DE69126248T2

DE69126248T2 - Immunchromatographischer assay und verfahren zur nutzung desselben

Info

Publication number: DE69126248T2
Application number: DE69126248T
Authority: DE
Inventors: Fon-Chiu Chen; Eugene Fan; Ching Huang; Michael Milner; Dou-Mei Wang; Gregg Wilson
Original assignee: Pacific Biotech Inc
Current assignee: Pacific Biotech Inc
Priority date: 1990-02-08
Filing date: 1991-02-08
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2011-02-09
Also published as: EP0466914B1; ATE153701T1; JP3317699B2; ES2103803T5; CA2049919A1; AU649022B2; DE69126248T3; EP0466914A1; EP0466914A4; CA2049919C; KR920701471A; US5096837A; DE69126248D1; WO1991012336A1; JPH04504764A; ES2103803T3; AU7316291A; EP0466914B2

Description

Einheitliche Latexteilchen ("ULPs) sind im wesentlichen äußerst einheitliche Kugeln mit geringem Durchmesser. Der typische Durchmesser liegt im Bereich von weniger als etwa 0,1 µm bis etwa 100 µm. Teilchen mit weniger als 5 µm Durchmesser werden üblicherweise durch Emulsionspolymerisation hergestellt. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist eine Reihe von Teilchen mit äußerst gleichmäßiger Größenverteilung
Die Hauptverwendung der ULPs liegt im Bereich der medizinischen Diagnostik, wobei die Teilchen für Latex-Agglutinationstests verwendet werden. Neuere bekannte Verwendungen umfassen nikrobiologische Anwendungen - z.B. Klassifizierung und Identifizierung von Bakterien sowie Messen des Blutserumanteus in Antibiotika (siehe z.B. Bangs, L.B. "Uniform Latex Particles", vorgestellt in einem Workshop zur 41. Nationalversammlung, American Association for Clinical Chemistry, 1989 und in gedruckter Form erhältlich von Seragen Diagnostics Inc., Indianapolis, IN; oder Galloway, R.J., vldevelopment of microparticle tests and immunoassays", 1988 von Seradyn Inc., Indianapolis, IN). Andere Arten von Teilchen, wie amidmodifizierter Latex ("AML") und carboxylatmodifizierter Latex ("CML") weisen an ihren Oberflächen jeweils Amid- und Carboxylsäuregruppen auf. Diese funktionellen Gruppen erlauben eine kovalente Bindung von Antigenen oder Antikörpern an die Oberfläche der ULPs zur Durchführung verbesserter Agglutinationstests.
Am häufigsten werden ULPs im Bereich der Immundiagnostik oder Immunoassays verwendet, insbesondere in Latex-Agglutinationstests, in denen sie zur Auffindung winzigster Mengen oder Konzentrationen von Antigenen oder Antikörpern in Blut, Serum, Urin oder cerebrospinalen Flüssigkeiten verwendet werden. Das heißt, ULPs werden zur Vergrößerung oder Sichtbarmachung von Antigen-/Antikörperkomplexbildungen verwendet; sie können auch zur Bestimmung der Mengenanteile dieser Reaktion verwendet werden.
Versucht man beispielsweise einen bestimmten Antikörper ("An") zu messen, wird ein geeignetes Antigen ("Ag") auf die Latexteilchen aufgebracht. Da das Ab zweiwertig ist, kann es sich an identischen Stellen von zwei nebeneinanderliegenden Teilchen anlagern und diese verbinden. Das heißt, wird Ab, das in der Probe einer Person vorhanden ist, mit den Ag-beschichteten Teilchen vermischt, verursacht es Agglutination oder Coagulation der Teilchen. Diese Aggregate sind im allgemeinen mit bloßem Auge sichtbar. Dieses Phänomen bildet im wesentlichen die Basis für die Latex-Agglutinationstests ("LAT").
Eine Hauptschwierigkeit bei LATs liegt in der Tatsache, daß die beschichteten Teilchen zu spontaner Agglutination neigen. Dies liegt hauptsächlich daran, daß Latexsuspensionen kolloidale Suspensionen hydrophober Teilchen sind. Die Stabilität einer Suspension hängt von der aktiven Oberflächenladung ab. Die Zugabe von kleinen Mengen Protein (ca. 10 µg pro mg Latex) kann eine Agglomeration bewirken, wogegen eine fortgesetzte Zugabe größerer Mengen Protein zu einer Verbesserung der Teilchenstabilität führt.
Diese Art von Agglutination stellt auch bei der chromatographischen Analyse, bei welcher farbige oder sichtbare Teilchen verwendet werden, ein Problem dar, wie z.B. in der in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO88/08534 beschriebenen Analyse. In dieser Analyse wird eine Probe auf ein Substrat aus absorbierendem Material aufgebracht und ein Analyt bindet bewegliche farbige Latexteilchen an Antikörper- oder Antigenträger. Die Teilchen, an die der Analyt gebunden ist, sind wiederum selbst an immobilisierte Immunoreagenzien gebunden während die Probe das Absorbtionsmaterial im Rahmen der Chromatographie in Längsrichtung durchströmt.
Es wurden verschiedene Methoden zur Lösung des damit verbundenen Problems der nichtspezifischen Agglutination vorgeschlagen, einschließlich der Verwendung von Verbindungsgliedern (Linkers) und Abstandhaltern (Spacers). Einige der vorgeschlagenen Abstandhalter beinhalten Protein A, Diaminoalkane, nackte Antikörper und Streptavidin-Biotin Spacer, um nur einige zu nennen. Die Verwendung von hetero-bifunktionellen Verbindungsgliedern, halogensubstituierten Carbonsäuren, Rinderserumalbumin, oberflächenaktive Mittel und F(ab)&sub2;-Fragmente wurde ebenfalls vorgeschlagen. Es erweisen sich jedoch nur wenige dieser Vorschläge als völlig zufriedenstellend, da sie dazu neigen, die Analyse zu stören und viele dabei eine Agglutination verhindern. Für LATs ist dies natürlich völlig unannehmbar.
Des weiteren wurde versucht, die Genauigkeit der in den nachfolgenden Veröffentlichungen beschriebenen Immunoassays zu verbessern. May et al. (Britisches Patent GB-A-2 204 398) beschreibt Vorrichtungen und Immunoassays für Analyten in Proben, in welchen eine feste Phase in mindestens zwei Bereiche aufgeteilt ist, von denen einer ein freibewegliches, markiertes und für das Analyt charakteristisches Reagens und der zweite ein permanent unbewegliches Reagens zum optischen Auffinden des an das bewegliche Reagens gebundenen Analyts enthält. Sakai et al. (US-Patent 4,680,274) beschreibt, daß ultrafeine Mikrokügelchen ("ultramicrospheres") mit einer Durchschnittsgröße von 0,2 µm oder weniger, auf das ein Stoff aufgebracht ist, der mit einem nichtspezifischen Faktor in einer Probe reagiert, zur Verhinderung einer nichtspezifischen Immunoreaktion verwendet werden können, wenn sie in einer Reihe von Immunoassays enthalten sind. Die Veröffentlichungen Manita (JP-A-5748658; Pat. Abstr. of Japan, Bd. 6 (121) (P-126) (999); Database WPI/Derwent, AN:82-34252E) beschreiben einen Immunoassay, in dem die Empfindlichkeit dadurch verbessert wird, daß die Reaktion in Gegenwart von immunologisch inaktiven Teilchen durchgeführt wird.
Aufgrund des ausdrücklichen Bedarfs an einem Immunoassayverfahren mit unterschiedlichen Anwendungsmöglichkeiten, das die Agglomerationsprobleme anderer Analysen vermeidet und die Ziele verbesserter Genauigkeit und größerer Auflösung fördert und das darüber hinaus bestechend einfach ist, offenbart die Anmelderin die vorliegende Erfindung.
Die Erfindung sieht u.a. einen Immonassay mit einer Wechselwirkung eines Antikörpers und eines Antigens vor, wobei einer der in der Analyse verwendeten Reaktionsteilnehmer ein erstes bewegliches Polymerteilchen umfaßt, an das ein Antikörper oder ein Antigen gebunden ist, und die Verbesserung darin besteht, daß ein erstes Teilchen im Gemisch mit einem zweiten beweglichen Polymerteilchen, an welches ein Protein gebunden ist, vorgesehen ist, wobei das Protein nicht an der Antikörper- Antigen-Wechselwirkung beteiligt ist. Eine alternative Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Aufbringen des Gemisches auf einen Teil einer Trägerschicht Eine weitere Variation sieht eine Immobilisierung des Gemisches auf einem ersten definierten Bereich einer Trägerschicht mit einer oder mehreren definierten Bereichen vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Immunoassay außerdem immobilisierendes Kaninchen-Antiimmunoglobulin G (IgG) (anti-rabbit immunoglobin) auf einem zweiten definierten Bereich der Trägerschicht auf. In einer anderen Ausführungsform ist das an das zweite bewegliche Teilchen gebundene Protein BSA. In einer alternativen Ausführungsform weisen die beweglichen Teilchen einen Durchmesser im Bereich von 0,1 µm bis 0,8 µm auf. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die beweglichen Teilchen farbig. Eine weitere Ausführungsform umfaßt die Zugabe eines Detergens zum Gemisch.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindungoffenbart ein Verfahren zur Verminderung oder Beseitigung falscher positiver und/oder falscher negativer Reaktionen aus Immunoassays, insbesondere wenn Liganden-gebundene Teilchen mit BSA- gebundenen Teilchen gemischt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die beweglichen Polymerteilchen ein Gemisch aus Teilchen, an die Liganden gebunden sind, und Teilchen, an die keine Liganden gebunden sind. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Teilchen, an die keine Liganden gebunden sind, mit einem Protein beschichtet, welches nicht an der in der Analyse verwendeten Liganden-Antiliganden-Bindung teilnimmt, wie BSA. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Polymerteilchen Latex oder Polystyrolkügelchen.
Jede der oben genannten Ausführungsformen kann auch in einem größeren Reagenssatz oder sogenannten Kit durchgeführt werden. Ein solcher Reagenssatz kann weiterhin Regenzien, Phiolen, Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Bindungen und Gebrauchsanweisungen umfassen. Zu solchen Reagenssätzen kann auch ein Filtergerät gehören.
Die Erfindung umfaßt ferner eine Trägerschicht zur Durchführung der Analyse, in der Polymerteilchen vorgesehen sind, von denen einige mit einem Antikörper oder Antigen markiert sind und eine ausreichende, die Agglomeration reduzierende Menge der Teilchen nicht mit dem Antigen oder Antikörper markiert sind.
Die Erfindung umfaßt natürlich auch das Verfahren zur Durchführung der Analyse, das Verfahren zur Verhinderung der Agglomeration, und die besonders einzigartigen Reagenzien (oder Reagensmischungen), die in solchen Analysen verwendet werden, sowie die diese Materialien enthaltenden Vorrichtungen oder Reagenssätze.
Weitere Merkmale und Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden anhand der nachfolgenden Diagramme beschrieben. Es zeigt
Fig. I ein Diagramm mit den Ergebnissen unter Verwendung eines Antikörper-Latex/BSA-Latex-Gemisches in einem Strep-A- Test, Testlauf Nr. 1;
Fig. II ein Diagramm mit den Ergebnissen unter Verwendung eines Antikörper-Latex/BSA-Latex-Gemisches in einem Strep-A- Test, Testlauf Nr. 2;
Fig. III ein Diagramm mit den Ergebnissen unter Verwendung eines Antikörper-Latex/BSA-Latex--Gemisches in einem Okkulten Bluttest.
Es wurde gefunden, daß viele gegenwärtig verwendete Immunoassays eine beeinträchtigte Genauigkeit aufweisen, und zwar aufgrund der falschen negativen und positiven Größen. Diese Probleme wurden wesentlich reduziert, wenn nicht sogar ganz ausgeräumt.

A. Herstellung von Antikörper-Latex-Konjugationen

Das Grundverfahren einer Protein-Latex-Konjugation, entweder über einfache Adsorption oder über kovalente Bindung, ist im Stand der Technik bekannt, ebenso wie die Verwendung von farbigen Latexteilchen, die die Auflösung und Lesbarkeit von Immunoassays verbessern. Es wurde verschiedene Verfahren allgemein beschrieben, z.B. in Bangs, L.B., "Uniform Latex Partides", vorgestellt in einem Workshop zum 41. National Meeting, Amer. Assoc. Clin. Chem., 1989, erhältlich in gedruckter Form von Seragen Diagnostics Inc., Indianapolis, IN; oder Galloway, R.J., Development of microparticle tests and immunoassays," Seradyn, Inc., Indianapolis, IN.
Ein Verfahren zur Herstellung beschichteter ULPs ist das Adsorptionsverfahren. Hierbei werden 1) reine Reagenzien verwendet; 2) die Teilchen vor dem Beschichten gereinigt und 3) die quantitative Oberflächenbedeckung des ULPs und die Ligandenchemie bestimmt. Die Antikörper-Latex-Konjugate ("Ab-Latex") können beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden: Im einfachsten Fall wird der geeignete Ligand in einer Pufferlösung aufgelöst, zu einer Latexsuspension gegeben und während eines Zeitraumes von wenigen Minuten bis mehr als 24 Stunden gerührt. Nach der Äquilibrierung wird der Latex zentrifugiert und der Überstand, der noch nicht adsorbierte Liganden enthält, wird entfernt. Der Latex wird in einer frischen Pufferlösung erneut suspendiert und dann zentrifugiert; der Überstand wird wieder entfernt. Diese Schritte werden wiederholt bis der Latex als frei von sämtlichen nicht adsorbierten Liganden angesehen werden kann. An diesem Punkt ist das Latexbeschichtungsverfahren abgeschlossen und der Latex fertig zur Verwendung in LATs.
Das kovalente Verbinden umfaßt die dauerhafte oder covalente Verbindung eines Liganden oder eines anderen Materials an die Oberfläche des Latexteilchens. Ist das kovalente Verbinden das gewählte Verfahren, muß zuerst der Ligand an die ULPs gebunden werden, dann ist die Stabilität der Latexteilchensuspension aufrechtzuerhalten und anschließend das Gerinnen des Proteins zu verhindern. (Eine allgemeine Beschreibung von kovalenten Bindungstechniken und die Nennung weiterer Veröffentlichungen findet man in Bangs, L.B., "Uniform Latex Partides.").
Obwohl sich die vorstehende Beschreibung auf Latexteilchen bezieht, können auch andere Polymerteilchen, wie Polystyrolteilchen, und sogar Metallteilchen, wie Goldsolteilchen, verwendet werden. Diese Teilchen und ihre Herstellungsverfahren sind bekannt.

B. Herstellung von BSA-Latex-Konjugaten

Die Herstellung von Rinderserumalbumin-Latexkonjugaten ("BSA- Latex") entspricht der oben beschriebenen Herstellung von Ab- Latex, mit der Ausnahme, daß anstelle der Antikörper BSA verwendet wird. Anstelle von BSA können alternativ auch andere Proteine, wie andere Albumine (einschließlich Lactoalbumin), Kasein, Globulin, Immunoglobulin (das nicht an der Antigen- Antikörper-Reaktion teilnimmt) und ähnliches verwendet werden, um eine nichtspezifische Bindung zu verhindern.

C. Gemische aus Ab-Latex und BSA-Latex

Ab-Latex und BSA-Latex werden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt, je nach dem durchzuführenden Test. Zur Herstellung von Gemischen, wie sie beispielsweise in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden, werden Ab-Latex und BSA-Latex in einem Volumenverhältnis von ca. 1 : 1 und 1 : 3 vermischt, zur Verwendung im okkulten Bluttest (siehe Beispiel II). In dem Strep-A-Test (Beispiel 1) betrug das Verhältnis von Ab-Latex : BSA-Latex ca. 1 : 2. Die Menge des Latex (oder anderer Teilchen), die keinen Antikörper tragen, kann in jeder Größenordiiung liegen, die eine angemessene Reduzierung der nichtspezifischen Bindung oder falscher Positivwerte bewirkt. Diese Mengen werden nach naheliegenden empirischen Verfahren bestimmt.

D. Ein-Schritt-Analyse

Die in einer bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendete Analysenreaktionseinheit umfaßt einen Streifen aus einer Nitrocellulosemembran mit einer Porengröße von ca. 8 µm, obwohl auch größere oder kleinere Porengrößen verwendet werden können (d.h. vorzugsweise in einem Bereich von ca. 3 µm bis ca. 12 µm). Der Streifen befindet sich in einem Kunststoffgehäuse. Das Verhältnis zwischen Porengröße und Teilchengröße ist wichtig. Der Durchmesser der verwendeten Teilchen sollte kleiner sein als die Porengröße der Membran, so daß die Teilchen sich durch die Membrane bewegen können.
Ca. je 5µl Ab-Latex oder Ab-Latex/BSA-Latex-Gemisch ("Ab/BSA") wurden dünnflüssig auf die Membran aufgebracht, und spezifisches Ab (positives Signal) und Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (goat anti-rabbit IgG) (negatives Signal) wurden vor dem Test an getrennten Bereichen auf der Membrane immobilisiert. (Der Ziegen-Anti-Kaninchen IgG ist von vielen Quellen erhältlich, z.B. von Pel-Freez, Rogers, AR.) Diese Bereiche können jedoch aneinander angrenzen oder sich überlappen.
Bei der Durchführung der Analyse wird eine Probe auf die Membran aufgebracht und fließt aufgrund der Kapillarwirkung entlang der Membran. Die fließende Probe trägt das Latexgemisch entlang der Membran, und der in der Probe enthaltene Analyt wird an den mit Antikörper markierten Latex gebunden. Der an den Latex gebundene Analyt wird bis zum "positiven Signal" Ab immobilisiert, und der nur das Kaninchen-Ab enthaltende Latex wird bis zum "negativen Signal" Ab immobilisiert. Ist der markierte Latex gefärbt, entsteht in den positiven und negativen Bereichen ein sichtbares Signal.
Durch die nachfolgenden Beispiele werden die bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung im einzelnen beschrieben. Die bedeutet aber nicht, daß die Erfindung hierauf beschränkt ist.

BEISPIEL I

Strep-A-Test

Das Carbohydrat-Antigen der Gruppe Streptococcus A (Strep-A- Antigen) wurde durch das Salpetrigsäure-Extraktionsverfahren hergestellt (Manual of Clinical Microbiology, 4. Ausgabe, American Society for Microbiology). Die Strep-A-Antigenlösung (0,25 ml) wurde auf die dafür vorgesehene Stelle der Probe einer Immunoassay-Vorrichtung aufgebracht; diese Vorrichtung umfaßt zumindest eine Trägerschicht oder eine Membran mit einer oder mehreren definierten Zonen, an die Liganden oder Antiliganden gebunden sind, wobei die Probe in einem Bereich außerhalb der definierten Zonen auf die Trägerschicht aufgebracht und dann ein Flüssigkeitsstrom auf die Trägerschicht geleitet wird, wodurch sich die Probe über die definierten Zonen verbreitet und die in der Probe enthaltenen Substanzen an die Zonen gebunden werden. Zumindest eine der definierten Zonen weist kolloidale Teilchen mit einem daran gebundenen Liganden auf, wobei der Ligand und jegliche in der Probe enthaltenen Analyten den in der ersten definierten Zone gebundenen Antiliganden ergänzen (Immunoassay-Vorrichtungen umgeben oder tragen oft die Membran noch mit einem Kunststoffgehäuse).
Zwei identische Tests wurden nebeneinander gefahren. Ein Test wurde nach 3 Minuten beendet, der andere nach 10 Minuten.
Wurde nur Ab-Latex (siehe Fig. 1.A.) allein verwendet, bewirken Antigenkonzentrationen zwischen 5 X 10&sup8; und 5 X 10&sup9; Strep-A- Zellen pro Test ein Zusammenkleben des Ab-Latex. Das Ergebnis war, daß sich nur eine sehr geringe Menge Latex über die Nitrocellulose-Membran bewegte und dadurch die positiven Signale bei 3 und 10 Minuten sehr leise waren. Wenn andererseits das Ab/BSA-Gemisch verwendet wurde (siehe Fig. 1.B.), bewirkte die gleiche Anzahl Strep-A-Zellen, die im Ab-Latex ein Zusammenkleben verursacht hatte, nicht die gleiche Agglutination in dem Ab/BSA-Gemisch. Dies wurde durch die Tatsache belegt, daß bei Verwendung von Ab/BSA mehr Latex beim Wandern über die Membrane beobachtet wurde. Dieses höhere Volumen an Latexbewegung bewirkte eine nachfolgende Verstärkung des Signals bei 3 und 10 Minuten, verglichen mit dem Einsatz von Ab-Latex allein. Bei niedrigeren Strep-A-Zellen-Konzentrationen (5 X 10&sup4; Zellen pro Test) zeigten jedoch beide, sowohl das Ab- Latex-Gemisch als auch das Ab/BSA-Gemisch, ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der sich bewegenden Latexmenge und der Signalstärke.
Bei Verwendung eines Gemisches von Ab-Latex und reinem Latex (Fig. 2.A.) bewirkten 5 x 10&sup9; Strep-A-Zellen pro Test, daß eine gewisse Menge an Latex zusammenklebte und das positive Signal nicht sichtbar war, der Hintergrund jedoch dunkel und unklar war, verglichen mit Ab/BSA (Fig. 2.B.). Bei 5 X 10&sup8; Zellen oder weniger pro Test (Fig. 2.b.) zeigte das Ab/BSA-Gemisch einen klareren Hintergrund verglichen mit dem Test, bei dem ein Gemisch aus Ab-Latex und reinem Latex verwendet worden war (Fig. 2.A.). Jedoch zeigte sogar die Kombination von Ab-Latex und reinem Latex eine bessere Latexbewegung als der Ab-Latex allein (Fig. 1.A. und Fig. 2.A.).

BEISPIEL II

Okkulter Bluttest

Zwei Probenstäbchen aus einem okkulten Bluttesteinheit (wie z.B. im US-Patent 5 182 191 beschrieben) wurden mit einer Kotprobe beschmiert und in einen Extraktionsbecher, der 350 µm Extraktionslösung enthaltend 0,1 % TRITON in 50 mM Tris- Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 (Tris und TRITON erhalten von Sigma Co., St. Louis, MO) enthielt, gegeben. Nach 10 sec schneller Bewegung in der Extraktionslösung wurden die Probenstäbchen entfernt und das Extraktionsgemisch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben auf die dafür vorgesehene Stelle der Probe einer Immunoassay-Vorrichtung aufgebracht. Die Analyse wurde nach 10 min durch Entfernen der Membran aus ihrem Kunststoffgehäuse beendet.
Die Beobachtungen wären ähnlich denen für den Strep-A-Test. Es wurde gefunden, daß in Gegenwart von menschlichem Hämoglobin (126 ng - 600 ng pro Test) der Ab-Latex zu einer zu frühen Agglutination neigte, was zu einer unausgeglichenen Latexbewegung führte ("Schlierenbildung" erschien auf dem Signalfenster; siehe Fig. 3). Aufgrund dieser frühen Agglutination konnte sich weniger Latex über das Signalfenster bewegen und das Signal erschien etwas verstümmelt und "unbeendet". Bei Zugabe von BSA-Latex wurde eine gleichmäßigere Bewegung von Latex beobachtet. Bei der Verwendung eines Ab/BSA-Gemisches wurde ein sauberer Hintergrund erhalten und gleiche oder bessere Empfindlichkeit als nur mit Ab-Latex. Vergleicht man ein Gemisch von Ab-Latex und BSA-Latex in einem Verhältnis von 1 : 1 mit einem Gemisch im Verhältnis von 1 : 2 oder 1 3 zeigt sich, daß der Hintergrund um so besser und die Bewegung des Latex über das Signalfenster um so schneller ist, je höher die BSA-Latex-Konzentration ist.
Diese Ergebnisse zeigten, daß die Verwendung eines Gemisches von Ab-Latex und BSA-Latex anstelle von Ab-Latex allein die Durchführung des Tests ohne Kompromisse hinsichtlich der Testempfindlichkeit verbesserte. Es wurde angenommen, daß das BSA- Latex in dem Ab/BSA-Gemisch als "Abstandshalter" wirkt und dadurch die sofortige Agglutination des Ab-Latex in Gegenwart des Testantigens verhindert. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß die Verwendung des Ab/BSA-Gemisches dazu neigt, die nichtspezifische Bindung und falsche Positivwerte zu unterbindet.

BEISPIEL III

HCG-Urin-Test

Es wurde festgestellt, daß die Verwendung des Ab/BSA-Gemisches das Auftreten falscher Positivwerte in einstufigen HCG-Urin- Tests vermindert oder ausgeschaltet. Wurde Ab-Latex vor der Durchführung des Tests allein auf den Träger aufgetragen, wurde festgestellt, daß ein falscher Positivwert erhalten werden kann. Wurde das Ab/BSA-Latex-Gemisch zum Testen desselben Urins verwendet, wurden keine falschen Positivwerte festgestellt. Das Auftreten falscher Positivwerte bei einigen Urinproben ist aufgrund der Gegenwart von Substanzen, die eine nicht-spezifische Bindung an Ab-Latex und immobilisiertes Ab bewirken, wahrscheinlich, Das Ergebnis ist die Bildung eines "Sandwichs". Die Gegenwart von BSA-Latex kann die nichtspezifische Bindung beeinträchtigen und damit das Auftreten von falschen Positivwerten vermindern oder ausschalten. Die Substanz im Urin, die eine solche nichtspezifische Bindung verursacht, ist vermutlich das Protein A des Staphylococcus areus. Es ist bekannt, daß das Protein A des S. areus IgG stark bindet, und wenn S. areus im Urin einer nicht schwangeren Frau enthalten sind, wird eine falsche positive Reaktion beobachtet.
Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit bestimmten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist der Umfang des Patentes nicht auf diese bestimmten Ausführungsformen beschränkt, er wird aber durch Bezug auf die nachfolgenden Ansprüche bestimmt.

Claims

Die Wechselwirkung eines Liganden und eines Antiliganden, aufweisende Analyse, bei welcher ein bei der Analyse verwendetes Reagenzmittel entweder den Liganden oder den Antiliganden aufweist und ein ungebundener (nonlabeled) Partikel in einer Beimischung zum Liganden oder Antiliganden vorcesehen ist, um die unspezifische Bindung zu minimieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse an einer chromatografischen Trägerschicht durchgeführt wird, entlang welcher die Beimischung wandert, wobei der Ligand oder Antiligand an einem ersten beweglichen Partikel gebunden ist, welcher sich durch die Trägerschicht bewegen kann und bei der Wechselwirkung nicht agglomeriert, und wobei die ungebundenen Partikel zweite bewegliche Partikel in der Größenordnung von 0,2 µm aufweisen, so daß sich die Partikel mittels der Kapillarwirkung durch die Trägerschicht bewegen können und aus dem gleichen Material wie die ersten Partikel bestehen, wobei das Verhältnis der zweiten Partikel zu den ersten Partikeln bei der Analyse zwischen 1:1 bis 3:1 beträgt.
2. Analyse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieimmunologischen Bindungsreaktionen auf der Trägerschicht stattfinden, wobei die Beimischung auf die Trägerschicht aufgebracht wird.
3. Analyse nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Beimischung auf eine erste definierte Zone der Träger- schicht aufgebracht wird.
4. Analyse nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand oder Antiligand sich mit dem ersten beweglichen Partikel verbindet und ein Antiligand gegen ein Analyte in einer zweiten definierten Zone der Trägerschicht festgesetzt wird.
5. Analyse nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Protein, welches durch das zweite bewegliche Partikel gebunden ist, wobei das Protein nicht an der Ligand-Antiligand-Reaktion teilnimmt.
6. Analyse hach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das durch das zweite bewegliche Partikel gebundene Protein Albumin ist.
7. Analyse nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein vom Rind stammendes Serumalbumin ist.
8. Analyse nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein IgG ist.
9. Analyse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten beweglichen Partikel Latexpartikel aufweisen, welche mit dem Liganden oder Antiliganden verbunden sind, und daß die zweiten beweglichen Partikel einfache bzw. ebene Latexpartikel aufweisen.
10. Analyse nach Anspruch 1, 4, 5 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die beweglichen Partikel einen Durchmesser zwischen 0,2 µ und 0,8 µ aufweisen.
11. Analyse nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die beweglichen Partikel gefärbt sind.
12. Analyse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beimischung zudem ein Detergens aufweist.
13. Verfahren zum Minimieren von Agglomerationen von Ligand-gebundenen (labeled) oder Antiligand-gebundenen (labeled) Partikeln, welche bei einer die Verwendung von gebundenen (labeled) und ungebundenen (nonlabeled) Partikeln verwendenden Analyse eingesetzt werden, wobei der Bestandteil (Label) mit einem Analyte eine Wechselwirkung eingeht, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte:

Bereitstellen der gebundenen Partikel, der ungebundenen Partikel und eines Analyte auf einer Trägerschicht, wobei sowohl die gebundenen Partikel als auch die ungebundenen Partikel in der Größenordnung von ungefähr 0,2 µm dimensioniert sind, so daß die Partikel sich mittels Kapillarwirkung durch die Trägerschicht bewegen können und aus dem gleichen Material bestehen, Ermöglichen einer Wechselwirkung des Bestandteils und des Analyte, sowie Bewegen der gebundenen Partikel durch die Trägerschicht von einer ersten Zone weg zu einer zweiten Zone, der Wechselwirkung nachfolgend, ohne daß eine Agglomeration der Partikel aufgrund der Wechselwirkung auftritt.
14. Analyse nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antiligand einen ersten Antikörper gegen ein Analyte aufweist, und daß der zweite Antiligand einen zweiten Antikörper gegen das Analyte aufweist.
15. Analyse nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein erstes Antigen gegen ein Analyte aufweist, wobei das Analyte einen Antikörper umfaßt, und daß der zweite Antiligand ein Antianalyte aufweist.
16. Analyse nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antiligand ein Antianalyte aufweist, wobei das Analyte einen Antikörper umfaßt, und daß der zweite Ligand ein Antigen gegen das Analyte aufweist.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten beweglichen Partikel Latexpartikel aufweisen, welche mit dem Liganden oder Antiliganden verbunden sind, und daß die zweiten beweglichen Partikel einfache bzw. ebene Latexpartikel aufweisen.
18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten beweglichen Partikel gefärbt sind.
19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein nicht mit dem Liganden oder Antiliganden wechselwirkendes Protein an den zweiten beweglichen Partikeln gebunden ist.