AT409801B

AT409801B - Verfahren zum screenen und isolieren von mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer zellen, die ein antigen präsentieren

Info

Publication number: AT409801B
Application number: AT9612000A
Authority: AT
Original assignee: Cistem Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2002-11-25
Also published as: WO2001092888A3; AU8382501A; WO2001092888A2; ATA9612000A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen und Isolieren von Mikroorganismen, insbe- sondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen präsentieren.

Screening-Methoden für Zellen- oder Phagen-Display-Bibliotheken stellen auf dem Gebiet der Genome einen Geschwindigkeits-bestimmenden Engpass dar. Effiziente Methoden zum Sortieren von Zellen sind entweder teuer oder mit dem Risiko verbunden, die Zellen, die gescreent und isoliert werden sollen, zu beschädigen.

Anderseits sind billigere Methoden oft mit hohen Hintergrund-Signalen verbunden, die zu Prob- lemen bei der Detektion von Mikroorganismen (Zellen, Phagen usw. ), an welchen ein Interesse be- steht, führen. Zumindest führen solche Methoden mit hohen Hintergrund-Signalen zu einem hohen Arbeitsaufwand bei der Analyse positiver Signale mit einer hohen Rate falsch positiver Ergebnisse.

Die Identifizierung von Organismen, an welchen ein Interesse besteht, mit Antikörpern ist ein allgemeines Verfahren bei solchen Screening-Systemen sowie bei der Identifizierung, Trennung, Züchtung und Manipulation solcher Mikroorganismen.

Beispielsweise ist es bekannt, dass die Markierung einer Ziel-Entität mit fluoreszierenden mo- noklonalen Antikörpern (MABs) oder Antikörpern, die mit Färbereagentien verbunden sind, ein Selektionsmittel zur Identifizierung von Ziel-Zellen ist. Wenn jedoch eine solche Identifizierung manuell oder mechanisch vorgenommen wird, müssen zahlreiche Tätigkeiten, die Inkubationen und Waschschritte mit umfassen, durchgeführt werden. Anstelle einer solchen direkten Markierung mit monoklonalen Antikörpern ist eine indirekte Analyse üblich, bei welcher die biologischen Ziel- Mikroorganismen zuerst mit einem spezifischen MAB markiert werden, welcher nicht markiert ist.

Nach ausgiebigem Waschen zum Entfernen von ungebundenem spezifischen MAB wird ein zwei- ter Antikörper zugegeben, der markiert ist und den ersten Antikörper erkennt. Obwohl jedoch solche indirekte Methoden noch spezifischer sind, erfordern sie beträchtliche Mengen an Reagen- zien und zahlreiche Tätigkeiten, die bei solchen Identifizierungsprozessen angewendet werden.

Es wurde vorgeschlagen, magnetische Teilchen zu verwenden, die einen Antikörper an ihre Oberfläche gebunden haben, welcher an spezifische Proteine oder Antigene binden kann (US 5,466,574 und US 6,013,532). Es wurde auch vorgeschlagen, dass dieses Verfahren zur Trennung von Zellen, Zellkomponenten oder Viren mit einer charakteristischen Determinante aus einer Testprobe verwendet wird, z. B. zum Entfernen seltener Zellen, zur Abreicherung natürlicher Killer-Zellen, zur Bestimmung von Reticulozyten, für Phagozytose-Tests, für Obsonisierungsunter- suchungen, zur Detektion spezifischer Tumorzellen oder zur immunspezifischen Isolierung von Monozyten, Granulozyten oder anderen Zelltypen.

Bisher wurde noch nicht vorgeschlagen, ein solches System spezifisch zum Screenen und Isolieren lebensfähiger prokaryontischer und euka- ryontischer Zellen, beispielsweise aus einer Bibliothek von Zellen, die eine Bibliothek von Antige- nen innerhalb eines Membranproteins aufweisen, zu verwenden. Tatsächlich wird die Lebensfähig- keit der Zellen bei den Methoden des Standes der Technik häufig während der Screening- und Isolierungsvorgänge gemäss einem solchen Stand der Technik stark verringert. Daraus ergibt sich, dass eine grosse Anzahl von Ziel-Mikroorganismen während solcher Vorgangsweisen verloren geht oder getötet wird.

C1q ist ein Plasmaprotein, das ständig in relativ hoher Konzentration (70 bis 80 mg/l) anwe- send ist und Teil des klassischen Weges der Komplement-Aktivierung ist. Das C1q-Protein-Molekül weist 6 kugelförmige "Köpfe" auf, von welchen jeder eine A-, B- und C-Polypeptidkette enthält und eine 81-Reste-Verlängerung trägt, die Teil eines zentralen, Kollagen-artigen Tripel-Helix-Schwan- zes ist (Eggleton et al., Trends in CELL BIOL. 8 (1998), S. 428-431). Es ist bekannt, dass C1q an erster Stelle an ein Antigen bindet, gefolgt von der Bindung von C1s und C1r an C1q (wodurch der C1-Komponenten-Komplex gebildet wird), gefolgt von einer seriellen Bindung der anderen Kom- plement-Komponenten C2-C9). C1q bindet an eine Reihe verschiedener Zelltypen, wodurch eine Anzahl verschiedener Immunantworten und Entzündungsreaktionen ausgelöst wird.

Es ist be- schrieben, dass die Wechselwirkungen von C1q mit humanen Neutrophilen, Eosinophilen, Blut- plättchen, Endothelzellen und B-Lymphozyten entzündliche Reaktionen und adaptive Immunant- worten beeinflussen. Es ist auch beschrieben, dass C1q eine Anzahl verschiedener Funktionen in Fibroplasten moduliert.

Eine der wichtigeren biologischen Rollen von C1q ist die Erkennung von Antigen/Antikörper- Komplexen. C1q bindet an solche Komplexe, wenn ein Antigen an der äusseren Oberflächenmemb- ran eines pathogenen Bakteriums von einem Antikörper erkannt wird. Wenn C1q an solche

Immunkomplexe bindet, führt die Aktivierung der anderen Komponenten-Faktoren durch diesen Bindungsvorgang zu einem Enzymkomplex an der Bakterienmembran, der zu einem Angriff und der Perforierung der Bakterienzellwand (Membran) und zur Lyse des Bakteriums führt.

Obwohl von C1q bekannt ist, dass es für Antikörper/Antigen-Immunkomplexe hoch spezifisch ist und es auch in Substanz-konjugierter Form zur Bestimmung oder Detektion eines spezifischen Antigens in einer Körperflüssigkeit oder in anderen biologischen Flüssigkeiten verwendet wurde, wurde noch nie vorgeschlagen, C1q bei einem Verfahren zum Isolieren lebensfähiger prokaryontischer und euka- ryontischer Zellen einzusetzen. Auf der Ebene der Zelldetektion wurden C1q oder C1q-Reagenzien verwendet, damit sie an fixierte und immobilisierte Zellen binden, um Oberflächen-Antigen oder intrazelluläre Substanzen von Mikroorganismen chemisch zu messen (vgl. US 4,882,423).

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Selektion und Isolierung le- bensfähiger Mikroorganismen, insbesondere lebensfähiger prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen präsentieren, vorzusehen, welches billig, einfach zu handhaben und hoch- selektiv ist, wenig Hintergrund hat und keine negativen Auswirkungen auf die Mikroorganismen, vorzugsweise zu selektierende Zellen, hat und daher zum Screenen grosser Bibliotheken anwend- bar ist, welche nur ein einziges oder ein paar Ziele, woran ein Interesse besteht, aufweisen.

Ausserdem ist es ein Ziel, ein solches Screening- und Isoliersystem insbesondere für Zellbiblio- theken vorzusehen, die eine Bibliothek von Antigenen in einer Aussenmembran-Display-Verbindung aufweisen und wobei die Erkennung des Antigens selbst dann möglich ist, wenn es als Insert in einem solchen Aussenmembran-Protein präsentiert ist.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren zum Screenen und Isolieren von Mikroorganis- men, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen aufweisen, gelöst, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - das Vorsehen einer Suspension einer Vielzahl lebensfähiger Mikroorganismen, die ein oder mehrere Mikroorganismen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, ent- halten, die mindestens eine Art von Antigen an ihrer Oberfläche präsentieren, - das In-Berührung-Bringen dieser Suspension von Mikroorganismen mit einer Lösung, die
Antikörper enthält, welche an die zumindest eine Art von Antigen binden, - das Inkubieren dieser Suspension mit diesen Antikörpern, um ein Binden der Antikörper an das (die) Antigen (e) zuermöglichen,

- das In-Berührung-Bringen dieser Suspension von Mikroorganismen mit Antikörper/Antigen-
Komplexen an ihrer Oberfläche mit C1q-Molekülen, um eine Bindung der C1q-Moleküle an die an der Oberfläche befindlichen Antikörper/Antigen-Komplexe zu ermöglichen, und - das Isolieren lebensfähiger Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryon- tischer Zellen, die C1q-Moleküle aufweisen, die an einen Antikörper/Antigen-Komplex an ih- rer Oberfläche gebunden sind.

Es war überraschend, dass mit der Verwendung von C1q-Molekülen ein schnelles. und einfa- ches sowie kostengünstiges Verfahren zum Screenen, Selektieren und Isolieren lebensfähiger Mik- roorganismen, insbesondere fragiler prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, vorgesehen werden konnte. Obwohl man vom Komplement weiss, dass es Zellen, die einen Antigen/Antikörper- Komplex an ihrer Oberfläche präsentieren, schwer schädigt und es deshalb bisher nur in Verbin- dung mit Nekrochemie verwendet wurde (z. B.

US 4,882,423), zeigte es sich im Verlauf der vorlie- genden Erfindung, dass die Verwendung der C1q-Moleküle und-Reagenzien zum Screenen und Isolieren lebensfähiger Zellen durchführbar ist, ohne zu riskieren, seltene oder fragile Zellen infolge von Problemen mit der Lebensfähigkeit in Verbindung mit dem Screening-Verfahren zu verlieren.

Ausserdem haben C1q-Moleküle einen weiteren Vorteil im Vergleich zu einem sekundären Anti-
EMI2.1
gerer Affinität an lgG2 und lgG4 binden. Daher kann man Epitope spezifisch isolieren, die eine Komplement-vermittelte Lyse bewirken könnten.

Gemäss bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist die Suspension der Vielzahl lebensfähiger Mikroorganismen eine Bibliothek von Mikroorganismen auf, worin jeder ein- zelne Mikroorganismus mindestens ein unikes Antigen präsentiert, das für die Mehrheit der Viel- zahl an Mikroorganismen nicht üblich ist. Dieses Antigen oder diese Bibliothek von Antigenen kann vorzugsweise von pathogenen Organismen abstammen, z. B. von einer genomischen Bibliothek eines solchen Mikroorganismus. Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein

solches Antigen ein randomisiertes Peptid, beispielsweise von randomisierten DNA-Sequenzen generiert (Grabowska et al., Virology 269 (2000), 47-53; Rowley et al., J. Immunol. 164 (2000), 3413-3419) sein.

Eine andere bevorzugte Alternative ist die Präsentation von "expressed sequence tags" (ESTs), vorzugsweise von ESTs, die von spezifischen EST-Bibliotheken mit bekannter Spezi- fität stammen, z.B. von spezifischen Organismen oder spezifischen Zelltypen.

Solche Mikroorganismen, in welchen heterologe Antigene präsentiert sind, werden durch nor- male Screening-Methoden wegen ihrer erhöhten Fragilität, insbesondere in Bezug auf ihre Memb- ran-Stabilität, sogar noch stärker gefährdet. Daher ist es sogar noch überraschender, dass beim vorliegenden C1q-System die Anzahl der lebensfähigen Zellen sogar für ein Screenen auf einzelne oder seltene Zellen/Antigene hoch genug ist.

Bevorzugte Zellen, die zur Präsentation von Antigenen gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind prokaryontische und eukaryontische Zellen, die im Labor unter herkömmli- chen Bedingungen leicht zu handhaben sind. Insbesondere Zellen mit etablierten Techniken zur Genmanipulation sind bevorzugt.

Wie oben festgestellt, wird bevorzugt, dass das (die) zu präsentierende (n) an die Antikorper zu bindende (n) für die Mikroorganismen heterolog ist (sind), d. h., dass das Antigen nicht im Wildtyp von solchen Mikroorganismen vorhanden ist (beispielsweise solche Mikroorganis- men genetisch modifiziert).

Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Antikörper enthaltende Lösung mehr als eine einzige Antikörperspezies auf. Das erfindungsgemässe Verfahren ist zum Screenen einer gemischten Antikörperlösung geeignet, die beispielsweise aus menschlichem oder tierischem Serum stammt, das absichtlich in Bezug auf ein spezifisches Antigen oder eine ganze Antigen- Bibliothek gezogen oder auf andere Weise verursacht wurde (z. B. durch spezifische Plasmaselek- tion). Dadurch ist das vorliegende System perfekt für ein Klonierungssystem, wie in WO 99/30151 beschrieben, geeignet.

Bevorzugte Antikörperlösungen sind daher Antikörper-Präparationen (insbesondere IgG-Präpa- rationen), die aus menschlichem Blut stammen, insbesondere von Patienten mit Antikörpern gegen das Pathogen der Antigen-Bibliothek, auf die gescreent werden soll. Besonders geeignet sind Hyperimmunoglobulin-Präparationen von beispielsweise HAV-, HBV-, HCV-, HIV-Patienten oder von Patienten, die Infektionen mit beispielsweise Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercu- losum, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, paeruginosa oder Chlamydia pneumoniae, oder andere klinisch relevante Infektionen mit viralen, prokaryontischen oder eukary- ontischen Pathogenen überstanden haben.

Wenn eine Antigen-Bibliothek in einem oder angrenzend an ein Oberflächenprotein eines Mikroorganismus, z. B. eines Bakteriums, wie E. coli, präsentiert wird, kann es oft schwierig sein, einen Komplex aus einem Antigen, einem Antikörper und einem C1q-Molekül zu bilden, insbe- sondere, wenn das Antigen in einer ziemlich unnatürlichen Umgebung präsentiert wird. Anderseits würde, wenn solch ein Immunkomplex oder die Detektion eines solchen Immunkomplexes bewir- ken würde, dass der Immunkomplex die Zellwand schädigt oder zerreisst, die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen schwer gefährdet.

Tatsächlich war es überraschend, dass das Screenen, die Detektion und das Isolieren mit C1q-Molekülen sogar bei Antigenen möglich war, die als integraler Teil des Oberflächenproteins der Mikroorganismen präsentiert wurden, insbesondere in jenen Fällen, wo dieses Antigen als integraler Teil des Aussenmembranproteins präsentiert wird (wie z.B. in WO 99/30151 beschrieben).

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist das bei der vorliegenden Erfindung verwendete C1q-Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C1q, Substanz-konjugiertem C1q, synthe- tischem C1q-Peptid, Oberflächen-gebundenem C1q oder Mischungen solcher Komponenten.

Insbesondere wird C1q, das mit spezifischen Marker-Substanzen konjugiert ist, bevorzugt. Solche Marker-Substanzen können Signal-aussendende Substanzen sein, wie Enzymsubstrate, Farbstoffe oder Pigmente, magnetisierbare Substanzen, Spender oder Akzeptoren für Elektronenübertragung, radioaktive Materialien, Metallverbindungen und Metallzusammensetzungen, die Signale aussen- den, welche von den Sensororganen oder einem Ausseninstrument detektierbar sind, Enzyme oder Coenzyme, die zur Aussendung detektierbarer Signale modifiziert werden können, Biotinylierung, Agglutinierungssubstanzen, die zusammenkommen, um dadurch leicht detektiert zu werden, Zellfunktions-regulierende Substanzen, beispielsweise bestimmte Enzyme, die auf die Gegensub-

stanzen wirken, welche mit C1q konjugiert sind, um letzteren irgendwelche Funktionen zu verleihen, und Substanzen,

wie hochpolymere Materialien, die die mit C1q konjugierten Antigene fangen oder reversibel fixieren. C1q kann aus verschiedenen Tieren, einschliesslich Schafen, Kaninchen, Meerschweinchen, Rindern, Pferden, Hunden, Mäusen und den Menschen isoliert werden und mittels herkömmlicher Reinigungsvorgänge hergestellt werden. Es ist auch möglich, synthetische C1q-Peptide zu verwenden, die den wesentlichen Teil für Immunkomplex-Erkennung und-Bindung enthalten. Beispiele für solche C1q-Moleküle, insbesondere Substanz- oder Oberflächen- gebundene C1qs, sind dem Fachmann im Prinzip bekannt und beispielsweise in US 4,882,423 und 4,143,124 beschrieben.

Gemäss bevorzugten Ausführungsformen ist das C1q-Molekül auf einer festen Matrix, insbesondere auf magnetischen Teilchen, immobilisiert, und sind die Mikroorganismen, an welchen ein Interesse besteht, durch Affinitätsreinigung unter Verwendung solcher magnetischer Teilchen gereinigt. Es war überraschend, dass dieses Verfahren zum Isolieren lebensfähiger Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, geeignet ist, die gegebenenfalls in Bezug auf ihre Oberflächenproteine genetisch manipuliert sind. Obwohl die magnetische Immobilisierung und Manipulation von Zellen im Prinzip bekannt ist (vgl. z. B. US 6,013,532), ist es jedoch bekannt, dass bei solchen Tätigkeiten normalerweise eine grosse Anzahl von Ziel-Mikroorganismen verloren geht oder getötet wird.

Ausserdem wurden solche magnetische Verfahren nur bei normalen, nicht-manipulierten oder fragilen Zellen angewendet, und niemals in Verbindung mit dem Komplement-System, von welchem bekannt ist, dass es eine starke Auswirkung auf die Integrität der Oberfläche solcher Mikroorganismen und ihre Lebensfähigkeit hat.

Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Kultur von Mikroorganismen, die ein Antigen präsentieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemäss isolierten Mikroorganismen, die durch das vorliegende Verfahren identifiziert werden, gegebenenfalls von den Antikörpern und der C1q Molekülen getrennt werden, geklont werden und gegebenenfalls in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet werden, beispielsweise um den Antigen- oder Immunkomplex zu identifizieren.

Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Set zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, umfassend - eine Suspension einer Mehrzahl lebensfähiger Mikroorganismen, die ein oder mehrere Mik- roorganismen enthalten, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, welche mindestens eine Antigen-Art an ihrer Oberfläche aufweisen, - eine Suspension von Antikörpern, welche an die mindestens eine Antigen-Art binden, und - mindestens eine C1q-Molekül-Art.

Die drei Mindest-Komponenten des Sets gemäss der vorliegenden Erfindung können an die spezifischen, oben beschriebenen Ausführungsformen angepasst werden und gegebenenfalls in lyophilisierter Form und/oder zusammen mit geeigneten Hilfsstoffen vorliegen. Vorzugsweise sind auch weitere Reagenzien oder Einrichtungen zum Isolieren der Zellen im Set inkludiert, z. B. Vorrichtungen zur magnetischen Trennung von Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und eukaryontischer Zellen.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und Isolierung von Antigenen, insbesondere Antigenen, die aus pathogenen Organismen stammen, um Vakzinen vorzusehen.

Das Verfahren ist im Beispiel und in den Zeichnungsfiguren weiter beschrieben, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 und Fig. 2 zeigen die C1q-vermittelte Ganzzellen-Affinitätsreinigung.

Beispiel
C1q kann Bakterien, die ein spezifisches Epitop (T7-Epitop) präsentieren, speziell isolieren:
Versuchsvorgang :
Einzelne Kolonien von DH5a-Zellen, die das Plasmid pEH1-LamBT7 oder das Plasmid pEH3 (nur den Vektor) enthalten, welche in 5 ml LBKan bzw. LBchl suspendiert waren, wurden etwa 4 h

lang bei 37 C inkubiert. Bei einer OD600von 0,2 wurden die Zellen mit 0,1mM IPTG 1,5 h lang bei 37 C induziert. Eine Mischung von mit T7-Epitop-markiertem LamB exprimierenden Zellen und nicht-Epitop-exprimierenden Zellen (Verhältnis = 102 : 106) wurde mit 10 ng T7-spezifischem Anti- körper entweder mit oder ohne 10 ug Human-IgGs (zuvor an E coli DH5Ó voradsorbiert) inkubiert.

Das Reaktionsvolumen war 100 ul (Puffer: 25 mM HEPES-CI, pH 7,4,2,5 mM CaCI2, 10 mM MgCI2, 0,1% BSA), die Inkubationstemperatur betrug 4 C, die Röhrchen wurden auf eine Schüttelvorrichtung gegeben (Rotator Drive STR4, Stuart Scientific).

Nach der Inkubation mit 5 ug biotinyliertem C1q wurde 1 ml HEPES-Puffer zugegeben, und die Eppendorf-Röhrchen wurden 15 min lang bei 4 C (8.000 U/min, Biofuge, Heraeus) zentrifugiert, das Zell-Pellet wurde noch einmal mit 1 ml frischem Puffer gewaschen. Danach wurden die Zellen in 100 ul Puffer resuspendiert, und 10 ul Streptavidin-gekoppelte MicroBeads (Miltenyi) wurden zugegeben.

Nach 50 min wurde die Inkubationsmischung mit 1,5 ml HEPES verdünnt und auf MS-Säulen (Miltenyi) geladen. Nach dem Waschen (3 x 1 ml Puffer) wurde die Säule vom Magnet genommen, und die gebundenen Zellen wurden mit 1,5 ml Puffer eluiert. Danach wurde die Elutionsfraktion noch einmal auf eine MS-Säule für eine zweite Trenn-Runde geladen (die Wasch- und Elutionsvo- lumina waren 3 x 1 ml bzw. 1,5 ml).

Inkubationszeit : t7-Monoklonaler Antikörper : 1 h lang, biotinyliertes C1q: über Nacht (16 h), 50 min mit MicroBeads, die mit Streptavidin konjugiert waren.

Die Fraktionen 1 + 2,3 + 4 und 5 + 6 wurden gepoolt, und die Hälfte des Volumens wurde auf LB-Platten plattiert, die entweder Kanamycin oder Chloramphenicol enthielten.

Ergebnis : Anzahl von Zellen, die beim Versuch verwendet wurden (E. coli Stamm DH5a)
LamB T7 (Kanamycin-Resistenz) : 67 pEH3 (nur Vektor) (Chloramphenicol-Resistenz): 1,5 x 105
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<tb> ciq <SEP> (ug <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb> Human-lgGs <SEP> (ug) <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
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<tb> T7-Ab <SEP> (ng)10 <SEP> 10
<tb>
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<tb>
<tb> Waschung <SEP> (Ms) <SEP> spezifisch <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 51 <SEP> 44
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<tb> Waschung <SEP> (MS) <SEP> spezifisch <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
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<tb> Elution <SEP> spezifisch <SEP> 36 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯unspezifisch <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb>

Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen, dass C1q-Bakterien, die ein spezifisches Epitop (T7-Epitop) an der Oberfläche präsentieren, aus einer Vielzahl von Bakterien,

die dieses Epitop nicht präsentieren, isolieren kann. Nach einer einzigen Trenn-Runde wurden mehr als 50% positive Baktenen mit einem Hintergrund von nur 10-20 Zellen (aus 1,5 x 105 Zellen ! ) gewonnen. Bei einem direkten Vergleich führte der sekundäre Antikörper, der anstelle von C1q verwendet wurde, zu einem viel höheren Hintergrund von 300-500 Zellen, die kein Epitop präsentierten.

Wie aus dem vorliegenden Beispiel ersichtlich, funktioniert C1q derzeit am besten mit LamB- Aussenmembranprotein oder ähnlichen Proteinen, das (die) an der Oberfläche ein Homotrimer bildet (bilden). Wenn man daher ein heterologes Peptid in eine der Loops insertiert, wird dieses Epitop drei Mal sehr nahe an einander präsentiert. Dies wird natürlich für eine effiziente C1q- Bindung bevorzugt, da eine starke Bindung nur auftritt, wenn C1q an mindestens zwei Antigen- gebundene IgGs gleichzeitig bindet.

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zum Screenen und Isolieren von Mikroorganismen, insbesondere prokaryonti- scher und eukaryontischer Zellen, die ein Antigen präsentieren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: <Desc/Clms Page number 6> - das Vorsehen einer Suspension einer Vielzahl lebensfähiger Mikroorganismen, die ein oder mehrere Mikroorganismen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zel- len, enthalten, die mindestens eine Art von Antigen an ihrer Oberfläche präsentieren, - das In-Berührung-Bringen dieser Suspension von Mikroorganismen mit einer Lösung, die Antikörper enthält, welche an die zumindest eine Art von Antigen binden, - das Inkubieren dieser Suspension mit diesen Antikörpern, um ein Binden der Antikörper an das (die) Antigen(e) zu ermöglichen,

- das In-Berührung-Bringen dieser Suspension von Mikroorganismen mit Antikörper/An- tigen-Komplexen an ihrer Oberfläche mit C1q-Molekülen, um eine Bindung der C1q-Mo- leküle an die an der Oberfläche befindlichen Antikörper/Antigen-Komplexe zu ermögli- chen, und - das Isolieren lebensfähiger Mikroorganismen, insbesondere prokaryontischer und euka- ryontischer Zellen, die C1q-Molekule aufweisen, die an einen Antikörper/Antigen-Kom- plex an ihrer Oberfläche gebunden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension einer Vielzahl lebensfähiger Mikroorganismen eine Bibliothek von Mikroorganismen aufweist, worin jeder einzelne Mikroorganismus mindestens ein unikes Antigen präsentiert, das die Mehrheit der Vielzahl von Mikroorganismen nicht hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen genetisch modifiziert sind und die mindestens eine Antigen-Art, die an diese Antikörper bindet, im Wildtyp der Mikroorganismen nicht vorhanden ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die die Anti- körper enthaltende Lösung mehr als eine Antikörper-Spezies aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen als integraler Teil eines Oberflächenproteins dieser Mikroorganismus präsentiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroor- ganismen Bakterien sind und das Antigen als integraler Teil eines Aussenmembranproteins präsentiert ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikör- perlösung eine IgG-Lösung ist, die aus Blutplasma stammt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein randomisiertes Peptid ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Peptid ist, das von einem pathogenen Mikroorganismus stammt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das C1q-Mo- lekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1q, Substanz-konjugiertem C1q, syn- thetischem C1q-Peptid, Oberflächen-gebundenem C1q oder Mischungen davon.
11. Verfahren zur Herstellung einer Kultur von Mikroorganismen, die ein Antigen präsentieren, dadurch gekennzeichnet, dass die gemäss einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 isolierten Mikroorganismen gegebenenfalls von den Antikörpern und den C1q-Mole- külen getrennt werden, kloniert und gegebenenfalls in einem geeigneten Wachstumsmedi- um gezüchtet werden.
12. Set zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, umfassend eine Suspension einer Mehrzahl lebensfähiger Mikroorganismen, die eine oder mehrere Mikroorganismen enthalten, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, welche mindestens eine Antigen-Art an ihrer Oberfläche aufweisen, eine Suspension von Antikörpern, welche an die mindestens eine Antigen-Art binden, und mindestens eine Ciq-Molekul-Art
13. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 11 zur Identifizierung und Iso- lierung von Antigenen.

HIEZU 2 BLATT ZEICHNUNGEN