CZ304211B6 - Humanizovaná protilátka, její fragment a jejich použití, polynukleová kyselina, expresní vektor, buňka a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Je popsána humanizovaná protilátka, která s váže na epitop obsažený mezi aminokyselinami v pozicích 13 a 28 peptidu A.beta., její imunologicky účinný fragment a jejich použití pro výrobu léčiva, dále pak polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující lehký nebo těžký řetězec humanizované protilátky nebo její imunologicky účinný fragment, expresní vektor pro expresi protilátky nebo jejího fragmentu, buňka, která je transfektována dvěma shora zmíněnými expresními vektory, jakož i farmaceutický prostředek obsahující takovou protilátku nebo její fragment. Řešení umožňuje způsob pro profylaktickou nebo terapeutickou léčbu stavů charakterizovaných tvorbou amyloidových plaků.

Description

Humanizovaná protilátka, její fragment a jejich použití, polynukleová kyselina, expresní vektor, buňka a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká humanizované protilátky, které se váže na epitop obsažený mezi aminokyselinami v pozicích 13 až 28 peptidů Αβ, jejího imunologicky účinného fragmentu ajejich použití pro výrobu léčiva, polynukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci kódující lehký nebo těžký řetězec humanizované protilátky nebo jejího imunologicky účinného fragmentu, expresního vektoru pro expresi protilátky nebo jejího fragmentu, buňky, která je transfektována dvěma svrchu zmíněnými expresními vektory, jakož i farmaceutického prostředku obsahujícího takovou protilátku nebo její fragment.

Dosavadní stav techniky

Mnoho stavů, které vedou ke kognitivním deficitům, mrtvicím, mozkovému krvácení a celkovému mentálním zhoršení je patrně asociováno s neuritickými a cerebrovasculámími plaky v mozku, které obsahují amyloidový beta peptid (Αβ). Mezi takové stavy patří preklinická a klinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a preklinická a klinická cerebrální amyloidová angiopatie (CAA). Amyloidové plaky jsou tvořeny z amyloidových beta peptidů. Tyto peptidy cirkulují v krvi a v mozkomíšním moku (CSF), obvykle ve formě komplexů s lipoproteiny. Αβ peptid v cirkulující formě je složen z 39 až 43 aminokyselin (nejčastěji z 40 nebo 42 aminokyselin), které vznikají ze štěpení společného prekursorového proteinu, amyloidového prekursorového proteinu, který se často označuje jako APP. Některé formy solubilního A jsou sami o sobě neurotoxické a mohou určovat závažnost neurodegenerace a/nebo kognitivní deficit (McLean, C. A., et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860-866; Lambert, M. P„ et al. (1998) 95:6448-6453; Naslund, J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571).

Důkazy naznačují, že A může být transportován mezi mozkem a krví (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, Β. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; Shibata M., et al., J. Clin. Invest. (2000) 106:1489-1499). Dále, Αβ v plakách je v rovnováze se solubilním Αβ v mozku a v krvi (Kawarabayashi T, et al., J. Neurosci. (2001)21:372-381).

Jak bylo popsáno v PCT přihlášce US 00/35681 a U.S. pořadové č. 09/153,130, které jsou zde uvedeny jako odkazy, celkové cirkulující hladiny A peptidů v CSF jsou podobné u normálních jedinců a u jedinců predisponovaných k příznakům Alzheimerovy nemoci. Nicméně, hladiny Αβ42 jsou v průměru nižší u jedinců s Alzheimerovou nemocí (Nitsch, R. M., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). Je známo, že Αβ₄₂ je více náchylný kagregaci než Αβ₄₀, a když ktomu dojde, vznikají nežádoucí následky jako je depozice Αβ v amyloidových plakách, konverze Αβ na toxické solubilní formy, poškození nervových buněk a poruchy chování, jako je demence (Golde, Τ. E., et al., Biochem. Biophys. Acta.(2000) 1502:172-187).

Způsoby pro indukci imunitní reakce pro redukci amyloidových depozit jsou popsány v PCT publikaci WO 99/27 944 publikované 10.6.1999. Přihláška uvádí, že kompletní agregovaný Αβ peptid může být užitečným imunogenem. imunogen. Podání Αβ fragmentu (aminokyseliny 1328) konjugovaného na ovčí anti-myší IgG nezpůsobuje žádnou změnu v ukládání amyloidu v kortexu, a pouze u jednoho zvířete z devíti, kterým byl podán konjugát Αβ 13-28 fragmentu, vykazovalo určitou lymfoproliferaci v reakci na Αβ40. Přihláška také naznačuje, že protilátky, které se specificky váží na Αβ peptid, mohou být použity jakc terapeutická činidla. Nicméně, toto se jeví jako spekulace, protože data podporující tuto hypotézu odrážejí protokoly, které zahrnují aktivní imunizaci za použití, například, Αβ₄₂. Peptidy jsou podány pomocí adjuvans ajsou určeny

- 1 CZ 304211 B6 titry protilátky indukované imunizací, stejně jako koncentrace Αβ peptidu a prekursorového peptidu. Přihláška silně naznačuje, že Αβ plak musí být redukován pro zmírnění příznaků Alzeimerovi nemoci, a že pro úspěšnou redukci Αβ plaku jsou nutné procesy zprostředkované buňkami.

WO 99160024, publikovaná 25.11.1999, se týká způsobů pro odstranění amyloidu za použití anti-amyloidové protilátky. Nicméně, je uvedeno, že mechanismus využívá schopnosti anti-Αβ protilátky vázat se na pre-existující amyloidová deposita (tj. plaky) a způsobit následnou lokální mikrogliální reakci na lokalizovaných plakách. Tento mechanismus nebyl ověřen in vivo. Tato přihláška dále uvádí, že aby byly účinné proti Αβ plakům, musí pronikat anti-Αβ protilátky do mozkového parenchymu a překonávat hematoencefalickou bariéru.

Několik PCT přihlášek, které se týkají pokusů o kontrolu amyloidových plaků, bylo publikováno 7.12.2000. WO 00/72 880 popisuje významnou redukci plaků v kortexu a hippocampu vtransgenním myším modelu Alzheimerovy nemoci při léčbě N-terminálních fragmentů Αβ peptidů a protilátek, které se váží na tyto fragmenty, ale ne při léčbě Αβι₃_₂₈ fragmentem konjugovaným na ovčí anti-myší IgG nebo při použití protilátky proti 13-28 fragmentu, protilátky 266. Bylo zjištěno, že protilátky proti N-konci překonávají hematoencefalickou bariéru a indukují fagocytózu amyloidových plaků v pokusech in vitro.

WO 00/72 876 popisuje v podstatě to samé co WO 00/72 880 a týká se imunizace složkami amyloidových fíbril samotnými.

WO 00/77 178 popisuje protilátky, které katalyzují hydrolýzu D-amyloidu, včetně protilátek namířených proti směsi fenylalanin-statinových přechodných sloučenin Cys-Aβlo-₂5 statin Phei₉-Phe₂o a Cys-Αβ i o- ₂? statin Phe₂₀-Ala₂i a protilátky proti Αβ _i025 s redukovanou amidovou vazbou mezi Phe_l9 a Phe₂₀. Tato přihláška zmiňuje sekvestrování Αβ, ale jedná se o spekulaci, protože není uveden žádný důkaz takového sekvestrování. Dále, přihláška neuvádí žádný důkaz in vivo, že podání protilátky způsobuje vylučování Αβ z centrálního nervového systému, interferuje s tvorbou plaků, redukuje tvorbu plaků, tvoří komplexy mezi protilátkou a Αβ ve tkáních nebo ovlivňuje kognitivní funkce.

Bylo zjištěno, že jednou dráhou Αβ metabolismu je transport z CNS do plasmy (Zlokovic, Β. V., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883). Dále bylo zjištěno, že Αβ v plasmě může pronikat přes hematoencefalickou-bariéru a vstupovat do mozku (Zlokovic, Β. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Také bylo zjištěno, že podání některých polyklonálních a monoklonálních Αβ protilátek snižuje deponování Αβ v amyloidových plakách v APPV717F transgenním myším modelu Alzheimerovy nemoci (Bard, F., et al., Nátuře Med. (2000) 6:916-9 (19); nicméně, uvádělo se, že toto je způsobeno tím, že některé anti—Αβ protilátky procházející hematoencefalickou-bariérou stimulují fagocytosu amyloidových plaků mikrogliemi. V Bardových pokusech testy na řezech mozku ex vivo ukázaly, že přítomnost Αβ protilátky, společně s exogenně přidanými mikrogliemi, indukuje fagocytosu Αβ, což vede k odstranění Αβ depozit.

Koncentrace jak solubilního Αβ₄₀, tak Αβ₄₂ v CSF a krvi mohou být snadno zjištěny za použití standardních testů za použití protilátky namířené proti epitopům v Αβ řetězci. Takové testy jsou popsány, například, v patentech US 5 766 846; US 5 837 672; a US 5 593 846. Tyto patenty popisují produkci myší monoklonální protilátky k centrální doméně Αβ peptidu, ta obsahuje epitopy okolo a včetně pozic 16 a 17. Také byly popsány protilátky namířené proti N-terminálnímu regionu. Bylo zjištěno, že některé monoklonální protilátky jsou imunoreaktivní s pozicemi 13-28 Αβ peptidu; tyto se neváží na peptid obsahující pozice 17-28, a proto - podle uvedených patentů - že tyto protilátky se váží na tento region, včetně pozic 16-17 (místo alfa-sekretasy). Mezi protilátky, o kterých je známo, že se váží na region mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ, patří myší protilátky 266, 4G8 a 1C2.

Neočekávaně jsme zjistili, že podání 266 protilátky velmi rychle a téměř úplně obnovuje kognitivní funkce (paměť) u 24-měsíčních hemizygotních transgenních myší (APP V717F). Dále. protilátka nemá vlastnosti, které se v oboru uvádějí jako nutné proto to, aby byla protilátka účinná při léčbě Alzheimerovy nemoci, Downova syndromu a jiných onemocnění souvisejících s Αβ peptidem. K našemu překvapení jsme pozorovali, že protilátky, které se váží na Αβ mezi pozicemi 13 a 28 (266 a 4G8), jsou schopné sekvestrovat solubilní formy Αβ z vázaných, cirkulujících forem v krvi, a že periferní podání protilátky 266 vede k rychlému vylučování relativně velkých množství Αβ peptidů zCNS do plasmy. Toto vede ke změně klírens solubilního Αβ. prevenci tvorby plaků, a - což je nejvíce překvapivé - ke zlepšení kognitivních funkcí, i bez nutné redukce Αβ amyloidových plaků, jakéhokoliv významného překonávání hematoencefalické bariéry, vazby na plaky, aktivace buněčných mechanismů nebo vazby s vysokou afinitou na agregovaný Αβ.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka nebo její imunologicky účinný fragment, jako je F_ab, F_ab, nebo F_(ab-₎₂, která se specificky váže na epitop obsažený mezi aminokyselinami 13 a 28 molekuly Αβ, a obsahuje

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce, majícího následující aminokyselinové sekvence:

CDR1 lehkého řetězce:

¹ 5 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) ; nebo

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:15)

CDR2 lehkého řetězce:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a CDR3 lehkého řetězce:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO:3) a sekvence úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce;

a

b) těžký řetězec obsahující tři CDR těžkého řetězce, mající následující aminokyselinové sekvence:

-3 CZ 304211 B6

CDR1 těžkého řetězce:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO:4)

CDR2 těžkého řetězce:

10 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO:5); nebo

10 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO:16) a CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6) a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka nebo její fragment, kde CDR1 lehkého řetězce je

5 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) a CDR2 těžkého řetězce je ¹ 5 ₁₀ 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO:5)

Jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka nebo její fragment, ve které humanizovaný variabilní region lehkého řetězce obsahuje následující sekvenci:

-4CZ 304211 B6

1 Asp

Xaa

Val

Met

5 Thr

Gin

Xaa

Pro

Leu

10 Ser

Leu

Pro

Val

Xaa

15 Xaa

Gly

Gin

Pro

Al a

20 Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

25 Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

30 Xaa

Tyr

Ser

Asp

Gly

35 Asn

Ala

Tyr

Leu

His

40 Trp

Phe

Leu

Gin

Lys

45 Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

50 Xaa

Leu

Leu

Ile

Tyr

55 Lys

Val

Ser

Asn

Arg

60 Phe

Ser

Gly

Val

Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

70 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

80 Ile

Ser

Arg

Val

Glu

85 Ala

Glu

Asp

Xaa

Gly

90 Val

Tyr

Tyr

Cys

Ser

95 Gin

Ser

Thr

His

Val

100 Pro Trp

Thr

Phe

Gly

105 Xaa

Gly

Thr

Xaa

Xaa

110 Glu

Ile

Lys

Arg

(SEQ ID

NO: 7)

kde:

Xaa v pozici 2 je Val nebo Ile:

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je Ile nebo Val;

io Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly;

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu;

a variabilní region těžkého řetězce obsahuje následující sekvenci:

1 Xaa

Val

Gin

Leu

5 Val

10

15 Gly

Glu

Xaa

Gly

Gly Gly

Leu

Val

Gin

Pro

20

25

30

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

35

40

45

Arg

Tyr

S e r

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

-5 CZ 304211 B6

55 60

Xaa

Leu

Val

Ala

Gin

Ile

Asn

Ser

Val

Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Xaa

Val

65 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

70 Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

75 Xaa

Xaa

Asn

Thr

Leu

80 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

85 Ser

Leu

Arg

Ala

Xaa

90 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

95 Tyr

Cys

Ala

Ser

Gly

100 Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

105 Gly

Thr

Xaa

Val

Thr

110 Val

Ser

Ser

(SEQ ID

NO: 8

kde:

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Glu, Val, Asp, nebo Ser;

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val nebo Thr;

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Ještě jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka nebo její fragment, která obsahuje variabilní region lehkého řetězce se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:9 a variabilní region těžkého řetězce uvedený v SEQ ID NO: 10. Přitom zvláště výhodným provedením tohoto vynálezu je humanizovaná protilátka nebo její fragment, která obsahuje lehký řetězec se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec uvedený v SEQ ID NO: 12.

Předmětem tohoto vynálezu je dále fragment humanizované protilátky uvedený svrchu.

Jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená humanizovaná protilátka nebo fragment, kde jde o imunoglobulin izotypu IgG 1.

Ještě jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená humanizovaná protilátka nebo fragment, kde protilátka nebo její fragment je produkován v hostitelské buňce vybrané ze souboru zahrnujícího myelomové buňky, ovariální buňky čínského křečka, ovariální buňky syrského křečka a buňky lidské embryonální ledviny.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující lehký řetězec nebo těžký řetězec svrchu uvedené humanizované protilátky nebo její imunologicky účinný fragment.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující variabilní region lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 9. Přitom zvláště výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující variabilní region těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 10 nebo svrchu uvedená polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující lehký řetězec uvedenou v SEQ ID NO: 11 nebo svrchu uvedená polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující těžký řetězec uvedenou v SEQ ID NO: 12.

-6CZ 304211 B6

Jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující lehký řetězec nebo těžký řetězec humanizované protilátky nebo jejich fragment.

Ještě jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená polynukleová kyselina, která po expresi ve vhodné hostitelské buňce vede k zisku svrchu uvedené protilátky nebo jejímu fragmentu.

Předmětem tohoto vynálezu je expresní vektor pro expresi svrchu uvedené protilátky nebo jejího fragmentu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující uvedenou protilátku nebo fragment.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž buňka, která je transfektovaná svrchu uvedeným expresním vektorem.

Jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená buňka, která je transfektovaná dvěma svrchu zmíněnými expresního vektory, kde první vektor obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující lehký řetězec a druhý vektor obsahuje sekvenci kódující těžký řetězec. Zvláště výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedený expresní vektor pro expresi protilátky nebo jejího fragmentu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující uvedenou protilátku nebo fragment. Jiným zvláště výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu uvedená buňka, která je transfektovaná zde uvedeným expresním vektorem nebo svrchu uvedená buňka, která je transfektovaná dvěma expresními vektory, kde první vektor obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující lehký řetězec a druhý vektor obsahuje sekvenci kódující těžký řetězec.

Jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je buňka, která je schopna exprese svrchu zmíněné lidské protilátky nebo jejího fragmentu.

Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje svrchu uvedenou humanizovanou protilátku nebo její fragment a farmaceuticky přijatelné přísady.

Předmětem tohoto vynálezu je použití svrchu uvedené humanizované protilátky nebo jejího fragmentu pro výrobu léčiva pro léčbu klinické nebo preklinické Alzheimerovy nemoci, Downova syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatie, dále pro výrobu léčiva pro léčbu, prevenci nebo revertování zhoršení kognitivních funkcí při klinické nebo preklinické Alzheimerovy nemoci, Downově syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatii, stejně jako pro výrobu léčiva pro léčbu Alzheimerovy nemoci.

Dále jsou uvedeny detailnější údaje k předmětu přihlášky a také údaje ilustrující vynález v jeho plné šíři.

Vynález poskytuje humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, které pozitivně ovlivňují kognitivní funkce u nemocí asociovaných s Αβ, jako je klinická nebo preklinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a klinická a preklinická cerebrální amyloidová angiopatie. Protilátky nebo jejich fragmenty nemusí pronikat hematoencefalickou bariérou, vázat se na amyloidové plaky, aktivovat buněčnou reakci nebo redukovat amyloidové plaky. Vjiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, které sekvestrují Αβ peptid z vázané, cirkulující formy v krvi, a mění klírens solubilních a vázaných forem Αβ v centrálními nervovém systému a plasmě. Vjiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde humanizované protilátky se specificky váží na epitop mezi aminokyselinami 13 a 2B Αβ molekuly. Vjiném aspektu vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde CDR jsou odvozeny od myší monoklonální protilátky 266 a kde si protilátky přibližně zachovávají vazebné vlastnosti myší protilátky a mají in vitro a in vivo vlastnosti funkčně ekvivalentní myší protilátce (sekvence SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO:6). V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde varia-7CZ 304211 B6 bilní regiony mají sekvence obsahující CDR z myší protilátky 266 a specifické lidské pracovní sekvence (sekvence SEQ ID NO:7 až SEQ ID NO: 10), kde si protilátky přibližně zachovávají vazebné charakteristiky myší protilátky a mají in vitro a in vivo vlastnosti funkčně ekvivalentní myší protilátce 266. V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde lehký řetězec má SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec má SEQ ID NO: 12.

Součástí předkládaného vynálezu jsou také polynukleotidové sekvence, které kódují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty popsané výše, vektory obsahující polynukleotidové sekvence kódující humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, hostitelské buňky transformované vektory nebo inkorporující polynukleotidy, které exprimují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, polynukleotidy, které exprimují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, farmaceutické přípravky humanizované protilátky a jejích fragmentů popsaných výše. Jsou také popsány způsoby výroby a použití těchto přípravků.

Takové humanizované protilátky ajejich fragmenty jsou použitelné pro sekvestrování Αβ u lidí; pro léčbu a prevenci nemocí a stavů charakterizovaných Αβ plaky nebo Αβ toxicity v mozku, jako je Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a cerebrální amyloidová angiopatie u člověka; pro diagnostiku těchto nemocí u člověka; a pro určení toho, zda bude lidský jedinec odpovídat na léčbu lidskou protilátkou proti Αβ.

Podání vhodné humanizované protilátky in vivo pro sekvestraci Αβ peptidů cirkulujícího v biologických tekutinách je použitelné pro preventivní a terapeutickou léčbu stavů spojených s tvorbou difusních, neuritických a cerebrovaskulárních plaků obsahujících Αβ v mozku. Humanizované protilátky, včetně jejich imunologicky reaktivních fragmentů, způsobují odstranění Αβ peptidů z makromolekulárních komplexů, které se normálně podílejí na jejich transportu v tělesných tekutinách do a z míst, ve kterých mohou být tvořeny plaky nebo kde mohou být toxické. Dále sekvestrování plasmatického Αβ peptidů pomocí protilátky nebo jejího fragmentu působí jako Jímka“, která účinně sekvestruje solubilní Αβ peptid v plasmatickém kompartmentu a indukuje přesun Αβ do plasmy z regionů v centrálním nervovém systému (CNS). Sekvestrováním Αβ v krvi se zvyšuje vylučování Αβ z mozku a brání se ukládání solubilního Αβ v insolubilních plakách a tvorbě toxických solubilních typů Αβ v mozku. Dále insolubilní Αβ v plakách, kterýje v rovnováze se solubilním Αβ, může být odstraněn z mozku prostřednictvím sekvestrace v krvi. Sekvestrováním Αβ peptidů pomocí protilátky také zvyšuje jeho vylučování z těla a inhibuje toxické účinky solubilního Αβ v mozku a vznik a další akumulaci insolubilního Αβ ve formě amyloidu v plakách. Protilátky podle předkládaného vynálezu nepronikají hematoencefalickou bariérou ve velkých množstvích (0,1 % plasmatické koncentrace). Dále humanizované protilátky nemusí při periferním podání pro dosažení účinku vyvolávat buněčnou imunitní reakci v mozku nebo cirkulaci při vazbě na Αβ peptid. Dále při periferním podání se nemusí pro dosažení účinku vázat na agregovaný Αβ peptid v mozku.

Způsob pro léčbu a pro prevenci stavů charakterizovaných tvorbou plaků obsahujících betaamyloidový protein u člověka zahrnuje podání, výhodně periferní, terapeuticky nebo proíylakticky účinného množství humanizované monoklonální protilátky nebo jejího imunologicky reaktivního fragmentu, kde tato protilátka se specificky váže na střední region Αβ peptidů. V jiném aspektu způsob pro inhibici tvorby amyloidových plaků a pro odstranění amyloidových plaků u člověka zahrnuje podání účinného množství humanizované protilátky, která sekvestruje Αβ peptid z cirkulující formy v krvi a indukuje vylučování peptidů z mozku, stejně jako mění Αβ klírens v plasmě a mozku, člověku, který potřebuje takovou inhibici.

Způsob umožňuje zastavení zhoršování kognitivních funkcí, zlepšení kognitivních funkcí, léčbu zhoršení kognitivních funkcí a prevenci zhoršení kognitivních funkcí u jedince s diagnostikovanou klinickou nebo preklinickou Alzheimerovou nemocí, Downovým syndromem nebo klinickou nebo preklinickou cerebrální amyloidovou angiopatií tím, že zahrnuje podání účinného množství humanizované protilátky danému jedinci.

-8CZ 304211 B6

Vynález také zahrnuje použití humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva, včetně dlouhodobé exprese rekombinantní sekvence protilátky nebo proti látkového fragmentu v lidských tkáních, pro léčbu, prevenci nebo reverzi Alzheimerovy nemoci, Downova syndromu nebo cerebrální amyloidové angiopatie; pro léčbu, prevenci, nebo reverzi zhoršování kognitivních funkcí při klinické nebo preklinické Alzheimerovy nemoci, Downova syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatie; nebo pro inhibici tvorby amyloidových plaků nebo působení toxických solubilních typů Αβ u člověka.

Vynález je založen na překvapivém zjištění, že během krátké doby po podání protilátky podle předkládaného vynálezu dojde k vyloučení relativně velkých množství peptidu Αβ z centrálního nervového systému do krve. Proto předkládaný vynález umožňuje způsoby pro hodnocení odpovědi lidského jedince na léčbu protilátkou, která se váže na peptid Αβ nebo jeho fragment, které zahrnují: a) podání protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; a b) měření koncentrace peptidu Αβ v krvi jedince.

Způsob pro léčbu lidského jedince protilátkou, která se váže na peptid Αβ nebo jeho fragment, zahrnuje: a) podání první dávky protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; b) během 3 hodin až 2 týdnů po podání první dávky měření koncentrace peptidu Αβ v krvi jedince; c) pokud je to nutné, vypočítání druhé dávky protilátky nebo jejího fragmentu podle výsledků z kroku b), kde druhá dávka je stejná nebo jiná než první dávka; a d) podání druhé dávky protilátky nebo jejího fragmentu.

Způsob pro hodnocení účinnosti protilátky, která se váže na peptid Αβ nebo jeho fragment, spočívající v inhibici nebo prevenci tvorby Αβ amyloidových plaků, v redukci peptidu Αβ amyloidových plaků, v redukci účinků toxických solubilních typů Αβ, nebo v léčbě stavů a onemocněni asociovaných s Αβ plaky, u člověka zahrnuje: a) získání prvního vzorku plasmy nebo CSF jedince; b) měření základní koncentrace Αβ v prvním vzorku; c) podání protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; d) během 3 hodin až 2 týdnů po podání protilátky nebo jejího fragmentu získání druhého vzorku plasmy nebo CSF jedince; a e) měření koncentrace Αβ ve druhém vzorku; kde účinnost je hodnocena podle množství Αβ navázaného na protilátku v krvi a podle koncentrace ΑβνΟΞΡ.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje procento peptidu Αβ v lidském mozkomíšníin moku, který se získá přes dialyzační membránu pomocí MAb 266 v závislosti na hraniční hodnotě molekulové hmotnosti dialyzační membrány.

Obr. 2 ukazuje koncentrace ΑβΤοΙηΙ v plasmě APP V717F transgenních myší po injekci buď 200 μg, nebo 600 μg MAb 266 v závislosti na čase.

Obr. 3A ukazuje množství uložené Αβ peptidu v kortexu APP C717F transgenních myší léčených salinickým roztokem, myším IgG, nebo MAb 266. Obr. 3E> ukazuje korelaci těchto výsledků s původem.

Obr. 4 ukazuje polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 lehkého řetězce z plasmidu pVk-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovaném humanizovaném; 266 lehkém řetězci (což odpovídá SEQ ID NO: 11 ve zralém stavu).

Obr. 5 ukazuje polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 těžkého řetězce z plasmidu pVgl-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovaném humanizovaném! 266 těžkém řetězci (což odpovídá SEQ ID NO: 12 ve zralém stavu).

-9CZ 304211 Bó

Obr. 6 je mapa plasmidů pVk-Hu266.

Obr. 7 je mapa plasmidů pVgl-Hu266.

Příklady provedení vynálezu

Αβ peptidy, které cirkulují v biologických kapalinách, představují karboxy terminální region prekursorového proteinu kódovaného na chromosomu 21. Z výsledků pokusů in vitro bylo popsáno, že Αβ peptid má špatnou rozpustnost ve fyziologických roztocích, protože obsahuje řetězec hydrofobních aminokyselin, které jsou součástí regionu, který zakotvuje jeho delší prekursor do buněčných lipidových membrán. Proto není překvapivé, že cirkulující Αβ peptid je za normálních okolností v komplexu sjinými skupinami, které brání jeho agregaci. Toto způsobuje obtíže při detekci cirkulujících Αβ peptidů v biologických kapalinách.

Výše uvedené patenty (patenty US 5 766 846; US 5 837 672 a US 5 593 846) popisují přípravu protilátky, včetně monoklonální protilátky, označené jako klon 266, která je namířena ka specificky se váže na peptid obsahující aminokyseliny 13-28 Αβ peptidů. Předkladatelé vynálezu zjistili, že protilátky, které se váží na tento region, oproti protilátkám, které se váži na jakékoliv jiné místo aminokyselinové sekvence Αβ, jsou schopné velmi účinně sekvestrovat solubilní Αβ peptid z makromolekulových komplexů. Tato sekvestrace způsobuje vylučování Αβ peptidů z CNS, mění jeho klírens v CNS a plasmě, a redukuje jeho schopnost tvořit plaky. Proto jsou protilátky s touto specifícitou, modifikované tak, aby byla snížena jejich imunogenicita pomocí přeměny na humanizované formy, možnou léčbou - jak profylaktickou, tak terapeutickou, stavů spojených s tvorbou beta-amyloidových plaků. Mezi takové stavy patří, jak bylo uvedeno výše, preklinická a klinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a preklinická a klinická cerebrální amyloidová angiopatie.

Termín „léčba“, jak je zde použit, zahrnuje terapeutickou léčbu, při které již existuje léčené onemocnění, stejně jako profylaktickou léčbu - tj. prevenci nebo zmírnění možného budoucího onemocnění.

Termín „monoklonální protilátky, které se váží na střední region Αβ peptidů“, označuje monoklonální protilátky (MAb nebo MAbs), které se váží na aminokyselinovou sekvenci představující epitop obsažený mezi pozicemi 13-28 Αβ. Nemusí být pokryt celý region. Pokud se protilátka váže na alespoň epitop v tomto regionu (zejména včetně místa pro x-sekretasu 16-17 nebo místa, na které se váže protilátka 266), tak je protilátka účinná ve způsobu podle předkládaného vynálezu.

Termín „protilátka“ označuje monoklonální protilátku jako takovou, nebo její imunologicky účinný fragment, jako je F_ab, F_ab- nebo F_{(ab )}2. V některých kontextech jsou fragmenty specificky uvedeny; nicméně, je třeba si uvědomit, že bez ohledu na to, zda jsou uvedeny fragmenty, zahrnuje termín „protilátka“ takové fragmenty, stejně jako jednořetězcové formy. Pokud si protein zachovává schopnost specifické vazby na zamýšlený cíl, a v tomto případě schopnost sekvestrace Αβ peptidů z proteinových nosičů v krvi, je zahrnut v termínu „protilátka“. Termín „protilátka“ také zahrnuje, například, jednořetězcové formy, obvykle označované jako Fv regiony, protilátky s touto specifícitou. Výhodně, ale ne nutně, jsou protilátky použitelné v předkládaném vynálezu produkovány rekombinantně, protože při úpravě typické myší nebo jiné non-lidské protilátky s vhodnou specifícitou je nutná její přeměna na humanizovanou formu. Protilátky mohou a nemusí být glykosylované, ačkoliv glykosylované protilátky jsou výhodné. Protilátky jsou správně zesítěné prostřednictvím disulfidových vazeb, jak je dobře známo v oboru.

- 10CZ 304211 B6

Je známo, že základní strukturální jednotka protilátky je tvořena tetramerem. Každý tetramer je tvořen dvěma identickými páry polypeptidových řetězců, kde každý pár je tvořen jedním „lehkým“ (přibližně 25 kDa) a jedním „těžkým“ řetězcem (přibližně 50 až 70 kDa). Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní region velikosti přibližně 100 až 110 nebo více aminokyselin primárně odpovědný za rozpoznávání antigenu. Karboxy-koncová část každého řetězce definuje konstantní region primárně odpovědný za efektorové funkce.

Lehké řetězce se dělí na gamma, mu, alfa a lambda. Těžké řetězce se dělí na gamma, mu, alfa, delta a epsilon, a definují izotyp protilátky jako IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, v příslušném pořadí. V lehkých a těžkých řetězcích jsou variabilní a konstantní regiony spojeny „J“ regionem tvořeným přibližně 12 nebo více aminokyselinami, kde těžký řetězec také obsahuje „T“ region tvořený přibližně 10 dalšími aminokyselinami.

Variabilní regiony každého lehkého/těžkého páru řetězců tvoří vazebné místo protilátky. Proto má intaktní protilátka dvě vazebná místa. Řetězce mají stejnou obecnou strukturu tvořenou dvěma relativně konzervovanými pracovními regiony (FR) spojenými třemi hypervariabilními regiony, které se také označují jako regiony určující komplementaritu neboli CDR. CDR ze dvou řetězců každého páru jsou uspořádány pomocí pracovních regionů, což umožňuje vazbu na specifický epitop. Od N- konce k C-konci obsahují jak lehký, tak těžký řetězec domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé doméně je v souladu s dobře známou konvencí (KApat „Sequences of Proteins of imunological interest“ National Institutes of Health, Bethesda, Md„ 1987 a 1991; Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987); Chothia, et al., Nátuře 342:878-883 (1989)).

Jak je v oboru známo, mohou být monoklonální protilátky snadno připraveny s vhodnou specificitou za použití standardních technik imunizace savců, přípravy hybridomů z buněk produkujících protilátky od uvedených savců a kultivací hybridomů nebo imortalizovaných buněk pro hodnocení jejich specificity. V tomto případě mohou být protilátky připraveny imunizací člověka, králíka, krysy nebo myší peptidem reprezentujícím epitop obsahující 13-28 region Αβ peptidu nebo jeho vhodný subregion. Materiály pro rekombinantní úpravu mohou být získány získáním nukleotidové sekvence kódující požadovanou protilátkou zhybridomů nebo jiných buněk, které jí produkují. Tato nukleotidová sekvence za zisku nukleotidu v humanizované formě.

Termín „humanizovaná protilátka“ označuje protilátku, která je složena částečně nebo zcela z aminokyselinové sekvence odvozené od lidské protilátky pozměněním sekvence protilátky mající non-lidské regiony určující komplementaritu (CDR). Nejjednodušší alterace může spočívat v substituci konstantního regionu lidské protilátky za myší konstantní region, za vzniku lidské/myší chiméry, která může mít dostatečně nízkou imunogenicitu pro to, aby byla přijatelná pro farmaceutické použití. Výhodně jsou variabilní region protilátky a i CDR také humanizované za použití technik, které jsou dobře známé v oboru. Pracovní regiony variabilních regionů jsou substituované příslušnými lidskými pracovními regiony za ponechání non-lidských CDR v podstatě beze změn, nebo nahrazením CDR sekvencí odvozenou z lidského genomu. Plně lidské protilátky jsou produkované geneticky modifikovanými myšmi, jejichž imunitní systémy byly pozměněny tak, aby odpovídaly lidským imunitním systémům. Jak bylo uvedené výše, je ve způsobech podle předkládaného vynálezu dostačující použití imunologicky specifického fragmentu protilátky, včetně fragmentů reprezentujících jednořetězcové formy.

Humanizované protilátka opět označuje protilátku obsahující lidský pracovní region, alespoň jeden CDR z non-lidské protilátky, a ve které jakýkoliv přítomný konstantní region je v podstatě identický s lidským imunoglobulinovým konstantním regionem, tj., alespoň přibližně z 85 až 90 %, výhodně alespoň z 95 % identický. Proto jsou všechny části humanizované protilátky, s výjimkou CDR, v podstatě identické s příslušnými částmi jedné nebo více přirozených lidských imunoglobulinových sekvencí. Například, humanizovaný imunoglobulin obvykle neoznačuje protilátku tvořenou chimérickým myším variabilním regionem/lidským konstantním regionem.

Humanizované protilátky mají alespoň tři potenciální výhody před non-lidskými a chimérickými protilátkami pro použití v lidské terapii:

1) vzhledem ktomu, že efektorová část je lidská, mohou lépe interagovat s lidským imunitním systémem (například účinněji likvidovat cílové buňky pomocí cytotoxicity závislé na komplementu (CDC) nebo buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC)).

2) Lidský imunitní systém by neměl rozpoznávat pracovní region nebo C region humanizované protilátky jako cizí a proto by protilátková reakce proti takové injikované protilátce měla být menší než proti totálně cizorodé non-lidské protilátce nebo a částečně cizorodé chimérické protilátce.

3) Bylo popsáno, že injikované non-lidské protilátky mají poločas v lidské cirkulaci mnohem kratší než je poločas lidských protilátek. Injikované humanizované protilátky budou mít poločas v podstatě identický jako přirozené lidské protilátky, což umožní podání nižších dávek a méně často.

Návrh humanizovaných imunoglobulinů může být proveden následujícím způsobem. Když spadá aminokyselina do následující kategorie, tak může být aminokyselina pracovního rámce lidského imunoglobulinů (akceptorového imunoglobulinů) nahrazena aminokyselinou pracovního regionu z on-lidského imunoglobulinů poskytujícího CDR (donorového imunoglobulinů):

(a) aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinů je neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, zatímco odpovídající aminokyselina v donorovém imunoglobulinu je typická pro lidský imunoglobulin v této pozici;

(b) pozice aminokyseliny je bezprostředně sousedící s jedním z CDR; nebo (c) jakýkoliv atom vedlejšího řetězce pracovní aminokyseliny je ve vzdálenosti přibližně 5 až 6 angstromů (centrum-centrum) od jakéhokoliv atomu CDR aminokyseliny ve třírozměrném modelu imunoglobulinů (Queen, et al., op. cit., a Co., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]. Když je každá aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinu a příslušná aminokyselina v donorovém imunoglobulinů neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, tak je aminokyselina nahrazena aminokyselinou typickou pro lidský imunoglobulin v této pozici.

Výhodná humanizovaná protilátka je humanizovaná forma myší protilátky 266. CDR humanizované 266 mají následující aminokyselinové sekvence:

- 12CZ 304211 B6 lehký řetězec CDR1:

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lle Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) lehký řetězec CDR2:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:2) lehký řetězec CDR3:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO:3) těžký řetězec CDR1:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO:4) těžký řetězec CDR2:

10 15

Gin lle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO:5) a těžký řetězec CDR3:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6).

Výhodný variabilní region lehkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských Vk segmentů DPK18 a J segmentu Jkl, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

1

5

10

15

Asp

Xaa

Val

Met

Thr

Gin

Xaa

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Xaa

Xaa

20

25

30

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

lle

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Xaa

35

40

45

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Ala

Tyr

Leu

His

Trp

Phe

Leu

Gin

Lys

Pro

- 13 CZ 304211 B6

Gly

Gin

Ser

Pro

50 Xaa

Leu

Leu

lle

Tyr

55 Lys

Val

Ser

Asn

Arg

60 Phe

Ser

Gly

Val

Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

70 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

80 lle

Ser

Arg

Val

Glu

85 Ala

Glu

Asp

Xaa

Gly

90 Val

Tyr

Tyr

Cys

Ser

95 Gin

Ser

Thr

His

Val

100 Pro Trp

Thr

Phe

Gly

105 Xaa

Gly

Thr

Xaa

Xaa

110 Glu

lle

Lys

Arg

(SEQ ID

NO:7)

kde:

Xaa v pozici 2 je Val nebo lle;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je lle nebo Val;

io Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly;

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu;

Výhodný variabilní region těžkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských VH segmentů DP53 a J segmentu JH4, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

1 Xaa

Val

Gin

Leu

5 Val

Glu

Xaa

10 Gly Gly Gly

Leu

Val

Gin

Pro

15 Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

20 Leu

Ser

Cys

Ala

25 Ala Ser

Giy

Phe

Thr

Phe

30 Ser

Arg

Tyr

Ser

Met

35 Ser

Trp

val

Arg

40 Gin Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

45 Leu

Xaa

Leu

Val

Ala

50 Gin

lle

Asn

Ser

55 Val Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

60 Tyr

Pro

Asp

Xaa

Val

65 Lys

Gly

Arg

Phe

70 Thr lle

Ser

Arg

Asp

Asii

75 Xaa

Xaa

Asn

Thr

Leu

80 Tyr

Leu

Gin

Met

85 Asn Ser

Leu

Arg

Ala

Xaa

90 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

95 Tyr

Cys

Ala

Ser

100 Gly Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

105 Gly

Thr

Xaa

Val

Thr

110 Val

Ser

Ser

(SEQ ID

NO: 8)

- 14CZ 304211 B6 kde:

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Glu, Val, Asp, nebo Ser;

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val nebo Thr;

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a ío Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Zejména výhodný variabilní region lehkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských Vk segmentů DPK18 a J segmentu Jkl, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

10 15

Asp Val

Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu

20

25

30

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Ile

Tyr

Ser

Asp

Gly

35 Asn

Ala

Tyr

Leu

His

40 Trp

Phe

Leu

Gin

Lys

45 Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

50 Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

55 Lys

Val

Ser

Asn

Arg

60 Phe

Ser

Gly

Val

Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

cly

70 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

80 Ile

Ser

Arg

Val

Glu

85 Ala

Glu

Asp

Val

Gly

90 Val

Tyr

Tyr

Cys

Ser

95 Gin

Ser

Thr

His

Val

100 Pro Trp

Thr

Phe

Gly

105 Gin

Gly

Thr

Lys

Val

110 Glu

Ile

Lys

Arg

(SEQ ID

NO: 9)

Zejména výhodný variabilní region těžkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských VH segmentů DP53 a J segmentu JH4.

- 15 CZ 304211 B6

1 Glu

Val

Gin

Leu

5 Val

Glu

Ser

Gly

10 Gly Gly

Leu

Val

Gin

Pro

15 Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

20 Leu

Ser

Cys

Ala

25 Ala Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

30 Ser

Arg

Tyr

Ser

Met

35 Ser

Trp

Val

Arg

40 Gin Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

45 Leu

Glu

Leu

Val

Ala

50 Gin

Ile

Asn

Ser

55 Val Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

60 Tyr

Pro

Asp

Thr

Val

65 Lys

Gly Arg

Phe

70 Thr Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

75 Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

80 Tyr

Leu

Gin

Met

85 Asn Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

90 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

95 Tyr

Cys

Ala

Ser

100 Gly Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

105 Gly

Thr

Leu

Val

110 . Thr Val

1 Ser Ser

(SEQ ID NO·-:

Výhodný lehký řetězec pro humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má amino kyselinovou sekvenci:

1 Asp

Val

Val

Met

5 Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

10 Ser

Leu

Pro

Val

Thr

15 Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

20 Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

25 Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

30 Ile

Tyr

Ser

Asp

Gly

35 Asn

Ala

Tyr

Leu

His

40 Trp

Phe

Leu

Gin

Lys

45 Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

50 Wrg'

Leu

Leu

Ile

Tyr

55 Lys

Val

Ser

Asn

Arg

60 Phe

Ser

Gly

Val

Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

70 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

80 Ile

Ser

Arg

Val

Glu

85 Ala

Glu

Asp

Val

Gly

90 Val

Tyr

Tyr

Cys

Ser

95 Gin

Ser

Thr

His

Val

100 Pro Trp

Thr

Phe

Gly

105 Gin

- 16CZ 304211 B6

Gly

Thr

Lys

Val

110 Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115 Val Ala

A.la

Pro

Ser

120 Val

Phe

Ile

Phe

Pro

125 Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130 Leu Lys

Ser

Gly

Thr

135 Ala

Ser

Val

Val

Cys

140 Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145 Tyr Pro

Arg

Glu

Ala

150 Lys

Val

Gin

Trp

Lys

155 Val

Asp

Asn

Ala

Leu

160 Gin Ser

Gly

Asn

Ser

165 Gin

Glu

Ser

Val

Thr

170 Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

175 Asp Ser

Thr

Tyr

Ser

180 Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

185 Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

190 Asp Tyr

Glu

Lys

His

195 Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

200 Glu

Val

Thr

His

Gin

205 Gly Leu

Ser

Ser

Pro

210 Val

Thr

Lys

Ser

Phe

215 Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

(SEQ ID

NO:11}

Výhodný těžký řetězec pro humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má amino kyselinovou sekvenci:

1 Glu

Val

Gin

Leu

5 Val

Glu

Ser

10 Gly Gly Gly Leu

Val

Gin

Pro

15 Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

20 Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

25 Ser Gly

Phe

Thr

Phe

30 Ser

Arg

Tyr

Ser

Met

35 Ser

Trp

Val

Arg

Gin

40 Ala Pro

Cíly

Lys

Gly

45 Leu

Glu

Leu

Val

Ala

50 Gin

Ile

Asn

Ser

Val

55 Gly Asn

Ser

Thr

Tyr

60 Tyr

Pro

Asp

Thr

Val

65 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

70 Ile Ser

Arg

Asp

Asn

75 Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

80 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

85 Ser Leu

Jkrg

Ala

Glu

90 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

95 Tyr

Cys

Ala

Ser

Gly

100 Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

105 Gly

Thr

Leu

Val

Thr

110 Val

Ser

Ser

Ala

Ser

115 Thr Lys

Gly

Pro

Ser

120 Val

- 17CZ 304211 B6

Phe

Pro

Leu

Ala

125 Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

130 Thr ser

Gly

Gly

Thr .

135 Ala

Ala

Leu

Gly

cys

14 0 Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

145 Phe Pro

Glu

Pro

Val

150 Thr

Val

Ser

Trp

Asn

155 Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

160 Ser Gly

Val

His

Thr

16 S Phe

Pro

Ala

Val

Leu

170 Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

175 Tyr Ser

Leu

Ser

Ser

180 Val

Val

Thr

Val

Pro

185 Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

190 Thr Gin

Thr

Tyr

Ile

195 Cys

Asn

Val

Asn

His

200 Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

205 Lys Val

Asp

Lys

Lys

210 Val

Glu

Pro

Lys

Ser

215 Cys

Asp

Lys

Thr

His

220 Thr Cys

Pro

Pro

Cys

225 Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

230 Leu

Gly Gly

Pro

Ser

235 Val Phe

Leu

Phe

Pro

240 Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

245 Thr

Leu

Met

Ile

Ser

250 Arg Thr

Pro

Glu

Val

255 Thr

Cys

Val

Val

Val

260 Asp

Val

Ser

His

Glu

265 Asp Pro

Glu

Val

Lys

270 Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

275 Asp

Gly

Val

Glu

Val

280 His Asn

Ala

Lys

Thr

285 Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

290 Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

295 Tyr Arg

Val

Val

Ser

300 Val

Leu

Thr

Val

Leu

305 His

Gin

Asp

Trp

Leu

310 Asn Gly

Lys

Glu

Tyr

315 Lys

Cys

Lys

Val

Ser

320 Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

325 Ala Pro

Ile

Glu

Lys

330 Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

335 Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

340 Glu Pro

Gin

Val

Tyr

345 Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

350 Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

355 Lys Asn

Gin

Val

Ser

360 Leu

Thr

Cys

Leu

Val

365 Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

370 Ser Asp

Ile

Tkla

Val

375 Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

380 Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

385 Asn Tyr

Lys

Thr

Thr

390 Pro

Pro

Val

Leu

Asp

395 Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

400 Phe Leu

Tyr

Ser

Lys

405 Leu

Thr

Val

Asp

Lys

410 Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

415 Gly Asn

Val

Phe

Ser

420 Cys

Ser

Val

Met

His

425 Glu

Ala

Leu

His

Asn

430 His Tyr

Thr

Gin

Lys

435 Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

440 Pro

Gly

Lys

(SEQ ID

HO: 12

- 18 CZ 304211 B6

Pro lehké a těžké řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu a pro humanizovanou 266 jsou možné i jiné sekvence. Imunoglobuliny mohou obsahovat dva páry komplexů lehký řetězec/těžký řetězec, kde alespoň řetězec obsahuje jeden nebo více myších regionů určujících komplementaritu funkčně navázaných na segmenty lidského pracovního regionu.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká rekombinantních polynukleotidů kódujících protilátky, které - po expresi - obsahují CDR těžkého a lehkého řetězce z protilátky podle předkládaného vynálezu. Stejně jako pro lidský pracovní region je aminokyselinová sekvence pracovního nebo variabilního non-lidského imunoglobulinu poskytujícího CDR srovnávána s odpovídajícími sekvencemi v knihovně variabilních regionů lidského imunoglobulinu a je vybrána sekvence mající nejvyšší procento identických aminokyselinami. Příkladem polynukleotidů, které kódují polypeptidové řetězce obsahující CDR pro těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky 266. jsou uvedeny na obr. 4 a 5. V důsledku degenerace kodonů a nekritických aminokyselinových substitucí mohou být za tyto polynukleotidové sekvence zaměněny jiné sekvence. Zejména výhodné polynukleotidy podle předkládaného vynálezu kódují protilátky, které - po expresi obsahují CDR SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:6, nebo jakékoliv variabilní regiony SEQ ID NO:7 SEQ ID NO: 10, nebo lehký a těžký řetězec SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12.

Polynukleotidy budou obvykle dále obsahovat polynukleotidové sekvence řídící expresi operativně navázané na sekvence kódující humanizovaný imunoglobulin, včetně přirozeně asociovaných či heterologních promotorových regionů. Výhodně, jsou sekvence řídící expresi eukaryotické promotorové systémy ve vektorech schopných transformovat nebo transfektovat eukaryotické hostitelské buňky, ale mohou být použity také řídicí sekvence pro prokaryotické hostitelské buňky. Po inkorporaci vektoru do vhodné hostitelské buněčné linie se hostitelské buňky propagují za podmínek vhodných pro vysokou expresi nukleotidové sekvence, a, pokud je to žádoucí, může být potom proveden odběr a přečištění lehkých řetězců, těžkých řetězců, dimerů lehký/těžký řetězec nebo intaktní protilátky, jejich vazebných fragmentů nebo jiných forem imunoglobulinů.

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu schopné exprimovat požadované humanizované protilátky mohou být připraveny z mnoha různých polynukleotidů (genomové nebo cDNA, RNA, syntetických oligonukleotidů, atd.) a složek (např., V, J, D a C regionů), stejně jako za použití různých technik. Spojení vhodné genomové a syntetické sekvence je běžným způsobem produkce, ale mohou být také použity cDNA sekvence.

DNA sekvence lidského konstantního regionu mohou být isolovány za použití dobře známých technik z různých lidských buněk, ale výhodně z imortalizovaných B-lymfocytů. CDR pro produkci imunoglobulinů podle předkládaného vynálezu budou obdobně odvozeny z non-lidské monoklonální protilátky vážící se na epitop mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ peptidu, kde tyto monoklonální protilátky jsou produkovány v jakémkoliv vhodném savčím zdroji, včetně myší, králíků nebo jiných obratlovců schopných produkovat protilátky dobře známými způsoby, jak je popsáno výše. Vhodnými zdrojovými buňkami pro polynukleotidové sekvence a hostitelskými buňkami pro expresi a sekreci imunoglobulinů jsou buňky známé v oboru.

Kromě humanizovaných imunoglobulinů, které byly popsány, mohou být snadno připraveny a vyrobeny „v podstatě homologní“ modifikované imunoglobuliny, za použití různých rekombinantních DNA technik dobře známých odborníkům v oboru. Například, pracovní regiony se mohou lišit od přirozené sekvence ve struktuře primární sekvence několika aminokyselinovými substitucemi, terminálními a intermediárními adicemi a delecemi, a podobně. Dále, různé lidské pracovní regiony mohou být použity samostatně nebo v kombinaci podle jako základ pro humanizované imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu. Obecně, modifikace genů může být snadno provedena za použití různých dobře známých technik, jako je místně cílená mutagenese.

- 19CZ 304211 B6

Alternativně mohou být připraveny polypeptidové fragmenty obsahující pouze část primární protilátky, kde tyto fragmenty mají jednu nebo více aktivit imunoglobulinu (např. fixaci komplementu). Tyto polypeptidové fragmenty mohou být produkovány proteolytickým štěpením intaktní protilátky za použití způsobů dobře známých v oboru, nebo insercí stop kodonů v požadovaných pozicích do vektorů za použití místně cílené mutagenese, například za CH1, což vede k produkci F_ab fragmentů nebo za pantový region, což vede k produkci F_(ab'₎₂ fragmentů. Jednořetězcové protilátky mohou být produkovány spojením VF a VH za použití DNA linkeru.

Jak bylo uvedeno výše, kódující nukleotidová sekvence bude exprimována v hostitelských po operativním navázání sekvence na (tj., umístění zajišťujícím její funkci) sekvenci řídící expresi. Tyto expresní vektory jsou obvykle replikovatelné v hostitelských organismech buď jako episomy, nebo jako integrální součást chromosomální DNA hostitele. Obecně expresní vektory obsahují selekční markéry, např. tetracyklinový nebo neomycinový, umožňující detekci buněk transformovaných požadovanou DNA sekvencí.

E. coli je prokaryotický hostitel použitelný pro klonování polynukleotidů podle předkládaného vynálezu. Mezi další použitelné mikroorganismy patří bacilii, jako je Bacillus subtilus, a další enterobactericaea; jako je Salmonella, Serratia a různé Pseudomonas species. V těchto prokaryotických hostitelích je možno také připravit expresní vektory, které budou obsahovat sekvence řídící expresi kompatibilní s hostitelskou buňkou (např., sekvenci rozpoznávající počátek replikace). Dále, může být použit jakýkoliv počet dobře známých promotorů, jako je laktosový promotorový systém, tryptofanový (tip) promotorový systém, beta-laktamasový promotorový systém nebo a promotorový systém z fágu lambda. Promotory obvykle obsahují sekvencí řídící expresi, volitelně s operátorovou sekvencí, a obsahují sekvenci vazebného místa pro ribosom a podobně, pro iniciaci a dokončení transkripce a translace.

Další mikroby, jako jsou kvasinky, mohou být také použity pro expresi. Saccharomyces jsou výhodným hostitelem, a mohou být použity s vhodnými vektory obsahujícími sekvence řídící expresi, jako jsou promotory, včetně 3-fosfoglycerát- kinasového nebo z jiných glykolytických enzymů, sekvenci rozpoznávající počátek replikace, terminační sekvence a podobně.

Kromě mikroorganismů mohou být savčí tkáňové kultury také použity po expresi a produkci polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Eukaryotické buňky jsou opravdu výhodné, protože v oboru existuje mnoho vhodných hostitelských buněčných linií schopných secernovat intaktní imunoglobuiiny a mezi tyto linie patří CHO buněčné linie, různé COS buněčné linie, buněčné linie ovariálních buněk, HeLa buňky, výhodně myelomové buněčné linie, transformované Blymfocyty, lidské buněčné linie z embryonálních ledvin nebo hybridomy. Expresní vektory pro tyto buňky mohou obsahovat sekvence pro řízení exprese, jako je sekvence rozpoznávající počátek replikace, promotor, zesilovač transkripce, a nutná místa pro zpracování, jako jsou vazebná místa pro ribozomy, místa pro sestřih RNA, polyadenylační místa, sekvence pro ukončení transkripce. Výhodnými sekvencemi pro řízení transkripce jsou promotory získané z imunoglobulinových genů, SV40, Adenoviru, hovězího papilloma viru, cytomegalovirů a podobně.

Vektory obsahující požadovanou nukleotidovou sekvenci (např. sekvence kódující těžký a lehký řetězec a sekvence řídící expresi) mohou být přeneseny do hostitelské buňky dobře známými způsoby, které jsou vybrány podle typu hostitele. Například, pro prokaryotické buňky se běžně používá transfekce chloridem vápenatým, zatímco pro ostatní hostitelské buňky se běžně používá transfekce s fosforečnanem vápenatým nebo elektroporace.

Po expresi mohou být celé protilátky, jejich dimery, jednotlivé lehké a těžké řetězce, nebo jiné formy imunoglobulinů podle předkládaného vynálezu, přečištěny za použití standardních postupů, včetně srážení síranem amonným, iontové výměny, afinitní, reversní, hydrofobní chromatografie, gelové elektroforézy a podobně. Výhodné jsou významně přečištěné imunoglobuiiny mající alespoň přibližně 90 až 95% homogenitu, nejvýhodnější jsou pro farmaceutické použití imunoglobuiiny mající 98 až 99% nebo vyšší homogenitu. Po přečištění - částečném nebo do

-20CZ 304211 B6 požadované homogenity, mohou být polypeptidy použity terapeuticky nebo proíylakticky, jak je zde popsáno.

Protilátky (včetně imunologicky reaktivních fragmentů) jsou podávány jedincům s rizikem nebo existencí příznaků souvisejících s Αβ-peptidem, nebo s patologií související s Αβ peptidem, jako je klinická nebo preklinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom nebo klinická nebo preklinická amyloidová angiopatie, za použití standardních technik podání, výhodně za použití periferního (tj. na podání do centrálního nervového systému) pomocí intravenosní, intraperitoneální, subkutánní, pulmonální, transdermální, intramuskulární, intranasální, bukální, sublinguální aplikace nebo aplikace v čípku. Protilátky mohou být také podány přímo do komorového systému, mozkomíšního moku nebo mozkového parenchymu, a techniky pro taková podání jsou dobře známé v oboru, takže není nutné používat obtížnějších postupů. Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou účinné tehdy, když jsou podány za použití jednodušších technik, jako je podání do periferní cirkulace. Mezí výhody předkládaného vynálezu patří schopnost protilátky vykazovat příznivé účinky i tehdy, když není podána přímo do centrálního nervového systému. Kromě toho bylo zjištěno, že množství protilátky, které překonává hematoencefalickou bariéru, je <0,1 % plasmatické koncentrace a že protilátky podle předkládaného vynálezu mají schopnost sekvestrovat Αβ v periferní cirkulaci, stejně jako měnit klírens CNS a plasmatického solubilního Αβ.

Farmaceutické prostředky jsou navrženy tak, aby byly vhodné pro vybraný způsob podání, a farmaceuticky přijatelné přísady, jako jsou disperzní činidla, pufry, surfaktanty, konzervační činidla, solubilizační činidla, činidla upravující izotonicitu, stabilizační činidla a podobně jsou použita podle potřeby. Remington's Farmaceutické Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, poslední vydání, zde uvedené jako odkaz, poskytuje techniky pro přípravu farmaceutických prostředků. Zejména výhodné může být změnění rozpustnosti protilátky podle předkládaného vynálezu tak, aby byla více lipofilní, například za použití enkapsulace v liposomech nebo blokování polárních skupin.

Výhodné je periferní systémové podání intravenosní nebo intraperitoneální nebo podkožní injekcí. Vhodná vehikula pro takové injekce jsou známá. Dále může být podání provedeno přes sliznice za použití nasálního aerosolu nebo čípků. Vhodné přípravky pro taková podání jsou dobře známé a obvykle obsahují surfaktanty, které usnadňují průnik membránou. Takové surfaktanty jsou často odvozeny od steroidů nebo kationtových lipidů, jako je N-[l-(2,3-dioleoyl)propylΝ,Ν,Ν-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) nebo různé sloučeniny jako je cholesterol hemisukcinát, fosfatidylglyceroly a podobně.

Koncentrace lidské izolované protilátky v prostředcích je od přibližně 0,1 % do 15 nebo 20 % hmotnostních aje určena podle objemu kapalin, viskozity a podobně, v souladu s vybraným způsobem podání. Tak mohou být typické farmaceutické prostředky pro injekce připraveny tak, aby obsahovaly 1 ml sterilní pufrované vody a 1 až 100 mg humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu. Přípravek by měl být sterilně přefiltrován pro výrobu, nebo by měl být jiným způsobem upraven tak, aby byl mikrobiologicky přijatelný. Typický prostředek pro intravenosní infusi by měl mít objem asi 250 ml, například za použití sterilního Ringerova roztoku, a koncentrace protilátky by měla být 1 až 100 mg na ml.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být zmrazená nebo lyofilizována pro uskladnění a rekonstituci ve vhodném sterilním nosiči před použitím. Lyofilizace a rekonstituce mohou vést k různému stupni ztráty aktivity protilátky (např. u běžných imunoglobulinů mají IgM protilátky tendenci k větší ztrátě aktivity než IgG protilátky). Dávky by měly být upraveny za účelem kompenzace této ztráty. pH prostředku by mělo být takové, aby bylo dosaženo rovnováhy mezi stabilitou protilátky (chemickou a fyzikální) a komfortem pacienta při aplikaci. Obecně je tolerováno pH mezi 4 a 8.

-21 CZ 304211 B6

Ačkoliv se uvedené způsoby zdají být nejvhodnější a nejvýhodnější pro podání proteinů, jako jsou humanizované protilátky, mohou být použity i jiné způsoby podání, jako je transdermální podání a orální podání, pokud je připraven vhodný prostředek.

Dále, může být výhodné použít prostředky s řízeným uvolňováním za použití biodegradovatelných potahů a matric, nebo osmotických mini-pump, nebo systémů na bázi dextranových korálků, alginátu nebo kolagenu.

Závěrem, prostředky pro podání protilátek podle předkládaného vynálezu jsou dobře známé v oboru a mohou být vybrány z různých možností.

Typické dávky mohou být optimalizovány za použití standardních klinických technik a dávky závisí na způsobu podání a stavu pacienta.

Následující příklady ilustrují, ale nijak neomezují, předkládaný vynález.

Příklady uvedené dále využívají, mimo jiné, myší monoklonální protilátku označenou „266“, která byla původně připravena imunizací peptidem složeným ze zbytků 13-28 lidského Αβ peptidu. Bylo potvrzeno, že tato protilátka je imunoreaktivní s tímto peptidem ale dříve bylo uvedeno, že nereaguje s peptidem obsahujícím pouze zbytky 17-28 lidského Αβ peptidu, nebo jakýkoliv jiný epitop v Αβ peptidu. Prostředek obsahující tuto protilátku je popsán v patentu US 5 766 846, který je zde uveden jako odkaz. Protože příklady popisují pokusy provedené na myších, je použití myší monoklonální protilátky uspokojivé. Nicméně, v léčbě lidí za použití způsobů podle předkládaného vynálezu jsou výhodné humanizované formy protilátky s imunospecificitou odpovídající protilátce 266.

Příklad 1

Sekvestrace přidaného Αβ peptidu v lidských tekutinách

Vzorky lidského mozkomíšním moku (CSF) (50 μΐ) a lidské plasmy (50 μΐ) se inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti následujícím způsobem:

1. samostatně;

2. spolu s 5 ng Αβ 40 peptidu; nebo

3. 5 ng Αβ 40 peptidu plus 1 mg monoklonální protilátky 266 (popsané, například patentu US 5 766 846, který je zde uveden jako odkaz).

Vzorky se potom zpracovaly elektroforézou na 4 až 25% nedenaturujícím gradientovém gelu, tj. nedenaturující gradientovou elektroforesou (NDGGE) a přenesly se do nitrocelulosy. Skvrny se potom barvily Ponceau S nebo, pro Westernovou hybridizaci, sondovaly biotinem-značenou monoklonální protilátkou (3D6), kteráje namířena proti prvním pěti aminokyselinám Αβ peptidu, vyvíjely se za použití streptavidinu-křenové peroxidasy a detekovaly se pomocí zesílené chemiluminiscence (ECL). Hydratované průměry materiálů obsažených v proužcích na blotech se vyhodnocovaly za použití Pharmacia markérů molekulové hmotnosti. Pokud se Αβ peptid vázal najiné molekuly, procházel gelem podle velikosti vzniklého komplexu.

Westernová hybridizace CSF s nebo bez 5 ng Αβ peptidu neukazovala žádný důkaz Αβ peptidu při detekci pomocí protilátky 3D6. Podobné výsledky byly získány pro lidskou plasmu. Toto platilo i přes skutečnost, že Αβ peptid mohl být detekován SDS-PAGE po Westernové hybridizaci za použití stejné techniky a na stejných vzorcích CSF. Pravděpodobně bránila detekci Αβ peptidu interakce mezi tímto peptidem a jinými faktory v testovaných kapalinách. Nicméně, když byla MAb 266 přidána k inkubaci, tak byly proužky charakteristické pro sekvestrující Αβ peptid

-22CZ 304211 B6 v komplexu s protilátkou přítomné jak v plasmě, tak v CSF. Hlavní proužek má hydratovaný průměr přibližně 11 nm, což odpovídá monomeru protilátky, menší proužek měl 13 nm, což odpovídá dimeru protilátky.

Příklad 2

Specificita sekvestrující protilátky

Použily se vzorky obsahující 50 μΐ lidského CSF nebo 10 μΐ vAPP^V7l7F CSF. APP^V7I7F jsou transgenní myší reprezentující myší model Alzheimerovy nemoci, ve kterých je exprimován transgen pro lidský amyloidový prekursorový protein s familiární mutací pro Alzheimerovu nemoc, což vede k produkci lidského Αβ peptidu v centrálním nervovém systému.

Vzorky se inkubovaly s nebo bez různých MAb (1 pg) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a potom se zpracovaly elektroforesou na 4 až 25 NDGGE a přenesly se na nitrocelulosu způsobem popsaným v příkladu 1. Protilátky byly následující:

MAb 266 (váže se na pozice 13-28);

MAb 4G8 (váže se na pozice 17-24);

QCBpan (králičí polyklonální protilátka pro pozice 1-40);

myší IgG (nespecifický);

MAb 3D6 (váže se na pozice 1-5);

MAB 21F12 (váže se na pozice 33—42):

MAb 6E10 (váže se na pozice 1-17); a

QCB40, 42 (králičí polyklonální protilátka pro Αβ40 a Αβ42).

Detekce komplexu Αβ peptid-protilátka se provedla způsobem popsaným v příkladu 1 za použití biotinem značené 3D6 (k N-konci Αβ peptidu) a potom streptavidinu-HRP a ECL. Podobná detekce byly provedeny v lidském CSF inkubovaném s MAb 266, v některých případech zaměněnou za QCB40,42, která se váže na karboxylový konec Αβ peptidu, pro 3D6.

Výsledky ukazují, že z testovaných protilátek pouze MAb 4G8 a MAb 266 umožňují detekcí Αβ peptidu.

Výsledky ukazují, že pro lidský CSF pouze MAb 266 a MAb 4G8 mohou sekvestrovat v detekovatelných množstvích komplex protilátka-Αβ (opět, bez protilátky nebyl Αβ detekován). MAb 266 byla také schopna produkovat podobné výsledky jako výsledky získané s lidským CSF s CSF z APP^V7I7F transgenních myší. Αβ peptid mohl být sekvestrován v lidském CSF za použití MAb 266 bez ohledu na to, zda byla pro vyvíjení ve westernovém přenosu použita 3D6 nebo QCB40,42 protilátka.

Příklad 3

Demonstrace komplexu Αβ peptid-266 dvourozměrnou elektroforesou

Vzorek obsahující 50 ng Αβ peptidu se inkubuje s 2 pg MAb 266 a při 37 °C po dobu 3 hodin. Stejná inkubace MAb 266 samotné se použije jako kontrola.

Vzorky se potom zpracují 2-dimenzionální elektroforesou.

V prvním rozměru se inkubované vzorky zpracují NDGGE jak je popsáno v příkladu 1. Polyakrylamidové gely se potom nastříhají na jednotlivé dráhy kolmé ke směru toku v prvním rozměru a ve druhém rozměru se provede gelová separace za denaturačních/ redukčních podmínek

-23 CZ 304211 B6 pomocí SDS-PAGE (Tricin-ureové gely). Přítomnost proužků se detekuje buď Ponceau-S barvením (jakýkoliv protein), nebo specifickým barvením za použití 6E10 MAb (Senetek, lne.) a biotinylované anti-myší A13 v detekčním systému na bázi HRP.

Ponceau-S barvení nitrocelulosových membrán po přenosu umožňuje vizualizaci těžkého a lehkého řetězce MAb 266 samostatně. Pomocí tohoto barvení bylo potvrzeno, že Αβ peptid byl v komplexu s MAb 266 jako proužek velikosti 4 kD, což odpovídá velikosti kompletní MAb 266 v prvním rozměru NDGGE.

Příklad 4

Demonstrace non-ekvivalence vazby a sekvestrace

Předpokládá se, že Αβ peptid cirkulující v plasmě a CSF je obsažen v komplexu s proteiny, včetně apolipoproteinů E. Tento příklad demonstruje to, že protilátky k apoE, ačkoliv se váží na komplex, nesekvestrují apoE od zbytku komplexu.

ApoE komplexy (500 ng) se inkubovaly s MAb nebo polyklonálními protilátkami k apoE (2 pg) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Inkubované vzorky se potom zpracovaly NDGGE za použití technik popsaných v příkladu 1. Po NDGGE se provedl westernový přenos s afinitně přečištěnou kozí anti-apoE protilátkou s detekcí pomocí ECL. Když nebyla přítomna žádná protilátka, tak mohl být apoE detekován při 8 až 13 nm, cožje v souladu s přítomností lipoproteinových částic. Přítomnost monoklonální nebo polyklonální protilátky k apoE vedla k posunu apoE k větším molekulám, tzv. „super posunu“. Toto ukazuje, že protilátky k apoE nesekvestrují, tj., neodstraňují apoE z lipoproteinových částic, ale spíše se váží na apoE na lipoproteinech za vzniku větších molekul.

Příklad 5

Sekvestrace Αβ není narušena anti-apoE protilátkami

Vzorek 100 μΐ lidského CSF se inkubuje buď s MAb 266 samotnou, nebo s polyklonální antiapoE, nebo s oběma protilátkami po dobu 60 minut při teplotě 37 °C. Vzorky se potom analyzují NDGGE jak je popsáno v příkladu 1 a detekce proužků se provede jak je popsáno v příkladu 1.

Výsledky ukazují, že když je MAb 266 přidána ke vzorku, tak je pozorovatelný přibližně 11 nm proužek charakteristický pro sekvestrovaný komplex 266-Αβ peptid. Tak je tomu bez ohledu na to, zdaje či není přítomen anti-apoE. Tento proužek, demonstrující sekvestrovaný Αβ, se také objeví tehdy, když se 50 ng Αβ peptidu přidá k inkubační směsi za přítomnosti MAb 266. Tak alterace molekulové hmotnosti apoE přítomností anti-apoE protilátky neinterferuje se sekvestrací Αβ peptidu MAb 266.

Příklad 6

Sekvestrace Αβ peptidu in vivo

A. Transgenní APP^V7I7F myši, též označované jako PDAPP myši, nadměrně exprimují mutantní formu lidského APP proteinu. Tyto myši produkují lidský Αβ v CNS a mají zvýšené koncentrace lidského Αβ peptidu cirkulujícího v CSF a plasmě. 8-měsíčním myším bylo intravenosní injekcí podán salinický roztok nebo 100 pg MAb 266. Krev byla těmto myším odebrána 10 minut po injekci a potom znova za 20 hodin po první injekci.

-24CZ 304211 B6

Vzorky obsahující 20 μΐ plasmy od každého zvířete byly analyzovány NDGGE a Westernovou hybridizací s protilátkou 3D6, jak je popsáno v příkladu 1. Zvířata, kterým byl podán salinický roztok, neměla charakteristický 11 nm proužek odpovídající sekvestrovanému Αβ peptidů po 10 minutách ani po 20 hodinách.

Nicméně, dvě zvířata, kterým byla injekčně podána MAb 266, měla tento proužek po 20 hodinách.

Β. V tomto pokusu se použily 2-měsíce staré APP^V7I7F myši. V den 0 se myším podala buď žádná MAb 266, nebo 1 mg MAb 266, nebo 100 pg této protilátky. Vzorky plasmy se odebraly dva dny před podáním protilátky a v dny 1, 3, 5 a 7. Vzorky plasmy se zpracovaly NDGGE a potom Westernovou hybridizací a detekcí s 3D6, jak je popsáno v příkladu 1. Ve všech dobách po podání MAb 266 byl komplex 266/A13 detekován bez ohledu na to, že vzorek plasmy byl zpracován proteinem G, který se váže na imunoglobulin, čímž účinně odstraňuje MAb 266. V testovaném období byly detekovány stabilní koncentrace komplexu s výjimkou lehkého poklesu v den 7 u zvířat, kterým bylo aplikováno 100 pg MAb 266; obecně byly koncentrace u zvířat, kterým bylo podáno 100 pg, nižší než u zvířat, kterým byl podán 1 mg této protilátky.

C. Dvěma 2-měsíčním APP^V7I7F myším se intravenosně podal 1 mg MAb 266 a od každé myši se odebral 25 pg vzorek plasmy. Vzorek plasmy se zpracoval NDGGE a potom Westernovým přenosem, jak je popsáno výše, s tou výjimkou, po vazbě biotinylované 3D6 se provedla detekce streptavidinem^l25I(Amersham) a expozice na fosfo-detekčním zařízení. Koncentrace komplexu se hodnotila ve srovnání se standardní křivkou získanou za použití známých množství Αβ40 v komplexu se saturační koncentrací MAb 266 a podobné detekce. Množství Αβ peptidů navázaného na MAb 266 bylo přibližně 100 ng/ml, což představuje přibližně 1,000-násobné zvýšení vzhledem k endogennímu Αβ peptidů u těchto myší, které je přibližně 100 μΙ/ml. Toto je také podobné koncentraci Αβ peptidů v mozku APP^V717F myší před depozicí Αβ (50 až lOOng/g); lidský APP a lidský Αβ v APP^V717F myších jsou produkovány téměř výlučně v mozku. Tak se zdá, že přítomnost MAb 266 v plasmě způsobí vychytání Αβ peptidů usnadňující vylučování Αβ peptidů z CNS do plasmy. Toto zvyšuje vylučování v důsledku zvýšeného přesunu Αβ z CNS do plasmy a také prevencí pronikání Αβ z plasmy do mozku.

Správná velikost sekvestrovaného Αβ peptidů se potvrdí zpracováním 20 μΐ vzorků plasmy získaných od APPV717F myší za 24 hodin pro injekci 1 mg MAb 266 na TRIS-tricinových SDSPAGE gelech a potom Westernovou hybridizací za použití anti-Αβ protilátky 6E10 před nebo po zpracování proteinem G za použití korálků s navázaným proteinem G. Proužek, který byl depletován proteinem G, byl detekován při 4-8 kD, což odpovídá přítomností monomerů a snad i dimerů Αβ peptidů.

D. 2-měsíčním APP^V717F myším se aplikoval intraperitoneálně buď PBS (n=7), nebo 500 mg biotinylované MAb 266 - tj., m266B (n=9). Před injekcí a za 24 hodin po injekci se plasma analyzovala na celkový Αβ peptid za použití modifikace ELIAS metody dle Johnson-Wood, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555; a Bales, K. R., et al., Nátuře Genet (1997) 17:263-264. Celkový Αβ navázaný na m266B se stanovil za použití 96-jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.) potažených m3D6. Naředěné vzorky plasmy a standardy (různé koncentrace Αβ40 a m266B) se inkubovaly přes noc v potažených plotnách a množství Αβ/σι266Β komplexu se určilo za použití ^l25I-streptavidinu. Dále, po 24-hodinách se vzorky plasmy nejprve zpracovaly proteinem G pro kvantifikaci Αβ peptidů nenavázaného na MAb 266, a celkový Αβ a Αβ₄₂ se určil ELISA v CSF. U myší s aplikovaným PBS byly plasmatické koncentrace Αβ peptidů 140 μΙ/ml před i po injekci. Plasmatické koncentrace byly podobné u myší s aplikovanou MAb 266 před injekcí, ale koncentrace Αβ peptidů nenavázaného na MAb 266 byly nedetekovatelné za 24 hodin po injekci.

-25CZ 304211 B6

Také se měřily koncentrace v CSF. CSF reprezentuje extracelulámí kompartment v CNS a koncentrace molekul v CSF v určitém rozsahu odráží koncentrace substancí v extracelulárním prostoru mozku. CSF se izoloval z kompartmentu cisterna magna. Myši se anestezovaly pentobarbitalem a potom se odstranila svalovina na bázi lební až prvním obratlů. CSF se získal opatrnou punkturou arachnoidní membrány překrývající cisternu za použití mikrojehly a disekčního mikroskopu a CSF se odebral do polypropylenové mikropipety. Po 24 hodinách po injekci se detekovalo zvýšení celkového Αβ peptidu v CSF myší s injekcí MAb 266, které bylo přibližně 2násobné v Αβ₄₂ ve srovnání s myšíma, kterým byl aplikován PBS. Toto bylo potvrzeno za použití denaturační gelové elektroforesy a potom westernovou hybridizaci s Αβ^-specifickou protilátkou 21F12.

V dalším pokusu se 3-měsíčním APP^V7I7F injikoval intravenosně buď PBS, nebo MAb 266, a následujícím způsobem se hodnotily koncentrace Αβ₄ο a Αβ₄₂ v CSF:

Pro měření Αβ₄₀ se použila monoklonální protilátka m2G3 specifická pro Αβ40. Popsaný ELISA test (Johnson-Wood, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) se modifikoval na RIA nahrazením Streptavidin-HRP činidla 1251-Streptavidinem. Fpro vzorky plasmy a CSF se test provedl za nedenaturačních podmínek s chyběním guanidinu v pufrech. Pro hodnocení Αβ peptidu rozpustného a nerozpustného v karbonátu v mozkovém homogenátu se vzorky homogenizovaly s 100 mM karbonátem, 40 mM NaCl, pH 11,5 (4 °C), odstředily se při 10,000 xg během 15 mm a Αβ se hodnotil v supernatantové (solubilní) a peletové (insolubilní) frakci, jak bylo popsáno dříve (Johnson-Wood, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) a jak bylo uvedeno výše. Měření komplexu Αβ/MAb 266 v plasmě se provedlo modifikovanou RIA. Myším se podala biotinylovaná MAb 266 (MAb 26GB) a plasma se izolovala v různých časech. Celkový Αβ navázaný na MAb 266 se měřil za použití 96-jamkových Optiplotnas (Packard, lne.) potažených m3D6. Ředěné vzorky plasmy a standardy (různé koncentrace Αβ₄₀ a MAb 26GB) se inkubovaly přes noc v potažených plotnách a množství komplexu celkový Αβ/MAb 266B se určilo za použití ¹²⁵l-streptavidinu.

hodiny po intravenosní injekci MAb 266 bylo detekováno 2-násobné zvýšení koncentrace Αβ40 v CSF a nesignifikantní zvýšení Αβ₄₂. Nicméně, za 24 a 72 hodin bylo pozorováno 3násobné zvýšení Αβ₄₀ a Αβ₄₂ v CSF. Podobné výsledky byly získány za použití analýzy na denaturačním gelu následované westernovou hybridizaci celkového CSF. Vylučování Αβ prostřednictvím mozkové intersticiální kapaliny, které se odráží v koncentracích CSF, je pravděpodobně odpovědné za pozorované zvýšení Αβ v CSF.

Významné je to, že změna v koncentracích Αβ peptidu v CSF nemůže být způsobena průnikem MAb 266 do CSF, protože koncentrace změřené za 24 hodin po injekci, které jsou nižší než 0,1 % plasmatických koncentrací MAb 266, jsou nedostatečné pro to, aby způsobily tyto změny. Tyto výsledky naznačují, že Αβ peptid je přesouván z mozkového parenchymu do CSF přítomností protilátky v krevním řečišti.

Formy Αβ peptidu, které jsou rozpustné v PBS nebo uhličitanovém pufru, byly měřeny v homogenátem mozkového kůry od stejných myší, kterým byla aplikována MAb 266 a u kterých byl CSF analyzován způsobem popsaným výše. Bylo pozorováno podobné zvýšení těchto solubilních forem v homogenátech kůry mozkové.

Příklad 7

MAb 266 účinkuje in vitro jako vychytávač Αβ peptidu

-26CZ 304211 B6

Dialyzační komůrka se připravila jako in vitro systém pro testování schopnosti MAb 266 vychytávat Αβ peptid. 1 ml lidské CSF se umístil do horní komůrky polypropylenové zkumavky separované dialyzační membránou s mezí propustnosti 10 až 100 kD od spodní komůrky obsahující 75 pm PBS s nebo bez 1 μΐ MAb 266.

Zdálo se, že rovnováhy bylo dosaženo po 3 hodinách, jak se určilo zpracováním materiálu ze spodní komůrky na kyselých močovinových gelech a potom Westernovým přenosem na přítomnost Αβ peptidů s 6E10 v různých dobách. Vzorky se denaturovaly v kyselině mravenčí na konečnou koncentraci 80 % (obj./obj.) a redukovaly se B-merkaptoethanolem (1%). Vzorky se zpracovaly elektroforesou (anoda-katoda) v 0,9 M pracovním pufru s kyselinou octovou na 4 až 35% polyakrylamidovém gradientovém gelu obsahujícím 6 M močoviny, 5 % (obj./obj.) ledovou kyselinu octovou a 2,5% TEMED. Kyselé pH gelu se neutralizovalo před přenosem na nitrocelulosu. Potom se standardní techniky westernového přenosu použily pro identifikaci Αβ. Detekované proužky odpovídaly 4 kD.

Množství Αβ odstraněného z horní komůrky se takto určilo ELISA analýzou horní a dolní komůrky (n=4) po 3 hodinách. Výsledky pro různé meze molekulové hmotnosti za přítomnosti a nepřítomnosti MAb266 jsou uvedeny na obr. 1. Jak je uvedeno, zatímco pouze minimální množství Αβ peptidů překonává membránou, když je v dolní komůrce přítomen PBS, 50 % Αβ peptidů se sekvestruje v dolní komůrce, když tato komůrka obsahuje MAb 266 a limit molekulové hmotnosti je 25 kDa; větší množství prochází tehdy, když se limit molekulové hmotnosti zvýší na 100 kDa, kdy téměř 100 % Αβ peptidů prochází přes membránu.

Také se pozorovalo, že protilátky proti N-konci Αβ 3D6 a 10D5 jsou schopné způsobit v tomto systému přenos Αβ přes membránu, ačkoliv nebyly schopné sekvestrovat Αβ peptid v testech popsaných v příkladu 1. Tyto výsledky ukazují, že protilátky k Αβ peptidů mají za těchto podmínek dostatečnou afinitu pro sekvestrování peptidů ve fyziologických roztocích od jiných vazebných proteinů, ale že MAb, jako je 266, které jsou imunoreaktivní s epitopem v pozici 13-28, jsou významně více účinné a váží se s vyšší afinitou.

V podobných testech měl apoE4 secemovaný astrocyty přečištěný způsobem popsaným v DeMattos, R. B., et al., J. Biol. Chem. (1998) 273:4206-4212; Sun, Y., et al., J. Nurosci. (1998) 18:3261-3272, malý, ale statisticky významný efekt na zvýšení množství Αβ peptidů v dolní komůrce. Žádný efekt nebyl pozorován tehdy, když byl polyklonální IgG nebo BSA zaměněn za MAb 266.

Příklad 8

Tok Αβ peptidů z CNS do plasmy

A. 1 pg Αβ40 se rozpustil v 5 μΐ krysího CFS pro uchování v rozpuštěném stavu a potom se injikoval do subarachnoidálního prostoru cisterna magna normálních Swiss-Webster myší, kterým byly před tím podány i.v. injekce buď PBS (n=3), nebo 200 pg biotinylované MAb 266 (n=3). V různých časech po léčbě se celkový Αβ v plasmě myší určil Αβ ELISA, za použití 3D6 jako potahovací protilátky a standardů Αβ ve směsi s nadbytkem biotinylované 266. Do každého vzorku plasmy se po odběru od každého zvířete přidal nadbytek biotinylované 266 pro P43 detekci v ELISA. U myší léčených PBS byly minimální detekovatelná množství peptidů v koncentracích 0,15 ng/ml detekovány jako píkové hodnoty po 30 až 60 minutách, a potom byly hodnoty prakticky nulové. U myší, kterým byla podána MAb 266, dosáhly plasmatické koncentrace P43 peptidů hodnot 330-násobně vyšších než u myší s injekcí PBS po 60 minutách (přibližně 50 ng/ml) a dosahovaly hodnot přibližně 90 ng/ml po 180 minutách.

-27CZ 304211 B6

B. Tento postup se opakoval za použití buď 200 pg (n=3), nebo 600 pg (n=3) injikovaných i.v. 2-měsíčním APP V717F myším. MAb 266 se injikovala i.v. 3-měsíčním APP^V7I7F myším za použití výše uvedených dávek. Před a v různých intervalech po i.v. injekci se plasmatická koncentrace Αβ navázaného na MAb 266 určila R1A. Podrobné výsledky od jedné myši jsou uvedeny na obr. 2.

Bylo zjištěno, že koncentrace Αβ navázaného na monoklonální protilátku MAb 266 se zvýšila ze základních hodnot 150 μί/ml na hodnoty 100 ng/ml za 4 dny. Analýzou časných částí křivky se určilo, že čistá rychlost vstupu Αβ,₀, do plasmy u APP^V7I7F Ig myší je 42 μί/ml/minutu za přítomnosti saturačních koncentrací protilátky.

Účinky MAb 266 na plasmatické koncentrace Αβ u přirozených a APP^V717F Tg myší, stejně jako účinky protilátky na koncentrace Αβ v CSF ukazují, že přítomnost MAb 266 v cirkulaci vede k změně rovnováhy v transportu Αβ mezi CNS a plasmou.

Příklad 9

Účinek MAb 266 na Αβ v mozku

4-měsíční APP^V7l7Ft/+ myši se léčily každé 2 týdny po dobu 5 měsíců IP injekcemi salinického roztoku, MAb 266 (500 pg) nebo kontrolního myšího IgG (100 pg, Pharmigen). Myši se utratily ve věku 9 měsíců a určilo se ukládání Αβ v kůře mozkové. % plochy pokryté Αβ-imunoreaktivitou, jak byla určena králičí pan-Αβ protilátkou (QCB, lne.), se kvantifikovalo v kůře mozkové ihned po barvení dorsálního hippocampu, jak je popsáno v Holtzman, D. M., et al., Ann. Neurob (2000) 97:2892-2897. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3 A. V tomto věku se u přibližně poloviny myší z každé skupiny ještě nezačaly vyvíjet depozita Αβ. Nicméně, % myší s >50% ukládáním Αβ v kůře mozkové bylo signifikantně nižší(P=0,02, Chi-kvadrátový test) ve skupině léčené 266. Ačkoliv se u APPV717P myší mohou vyvíjet větší depozita Αβ v 9 měsících, existuje značná variabilita s přibližně 50 % bez depozit a přibližně 50 % s výraznými depozity. U zvířat mohou vyvíjet větší depozita Αβ v 9 měsících, existuje značná variabilita s přibližně 50 % bez depozit a přibližně 50 % s výraznými depozity. U zvířat léčených PBS a IgG mělo 6/14 a 5/13 myší více než 50 % kůry mozkové nAβarveno Αβ barvením, zatímco pouze jedna ze 14 myší léčených MAb 266 měla tuto úroveň barvení. Téměř 50 % zvířat ve všech skupinách nemělo ukládání Αβ v 9 měsících věku. Toto se zdá být způsobeno původem myší v naší kohortě, protože ačkoliv byly všechny testované myši ověřené jako APPB717+/+, byly vysoké hladiny deponování Αβ pozorovány pouze u myší ze 4/8 párů (vrhy s vysokou patologií Αβ pozorovány pouze u myší ze 4/8 párů (vrhy s vysokou patologií). Myši z druhých 4 vrhů byly v podstatě bez depozit Αβ (vrhy s malou patologií). Za použití vrhů jako ko-proměnné byl patrný silný, statisticky významný efekt m266 na redukci deponování Αβ (p=0,0082, obr. 3B).

Příklad 10

Periferně injikovaná MAb 266 se neváže na plaky u APPV717F Tg myší

Pro stanovení toho, zda se MAb 266 injikovaná i.p. během 5 měsíců váže na Αβ v mozku se použily řezy mozkem od 9-měsíční APP^V717F Tg myši, které obsahovaly depozita Αβ a které byly léčeny MAb 266, salinickým roztokem nebo kontrolním IgG. Zpracování tkání a imunobarvení se provedly popsaným způsobem (Bales, K. R., et al., Nátuře Genet. (1997) 17:263-264). Tkáně od všech skupin zvířat se inkubovaly s fluoresceinem-značeným anti-myším IgG (Vektor; lne.) a potom se hodnotily pod fluorescenčním mikroskopem. V žádné skupině nebylo pozorováno spe-28CZ 304211 B6 cifické barvení Αβ depozit. Naopak, při aplikování MAb 266 na řezy před inkubací řezů s antimyším IgG byla depozita Αβ jasně detekována.

Příklad 11

Efekt podání protilátky 266 na kognitivní funkce 24-měsíčních transgenních hemyzygotních PDAPP myší.

Použilo se 16 hemizygotních transgenních myší (APP^V717F). Myši byly v době zahájení testu staré 24 měsíců. Všechny injekce byly intraperitoneální (i.p.). Polovině myší se podávaly jednou týdně injekce fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS, kontrola) a druhé polovině injekce 500 μg myší protilátky 266 rozpuštěné v PBS. Injekce se prováděly po dobu 7 týdnů (42 dnů), celkově 6 injekcí. 3 dny po poslední injekci se hodnotilo chování zvířat za použití testu kognitivních funkcí, jak je popsán v J. C. Dodart, et al., Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999). Vypočetl se index kognitivních funkcí (TB x 100)/(TE«-TA). Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 1.

Tabulka 1

Index kognitivních funkcí
	N	Průměr	Standardní	Standardní
			odchylka	chyba
Kontrola (PBS)	8	7,22“	8,80	3,11
Protilátka 266	8	54,35	7,43	2,62

** p = 0,0010

Podávání 500 μg protilátky 266 jednou týdně 24-měsíčním, hemizygotním, transgenním myším bylo spojeno se statisticky významnou změnou chování. Protilátkou léčené myši měly indexy kognitivních funkcí podobné jako normální kontrolní zvířata [J.-C. Dodart, et al.]. Rozdíly v indexech kognitivních funkcí byly statisticky významné při p=0,001. Vyšší index kognitivní funkce ukazuje, že léčba protilátkou, která se váže na beta amyloidový peptid v regionu aminokyselina 13-28 revertuje poruchy chování, které byly dokumentovány v tomto myším modelu Alzheimerovy nemoci. Proto může podání protilátky, která se váže na beta amyloidový peptid v regionu aminokyselin 13-28 léčit onemocnění jako je Alzheimerovy nemoc a Downův syndrom a také může zastavit zhoršování kognitivních funkcí, které je obvykle spojeno s progresí onemocnění.

Postižení amyloidem (% plochy barvené imunoreaktivním materiálem po barvení anti-Αβ protilátkou 3D6 nebo 21F12) se kvantifikovala kůře mozkové ihned po nAfiarvení hippocampu včetně oblastí cinguly a parietálního kortextu v mozku 24-měsíčních zvířat léčených myší protilátkou 266 po dobu 7 týdnům, jak je popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Rozdíly mezi skupinami nebyly statisticky významné.

-29CZ 304211 B6

Tabulka 2: Množství amyloidových plaků u APPV717F +/- myší po léčbě myší 266 anti-Αβ protilátkou

Velikost plaků (%)
Při použití 3D6	Při použití 21F12
N	Průměr Standard., chyba	Průměr Standardní chyba
Kontrola (PBS) 7	44,3 5,93	0,77 0,14
Protilátka 266 8	38,0 2,96	0,93 0,11

Pro tato velmi stará zvířata nevede léčba myší protilátkou 266 v významně odlišnému množství amyloidu ve srovnání se skupinou léčenou PBS, podle měření buď pomocí 3D6, nebo za použití 21F12. Dále, množství Αβ bylo významně vyšší a signifikantně zvýšení ve srovnání s množstvím amyloidu u mladších zvířat (viz dále), které nebyly schopné rozpoznat nový objekt od známého objektu v testu kognitivních funkcí. Překvapivě tyto výsledky demonstrují, že anti-Αβ protilátky mohou revertovat kognitivní defekty bez nutnosti redukovat množství amyloidu jako takového.

Po 7 týdnech léčby se index kognitivních funkcí ve skupině léčené m26 statisticky významně nelišil od skupiny normálních 24-měsíců starých myší. Toto ukazuje na kompletní vylepšení kognitivního deficitu u těchto transgenních myší.

Příklad 12

Efekt podání protilátky 266 na kognitivní funkce u mladých transgenních hemizygotních PDAPP myší

Použilo se 54 homozygotních, transgenních myší (APP^V717F). 23 myší bylo na začátku testu ve věku přibližně 2 měsíce. Zbývající myši byl na začátku testu ve věku přibližně 4 měsíce. Trvání léčby bylo 5 měsíců. Tak bylo na konci testu stáří myší přibližně sedm (7) měsíců nebo přibližně devět (9) měsíců.

Všechny injekce byly intraperitoneální (i.p.). Všechny myši v kontrolní „PBS“ skupině dostávaly jednou týdně injekcí fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS; 200 μΐ). Všechny myši v „IgG“ kontrolních skupinách dostávaly jednou týdně injekci IgGlkappal isotypu (100 pg/myš/týden). Všechny myši v „high dose“ skupinách dostávaly jednou týdně injekci 500 pg protilátky 266 rozpuštěné v PBS („HD“). Všechny myši v „low dose“ skupinách dostávaly jednou týdně injekci 100 pg protilátky 266 rozpuštěné v PBS („LD“). Tři dny po poslední injekci se chování myší hodnotilo za použití testu kognitivních funkcí, jak je popsán v příkladu 10, a diskriminační index se vypočetl jako rozdíl mezi dobou strávenou na novém objektu a dobou strávenou na známém objektu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3. Data jsou sdružena podle věku myší na konci testu.

-30CZ 304211 B6

Tabulka 3: Statistika pro diskriminační index

		Diskriminační	index (minuty)
	N	Průměr	Standardní	Standardní
			odchylka	chyba
7 měsíců
PBS	7	2,12	4,22	1,59
IgG	8	0,81	3,64	1,29
HD	8	10,04*	6,52	2,30
9 měsíců
PBS	7	1,87	3,54	1,34
IgG	8	0,96	3,51	1,24
LD	8	10,75*	6,44	2,28
HD	8	12,06***	7,82	2,76

* p < 0.05 *** pcO.OOOl

Dohromady tato data podporují závěr, že podávání protilátky 266, protilátky namířené proti centrální doméně Αβ, zmírňuje deponování plaků u 7 až 9 měsíčních APP^V717F myší, stejně jako revertuje existující poruchy chování. Léčba pacientů protilátkou proti Αβ peptidu bude inhibovat nebo bránit zhoršování kognitivních funkcí, které je obvykle spojeno s progresí onemocnění, a bude obvykle revertovat takové zhoršení.

Diskriminační index pro léčená zvířata nebyl statisticky významně odlišný od indexu myší stejného věku. Proto - stejně jako u starších zvířat (příklad 11) - léčba m266 zcela revertovala zhoršování kognitivních funkcí u těchto mladších transgenních zvířat.

Příklad 13

Syntéza humanizované protilátky 266

Buňky a protilátky. Myší myelomová buněčná linie Sp2/0 se získala z ATCC (Manassas, VA) a kultivovala se v DME médiu obsahujícím 10% PBS (kat. # SH32661.03, HyClone, Logan, UT) při 370C v CO2 inkubátoru. Myší 266 hybridomové buňky se nejprve kultivovaly v RPMI-1640 médiu obsahujícím 10% FBS (HyClone), 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 0,1 mM neesenciální aminokyseliny, 1 mM natřium-pyruvát, 25 pg/ml gentamiciriu, a potom se expandovaly v bezsérovém médiu (Hybridoma SFM, kat # 12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 2% FBS s nízkým obsahem Ig (kat # 30151.03, HyClone) na objem 2,5 litru ve válcových zkumavkách. Myší monoklonální protilátka 266 (Mu266) se přečistila ze supernatantu kultury afinitní chromatografii za použití protein—G sepharosové kolony. Biotinylovaná Mu266 se připravila za použití EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotinu (kat # 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

-31 CZ 304211 B6

Klonování cDNA variabilního regionu. Celková RNA se extrahovala z přibližně 107 hybridomových buněk za použití TRIzol činidla (Life Technologies) a poly(A)+ RNA se izolovala pomocí PolyATract mRNA Isolation systému (Promega, Madison, WI) podle návodu výrobce. Dvojřetězcová cDNA se syntetizovala za použití SMART-RACE cDNA Amplification Kitu (Clontech, Palo Alto, CA) podle návodu výrobce.cDNA pro variabilní regiony pro lehký a těžký řetězec se amplifíkovaly polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití 3' primerů, které se váží v příslušném pořadí na myší kappa a gamma řetězce konstantních regionů, a 5' univerzálního primerů obsaženého v SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitu. Pro VL PCR měl 3' primer sekvenci:

5’ - TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC -3’ [SEQ ID

NO:13] kde zbytky 1Ί-46 hybridizují na myší Ck region. Pro VH PCR měly 3' primery degenerovanou sekvenci:

A G T ’ -TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3 ’

T se zbytky 17-50 hybridizujícími na myší gamma řetězec CH1. VL a VH cDNA se subklonovaly dopCR4Blunt-TOPO vektoru (Invitrogen, Carlsbad, CA) za účelem stanovení sekvence. DNA sekvencování se provedlo za použití PCR cyklických sekvencovacích reakcí s fluorescentními dideoxy-řetězcovými terminátory (Applied Biosystems, Foster City, CA) podle návodu výrobce. Sekvencovací reakce se analyzovaly na Model 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems).

Konstrukce variabilních regionů humanizované 266 (Hu266). Humanizace V regionů myší protilátky se provedla způsobem popsaným v Queen et al. [Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029— 1003 (1988)]. Pracovní region lidského V regionu použitý jako akceptor pro Mu266 CDR se vybral podle homologie sekvence. Počítačové programy ΑβΜΟϋ a ENCAD [Levitt, Μ., 1. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)] se použily pro konstrukci molekulového modelu variabilních regionů. Aminokyseliny v humanizovaném V regionu, které byly určeny jako kontaktní s CDR, se substituovaly příslušnými zbytky Mu266. Toto se provedlo ve zbytcích 46, 47, 49 a 98 v těžkém řetězci a se zbytkem 51 v lehkém řetězci. Aminokyseliny v humanizovaném V regionu, které byly vzácné ve stejné podskupině V-regionů, byly změněny na konvenční aminokyseliny pro eliminaci potenciální imunogenicity. Toto se provedlo ve zbytcích 42 a 44 v lehkém řetězci.

Geny pro variabilní regiony lehkého a těžkého řetězce se připravily a amplifíkovaly za použití 8 překrývajících se syntetických oligonukleotidů délky od přibližně 65 do 80 bází [He, X. Y., et al., J. Immunol. 160: 029-1035 (1998)]. Oligonukleotidy se tepelnou reakcí spárovaly a prodloužily se Klenow fragmentem DNA polymerasy I, za zisku 4 dvouřetězcových fragmentů. Získané fragmenty se denaturovaly, tepelnou reakcí se spárovaly a prodloužily se Klenow fragmentem za zisku dvou fragmentů. Tyto fragmenty se denaturovaly, tepelnou reakcí se spárovaly a znovu se prodloužily za zisku dvou kompletního genu. Získaný produkt se amplifikoval PCR za použití Expand High Fidelity PCR Systému (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). PCRamplifikované fragmenty se přečistily na gelu a klonovaly se do pCR4Blunt-TOPO vektoru. Po potvrzení sekvence se VL a VH geny trávily MIuI a Xbal, přečistily se na gelu a subklonovaly se v příslušném pořadí do vektorů pro expresi lehkého a těžkého řetězce za zisku pVk-Hu266 a pVgl-Hu266 (viz obr. 6 a 7, v příslušném pořadí) [Co. M. S., et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1992)]. Zralá humanizovaná 266 protilátka exprimovaná z těchto plasmidů měla lehký řetězec SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec SEQ ID NO: 12.

-32CZ 304211 B6

Stabilní transfekce. Stabilní transfekce do myší myelomové buněčné linie Sp2/0 se provedla elektroporací za použití Gene Pulser přístroje (BioRad, Hercules, CA) při 360 V a 25 gF, jak je popsáno (Co et al., 1992). Před transfekci se pVk-Hu266 a pVgl-Hu266 plasmidové DNA linearizovaly za použití Fspl. Přibližně 107 Sp2/0 buněk se transfektovalo 20 gg pVk-Hu266 a 40 gg pVgl-Hu266. Transfektované buňky se suspendovaly v DME médiu obsahujícím 10% PBS a buňky se umístily na několik 96-jamkových ploten. Po 48 hodinách se přidalo selekční médium (DME médium obsahující 10% PBS, HT metidový doplněk, 0,3 mg/ml xanthinu a 1 gg/ml kyseliny mykofenolové. Přibližně 10 dní po zahájení selekce se supematanty kultury testovaly na produkci protilátek za použití EF1SA, jakje popsáno dále. Klony s vysokou produkcí se expandovaly v DME médiu obsahujícím 10% PBS a dále se analyzoval na expresi protilátek. Selektované klony se potom adaptovaly na růst v Hybridoma SFM.

Měření exprese protilátek EEISA. Jamky 96-jamkové EEISA plotny (Nunc-lmmuno plotna, kat. # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) se potáhly 100 gl 1 gg/ml kozím anti-lidskýin IgG, specifickým pro Fcgamma fragment, polyklonální protilátkou (kat # 109-005-098, Jackson ImunoResearch, West Grove, PA) v 0,2 M pufru tvořeným uhličitanem sodným-hydrogenuhličitanem sodným (pH 9,4) přes noc při teplotě 40 °C. Po promytí promývacím pufrem (PBS obsahující 0,1% Tween 20) se jamky blokovaly 400 pl Superblock Blocking Buffer (kat # 37535, Pierce) po dobu 30 minut a potom se promyly promývacím pufrem. Vzorky obsahující Hu266 se vhodně naředily v EEISA pufru (PBS obsahující 1% BSA a 0,1% Tween 20) a aplikovaly se na ELISA plotny (100 pl na jamku). Jako standard se použila humanizovaná anti-CD33 IgGl monoklonální protilátka HuM195 (Co, et al., 1992, výše). ELISA plotna se inkubovala po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a jamky se potom promyly promývacím pufrem. Potom se do každé jamky přidalo 100 gl 1/1000-ředěné HRP-konjugované kozí anti-lidský kappa polyklonální protilátky (kat # 105 0-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) v ELISA pufru. Po inkubaci po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a promytí promývacím pufrem se do každé jamky přidalo 100 gl ΑβΤβ substrátu (kat # 507602 a 506502, Kirkegaard a Perry ΕΑβθΓ8ΐοπ65, Gaithersburg, MD). Vyvíjení barvy se ukončilo přidáním 100 gl 2% kyseliny šťavelové na jamku. Absorbance se odečítala při 415 nm za použití OPTImax čtečky mikroploten (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Přečištění Hu266. Jeden z transformantů s vysokou expresí Hu266 označený jako Sp2/0 (klon 1D9) se upravil na růst v Hybridoma SFM a expandoval se na objem 2 litry v otočných baňkách. Vyčerpaný supernatant kultury se získal poté, co procento živých buněk dosáhlo 10 % nebo méně a vnesl se do protein—A Sepharosové kolony. Kolona se promyla PBS před tím, než se protilátka eluovala 0,1 M glycinem-HCl (pH 2,5), 0,1 M NaCl. Eluovaný protein se dialyzoval proti 3 výměnám 2 litrů PBS a přefiltroval se přes 0,2gm filtr před uskladněním při 40 °C. Koncentrace protilátky se určila měřením absorbance při 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A280). SDS-PAGE v Trisglycinovém pufru se provedla standardním způsobem na 4 až 20% gradientovém gelu (kat # EC6025, Novex, San Diego, CA). Přečištěná humanizovaná 266 protilátka se redukovala a zpracovala se na SDS-PAGE gelu. Celá protilátka vykazuje dva proužky přibližné molekulové hmotnosti 25 kDa a 50 kDa. Tyto výsledky jsou v souladu s molekulovými hmotnostmi pro lehký řetězec a těžký řetězec nebo fragment těžkého řetězce vypočtenými podle jejich aminokyselinového složení.

Příklad 14

In vitro vazebné vlastnosti humanizované 266 protilátky

Vazebná účinnost humanizované 266 protilátky, syntetizované a přečištěné způsobem popsaným výše, se srovnávala s myší 266 protilátkou za použití biotinylované myší 266 protilátky ve srovnávací ELISA analýze. Jamky 96-jamkové ELISA plotny (Nunc-Imuno plotna, kat # 439454.

-33 CZ 304211 B6

NalgeNunc) se potáhly 100 μΐ 13-amyloidového peptidu (1—42) konjugovaného na BSA v 0,2 M pufru tvořeném uhličitanem sodným/hydrogenuhličitanem sodným (pH 9,4) (10 pg/ml) přes noc při 40 °C. Konjugát A3142-BSA se připravil rozpuštěním 7,5 mg Api42-Cys43 (C-terminální cystein na Αβ142, AnaSpec) v 500 μΐ dimethylsulfoxidu, a potom okamžitým přidáním 1500 μΐ destilované vody. 2 miligramy maleimidem-aktivovaného hovězího sérového albuminu (Pierce) se rozpustily v 200 μΐ destilované vody. Tyto dva roztoky se smísily a nechaly se ustát při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Chromatografie na gelové koloně se použila pro separování nezreagovaného peptidu od konjugátu ΑβΙ-42-Cys-BSA.

Po promytí jamek fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) obsahujícím 0,1% Tween 20 (promývací pufr) za použití promývacího zařízení pro ELISA plotny se jamky blokovaly přidáním 300 μΐ SuperBlock činidla (Pierce) na jamku. Po 30 minutách blokování se jamky promyly promývacím pufrem a odstranil se nadbytek kapaliny.

Směs biotinylované Mu266 (konečná koncentrace 0,3 pg/ml) a kompetiční protilátky (Mu266 nebo Hu266; konečná koncentrace od 750 μΐ/ml a sériová 3-násobná ředění) v ELISA pufru se přidala v trojím provedení v objemu 100 μΐ na jamku. Jako nekompetiční kontrola se přidalo 100 μΐ 0,3 pg/ml biotinylované Mu266. Jako základní kontrola se přidalo 100 μΐ ELISA pufru. ELISA plotna se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 90 min. Po promytí jamek promývacím pufrem se do každé jamky přidalo 100 μΐ 1 μΐ/ml HRP-konjugovaného streptavidinu (kat # 21124, Pierce). Plotna se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 30 min. a promyla se promývacím pufrem. Pro vývoj barvy se přidalo 100 μΐ/jamku ARTS Peroxidase Substráte (Kirkegaard & Perry ΕΑβθΓηίοπε8). Vývoj barvy se ukončil přidáním 2% kyseliny šťavelové v dávce 100 μΐ/jamku. Absorbance se odečítala při 415 nm. Absorbance se zanesly do grafu proti logaritmu koncentrace kompetitoru, křivky se upravily pro data (za použití Prism) a určily se IC50 pro každou protilátku za použití způsobů dobře známých v oboru.

Průměrná IC₅₀ pro myší 266 byla 4,7 pg/ml (tři samostatné pokusy, standardní odchylka = 1,3 μΙ/ml) a pro humanizovanou 266 byla 7,5 μΐ/ml ((tři samostatné pokusy, standardní odchylka = 1,1 μΐ/ml). Byla provedena druhá sada pokusů, v podstatě tak, jak je popsáno výše, a průměrná IC50 pro myší 266 byla 3,87 μΐ/ml (SD = 0,12 μΐ/ml) a pro lidskou 266 byla IC₅o 4,0 μΐ/ιηΐ (SD = 0,5 μΐ/ml). Podle těchto výsledků lze říci, že humanizovaná 266 má vazebné vlastnosti, které jsou velmi podobné vlastnostem myší protilátky 266. Proto předpokládáme, že humanizovaná 266 má velmi podobné in vitro a in vivo aktivity ve srovnání s myší 266 a dále předpokládáme, že bude mít u člověka stejné účinky jako myší 266 u myší.

Příklad 15 ln vitro vazebné vlastnosti myších protilátek 266 a 4G8

Afinita protilátky (KD = Kd/Ka) se určila za použití BIAcore biosensoru 2000 a data se analyzovala BIAevaluation (v.3.1) softwarem. Záchytná protilátka (králičí anti-myší) se navázala prostřednictvím volných amino skupin na karboxylové skupiny na průtokové komůrce 2 biosenzorového čipu (CM5) za použití N-ethyl-N-dimethylaminopropyl-karbodiimidu a N- hydroxysukcinimidu (EDC/NHS). Nespecifický králičí IgG se navázal na průtokovou komůrku 1 jako základní kontrola. Monoklonální protilátky byly zachyceny za dosažení 300 rezonančních jednotek (RU). Amyloid-beta 140 nebo 142 (Bioscience International lne.) se potom nechal protékat okolo čipu v klesajících koncentracích (1000 až 0,1-násobek KD). Pro regeneraci čipu se navázané anti-Αβ protilátka eluovala z čipu za použití výplachu glycinem-HCl (pH 2). Kontrolní injekce neobsahující beta-amyloid sloužila jako kontrola pro odečtení základních hodnot. Sensorogramy ukazující asociační a disociační fáze se analyzovaly pro stanovení Kd a Ka. Za použití tohoto způsobu byla afinita myší protilátky 266 pro Αβ, .to a pro Αβ,_42 stanovena na 4 pM. Afi-34CZ 304211 B6 nita 4G8 pro Αβ,^ο byla 23 nM a pro Λβ| ₄ι byla 24 nM. I přes 6000-násobný rozdíl v afinitách pro Αβ jak 266, tak 4G8, která se váže na epitopy mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ, účinně sekvestrují Αβζ lidského CSF. Proto je lokalizace epitopu nejdůležitější - důležitější než vazebná afinita - pro stanovení schopnosti protilátky sekvestrovat Αβ a tím poskytovat výhody předkládaného vynálezu.

Příklad 16

Epitopové mapování myší protilátky 266 za použití Biacore metody a solubilních peptidů

BIAcore je automatizovaný biosenzorový systém pro měření molekulových interakcí (Karlsson R., et al., J. Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)). Výhody BIAcore ve srovnání sjinými vazebnými testy spočívají v tom, že vazba antigenu může býl: měřena bez značení nebo imobilizace antigenu (tj. antigen je v přirozenější konformaci). BlAcore metoda byla použita pro hodnocení vazby různých fragmentů beta-amyloidového peptidů na myší protilátku 266, v podstatě tak. jak je to popsáno v příkladu 12, stou výjimkou, že všechna ředění byla provedena s HEPES pufrovaným salinickým roztokem obsahujícím Tween 20, a injikovaly se různé fragmenty Αβ (BioSource International), a injikovala se jediná koncentrace každého fragmentu (440 nM).

Fragmenty beta-amyloidu 1-28, 12-28, 17-28 a 6-25 se vázaly na myší protilátku 266, zatímco Αβ fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 se nevázaly na protilátku. Fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 se vázaly na jiné ηιΑβ se známou epitopovou specificitou pro tyto regiony Αβ. Podle této metody se zdá, že vazebný epitop myší protilátky 266 je mezi aminokyselinami 17 a 25 Αβ. Protože se vazba realizuje obvykle s alespoň 3 zbytky v epitopu, lze odvodit, že epitop je obsažen ve zbytkách 19-23.

Příklad 17 ln vitro vazebné vlastnosti humanizované protilátky 266

Afinita (KD=Kd/Ka) humanizované protilátky 266, syntetizované a přečištěné způsobem popsaným výše, se určila v podstatě způsobem popsaným v příkladu 15. Za použití tohoto způsobu se určila afinita humanizované 266 pro Αβ 1-42 jako 4 pM.

Claims (26)

1. Humanizovaná protilátka nebo její imunologicky účinný fragment, jako je F_ab, F_ab· nebo F(_ab')2, která se specificky váže na epitop obsažený mezi aminokyselinami 13 a 28 molekuly Αβ, a obsahuje

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce, majícího následující aminokyselinové sekvence:

CDR1 lehkého řetězce:

-35 CZ 304211 B6

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) ; nebo

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:15)

CDR.2 lehkého řetězce:

1 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:2) a CRD3 lehkého řetězce:

1 5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO:3) a sekvence úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce;

b) těžký řetězec obsahující tři CDR těžkého řetězce, mající následující aminokyselinové sekvence:

CDR1 těžkého řetězce:

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1)

1 5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO:4)

CDR2 těžkého řetězce:

15 10 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) ; nebo

15 10 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO:16) a CRD3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6( a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

2. Humanizovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, ve které

-36CZ 304211 B6

CDR1 lehkého řetězce je

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) a CDR2 těžkého řetězce je

1 _T, „ ⁵ 10 15 ^SEQ^ID Ν0^5^^{6Γ 731 017 ASn Ser ΤΗΓ Tyr Tyr Pr}° ^{ASP Thr Val LyS Gly} io

3. Humanizovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, ve které humanizovaný variabilní region lehkého řetězce obsahuje následující sekvenci:

15 10 15

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa 20 25 30 Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa 35 40 45 Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val 95 101 0 105 Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110 Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SE Q ID NO: 7)

15 kde:

Xaa v pozici 2 je Val nebo Ile;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser;

20 Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je Ile nebo Val;

Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly;

25 Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu;

a variabilní region těžkého řetězce obsahuje následující sekvenci:

-37CZ 304211 B6

1 Xaa Val Gin Leu 5 Val Glu Xaa Gly Gly 10 Gly Leu Val Gin 15 Pro Gly Gly Ser Leu Arg 20 Leu Ser Cys Ala Ala 25 Ser Gly Phe Thr 30 Phe Ser Arg Tyr Ser Met 3 5 Ser Trp Val Arg Gin 4 0 Ala Pro Gly ’ Lys 45 Gly Leu Xaa Leu Val Ala '50 Gin Ile Asn Ser Val 55 Gly Asn Ser Thr 60 Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val 65 Lys Gly Arg Phe Thr 70 Ile Ser Arg Asp 75 Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu 80 Tyr Leu Gin Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala 90 Xaa Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr Cys Ala Ser Gly 100 Asp Tyr Trp Gly 105 Gin Gly Thr Xaa Val Thr 110 Val Ser Ser (SEQ ID NO:8)

kde:

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Glu, Val, Asp, nebo Ser;

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

ío Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val nebo Thr;

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

15

4. Humanizovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která obsahuje variabilní region lehkého řetězce se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilní region těžkého řetězce uvedený v SEQ ID NO: 10.

5. Humanizovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 4, která obsahuje lehký řetězec se

20 sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec uvedený v SEQ ID NO: 12.

6. Fragment humanizované protilátky podle nároku 1 nebo 5.

7. Humanizovaná protilátka nebo fragment podle nároku 1, kde jde o imunoglobulin izotypu

25 IgGl.

8. Humanizovaná protilátka nebo fragment podle nároku 1, kde protilátka nebo její fragment je produkován v hostitelské buňce vybrané ze souboru zahrnujícího myelomové buňky, ovariální buňky čínského křečka, ovariální buňky syrského křečka a buňky lidské embryonální ledviny.

9. Polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující lehký řetězec nebo těžký řetězec humanizované protilátky podle nároku 1, nebo její imunologicky účinný fragment.

10. Polynukleová kyselina podle nároku 9, která obsahuje sekvenci kódující variabilní region

35 lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 9.

-38CZ 304211 B6

11. Polynukleová kyselina podle nároku 9, která obsahuje sekvenci kódující variabilní region těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 10.

12. Polynukleová kyselina podle nároku 9, která obsahuje sekvenci kódující lehký řetězec uvedenou v SEQ ID NO: 1113. Polynukleová kyselina podle nároku 9, která obsahuje sekvenci kódující těžký řetězec uvedenou v SEQ ID NO: 12.

14. Polynukleová kyselina, která obsahuje sekvenci kódující lehký řetězec nebo těžký řetězec humanizované protilátky podle nároku 5, nebo jejich fragment.

15. Polynukleová kyselina, která po expresi ve vhodné hostitelské buňce vede k zisku protilátky podle nároku 1, nebo jejímu fragmentu.

16. Polynukleová kyselina, která po expresi ve vhodné hostitelské buňce vede k zisku protilátky podle nároku 5, nebo jejímu fragmentu.

17. Expresní vektor pro expresi protilátky nebo jejího fragmentu podle nároku 1, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující uvedenou protilátku nebo fragment.

18. Buňka, která je transfektovaná expresním vektorem podle nároku 17.

19. Buňka, která je transfektovaná dvěma expresními vektor/ podle nároku 17, kde první vektor obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující lehký řetězec a druhý vektor obsahuje sekvenci kódující těžký řetězec.

20. Expresní vektor pro expresi protilátky nebo jejího fragmentu podle nároku 5, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující uvedenou protilátku nebo fragment.

21. Buňka, která je transfektovaná expresním vektorem podle nároku 20.

22. Buňka, která je transfektovaná dvěma expresními vektor/ podle nároku 20, kde první vektor obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující lehký řetězec a druhý vektor obsahuje sekvenci kódující těžký řetězec.

23. Buňka, která je schopna exprese lidské protilátky nebo jejího fragmentu podle nároku 1 nebo 5.

24. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou protilátku nebo fragment podle jakéhokoliv z nároků 1 nebo 5 a farmaceuticky přijatelné přísady.

25. Použití humanizované protilátky nebo jejího fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 1 nebo 5 pro výrobu léčiva pro léčbu klinické nebo preklinické Alzheimerovy nemoci, Downova syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatie.

26. Použití humanizované protilátky nebo jejího fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 1 nebo 5 pro výrobu léčiva pro léčbu, prevenci nebo revertování zhoršení kognitivních funkcí při klinické nebo preklinické Alzheimerovy nemoci, Downově syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatie.

-39CZ 304211 B6

27. Použití humanizované protilátky nebo fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 1 nebo 5 pro výrobu léčiva pro léčbu Alzheimerovy nemoci.