierten Substanzen mit einer oder mehreren OH-Gruppen pro Molekül, aus den Eiweißstoffen, den Peptiden, den Aminosäuren, den polyosischen Substanzen, einschließlich einer oder mehrerer Karboxylsäuren und/oder Karboxylatgruppen, dem Polyvinylpyrrolidon und seinen Gemischen besteht, ausgewählt wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung, wird als neues Industrieprodukt das immunologische Reagens empfohlen, das aus den mit dem adsobierten, immunologischen und mit dem Stabilisierungsmittel versehenen Partikeln besteht, und welches man gemäß dem o.g. Verfahren erhält, wobei die Ausdehnung des immunologischen Reagens so beschaffen ist, daß das Verhältnis Wellenlänge (λ) / mittlerer Durchmesser (d) der Partikel über oder gleich 5/1 ist, während der Analyse unter Bestrahlung bei einer vorgegebenen Wellenlänge (λ).
Erfindungsgemäß sind die Latexpartikel insbesondere folgendermaßen beschaffen:
(i) Die Latexpartikel, die mit der immunologischen Substanz und dem Stabilisierungsmittel versehen sind und sich in einer Suspension in einem flüssigen, wässrigen Nilieu befinden, sind unsichtbar, bei Bestrahlung mit einer Wellenlänge (λ) über dem mittleren Durchmesser (d) der Partikel, und
(II) die Latexpartikel, die mit der immunologischen Substanz und dem Stabilisierungsmittel versehen sind und sich in einer Suspension in einem flüssigen, wässrigen Milieu befinden, werden bei Bestrahlung "sichtbar" durch Agglutination, nachdem sie mit einer Substanz in Kontakt gebracht wurden, die unter den Antikörpern beziehungsweise den Antigenen ausgewählt wurde, und die der auf den Partikeln fixierten, immunologischen Substanz entspricht.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung, wird die Verwendung des immunologischen Reagens auf dem Gebiet der immunologischen Dosierungen vom Typ Antigen/Antikörper empfohlen.
Die Dosierungsverfahren umfassen erfindungsgemäß:
- direkte Bestimmung eines Antikörpers mittels Agglutination nach der Verbindung des Antikörpers mit dem Reagens, bestehend aus den Latexpartikeln, die jeweils mittels Kovalenz oder Adsorption mit einem Antigen verbunden und stabilisiert sind;
- direkte Bestimmung eines Antigens mittels Agglutination nach Verbindung des Antigens mit einem Reagens, bestehend aus den Latexpartikeln, die jeweils mittels Kovalenz oder Adsorption mit einem Antikörper verbunden sind; und,
- Hemmung der Agglutination des Reagens Latex/Antigen bei Vorhandensein des entsprechenden Antikörpers und indirekte Dosierung des freien Antigens (vor allem durch kompetitive Verfahren) oder umgekehrt.
Diese Dosierungsverfahren sind bei normalen Anwendungsbedingungen temperaturunempfindlich und können bei einer Temperatur von 0 bis 60ºC, insbesondere von 4 bis 60ºC und hauptsächlich bei einer üblichen Temperatur, auf dem immunologischen Gebiet im Bereich von 15 bis 37ºC, angewendet werden.
Erfindungsgemäß beruht die Dosierungstechnik günstigerweise auf dem Wechsel Unsichtbarkeit/Sichtbarkeit von submikronischen Partikel mittels Agglutination und unterscheidet sich von den o.g., aus dem Stand der Technik bekannten, technischen Lösungen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß versteht man unter den Ausdrücken "unsichtbare Partikel" und "sichtbare Partikel" einerseits, daß die sogenannten unsichtbaren oder transparenten Partikel die elektromagnetische Strahlung, wie das Licht, weder zerstreuen noch absorbieren, weil sie das Milieu mit den Partikeln ohne wesentliche Abweichung von der Bestrahlung passieren und andererseits, die sichtbaren Partikel absorbieren und/oder die elektromagnetische Strahlung zerstreuen.
Unter dem Begriff "immunologische Substanz" oder "immunologisches Material" versteht man jede, aus dem aus den Antigenen und den Antikörpern bestehenden Komplex, ausgewählte Substanz, die mittels Kovalenz oder Adsorption auf den Nikropartikeln fixiert werden soll.
Unter dem Begriff "Ligand" versteht man hier das mit jedem Latexpartikel mittels Kovalenz oder Adsorption verbundene Antigen oder den Antikörper.
Unter dem Begriff "immunologoisches Reagens" versteht man den Komplex, bestehend aus den unter Antigenen beziehungsweise Antikörpern ausgewählten Latexpartikeln und der immunologischen Substanz, die mittels Kovalenz oder Adsorption mit jedem der Partikel verbunden ist, wobei die Latexpartikel mit dem immunologischen, mittels eines Stabilisierungsmittels stabilisierten Material, versehen sind.
Unter den Begriffen "Substanz" oder "entsprechender Bestandteil" (homolog, ergänzend und/oder zugeordnet) eines Antikörpers (oder eines Antigens), versteht man das Antigen bzw. den Antikörper, der mit dem Antikörper reagiert oder bzw. das Antigen des immunologischen Reagens.
Der Begriff "Antigen" bezeichnet hier, genauer gesagt, jedes Antigen, aber auch jede Substanz, von der ausgehend ein Antikörper erzeugt werden kann; unter den Substanzen, die Antikörper erzeugen können, kann man hauptsächlich die Haptene, die Peptide, die Medikamente mit mindestens einem peptidischen Fragment, die Alkaloide und allgemein jede Substanz, die eine immunologische Struktur aufweist, erwähnen.
Wie oben erwähnt, ist erfindungsgemäß die Wahl des Latex für die Anwendung des Fixierungs- und des Dosierungsverfahrens von Wichtigkeit. Es ist empfehlenswert, Acryllatexpartikel aus Butylpolymetacrylat zu verwenden, mit einem mittleren Durchmesser von weniger oder gleich 100 nm, wobei das Latex ein aus Styroleinheiten und aus Butylmetacrylateinheiten, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 40/60 bis 45/55 bestehender Copolymer ist, mit einer Dichte von 0,9 bis 1,4 g/cm³ und zwischen 100 bis 450 Mikroäquivalente der COOH Gruppen pro Gramm Latex aufweist.
Vorzugsweise wird die Verwendung eines Copolymers, bestehend aus Styroleinheiten und Butylmetacrylateinheiten, empfohlen, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 42/58 bis 43/57 mit einer Dichte von 1,0 bis 1,1 g/cm³ und der 250 bis 300 Mikroäguivalente der COOH-Gruppen pro Gramm Latex aufweist.
Erfindungsgemäß sind die Latexpartikel vorzuziehen mit einem Durchmesser (d) von 67 nm, einer Dichte von 1,0 bis 1,1 g/cm³, bestehend aus einem Butylstyrolmetacrylat der Fa. RHONE-POULENC, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 42,4/57,6 mit 250 bis 300 Mikroäquivalenten der COOH-Gruppen pro Gramm Latex.
Wie oben erwähnt, ist es wesentlich, daß die erfindungsgemäß geeigneten Latexpartikel, einen mittleren Durchmesser (d) von weniger oder gleich 100 nm, vorzugsweise zwischen 1 und 100 nm und am besten im Bereich von 5 bis 100 nm aufweisen.
Die erfindungsgemäß angewandte, elektromagnetische Strahlung zum Einschätzen der Agglutinationsschwankung während der Reaktion des immunologischen Reagens mit seiner Zuordnung, muß also eine Wellenlänge (λ) aufweisen, die deutlich über dem mittleren Durchmesser (d) der Latexpartikel liegt. Vorzugsweise liegt die Wellenlänge im Bereich von 300 und 1000 nm (hauptsächlich zwischen 400 und 700 nm). Wie oben erwähnt, ist das Verhältnis λ /d über oder gleich 5.
Es ist ebenso wichtig, daß das Latex eine reaktive Funktionalität mit der immunologischen Substanz aufweist. Hier empfehlen sich die Latexarten mit einer COOH-Funktionalität, d.h. , genauer gesagt, die COOH-Gruppen oder, je nach dem pH des Milieus, die COO&supmin; oder COOR' Gruppen, bei denen R' eine übliche Blockierungsgruppe im immunologischen Bereich ist, die hauptsächlich eine Alkylgruppe mit C1-C4, Phenyl oder Benzyl beinhalten kann, wobei die passenderen R' Gruppen hier die Alkylgruppen mit C1-C4 wie Methyl, Äthyl, Isopropyl, T-Butyl oder S-Butyl sind.
In der Praxis enthalten die Reagensgruppen der reaktiven Funktionalität mit der immunologischen Substanz ca. 100 bis 450 Mikroäquivalente (die hier einfacherweise als COOH Gruppen bezeichnet werden) pro Gramm Latex.
Erfindungsgemäß geschieht die Fixierung des immunologischen Materials auf den submikronischen Latexpartikeln mittels Kovalenz oder Adsorption. Die Fixierung mittels Kovalenz unterscheidet sich von der Fixierung mittels Adsorption durch die Tatsache, daß die COOH Funktionalität, wie oben definiert, bei der Fixierung mittels Kovalenz durch eine Carbodiimidverbindung aktiviert oder sensibilisiert wird (die am besten in dem biologischen Herstellungsmilieu löslich ist).
Bei der Fixierung mittels Kovalenz, geschieht die Verbindung aus Punkt A) nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Verbindung des immunologischen Materials mit den Latexpartikeln von mindestens 10 Minuten in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von 4-10 und einer ionischen Kraft von 0,01 bis 0,5 aufweist, bei denen die aktiven COOH-Teile vorab mittels einer Carbodiimidverbindung sensibilisiert wurden, danach Hinzufügen eines Stabilisierungsmittels in überschüssiger Menge zur Blockierung der aktiven, noch freien Teile auf den Latexpartikeln
In Abwandlung kann das Fixieren mittels Kovalenz vor der Verbindung, die Reaktion der aktiven Teile der Latexpartikel (vorab durch Reaktion mit der Carbodiimidverbindung aktiviert oder sensibilisiert) mit einer bifunktionellen Verbindung des Kettenstreckmittels in einer wässrigen Pufferlösung umfassen, mit einem pH von 4-10 und einer ionischen Kraft von 0,01 bis 0,5 bei einer Temperatur von 40-60ºC mindestens 10 Minuten lang.
Erfindungsgemäß sind die Latexarten mit einer reaktiven COOH Funktionalität, entweder direkt zur kovalenten Kopplung des Ligand mittels einer chemischen Reaktion anwendbar, oder nach seitlicher Kettenausdehnung mittels eines bifunktionellen Armes. Zu den bifunktionellen Verbindungen, die erfindungsgemäß zur Schaffung des bifunktionellen Armes oder der Brücke herangezogen werden, gehören die Diamine und die Aminosäuren einschließlich einer Aminogruppe, die ein Bezug auf die Karboxylgruppe eine Endposition einnimmt, wie zum Beispiel die &epsi;-Aminocaprosäure; dieser Arm oder die Brücke wird anschließend zur kovalenten Kopplung aktiviert.
Die Hauptbesonderheit der Latexarten ist ihre Fähigkeit, stabile Suspensionen zu bilden, die unter gewissen Bedingungen auf eine spezifische Art und Weise destabilisiert werden können, in diesem besonderen Fall, die Antigen/Antikörper Reaktion. Erfindungsgemäß behalten die durch ein Antigen oder einen Antikörper sensibilisierten Partikel, zum Beispiel ein Hapten, die inhärenten Eigenschaften des Latex und die der gekoppelten, immunologischen Substanz. Die Partikel bleiben während der Lagerung gleichmäßig verstreut und verfestigen sich nur bei Vorhandensein des Zusatzelementes des Ligand/Antiligand Systems.
Hinsichtlich der reaktiven Funktionalität, erlaubt das Vorhandensein von funktionellen Gruppierungen wie COOH oder anderer o.g. Gruppen, auf der Oberfläche der Latexpartikel, eine kovalente Kopplung mit den funktionellen Gruppierungen des Ligand. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise die funktionellen Paare COOH/NH&sub2; verwendet. Natürlich können auch andere, in der Technik bekannte Verbindungen von funktionellen Paaren in Betracht gezogen werden.
Zur Information werden im Folgenden nicht einschränkende Beispiele für Kopplung mittels Kovalenz aufgeführt:
- Aktivierung der COOH Gruppierungen des Latex mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids (z.B., EDAC oder Morphocarbodiimid oder jedes andere lösliche Carbodiimid), das mit den NH&sub2; Gruppierungen des Ligand bei einem pH zwischen 4 und 10 in einem Milieu ohne freie Aminogruppierungen reagiert: die Aktivierung kann in zwei Schritten zusammen mit der Beseitigung des überschüssigen Kopplungsreagens (vorzuziehendes Verfahren) erfolgen oder direkt gleichzeitig; der Ligand wird anschließend in angemessenem Verhältnis hinzugefügt, dann wird das Latex saturiert und stabilisiert.
- Aktivierung der COOH Gruppierungen des Latex durch ein Carbodiimid und Hinzufügen eines Zwischenarmes: das durch das Carbodiimid aktivierte Latex wird vorläufig mittels eines überschüssigen Diamins "abgeleitet" (bei dieser Technik wird normalerweise ein aliphatisches Diamin mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen verwendet), zum Entfernen des Ligand von der Oberfläche, wodurch er reaktiver wird und um NH&sub2; Gruppierungen zu schaffen; die so gewonnenen und als "abgeleitet" bezeichneten Partikel, werden danach durch das Glutaraldehyd (überschüssiges Material wird entfernt) oder das Carbodiimid aktiviert; nach der Aktivierung reagieren sie mit den NH&sub2; oder COOH Gruppen des Ligand.
Die Verwendung von Latex mit reaktiver Funktionalität, einschließlich anderer reaktiver Gruppierungen, ermöglicht interessante Möglichkeiten zur kovalenten Kopplung:
- Durch ein Carbodiimid oder ein 2-Äthoxy-1-(2H)Chinolinkarboxylat, vor allem das 2-Äthoxy-1(2H)-Äthylchinolinkarboxylat (EEDQ) aktiviertes Karboxyllatex (COOH),
- Durch Glutaraldehyd aktiviertes Latex mit Estergruppierungen (COOR').
Bei der Fixierung mittels Kovalenz oder Adsorption, geschieht die Stabilisierung aus Punkt (B) während oder nach der Verbindung aus Punkt (A). Anders ausgedrückt, kann das bei Punkt (B) vorgesehene Stabilisierungsmittel einem reaktionellen, biologischen Milieu während der Verbindung (A) oder danach zugefügt werden. Meistens wird das Zufügen des Stabilisierungsmittels nach der Verbindung bevorzugt; bei der Fixierung mittels Kovalenz, kann das Stabilisierungsmittels mit dem Verbindungsmilieu zusammengebracht werden, wenn das Stabilisierungsmittel keine reaktiven NH&sub2; Gruppen enthält.
Zur Vervollständigung der Stabilisierung kann nach dem Zufügen des Stabilisierungsmittels ein Ballaststoff zugegeben werden, der sich erfindungsgemäß sehr zum Lyophilisieren des immunologischen Reagens eignet und aus einem eiweißartigen oder polyhydroxilierten Material besteht.
Ebenso kann ein solcher Ballaststoff vor Punkt (A) zum Fixieren des immunologischen Materials auf den Latexpartikeln mittels Kovalenz verwendet werden, zur Bildung eine molokularen Verbindungsschicht (Albumin oder ein organischer Polymer wie Polylysin) zwischen dem Latex und dem Ligand.
Bei der Sensibilisierungsart der Latexpartikel und der Fixierung des Ligand mittels Kovalenz oder Adsorption werden die Experimentierbedingungen, d.h. der pH, die ionische Kraft, das Volumen, die Temperatur, die Dauer und die Konzentration des Ligand, je nach Art des zu dosierenden Mittels abgestimmt, um Folgendes zu erreichen:
Eine perfekte Stabilität des immunologischen Partikelreagens in einem entsprechenden biologischen Milieu,
-eine maximale Reaktivität und eine wirksame Reproduzierbarkeit und
- eine hervorragende Konservierung des immunologischen Reagens während der Lagerung (nach Ende einer Konservierungszeit von 12-18 Monaten bei + 4ºC keine bemerkenswerte Verschlechterung oder Inaktivierung des Reagens).
Vom Praktischen her gesehen, stellt man fest, daß unabhängig von der Pufferlösung, die Erhöhung des pH Wertes und der ionischen Kraft, einerseits eine Stabilisierung des immunologischen Reagens mit sich bringt und andererseits eine entsprechende Verringerung der Reaktivität auslöst.
Deshalb wird zur Herstellung des immunologischen Reagens eine globale Anpassung empfohlen, die ermöglicht, den o.g. antinomischen Aspekt zu beseitigen und bei der ein flüssiges, wässriges Milieu, bestehend aus Wasser und einem Puffermittel, mit einem pH im Bereich von 4 bis 10, (vorzugsweise 6-9 und besser 8,2-8,5), mit einer ionischen Kraft im Bereich von 0,01 bis 0,5, verwendet wird und das gegebenenfalls zur Stabilisierung der Latexpartikel einen inerten, eiweißartigen oder polyhydroxilierten Ballaststoff aufweist, der nach der Stabilisierung aus Punkt (B) beigemischt wird.
Aus praktischen Gründen, soll die Reaktion des immunologischen Reagens mit der ergänzenden oder zugeordneten Substanz in einem flüssigen, wässrigen Milieu, mit einem pH von 4-10, erfolgen, vor allem einem pH von 5-9, einer ionischen Kraft von 0,01-0,5 und das gegebenenfalls einen polymerischen Alkohol und/oder eine unter den Proteinen und den inerten Aminosäuren ausgewählte Substanz, aufweist.
Das Dosierungsverfahren, das erfindungsgemäß empfohlen wird, und bei dem eine Reaktion des Typs Antigen/Antikörper zur Anwendung kommt, ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:
(1) Verbindung von Latexpartikeln in einem flüssigen, wässrigen Milieu mit einem pH von 4 bis 10 und einer ionischen Kraft im Bereich von 0,01 bis 0,5 (i), wobei das Latex ein aus Styroleinheiten und aus Butylmetacrylateinheiten bestehender Copolymer ist, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 40/60 bis 45/55, einschließlich einer molaren Menge von Butylmetacrylateinheiten mit über 50 %, bei einer Dichte von 0,9 bis 1,4 g/cm³, die aus 100 bis 450 Mikroäquivalenten der COOH-Gruppen pro Gramm Latex zusammengesetzt sind, wobei die Partikel einen mittleren Durchmesser (d) von weniger oder gleich 100 nm aufweisen und mit einer unter den Antigenen oder Antikörpern augewählten Substanz versehen sind und die mittels Kovalenz oder Adsorption mit jedem der Partikel verbunden ist, und wobei die aktiven Teile jedes einzelnen, nicht mit der immunologischen Substanz verbundenen Partikels, mittels eines Stabilisierungsmittels, das aus dem gesamten Komplex, bestehend aus den hydroxylierten Substanzen, mit einer oder besser mehreren OH-Gruppen pro Molekül, aus den Eiweißstoffen, den Peptiden, den Aminosäuren, den polyosischen Substanzen, einschließlich einer oder mehrerer Karboxylsäure- und/oder Karboxylatgruppen, dem Polyvinylpyrrolidon und deren Analogen oder Gemischen besteht, ausgewählt wird, mit einer ergänzenden oder der immunologischen Substanz zugeordneten Substanz und
(2) Beurteilung der Agglutinationsentwicklung durch Bestrahlen mit einer Wellenlänge (λ) im Bereich von 300 bis 1000 nm (hauptsächlich 400-700 nm), damit das Verhältnis λ/d mehr oder gleich 5 ist.
Bei diesem Verfahren wird entweder die eigentliche Agglutination oder die Hemmung der Agglutination beurteilt.
Die empfohlene Temperatur für die Anwendung dieses Verfahrens liegt in dem Bereich zwischen 4 bis 60ºC und am besten bei 15 bis 37ºC.
Vorzugsweise geschieht die Dosierung mittels Turbidimetrie. Die Dosierung mittels Turbidimetrie hat den Vorteil, daß sie jedem Labor eine bequeme Anwendung gestattet, das nur ein Photometer oder ein Spektrophotometer (mit einer Wellenlänge zwischen 300 und 1000 nm) hat oder das mit einer automatischen oder hochentwickelten Apparatur ausgerüstet ist (Typ Zentrifugeanalysator, wie der COBAS BIO Analysator).
Die Dosierung kann ebenfalls mittels Nephelometrie oder Partikelzählung vorgenommen werden. Dabei handelt es sich jedoch, wegen der Gerätekosten, um eine einschränkendere Anwendung.
Erfindungsgemäß liegt die Dosierungsempfindlichkeit allgemein bei mindestens 100 ng/ml. Hauptsächlich bei der Nephelometrie könnte die Empfindlichkeitsschwelle manchmal niedriger sein, um genau oder mindestestens 10 ng/ml zu betragen.
Bei einer günstigen Anwendungsart der Erfindung, ist die Dosierungsdauer kurz und liegt meistens bei 30 bis 600 s.
Diese Dosierung ist einerseits bei der quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, bei allen zur Erzeugung von Antikörpern geeigneten Substanzen, wie den Haptenen, den Peptiden, den Medikamenten mit mindestens einem Peptidfraqment, den Alkaloiden und andererseits in verschiedenen biologischen Milieus, wie Plasma, Serum, Urin, Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit und biologischen Extrakten bei verschiedenen, technischen Bereichen, wie z.B bei der Veterinär- und der Humanmedizin, im Nahrungsmittel- und Umweltbereich und Ähnlichem, anwendbar.
Die beste Andwendungsart der Erfindung ist die Verbindung aus Punkt (A) in einem wässrigen, biologischen Milieu mit einem pH von 6-9 und besser von 8,2-8,5 (besonders in einem Glycinpuffer mit einem pH von 8,35) mit einer ionischen Kraft von 0,01-0,5. Die Verbindungsdauer aus Punkt (A) liegt bei mindestens 10 Minuten zum Fixieren des immunologischen Materials mittels Kovalenz und bei mindestens 60 Minuten beim Fixieren des immunologischen Materials mittels Adsorption.
Bei dieser besten Anwendungsart bringt man nach Punkt (A) 100 Gewichtsanteile Latex mit 1 bis 50 oder besser 2 bis 20 Gewichtsanteilen von immunologischem Material in Verbindung und danach werden 10 bis 100 Gewichtsanteile stabilisierendes Material für 100 Gewichtsanteile, der bei der Verbindung benutzten Latexpartikel, verwendet.
Weiter geschieht bei der besten Anwendungsart das Zufügen des Stabilisierungsmittels nach der Verbindung aus Punkt (A) in einem identischen oder ähnlichen, biologischen Milieu, wie bei dem der genannten Verbindung.
Bei der Anwendung des Dosierungsverfahrens ist es empfehlenswert, ein identisches oder ähnliches, wässriges, biologisches Milieu zu verwenden, wie bei der Verbindung aus Punkt (A).
Andere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung werden bei der Lektüre, die den Anwendungsbeispielen folgt, deutlich, welche keineswegs einschränkend sind, sondern der Illustration dienen.
Bei diesen Beispielen, beziehen sich die Beispiele 1-4 auf ein immunologisches Reagens, in dem das immunologische Material mittels Kovalenz mit den submikronischen Latexparttikeln verbunden ist und die Beispiele 5-8 beziehen sich auf ein immunologisches Reagens, in dem das immunologische Material mittels Adsorption mit den submikronischen Latexpartikeln verbunden ist.

BEISPIEL 1

Herstellung des immunologischen Reagens

Verwendet wird ein Latex bestehend aus Poly(Butylmetacrylat), genauer gesagt, einem Copolymer mit Styrolbutylmetacrylat, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheiten/Butylmetacrylateinheiten von 42,4/57,6 mit einer Dichte von 1,02 g/cm³, in Form von Kugeln mit einem Durchmesser von 67 nm der Fa. RHONE POULENC. Die reaktive Funktionalität dieses Latex (im Folgenden "Latex 1" genannt) setzt sich aus den COOH und/oder COOR" Gruppen, je nach dem pH des Milieus zusammen, wobei der Gesamtgehalt an reaktiven COOH und COOR" Gruppen eine Menge von 250 bis 300 Mikroäquivalenten pro Gramm Latex enthält.
Die Fixierung der immunologischen Substanz (d.h. Antigen oder Antikörper) geschieht in zwei Schritten. Vorherige Aktivierung der Karboxyl- und/oder Karboxylatfunktionen des Latex mittels eines Carbodiimids, gefolgt von der Kopplung des Ligand. Einem ml Latex zu 10% p/v (Gewicht/Volumen) werden 5 mg Carbodiimid hinzugefügt. Nach einer Inkubation bei 50ºC oder bei Raumtemperatur (von 10 Minuten bis 2 Stunden) werden die Latexkugeln mehrmals gewaschen und dann mit 1 bis 30 mg verdünntem (am besten 5 bis 10 mg) Antigen oder Antikörper zusammengebracht, 10 bis 30 Minuten lang in einer wässrigen, biologischen Pufferlösung (Glycinpuffer mit einem pH von 8,35), mit einer ionischen Kraft des Kontaktmilieus von 0,01-0,5. Eine Aminosubstanz wird zum Schluß zur Sättigung der freien Stellen hinzugefügt, mit einem Volumen, welches eine direkte Anwendung des Reagens (0,75 % Endgewicht/-volumen) ermöglicht.

BEISPIEL 2

PDF-Dosierung im Serum

In der Meßschale werden nacheinander zugefügt: 15 ul Dosierungsstandard oder -Probe und 500 ul (bei Spektrophotometrie) oder 200 ul (auf COBAS BIO ) mit einem Antikörper versehene Latexkugeln, die in einem Reaktonspuffer verdünnt sind (Endkonzentration 0,075%) (hergestellt nach Beispiel 1, ausgehend von einem Antikörper Anti-PDF (hergestellt nach einem bekannten Verfahren, ausgehend von einem oder mehreren PDF - Abbauprodukt des Fibrinogens). Die Ablesung erfolgt bei 600 nm nach 60 bis 600 s Reaktionszeit, bei manueller Ablesung auf dem Spektrometer, nach 30 bis 180 s bei automatischer Ablesung auf "Cobas Bio" oder durch jede andere kinetische Messung. Die Reaktionsschnelligkeit ermöglicht ebenfalls eine manuelle, kinetische Ablesung zwischen 60 s und 600 s (Figur 1) oder zwischen 80 s und 600 s auf dem COBAS BIO Analysator (Figuren 2a und 2b). Der Zoneneffekt wird bei Konzentrationen über 500 g/ml in der Probe beobachtet. Eine zusätzliche Vorverdünnung ermöglicht die Beseitigung von Fehlerrisiken durch überschüssiges Antigen. Die Erfassungsschwelle im Reaktionsmilieu liegt bei 100 ng/ml.
Figur 1 zeigt die Eichungskurven 1A, 1B und 1C für Reaktionszeiten von 2,5 beziehungsweise 10 Minuten im Koordinatensystem Absorbierfähigkeit A (auf der ordinate) / Endkonzentration in PDF (in ug/ml, auf der Abszisse) bei einer Bestrahlung von 600 nm.
Figur 2a zeigt die kinetischen Kurven, die sich aus der Dosierung des PDF im Koordinatensystem optische Dichte D (auf der Ordinate) / Reaktionszeit T (in Sekunden, auf der Abszisse) ergeben, bei Endkonzentrationen von PDF bei 0 (Kurve 2A); 0,75 (Kurve 2B); 1,5 (Kurve 2C); 3 (Kurve 2D); 4,5 (Kurve 2E) und 7,5 ug/ml (Kurve 2F), bei einer Bestrahlung von 600 nm mittels eines COBAS BIO Analysators.
Ebenso zeigt die Figur 2b die kinetischen Kurven, die sich aus der Dosierung des PDF im Koordinatensystem optische Dichte D (auf der Ordinate) / Reaktionszeit T (in Minuten, auf der Abszisse) ergeben, bei Endkonzentrationen von PDF bei 0 (Kurve 2'A); 0,4 (Kurve 2'B); 0,9 (Kurve 2'C); 1,8 (Kurve 2'D); 3,75 (Kurve 2'E) und 7,5 ug/ml (Kurve 2'F) bei einer Bestrahlung von 600 nm mittels eines COBAS BIO Analysators.

BEISPIEL 3

Direkte Dosierung von Antithrombine III (AT III)

50 ul vom Standard oder von der Probe 80 mal vorverdünnt, werden mit den Latexantikörpern vermischt (hergestellt gemäß Beispiel 1 ab Anti-AT III) verdünnt mit einem Volumen von 500 ul in dem Reaktionspuffer (0,075 % Endgewicht/-volumen).
Die Ablesung geschieht bei 600 nm nach 2 bis 10 Reaktionsminuten. Der Eichungsbereich liegt bei 0 bis 200 % des plasmatischen AT III, was den Werten zwischen 0 und 3,7 ug/ml in dem Reaktionsmilieu (Figur 3) entspricht.
Figur 3 zeigt die Eichungskurve bei 600 nm des plasmatischen AT III (auf der Abszisse Endkonzentrationen von AT III in pg/ml und von plasmatischem AT III entsprechend in % angegeben; mit der optischen Dichte D auf der Ordinate) nach 5 Minuten Inkubationszeit.

BEISPIEL 4

Indirekte Dosierung des PDF

Vorab werden 200 ul Antikörper in die Meßschale gebracht, in diesem besonderen Fall ein Anti-PDF, und 600 ul von freiem, vorverdünntem PDF. Die Reaktion wird danach durch Zufügen von durch PDF (bei 0,75 %) sensibilisierten Latexkugeln ausgelöst (hergestellt nach Beispiel 1 ausgehend von dem auf den Kugeln fixierten PDF), um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten.
Die zu dosierenden PDF-Konzentrationen, die sich durch Reaktionshemmung bemerkbar machen, drücken sich entsprechend der optischen Dichteschwankung oder der bei 600 nm auf dem Spektrometer gemessenen Absorbierfähigkeit aus.
Die nachfolgende Figur 4 zeigt die Agglutinationshemmung des Latex/PDF Reagens in dem Koordinatensystem optische Dichte D (auf der Ordinate), Konzentration des PDF (in ug/ml auf der Abszisse) bei 600 4nm.

BEISPIEL 5

Herstellung des immunologischen Reagens

Latex 1 aus Beispiel 1 wird in Form von Kugeln mit einem Durchmesser von 67 nm verwendet, wobei die reaktive Funktionalität des Latex, wie in Beispiel 1 angegeben, eine Menge von 20 bis 300 Mikroäquivalenten der Karboxylgruppen pro Gramm Latex enthält.
Die Fixierung mittels Adsorption der immunologischen Substanz (d.h. Antigen oder Antikörper) geschieht an der Oberfläche des polymerischen Stoffes der Partikel. In einem Glycinpuffer mit einem pH von 8,35 werden 100 mg (1 ml bei einer Konzentration von 10% p/v) submikronische Latexpartikel 1 mit 1 bis 50 mg (vorzugsweise 2 bis 20 mg) Antikörpern (oder Antigen) von hoher Reinheit verbunden, wobei das biologische Adsorptionsmilieu eine ionische Aktivität von 0,01-0,5 aufweist. Inkubiert wird bei 56ºC 1-24 h lang.
Die submikronischen Partikel, auf denen die immunologische Substanz fixiert wurde, werden gespült und anschließend nachdem sie in demselben Glycinpuffer mit einem pH von 8,35 in eine Suspension gebracht wurden, werden 20 bis 40 mg polyhydroxyliertes Material, hier vorzugsweise Diäthylenglykol, Äthylenglykol, Glyzerin oder PEG hinzugefügt; anschließend wird bei 56ºC 1 bis 24 h lang inkubiert.
Danach wird die entstandene Suspension bis zur anwendbaren Verdünnung (hier 0,075 % p/v) unter Verwendung eines Glycinstabilisierungspuffers, der das polyhydroxylierte Material (hier Diäthylenglykol, Äthylenglykol, Glyzerin oder PEG) und Albumin enthält, verdünnt.

BEISPIEL 6

Dosierung des PDF im Serum

In der Meßschale werden nacheinander zugefügt:
15 ul Dosierungsstandard oder -probe und 500 ul (bei Spektrophotometrie) oder 200 ul (auf COBAS BIO ) mit einem Antikörper und im Reaktionspuffer (Endkonzentration 0,075%) verdünnte Latexkugeln [hergestellt gemäß Beispiel 5 ausgehend von einem Anti-PDF Antikörper, gemäß einem an sich bekannten Verfahren, ausgehend von einem oder mehreren PDF (Abbauprodukt des Fibrinogen)]. Die Ablesung erfolgt bei 600 nm nach 60 bis 500 s Reaktion bei manueller Ablesung auf dem Spektrophotometer oder von 30 bis 180 s bei automatischer Ablesung auf COBAS BIO oder durch jede andere kinetische Messung. Die Reaktionsschnelligkeit ermöglicht ebenfalls eine kinetische, manuelle Ablesung zwischen 60 s und 600s (Figur 5) oder zwischen 30 s und 600 s auf dem COBAS BIO Analysator (Figuren 6a und 6b). Der Zoneneffekt wird bei Konzentrationen über 500 ug/ml in der Probe beobachtet. Durch eine zusätzliche Vorverdünnung kann jegliches Fehlerrisiko durch überschüssiges Antigen ausgeschlossen werden. Die Erfassungsschwelle liegt im Reaktionsmilieu bei 100 ng/ml.
Figur 5 zeigt die Eichungskurven 1A, 1B und 1C für Reaktionszeiten von 2,5 beziehungsweise 10 Minuten im Koordinatensystem Absorbierfähigkeit A (auf der Ordinate) / Endkonzentration PDF in ug/ml (auf der Abszisse) bei einer Bestrahlung von 600 nm.
Die Figur 6a zeigt kinetische Kurven, die sich aus der Dosierung der PDF im Koordinatensystem optische Dichte D (auf der Ordinate / Reaktionszeit T in Sekunden (auf der Abszisse) ergeben, bei Endkonzentrationen des PDF von 0 (Kurve 2A); 0,75 (Kurve 2B): 1,5 (Kurve 2C); 3 (Kurve 2D); 4,5 (Kurve 2E) und 7,5 ug/ml (Kurve 2F), bei einer Bestrahlung von 600 nm, mittels eines COBAS BIO Analysators.
Ebenso zeigt die Figur 6b die kinetischen Kurven, die sich aus der PDF Dosierung im Koordinatensystem optische Dichte D (auf der Ordinate) / Reaktionszeit T in Minuten (auf der Abszisse) ergeben, bei Endkonzentrationen von PDF von 0 (Kurve 2'A); 0,4 (Kurve 2'B); 0,9 (Kurve 2'C); 1,8 (Kurve 2'D); 3,75 (Kurve 2'E) un 7,5 ug/ml (Kurve 2'F) bei einer Bestrahlung von 600 nm, mittels eines COBAS BIO Analysators.

BEISPIEL 7

Direkte Dosierung des Antithrombin III (AT III)

50 ul Standard oder Probe 80 mal vorverdünnt werden mit den Latexantikörpern (hergestellt gemäß Beispiel 5, ausgehend von Anti-AT III) verdünnt bei einem Volumen von 500 ul in dem Reaktionspuffer (0,075 % Endgewicht/-Volumen), gemischt.
Die Ablesung erfolgt bei 600 nm nach 2 bis 10 Reaktionsminuten. Der Eichungsbereich liegt zwischen 0 und 200 % des plasmatischen AT III, was Werten zwischen 0 und 3,7 ug/ml im Reaktionsmilieu entspricht (Figur).
Figur 7 zeigt die Eichungskurve bei 600 nm des plasmatischen AT III (auf der Abszisse: Endkonzentrationen an AT III in ug/ml und im plasmatischen AT III entsprechend in % augegeben; auf der Ordinate: die optische Dichte D) nach 5 Minuten Inkubationszeit.

BEISPIEL 8

Indirekte Dosierung des PDF

Vorab werden 200 ul Antikorper in die Meßschale gegeben, in diesem besonderen Fall, ein Anti-PDF und 600 ul vorverdünntes, freies PDF. Anschließend wird die Reaktion durch Zufügen von, durch PDF (bei 0,75 %) sensibilisierten Latexkugeln, ausgelöst [Herstellung gemäß Beispiel 5 mittels Adsorption des PDF auf den Kugeln], um ein Endvolumen von 1 ml zu erzielen.
Die zu dosierenden PDF-Konzentrationen, die sich durch eine Reaktionshemmung bemerkbar machen, drücken sich entsprechend der Schwankung der optischen Dichte oder der bei 600 nm auf dem Spektrometer gemessenen Absorbierfähigkeit aus. Die nachfolgende Figur 8 zeigt die Hemmungskurve der Agglutination des Latexreagens/PDF im Koordinatensystem optische Dichte (auf der Ordinate), Konzentration des PDF in ug/ml (auf der Abszisse), bei 600 nm.
Erfindungsgemäß werden Dosierungsnecessaires oder -etuis empfohlen, die vor allem in einer wässrigen Flüssigkeit (i) suspendierte Latexmikrosphären enthalten, die zur Verbindung mittels Adsorption mit der immunologischen Substanz des Anwenders verbunden sind oder (ii) immunologisches Reagens, in dem die immunologische Substanz auf jeder Mikrosphäre zur Bildung vor allem eines immunologischen Reagens, wie Latex/PDF, Latex/Anti-PDF, Latex/Anti-AT III oder Latex/AT III adsorbiert ist und welches besonders auf dem Gebiet der Hämostase, verwendbar ist.

VERGLEICHSANALYSEN

Zwei Serien von Vergleichsanalysen wurden mit dem immunologischen Reagens durchgeführt, das aus den im Folgenden genannten, carboxylierten Latexarten (mit einem Gehalt an COOH oder COOR' Gruppen von 250- 350 Mikroäquivalenten) gewonnen wurde, wobei diese in Form von Kugeln, einen Durchmesser von 55 bis 70 nm aufweisen (der entsprechende Gehalt an Comonomeren wird in einem molaren, prozentualen Anteil angegeben):
Latex A: Polypropylen
Latex B: Styrol-Butylmetacrylat (52/48)
Latex C: Metylacrylat-Butylmetacrylat (55/45)
Latex D: Styrol-Butadien (55/45)
Latex E: Styrol-Butadien-Butylmetacrylat (50/25/25)
auf denen man Anti-PDF Antikörper mittels Kovalenz (Serie A) oder mittels Adsorption (Serie B) fixiert hat, um sie mit dem immunologischen Reagens, welches aus Anti-PDF Antikörpern und aus Latex 1 mittels Kovalenz (Beispiel 1) gewonnen wurde oder bzw. mittels Adsorption (Beispiel 5) zu vergleichen.
Die Stabilität wurde während der Lagerung bei 4ºC mehr als 180 Tage lang, bei einer Konzentration von 1 % p/v, bewertet. Die erzielten Ergebnisse werden auf den folgenden Tabellen A und B, die sich auf die entsprechenden Serien (A) und (B) beziehen, dargestellt. TABELLE A STABILITÄT DES IMMUNOLOGISCHEN REAGENS, IN DEM INMUNOLOGISCHES MATERIAL MITTELS KOVALENZ FIXIERT IST Latex Selbstagglutination keine Agglutination bei T = 180 Selbstagglutination bei T TABELLE B STABILITÄT DES IMMUNOLOGISCHEN REAGENS, IN DEM IMMUNOLOGISCHES MATERIAL MITTELS ADSORPTION FIXIERT IST Latex Selbstagglutination Keine Agglutination bei T = 180 Selbstagglutination bei T
Die Ergebnisse der Tabelle A und B weisen darauf hin, daß der Auswahl des Latex bei der Stabilität des immunologischen Reagens erfindungsgemäß eine besondere Bedeutung zukommt, wobei mit dem Latex 1 keine Selbstagglutination nach einer Dauer von mindestens 180 Tagen feststellbar ist.

Claims

1. Verfahren zum Fixieren von immunologischem, unter Antigenen und Antikörpern auf submikronischen Latexpartikeln, ausgewähltem Material, mittels Kovalenz oder Adsorption, wobei das Verfahren, welches die Stabilisierung des Latex beinhaltet, dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Schritte umfaßt:

(A) Verbindung, in einem geeigneten, flüssigen Milieu mit einer ionischen Kraft im Bereich von 0,01 bis 0,5 bei einem pH von 4 bis 10, und einer Temperatur von 0 bis 60º C,

(1) von Latexacrylpartikeln auf Butylpolymetacrylatbasis mit einem mittleren Durchmesser, der kleiner oder gleich 100 nm ist, wobei das Latex ein aus Styroleinheiten und aus Butylmetacrylateinheiten bestehender Copolymer ist, mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 40/60 bis 45/55, einschließlich einer molaren Menge von Butylmetacrylateinheiten mit über 50 %, bei einer Dichte von 0,9 bis 1,4 g/cm³, die aus 100 bis 450 Mikroäquivalenten der COOH-Gruppen pro Gramm Latex zusammengesetzt sind, mit

(2) dem immunologischen Material

um durch ein immunologisches Material sensibilisierte Latexpartikel zu gewinnen und wobei das immunologische Material mit jedem Latexpartikel verbunden ist und

(B) Stabilisierung des so gewonnenen, immunologischen Reagens, mittels eines Stabilisierungsmittels, das aus dem gesamten Komplex, bestehend aus den hydroxylierten Substanzen mit einer oder mehreren OH-Gruppen pro Molekül, aus den Eiweißstoffen, den Peptiden, den Aminosäuren, den polyosischen Substanzen, einschließlich einer oder mehrerer Karboxylsäuren und/oder Karboxylatgruppen, dem Polyvinylpyrrolidon und seinen Gemischen besteht, ausgewählt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Latexacryl ein Copolymer ist, der aus Styroleinheiten und Butylmetacrylateinheiten mit einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 42/58 bis 43/57 und wobei das Latexacryl eine Dichte von 1,0 bis 1,1 g/cm³ hat und zwischen 250 bis 300 Mikroäquivalente der COOH Gruppen pro Gramm Latex aufweißt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung aus Punkt (A) in einem flüssigen Milieu geschieht, welches das Stabilisierungsmittel aus Punkt (B) enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stabilisierung aus Punkt (B) nach der Verbindung aus Punkt (A) geschieht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexpartikel einen mittleren Durchmesser von 10 bis 100 nm aufweisen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, zum Fixieren des immunologischen Materials auf den Latexpartikeln mittels Kovalenz, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verbindung von mindestens 10 Minuten in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von 4-10 und einer ionischen Kraft von 0,01 bis 0,5 des immunologischen Materials mit den Latexpartikel beinhaltet, in denen die aktiven COOH Stellen vorab mittels einer Carbodiimidverbindung sensibilisiert wurden, und anschließend Hinzufügen eines Stabilisierungsmittels in überschüssiger Menge zur Blockierung der auf den Partikeln der Latexpartikel noch freien, aktiven Stellen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es vor der Verbindung, die Reaktion der aktiven Stellen der Latexpartikel mit einer bifunktionellen, kettenausdehnenden Verbindung in einer wässrigen Pufferlösung bei einem pH von 4-10 und mit einer ionischen Kraft von 0,01 bis 0,5 bei einer Temperatur von 40-60º C, mindestens 10 Minuten lang, beinhaltet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verbindung der Latexpartikel einschließt, die an ihrer Oberfläche eine molekulare Verbindungsschicht aufweisen, welche aus einem aus Albumin und Polylysin ausgewählten Material besteht.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Fixieren des immunologischen Materials auf den Latexpartikeln mittels Adsorption, dadurch gekennzeichnet, daß es die mindestens einstündige Verbindung des immunologischen Materials mit den Latexpartikeln umfaßt, in einem wässrigen Milieu bei einem pH von 4-10 und einer ionischen Kraft von 0,01 bis 0,5, und anschließend das Hinzufügen eines Stabilisierungsmittels in überschüssiger Menge zur Blockierung der aktiven, noch auf den Partikeln der Latexpartikel freien Stellen.

10. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 6 und 9 dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung des immunologischen Materials mit den Latexpartikeln in einem Glycinpuffer mit einem pH von 8,35 geschieht.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß Punkt (A) 100 Gewichtsanteile Latexpartikel mit 1 bis 50 und vorzugsweise 2 bis 20 Gewichtsanteile immunologische Material miteinander in Kontakt gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 bis 100 Gewichtsanteile stabilisierendes Material für 100 Gewichtsanteile Latexpartikel verwendet, die bei der Verbindung angewendet wurden.

12. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven COOH Stellen, beziehungsweise COOR' der Latexpartikel vorab durch eine Carbodiimidverbindung beziehungsweise durch eine Glutaraldehydverbindung sensibilisiert wurden.

13. Immunologisches Reagens, bestehend aus submikronischen Latexpartikeln, auf denen durch Kovalenz oder Adsorption ein immunologisches Material fixiert wurde, dadurch gekennzeichnet, daß es gemäß dem Verfahren aus einem der Ansprüche 1, 6, 9 und 11 gewonnen wurde und wobei die Partikel derart beschaffen sind, daß sie

(i) mit der immunologischen Substanz und dem Stabilisierungsmittel versehen sind, sie sich in einer Suspension in einem flüssigen, wässrigen Milieu befinden, sie unsichtbar sind, wenn sie mit einer Wellenlänge (λ), über dem mittleren Durchmesser (d) der Partikel bestrahlt werden und

(ii) mit der immunologischen Substanz versehen sind und das Stabilisierungsmittel sich in einer Suspension in dem flüssigen, wässrigen Milieu befindet, sie durch Agglutination "sichtbar" werden, wenn sie bestrahlt werden, sie mit einer Substanz in Kontakt gebracht wurden, die unter den Antikörpern beziehungsweise den Antigenen ausgewählt wurde und die der auf den Partikeln fixierten Substanz entspricht, wobei das Verhältnis λ/d über oder gleich 5/1 ist.

14. Dosierungsverfahren unter Verwendung einer Reaktion des Typs Antigen/Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß es

(1) in einem flüssigen, wässrigen Milieu bei einem pH im Bereich zwischen 4 und 10 und einer ionischen Stärke im Bereich von 0,01 bis 0,5 (i) Latexpartikel in Kontakt bringt, wobei das Latex ein Copolymer ist, der aus Styroleinheiten und Butylmetacrylateinheiten besteht, bei einem molaren Verhältnis Styroleinheit/Butylmetacrylateinheit von 40/60 bis 45/55, einschließlich einer molaren Menge von Butylmetacrylateinheiten über 50% mit einer Dichte von 0,9 bis 1,4 g/cm³ und die 100 bis 450 Mikroäquivalente der COOH-Gruppen pro Gramm Latex aufweisen, wobei die Partikel einen mittleren Durchmesser (d) von weniger oder gleich 100 nm aufweisen und mit einer immunologischen Substanz versehen sind, die unter den Antigenen und Antikörpern ausgewählt wurde und die durch Kovalenz oder Adsorption mit jedem Partikel verbunden ist, wobei die aktiven Stellen jedes nicht mit der immunologischen Substanz verbundenen Partikels, hauptsächlich von einem Stablilisierungsmittel blockiert werden, das aus der Verbindung, bestehend aus den hydroxylischen Substanzen, ausgewählt wurde, die eine oder mehrere OH-Gruppen pro Molekül aufweisen, wobei die Eiweißstoffe, Peptide, Aminosäuren, die polyosischen Substanzen, aus einer oder aus mehreren Gruppen von Karboxyl- und/oder Karboxylatsäuren, dem Polyvinylpyrrolidon, deren Analogen oder deren Gemischen bestehen, mit (ii) einer zusätzlichen oder der immunologischen Substanz zugeordneten Substanz und

(2) zur Beurteilung der Entwicklung der Agglutination durch Bestrahlung bei einer Wellenlänge (λ) im Bereich von 300 bis 1000 nm (vorwiegend 400-700 nm), sodaß das Verhältnis λ/d mehr oder gleich 5 beträgt.