[go: up one dir, main page]

CZ20013527A3 - Sloučeniny a způsoby pro terapii a diagnostiku karcinomu plic - Google Patents

Sloučeniny a způsoby pro terapii a diagnostiku karcinomu plic Download PDF

Info

Publication number
CZ20013527A3
CZ20013527A3 CZ20013527A CZ20013527A CZ20013527A3 CZ 20013527 A3 CZ20013527 A3 CZ 20013527A3 CZ 20013527 A CZ20013527 A CZ 20013527A CZ 20013527 A CZ20013527 A CZ 20013527A CZ 20013527 A3 CZ20013527 A3 CZ 20013527A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
polynucleotide
sequences
patient
cdna sequence
Prior art date
Application number
CZ20013527A
Other languages
English (en)
Inventor
Tongtong Wang
Liqun Fan
Original Assignee
Corixa Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/285,479 external-priority patent/US6821518B1/en
Priority claimed from US09/466,396 external-priority patent/US6696247B2/en
Priority claimed from US09/476,496 external-priority patent/US6706262B1/en
Priority claimed from US09/480,884 external-priority patent/US6482597B1/en
Application filed by Corixa Corporation filed Critical Corixa Corporation
Publication of CZ20013527A3 publication Critical patent/CZ20013527A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká obecně léčby a diagnostiky nádorů, jako je karcinomu plic. Přesněji se vynález týká polypeptidů obsahujících alespoň část proteinu karcinomu plic a polynukleotidů kódujících takové polypeptidy. Takové polypeptidy a polynukleotidy mohou být použity ve vakcínách a farmaceutických prostředcích pro prevenci a léčbu karcinomu plic, a pro diagnostiku a sledování takových nádorů.
Dosavadní stav techniky
Karcinom plic je hlavní příčinou úmrtí na nádorové onemocnění u mužů a žen ve Spojených Státech Amerických a v roce 1994 bylo zjištěno 172000 nových případů., 5-leté přežití u všech pacientů s karcinomem plic, bez ohledu na stadium v době diagnosy, je pouze 13%. Toto je v protikladu s 5-letým přežitím 46% u případů lokalizovaného onemocnění. Nicméně, pouze 16% případů karcinomu plic je diagnostikováno před disseminací onemocnění.
Časná diagnostika je obtížná, protože klinické příznaky často nejsou přítomny až do dosažení pokročiléhpo stadia. V současnosti se k diagnostice využívá rentgenový snímek plic, cytologické vyšetření sputa a bronchoskopické -vyšetření. Léčba je různá podle typu a stadia nádoru a zahrnuje operační léčbu, radioterapii a/nebo chemoterapii. I přes rozsáhlý výzkum zaměřený na léčbu karcinomu plic zůstává tento nádor obtížně léčitelný.
Proto existuje potřeba zlepšených vakcín, terapeutických postupů a diagnostických technik pro karcinom plic.
• · · ·
Podstata vynálezu
Stručně, vynález poskytuje prostředky a způsoby pro terapii nádorů, jako je karcinom plic. V jednom aspektu vynález poskytuje polypeptidy obsahující imunogenní část plicního karcinomového proteinu, nebo jeho varianty. V některých provedeních jsou varianty imunogenní, takže schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen není významně snížena. V některých provedeních má polypeptid sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující: (a) sekvence uvedené v jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71,
111,
113,
125, 127,
73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109,
128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160,
167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188 -191, 193, 194, 198-207, 209,
210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347 a 349 ; (b) varianty
sekvencí uvedených v jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO : 1-3, 6-8,
10-13, 15 -27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54 55, 57- 59, 61-69, 71,
73, 74, 77, 78 , 80-82, 84, 86-96, 107 -109, 111, 113, 125, 127,
128, 129, 131- 133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160,
167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188 -191, 193, 194, 198-207, 209,
210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347 a 349 ; a (c)
sekvencí komplementárních k sekvencím uvedeným v (a) nebo (b). ve specifických provedeních obsahují polypeptidy podle předkládaného vynálezu alespoň část nádorového proteinu, který obsahuje aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv ze SEQ ID NO: 152, 155, 156, 165, 166, 169, 170, 172, 174, 176, 226-252, 338-344 a 346, a jejich varianty.
Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotid, který kóduje polypeptid popsaný výše nebo jeho část (například část kódující alespoň 15 aminokyselinových zbytků proteinu karcinomu plic), expresní vektory obsahující takové polynukleotidy a hostitelské ···· ·» »· ···· ·· ·· ··· 9 · 9 ···· • 9 · 9 · 4 · · ·· · ·· 9 9 · · · · · · · 9 • ••9 99 9 99«
99 ·· 999 ·· 9999 buňky transformované nebo transfektované takovými expresními vektory.
V jiných aspektech předkládaný vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující polypeptid nebo polynukleotid popsaný výše a fyziologicky přijatelný nosič.
V příbuzném aspektu vynález poskytuje vakcíny pro profylaktické nebo terapeutické použití. Takové vakcíny obsahují polypeptid nebo polynukleotid popsaný výše a imunostimulační činidlo.
Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutické prostředky obsahující: (a) protilátku nebo její vazebný fragment pro antigen, která se specificky váže na protein karcinomu plic; a (b) fyziologicky přijatelný nosič.
V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující: (a) buňku prezentující antigen, která exprimuje polypeptid popsaný výše; a (b) fyziologicky přijatelný nosič nebo přísadu. Mezi buňky prezentující antigen patří dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a B-lymfocyty.
V příbuzné provedení předkládaný vynález poskytuje vakcíny obsahující: (a) buňku prezentující antigen, která exprimuje polypeptid popsaný výše; a (b) imunostimulační činidlo.
Předkládaný vynález dále poskytuje, v jiných aspektech, fúzní proteiny, které obsahují alespoň jeden polypeptid, jak je popsán výše, stejně jako polynukleotidy kódující takové fúzní proteiny.
V příbuzných aspektech poskytuje vynález farmaceutické prostředky obsahující fúzní protein nebo polynukleotid kódující fúzní protein, v kombinaci s fyziologicky přijatelným nosičem.
V dalších aspektech poskytuje vynález vakcíny obsahující fúzní protein nebo polynukleotid kódující fúzní protein v kombinaci s imunostimulačním činidlem.
V dalších aspektech poskytuje vynález způsoby pro inhibici vývoje nádoru u pacienta, při kterých je pacientovi podán farmaceutický prostředek nebo vakcína popsaná výše.
Předkládaný vynález dále poskytuje, v dalších aspektech, způsoby pro odstranění nádorových buněk z biologického vzorku, které zahrnují kontaktování biologického vzorku s T-lymfocyty, které specificky reagují s proteinem karcinomu plic, kde krok kontaktování je proveden za podmínek a po dobu dostatečnou pro odstranění buněk exprimujících protein ze vzorku.
V příbuzných aspektech poskytuje vynález způsoby pro inhibici vývoje nádoru u pacienta, při kterých je pacientovi podán biologický vzorek zpracovaný způsobem popsaným výše.
V dalších aspektech poskytuje vynález způsoby pro stimulaci a/nebo expanzi T-lymfocytů specifických pro protein karcinomu plic, které zahrnují kontaktování T-lymfocytů s: (i) polypeptidem popsaným výše; (ii) polynukleotidem kódujícím takový polypeptid; a/nebo (iii) buňkou prezentující antigen, která exprimuje takový polypeptid; za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění stimulace a/nebo expanze T-lymfocytů. Vynález také poskytuje určené populace T-lymfocytů obsahující T-lymfocyty popsané výše.
V dalších aspektech poskytuje vynález způsoby pro inhibici vývoje nádoru u pacienta, při kterých je pacientovi podáno účinné množství T-lymfocytů připravených způsobem popsaným výše.
• · · · · · · • · · ··«·· · · · *·· ··· · ··· · • · · · ·· · ··· ·· ·· ·· ··· ·· ····
V dalších aspektech poskytuje vynález způsoby pro inhibici vývoje nádoru u pacienta, které zahrnují následující kroky: (a) inkubaci CD4* a/nebo CD8* T-lymfocytů izolovaných od pacienta s: (i) polypeptidem obsahujícím alespoň imunogenní část proteinu karcinomu plic; (ii) polynukleotidem kódujícím takový polypeptid,a (iii) buňkou prezentující antigen, která exprimuje takový polypeptid; a (b) podání účinného množství proliferovaných T-lymfocytů pacientovi a tím inhibici vývoje karcinomu u pacienta. Proliferované buňky mohou - ale nemusí - být před podáním pacientovi klonovány.
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta, který zahrnuje kroky: (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta s vazebným činidlem, které se váže na polypeptid popsaný výše; (b) detekování množství polypeptidu ve vzorku, který se váže na vazebné činidlo; a (c) srovnání množství polypeptidu s předem určenou hraniční hodnotou a z toho stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta, ve výhodných provedeních je vazebným činidlem protilátka, výhodně monoklonální protilátka. Nádorem může být karcinom plic.
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob pro sledování progrese nádoru u pacienta, který zahrnuje kroky: (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta v první době s vazebným činidlem, které se váže na polypeptid popsaný výše; (b) detekování množství polypeptidu ve vzorku, který se váže na vazebné činidlo; a (c) opakování kroků (a) a (b) za použití biologického vzorku získaného od pacienta v další době; a (d) srovnání množství polypeptidu detekovaného v kroku (c) s množstvím detekovaným v kroku (b) a z toho sledování progrese nádoru u pacienta.
···· • ··· ·· ·· • ♦ ♦ · * · ♦ · . ♦ · · · · · · · · · · · ♦ · · ··· · · ···· · · · ··· ·· ·· ·· ··· ·· ····
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta, který zahrnuje kroky: (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta s oligonukleotidem, který hybridizuje na polynukleotid, který kóduje protein karcinomu plic; (b) detekování množství polynukleotidu ve vzorku, výhodně mRNA, který hybridizuje na oligonukleotid; a (c) srovnání množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, s předem určenou hraniční hodnotou a tím stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta. V některých provedeních je množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, určeno pomocí polymerasové řetězové reakce, za použití, například, alespoň jednoho oligonukleotidového primeru, který hybridizuje na polynukleotid kódující polypeptid popsaný výše, nebo na polynukleotid komplementární k takovému polynukleotidu. V jiných provedeních je množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, určeno pomocí hybridizační techniky, za použití oligonukleotidové sondy, která hybridizuje na polynukleotid kódující polypeptid popsaný výše, nebo na polynukleotid komplementární k takovému polynukleotidu.
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob pro sledování progrese nádoru u pacienta, který zahrnuje kroky: (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta s oligonukleotidem, který hybridizuje na polynukleotid, který kóduje protein karcinomu plic; (b) detekování množství polynukleotidu ve vzorku, který hybridizuje na oligonukleotid; (c) opakování kroků (a) a (b) za použití biologického vzorku získaného od pacienta v další době; a (d) srovnání množství polynukleotidu detekovaného v kroku (c) s množstvím detekovaným v kroku (b) a z toho sledování progrese nádoru u pacienta.
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález protilátky, jako jsou monoklonální protilátky, které se váží na polypeptid popsaný výše, stejně jako diagnostické kity obsahující takové protilátky, vynález také poskytuje diagnostické kity obsahující jednu nebo více oligonukleotidových sond nebo primerů popsaných výše.
Tyto a další aspekty předkládaného vynáleu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a připojených výkresů. Všechny uvedené citace jsou použity jako odkazy ve své úplnosti.
Identifikace sekvencí:
SEQ ID NO: 1 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-2
SEQ ID NO: 2 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-28
SEQ ID NO: 3 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-90
SEQ ID NO: 4 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-144
SEQ ID NO: 5 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-133
SEQ ID NO: 6 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-169
SEQ ID NO: 7 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-6
SEQ ID NO: 8 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-11
SEQ ID NO: 9 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-17
SEQ ID NO: 10 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-25
SEQ ID NO: 11 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-39
SEQ ID NO: 12 je první určená cDNA sekvence pro LST-S2-43
SEQ ID NO: 13 je druhá určená cDNA sekvence pro LST-S2-43
SEQ ID NO: 14 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-65
SEQ ID NO: 15 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-68
SEQ ID NO: 16 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-72
SEQ ID NO: 17 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-74
SEQ ID NO: 18 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-103
SEQ ID NO: 19 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-1F
SEQ ID NO: 20 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-2A
SEQ ID NO: 21 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-4H
SEQ ID NO: 22 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-5A
SEQ ID NO: 23 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-6B
SEQ ID NO: 24 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-N1-7B
SEQ ID NO: 25 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-N1-7H
SEQ ID NO: 26 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-N1-8A
SEQ ID NO: 27 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-8D
SEQ ID NO: 28 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-9A
SEQ ID NO: 29 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-9E
SEQ ID NO: 30 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-10A
SEQ ID NO: 31 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-10G
SEQ ID NO: 32 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-11A
SEQ ID NO: 33 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-12C
SEQ ID NO: 34 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-N1-12E
SEQ ID NO: 35 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-3D
SEQ ID NO: 36 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-6C
SEQ ID NO: 37 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-5D
SEQ ID NO: 38 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-B1-5F
SEQ ID NO: 39 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-6G
SEQ ID NO: 40 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-8A
SEQ ID NO: 41 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-8D
SEQ ID NO: 42 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-10A
SEQ ID NO: 43 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-9B
SEQ ID NO: 44 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-B1-9F
SEQ ID NO: 45 je určená cDNA sekvence pro LST-S2-B1-12D
SEQ ID NO: 46 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-2B
SEQ ID NO: 47 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-5F
SEQ ID NO: 48 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-6B
SEQ ID NO: 49 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-7F
SEQ ID NO: 50 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-8G
SEQ ID NO: 51 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-9E
SEQ ID NO: 52 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-I2-12B
SEQ ID NO: 53 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-2C
SEQ ID NO: 54 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-1G
SEQ ID NO: 55 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-4G
SEQ ID NO: 56 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-3H
SEQ ID NO: 57 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-5G
SEQ ID NO: 58 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-9B
SEQ ID NO: 59 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-10H
SEQ ID NO: 60 je určená CDNA sekvence pro LST-S2-H2-12D
SEQ ID NO: 61 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-2
SEQ ID NO: 62 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-4
SEQ ID NO: 63 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-7
SEQ ID NO: 64 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-8
SEQ ID NO: 65 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-12
SEQ ID NO: 66 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-13
SEQ ID NO: 67 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-14
SEQ ID NO: 68 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-16
SEQ ID NO: 69 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-21
SEQ ID NO: 70 je určená CDNA sekvence pro LST-S3-22
SEQ ID NO: 71 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-7
SEQ ID NO: 72 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-1E
SEQ ID NO: 73 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-1G
SEQ ID NO: 74 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-3E
SEQ ID NO: 75 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-4E
SEQ ID NO: 76 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-6D
SEQ ID NO: 77 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-8D
SEQ ID NO: 78 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-10A
SEQ ID NO: 79 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-10C
SEQ ID NO: 80 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-9D
SEQ ID NO: 81 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-10D
SEQ ID NO: 82 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-9H
SEQ ID NO: 83 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-11D
SEQ ID NO: 84 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-12D
SEQ ID NO: 85 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-11E
SEQ ID NO: 86 je určená CDNA sekvence pro LST-S1-A-12E
SEQ ID NO: 87 je určená CDNA sekvence pro L513S (T3)
SEQ ID NO: 88 je určená CDNA sekvence pro L513S soubor 1
SEQ ID NO: 89 je první určená ; cDNA sekvence pro L514S
9999 • · • 999 ··
SEQ ID NO: 90 je druhá určená cDNA sekvence pro L514S
SEQ ID NO: 91 je první určená cDNA sekvence pro L516S
SEQ ID NO: 92 je druhá určená cDNA sekvence pro L516S
SEQ ID NO: 93 je určená cDNA sekvence pro L517S
SEQ ID NO: 94 je rozšířená cDNA sekvence pro LST-S1-169
(též známý jako L519S)
SEQ ID NO: 95 je první určená CDNA sekvence pro L520S
SEQ ID NO: 96 je druhá určená CDNA sekvence pro L520S
SEQ ID NO: 97 je první určená CDNA sekvence pro L521S
SEQ ID NO: 98 je druhá určená CDNA sekvence pro L521S
SEQ ID NO: 99 je určená cDNA sekvence pro L522S
SEQ ID NO: 100 je určená cDNA sekvence pro L523S
SEQ ID NO: 101 je určená cDNA sekvence pro L524S
SEQ ID NO: 102 je určená CDNA sekvence pro L525S
SEQ ID NO: 103 je určená CDNA sekvence pro L526S
SEQ ID NO: 104 je určená CDNA sekvence pro L527S
SEQ ID NO: 105 je určená CDNA sekvence pro L528S
SEQ ID NO: 106 je určená CDNA sekvence pro L529S
SEQ ID NO: 107 je první určená cDNA sekvence pro L530S
SEQ ID NO: 108 je druhá určená cDNA sekvence pro L530S
SEQ ID NO: 109 je určená kompletní cDNA sekvence pro krátkou formu
L531S
SEQ ID NO: 110 je předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná
SEQ ID NO: 109
SEQ ID NO: 111 je určená kompletní cDNA sekvence pro dlouhou formu
L531S
SEQ.ID NO: 112 je předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná
SEQ ID NO: 111
SEQ ID NO: 113 je určená kompletní cDNA sekvence pro L520S
SEQ ID NO: 114 je předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná
SEQ ID NO: 113
SEQ ID NO: 115 je určená cDNA sekvence pro soubor 1
SEQ ID NO: 116 je určená cDNA sekvence pro soubor 3
SEQ ID NO: 117 je určená cDNA sekvence pro soubor 4
SEQ ID NO: 118 je určená CDNA sekvence pro soubor 5
SEQ ID NO: 119 je určená CDNA sekvence pro soubor 7
SEQ ID NO: 120 je určená CDNA sekvence pro soubor 8
SEQ ID NO: 121 je určená CDNA sekvence pro soubor 9
SEQ ID NO: 122 je určená CDNA sekvence pro soubor 10
SEQ ID NO: 123 je určená CDNA sekvence pro soubor 12
SEQ ID NO: 124 je určená CDNA sekvence pro soubor 11
SEQ ID NO: 125 je určená CDNA sekvence pro soubor 13
SEQ ID NO: 126 je určená CDNA sekvence pro soubor 15
SEQ ID NO: 127 je určená CDNA sekvence pro soubor 16
SEQ ID NO: 128 je určená CDNA sekvence pro soubor 17
SEQ ID NO: 129 je určená CDNA sekvence pro soubor 19
SEQ ID NO: 130 je určená CDNA sekvence pro soubor 20
SEQ ID NO: 131 je určená CDNA sekvence pro soubor 22
SEQ ID NO: 132 je určená CDNA sekvence pro soubor 24
SEQ ID NO: 133 je určená CDNA sekvence pro soubor 29
SEQ ID NO: 134 je určená CDNA sekvence pro soubor 31
SEQ ID NO: 135 je určená CDNA sekvence pro soubor 33
SEQ ID NO: 136 je určená CDNA sekvence pro soubor 38
SEQ ID NO: 137 je určená CDNA sekvence pro soubor 39
SEQ ID NO: 138 je určená CDNA sekvence pro soubor 41
SEQ ID NO: 139 je určená CDNA sekvence pro soubor 43
SEQ ID NO: 140 je určená CDNA sekvence pro soubor 44
SEQ ID NO: 141 je určená CDNA sekvence pro soubor 45
SEQ ID NO: 142 je určená CDNA sekvence pro soubor 47
SEQ ID NO: 143 je určená CDNA sekvence pro soubor 48
SEQ ID NO: 144 je určená CDNA sekvence pro soubor 49
SEQ ID NO: 145 je určená CDNA sekvence pro soubor 50
SEQ ID NO: 146 je určená CDNA sekvence pro soubor 53
SEQ ID NO: 147 je určená CDNA sekvence pro soubor 54
SEQ ID NO: 148 je určená CDNA sekvence pro soubor 56
·· ** • r* * 99 v φ
• • · • · 9 » W 9 9 • 9 • · • ·
• • 9 ·· • · · • · ·· • · • · • « ···> 9 9 « * 9 09 « 9 999 ·
SEQ
SEQ
SEQ
ID
ID
NO:
NO:
149
150 je je je určená cDNA sekvence pro soubor 57 určená cDNA sekvence pro soubor 58 kompletní cDNA sekvence pro L530S
151
NO:
ID
SEQ ID NO: 152 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 151
SEQ ID NO: 153 je kompletní cDNA sekvence první varianty L514S
SEQ ID NO: 154 je kompletní cDNA sekvence druhé varianty L514S
SEQ ID NO: 155 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 153
SEQ ID NO: 156 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 154
SEQ ID NO: 157 je určená cDNA sekvence pro soubor 59
SEQ ID NO: 158 je kompletní cDNA sekvence pro L763P (též
označovaný jako soubor 22)
SEQ ID NO: 159 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 158
SEQ ID NO: 160 je kompletní cDNA sekvence pro L762P (též
označovaný jako soubor 17)
SEQ ID NO: 161 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 160
SEQ ID NO: 162 je určená cDNA sekvence pro L515S
SEQ ID NO: 163 je kompletní cDNA sekvence první varianty L524S
SEQ ID NO: 164 je kompletní cDNA sekvence druhé varianty L524S
SEQ ID NO: 165 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 163
SEQ ID NO: 166 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 164
SEQ ID NO: 167 je kompletní cDNA sekvence první varianty L762P
SEQ ID NO: 168 je kompletní cDNA sekvence druhé varianty L762P
SEQ ID NO: 169 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 167
SEQ ID NO: 170 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 168
SEQ ID NO: 171 je kompletní cDNA sekvence pro L773P (též
označovaný jako soubor 56)
SEQ ID NO: 172 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 171
SEQ ID NO: 173 je prodloužená cDNA sekvence pro L519S
SEQ ID NO: 174 je předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná
SEQ ID NO: 173
SEQ ID NO: 175 je kompletní cDNA sekvence pro L523S
SEQ ID NO: 176 je předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná
SEQ ID NO: 175
SEQ ID NO: 177 je určená CDNA sekvence pro LST-sub5~7A
SEQ ID NO: 178 je určená CDNA sekvence pro LST-sub5-8G
SEQ ID NO: 179 je určená CDNA sekvence pro LST-sub5-8H
SEQ ID NO: 180 je určená CDNA sekvence pro LST-Sub5-10B
SEQ ID NO: 181 je určená CDNA sekvence pro LST-sub5-10H
SEQ ID NO: 182 je určená CDNA sekvence pro LST-sub5-12B
SEQ ID NO: 183 je určená CDNA sekvence pro LST-Sub5-llC
SEQ ID NO: 184 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-lc
SEQ ID NO: 185 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-2f
SEQ ID NO: 186 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-2G
SEQ ID NO: 187 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-4d
SEQ ID NO: 188 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-4e
SEQ ID NO: 189 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-4f
SEQ ID NO: 190 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-3h
SEQ ID NO: 191 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-5d
SEQ ID NO: 192 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-5h
SEQ ID NO: 193 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-6h
SEQ ID NO: 194 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-7a
SEQ ID NO: 195 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-8a
SEQ ID NO: 196 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-77d
SEQ ID NO: 197 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-7e
SEQ ID NO: 198 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-8e
SEQ ID NO: 199 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-7g
SEQ ID NO: 200 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-9f
SEQ ID NO: 201 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-9h
SEQ ID NO: 202 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-llb
SEQ ID NO: 203 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-llc
SEQ ID NO: 204 je určená CDNA sekvence pro LST-Sub6-12c
SEQ ID NO: 205 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-12e
SEQ ID NO: 206 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-12f
SEQ ID NO: 207 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-llg
SEQ ID NO: 208 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-12g
SEQ ID NO: 209 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-12h
• · · ·
SEQ ID NO: 210 je určená cDNA sekvence pro LST-sub6-II-la
SEQ ID NO: 211 je určená cDNA sekvence pro LST-sub6-II-2b
SEQ ID NO: 212 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-2g
SEQ ID NO: 213 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-lh
SEQ ID NO: 214 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-4a
SEQ ID NO: 215 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-4b
SEQ ID NO: 216 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-3e
SEQ ID NO: 217 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-4f
SEQ ID NO: 218 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-4g
SEQ ID NO: 219 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-4h
SEQ ID NO: 220 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-5c
SEQ ID NO: 221 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-5e
SEQ ID NO: 222 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-6f
SEQ ID NO: 223 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-5g
SEQ ID NO: 224 je určená CDNA sekvence pro LST-sub6-II-6g
SEQ ID NO: 225 je aminokyselinová sekvence pro L528S
SEQ ID NO: 226-251 jsou syntetické peptidy odvozené od L762P
SEQ ID NO: 252 je exprimovaná aminokyselinová sekvence L514S
SEQ ID NO: 253 je DNA sekvence odpovídající SEQ ID NO: 252.
SEQ ID NO: 254 je DNA sekvence expresního konstruktu L762P
SEQ ID NO: 255 je určená CDNA sekvence pro klon 23785
SEQ ID NO: 256 je určená CDNA sekvence pro klon 23786
SEQ ID NO: 257 je určená CDNA sekvence pro klon 23788
SEQ ID NO: 258 je určená CDNA sekvence pro klon 23790
SEQ ID NO: 259 je určená CDNA sekvence pro klon 23793
SEQ ID NO: 260 je určená CDNA sekvence pro klon 23794
SEQ ID NO: 261 je určená CDNA sekvence pro klon 23795
SEQ ID NO: 262 je určená CDNA sekvence pro klon 23796
SEQ ID NO: 263 je určená CDNA sekvence pro klon 23797
SEQ ID NO: 264 je určená CDNA sekvence pro klon 23798
SEQ ID NO: 265 je určená CDNA sekvence pro klon 23799
SEQ ID NO: 266 je určená CDNA sekvence pro klon 23800
SEQ ID NO: 267 je určená CDNA sekvence pro klon 23802
• · 9 ·
SEQ ID NO: 268 je určená cDNA sekvence pro klon 23803
SEQ ID NO: 269 je určená CDNA sekvence pro klon 23804
SEQ ID NO: 270 je určená CDNA sekvence pro klon 23805
SEQ ID NO: 271 je určená CDNA sekvence pro klon 23806
SEQ ID NO: 272 je určená CDNA sekvence pro klon 23807
SEQ ID NO: 273 je určená CDNA sekvence pro klon 23808
SEQ ID NO: 274 je určená CDNA sekvence pro klon 23809
SEQ ID NO: 275 je určená CDNA sekvence pro klon 23810
SEQ ID NO: 276 je určená CDNA sekvence pro klon 23811
SEQ ID NO: 277 je určená CDNA sekvence pro klon 23812
SEQ ID NO: 278 je určená CDNA sekvence pro klon 23813
SEQ ID NO: 279 je určená CDNA sekvence pro klon 23815
SEQ ID NO: 280 je určená CDNA sekvence pro klon 25298
SEQ ID NO: 281 je určená CDNA sekvence pro klon 25299
SEQ ID NO: 282 je určená CDNA sekvence pro klon 25300
SEQ ID NO: 283 je určená CDNA sekvence pro klon 25301
SEQ ID NO: 284 je určená CDNA sekvence pro klon 25304
SEQ ID NO: 285 je určená CDNA sekvence pro klon 25309
SEQ ID NO: 286 je určená CDNA sekvence pro klon 25312
SEQ ID NO: 287 je určená CDNA sekvence pro klon 25317
SEQ ID NO: 288 je určená CDNA sekvence pro klon 25321
SEQ ID NO: 289 je určená CDNA sekvence pro klon 25323
SEQ ID NO: 290 je určená CDNA sekvence pro klon 25327
SEQ ID NO: 291 je určená CDNA sekvence pro klon 25328
SEQ ID NO: 292 je určená cDNA sekvence pro klon 25332
SEQ ID NO: 293 je určená CDNA sekvence pro klon 25333
SEQ ID NO: 294 je určená CDNA sekvence pro klon 25336
SEQ ID NO: 295 je určená CDNA sekvence pro klon 25340
SEQ ID NO: 296 je určená CDNA sekvence pro klon 25340
SEQ ID NO: 297 je určená CDNA sekvence pro klon 25356
SEQ ID NO: 298 je určená CDNA sekvence pro klon 25357
SEQ ID NO: 299 je určená CDNA sekvence pro klon 25361
SEQ ID NO: 300 je určená CDNA sekvence pro klon 25363
···· ·· ·· ···· ·· ·· • · · ··· ···· • · · ····· · · · • · · · «· · · · ·· ····
SEQ ID NO: 301 je určená cDNA sekvence pro klon 25394
SEQ ID NO: 302 je určená CDNA sekvence pro klon 25402
SEQ ID NO: 303 je určená CDNA sekvence pro klon 25403
SEQ ID NO: 304 je určená CDNA sekvence pro klon 25405
SEQ ID NO: 305 je určená CDNA sekvence pro klon 25407
SEQ ID NO: 306 je určená CDNA sekvence pro klon 25409
SEQ ID NO: 307 je určená CDNA sekvence pro klon 25396
SEQ ID NO: 308 je určená CDNA sekvence pro klon 25414
SEQ ID NO: 309 je určená cDNA sekvence pro klon 25410
SEQ ID NO: 310 je určená CDNA sekvence pro klon 25406
SEQ ID NO: 311 je určená CDNA sekvence pro klon 25306
SEQ ID NO: 312 je určená CDNA sekvence pro klon 25362
SEQ ID NO: 313 je určená CDNA sekvence pro klon 25360
SEQ ID NO: 314 je určená CDNA sekvence pro klon 25398
SEQ ID NO: 315 je určená CDNA sekvence pro klon 25355
SEQ ID NO: 316 je určená CDNA sekvence pro klon 25351
SEQ ID NO: 317 je určená CDNA sekvence pro klon 25331
SEQ ID NO: 318 je určená CDNA sekvence pro klon 25338
SEQ ID NO: 319 je určená CDNA sekvence pro klon 25335
SEQ ID NO: 320 je určená CDNA sekvence pro klon 25329
SEQ ID NO: 321 je určená CDNA sekvence pro klon 25324
SEQ ID NO: 322 je určená CDNA sekvence pro klon 25322
SEQ ID NO: 323 je určená cDNA sekvence pro klon 25319
SEQ ID NO: 324 je určená CDNA sekvence pro klon 25316
SEQ ID NO: 325 je určená CDNA sekvence pro klon 25311
SEQ ID NO: 326 je určená CDNA sekvence pro klon 25310
SEQ ID NO: 327 je určená CDNA sekvence pro klon 25302
SEQ ID NO: 328 je určená CDNA sekvence pro klon 25315
SEQ ID NO: 329 je určená CDNA sekvence pro klon 25308
SEQ ID NO: 330 je určená CDNA sekvence pro klon 25303
SEQ ID NO: 331- 337 ' jsou cDNA sekvence izoforem homologu p53
supresoru, p63 (který je též označovaný jako L530S)
SEQ ID NO: 338-344 jsou aminokyselinové sekvence kódované SEQ ID • · · · • ·
NO: 331 -337 , v
SEQ ID NO: 345 je
SEQ ID NO: 346 je
ID NO: 345
SEQ ID NO: 347 je
SEQ ID NO: 348 je
SEQ ID NO: : 347
SEQ ID NO: 349 je
SEQ ID NO: 350 je
příslušném pořadí.
druhá cDNA sekvence pro antigen L763P. aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ určená kompletní cDNA sekvence pro L523S předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná cDNA sekvence kódující N-koncovou část L773P aminokyselinová sekvence N-koncové části L773P.
Podrobný popis vynálezu
Jak bylo uvedeno výše, je předkládaný vynález obecně zaměřen na prostředky a způsoby pro terapii nádorů, jako je karcinom plic. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat polypeptidy plicních nádorů, polynukleotidy kódující takové polypeptidy, vazebná činidla, jako jsou protilátky, buňky prezentující antigen (APC) a/nebo buňky imunitního systému (například T-lymfocyty). Polypeptidy podle předkládaného vynálezu obecně obsahují alespoň část (jako je imunogenní část) proteinu plicních nádorů nebo jeho varianty. Protein plůicního nádoru je protein, který je exprimovaný buňkami plicního nádoru (výhodně lidskými buňkami) v úrovni, která je alespoň dvakrát, lépe alespoň pětkrát vyšší než úroveň exprese v normálních tkáních, jak je určeno zde popsanými representativními testy. Některé proteiny plicních nádorů jsou nádorové proteiny, které reagují detekovatelně (v imunotestech, jako je ELISA nebo westernová hybridizace) s antisérem od pacenta s plicním nádorem. Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu obecně obsahují DNA nebo RNA sekvenci, která kóduje celý nebo část takového polypeptidu, nebo která je komplementární k takové sekvenci. Protilátky jsou obecně proteiny imunitního systému, nebo jejich • · · · • · vazebné fragmenty pro antigen, které se mohou vázat na alespoň část polypeptidu popsaného výše. Buňky prezentující antigen zahrnují dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a B-lymfocyty, které exprimují polypeptid, jak je zde popsán. T-lymfocyty, které mohou být použity v prostředcích podle předkládaného vynálezu, jsou obecně T-lymfocyty, které jsou specifické pro polypeptid, jak je zde popsán.
Předkládaný vynález je založen na objevu lidských plicních nádorových proteinů. Sekvence polynukleotidů kódujících specifické nádorové proteiny jsou uvedeny v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153,. 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349.
Polynukleotidy proteinů plicních nádorů
Jakýkoliv polynukleotid, který kóduje plicní nádorový protein nebo jeho část nebo jinou variantu, jak je zde popsána, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Výhodné polynukleotidy obsahují alespoň 15 následujících nukleotidů, lépe alespoň 30 následujících nukleotidů, ještě lépe alespoň 45 následujících nukleotidů, které kódují část plicního nádorového proteinu. Ještě lépe kóduje polynukleotid imunogenní část plicního nádorového proteinu. Polynukleotidy komplementární k jakékoliv takové sekvenci také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Polynukleotidy mohou být jednořetězcové (kódující nebo protismyslné) nebo dvouřetězcové, a mohou to být DNA (genomové, cDNA nebo syntetické) nebo RNA molekuly. Mezi RNA molekuly patří HnRNA molekuly, které obsahují introny a zcela odpovídají DNA molekule, a mRNA molekuly, které neobsahují introny. Další kódující nebo nekódující sekvence mohou, ale nemusí, být přítomny v polynukleotidu podle předkládaného vynálezu, a polynukleotid může, ale nemusí, být navázán na jiné molekuly nebo nosiče.
Polynukleotidy mohou obsahovat přirozené sekvence (t.j. endogenní sekvence, které kódují plicní nádorový protein nebo jeho část) nebo mohou obsahovat varianty takové sekvence. Varianty polynukleotidů mohou obsahovat jednu nebo více substitucí, adicí, delecí a/nebo insercí, které nesnižují imunogenicitu kódovaného polypeptidu ve srovnání s přirozeným nádorovým proteinem. Vliv na imunogenicitu kódovaného polypeptidu může být hodnocen způsobem zde popsaným. Varianty výhodně vykazují alespoň 70% identitu, lépe alespoň 80% identitu a nejlépe alespoň 90% identitu s polynukleotidovou sekvencí kódující přirozený plicní nádorový protein nebo jeho část. Termín varianta také zahrnuje homologní geny xenogenního původu.
Dvě polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence jsou identické, pokud je sekvence nukleotidů nebo aminokyselin dvou sekvencí stejná, jsou-li sekvence přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální shody. Srovnání dvou sekvencí je obvykle provedeno ve srovnávacím oknu za účelem identifikace a srovnání lokálních regionů podobnosti sekvence. Termín srovnávací okno”, jak je zde použit, označuje segment alespoň 20 následujících pozic, obvykle 35 až 75 nebo 40 až 50, ve kterých může být sekvence srovnávána s referenční sekvencí o stejném počtu pozic po optimálním přiřazení dvou sekvencí.
Optimální přiřazení dvou sekvencí pro srovnání může být provedeno za použití Megalign programu v Lasergene bioinformatickém softwaru (DNASTAR, lne., Madison, WI) , za použití chybových parametrů. Tento program využívá několik schémat přiřazení sekvencí, které jsou popsány v následujících odkazech: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. V Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, svazek 5, Suppl. 3, str.
·»·· ♦ ··♦·
345-358; Hein, J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes str. 626-645, Methods in Enzymology svazek 183, Academie Press, lne., San Diego, CA; Higgins, D.G., and Sharp, P.M., (1989), CABIOS 5: 151-153; Myers, E.W. and Muller, W.
(1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E.D. (1971), Comb. Theor. 11: 105; Santou, N., Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisko, CA; Wilbur, W.J., and Lipman, D.J., (1983), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 726-730.
Výhodně je procento identity sekvencí určeno srovnáním dvou optimálně přiřazených sekvencí ve srovnávacím okénku velikosti alespoň 20 pozic, kde část polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence v okénku může obsahovat adice nebo delece (t.j. mezery) z 20% nebo méně, obvykle z 5 až 15%, nebo 10 až 12%, vzhledem k referenční sekvenci (která neobsahuje adice ani delece). Procento identity může být vypočteno určením počtu pozic, ve kterých se vyskytují identické baze nebo aminokyseliny v obou sekvencích za zisku počtu odpovídajících pozic, dělením počtu odpovídajících pozic celkovým počtem pozic v referenční sekvenci (t.j. velikostí okna) a násobením výsledku 100 za zisku procenta identity sekvencí.
Varianty mohou být také, nebo alternativně, významně homologické s přirozeným genem nebo jeho částí nebo jeho komplementem. Takové polynukleotidové varianty jsou schopné hybridizovat za středně přísných podmínek na přirozené DNA sekvence kódující přirozený plicní nádorový protein (nebo na komplementární sekvenci). Vhodné středně přísné podmínky jsou předpromytí v roztoku 5xSSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8); hybridizace při 50 °C - 65 °C, 5 x SSC přes noc; a potom promytí dvakrát při 65 °C ve 2x, 0,5x a 0,2 x SSC obsahujícím 0,1% SDS.
···· ·· ·· ·»·♦ ·· ·· • · · · · · ♦ « · 9 • · · · · ··· · « ·
Odborníkům v oboru bude jasné, že v důsledku degenerace genetického kódu existuje mnoho nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid, jak je zde popsán. Některé z těchto polynukleotidů mají minimální homologii s nukleotidovou sekvencí přirozeného genu. Nicméně, polynukleotidy, které se liší z důvodů rozdílů ve využití kodonů, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Dále, alely genů obsahujících polynukleotidové sekvence zde uvedené spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Alely jsou endogenní geny, které jsou pozměněny v důsledku jedné nebo více mutací, jako jsou delece, adice a/nebo substituce nukleotidů. Výsledná mRNA a protein mohou mít, ale nemusí, pozměněnou strukturu nebo funkci. Alely mohou být identifikovány za použití standardních technik (jako je hybridizace, amplifikace a/nebo srovnávání s databází sekvencí).
Polynukleotidy mohou být připraveny mnoha technikami. Například, polynukleotid může být identifikován, jak je podrobněji popsáno dále, vyšetřováním mikrosestav cDNA na expresi asociovanou s nádorem (t.j. expresi, která je alespoň 2-krát vyšší v plicním nádoru než v normální tkáni, jak se určí representativním testem zde popsaným). Taková vyšetření byla provedena za použití Synteni mikrosestav (Palo AIto, CA) podle návodu výrobce (a v podstatě tak, jak je popsáno v Schena et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 10614-10619, 1996, a Heller et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 2150-2155, 1997). Alternativně mohou být polynukleotidy amplifikovány z cDNA připravené z buněk exprimujících zde popsané proteiny, jako jsou buňky plicních nádorů. Takové polynukleotidy mohou být amplifikovány polymerasovou řetězovou reakcí (PCR).
V tomto způsobu mohou být primery specifické pro sekvenci navrženy podle zde uvedených sekvencí a mohou být zakoupeny nebo syntetizovány.
Amplifikovaná část může být použita pro izolaci kompletního • · · ♦ • · genu z vhodné knihovny (například cDNA knihovny plicního nádoru) za použití dobře známých technik. V takových postupech je knihovna (cDNA nebo genomová) vyšetřována za použití jedné nebo více polynukleotidových sond nebo primerů vhodných pro amplifikaci. Výhodně zahrnuje knihovna větší molekuly. Náhodně sondované knihovny mohou být také výhodě pro identifikaci 5' a předcházejících regionů genů. Genomové knihovny jsou výhodné pro získání intronů a 5' přesahujících sekvencí.
Pro hybridizační techniky může být částečná sekvence značená (například nick-translací nebo na konci 32P) za použití dobře známých technik. Bakteriální nebo bakteriofágová knihovna se potom vyšetřuje na hybridizačních filtrech obsahujících denaturované bakteriální kolonie (nebo deskách obsahujících plaky fágů) pomocí značené sondy (viz Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridizující kolonie nebo plaky se selektují a expandují a DNA se z nich izoluje pro další analýzu. cDNA klony mohou být analyzovány pro určení množství dalších sekvencí například pomocí PCR za použití primeru z částečné sekvence a primeru z vektoru. Pro identifikaci jednoho nebo více překrývajících se klonů mohou být připraveny restrikční mapy a částečné sekvence. Kompletní sekvence může být potom určena pomocí standardních technik, které mohou zahrnovat tvorbu serie delečních klonů. Získané překrývající se sekvence se potom sestaví do jedné kontinuální sekvence. Kompletní cDNA molekula může být připravena ligací vhodných fragmentů, za použití dobře známých technik.
Alternativně, existuje mnoho amplifikačních technik pro získání kompletní kódující sekvence z částečné cDNA sekvence. V takových technikách se amplifikace obvykle provádí pomocí PCR. Pro provedení amplifikace může být použit jakýkoliv z mnoha komerčně ···· dostupných kitů. Primery mohou být navrženy, například, za použití softwaru dobře známého v oboru. Primery mají výhodně délku 22-30 nukleotidů, obsah GC alespoň 50% a tepelně se váží na cílovou sekvenci při teplotě přibližně 68 °C až 72 °C. Amplifikovaný region může být sekvencován způsobem popsaným výše a překrývající se sekvence mohou být sestaveny do kontinuální sekvence.
Jednou takovou amplifikační technikou je inverzní PCR (viz Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), která využívá restrikčních enzymů pro generování fragmentu ve známém regionu genu. Fragment se potom cirkularizuje intramolekulovou ligací a použije se jako templát pro PCR s divergentními primery odvozenými od známého regionu genu. V alternativním postupu může být sekvence sousedící s částečnou sekvencí získána amplifikací s primerem pro spojovací sekvenci a s primerem specifickým pro známý region. Amplifikované sekvence jsou obvykle zpracovány ve druhém kole amplifikace se stejným spojovacím primerem a s druhým primerem specifickým pro známý region. Variace tohoto postupu, která využívá dva primery, které iniciují prodloužení v opačných směrech ze známé sekvence, je popsána ve WO 96/38591. Jinou takovou technikou je rychlá amplifikace konců cDNA neboli RACE. Tato technika zahrnuje použití vnitřního primeru a vnějšího primeru, který hybridizuje na polyA region nebo vektorovou sekvenci, za účelem identifikace sekvencí, které jsou 5' a 3' ke známé sekvenci. Další technikou je záchytná PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic., 1: 111-19, 1991); a procházecí PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60, 1991). Další metody využívající amplifikace mohou být také použity pro získání kompletní cDNA sekvence.
V některých případech je možno získat kompletní cDNA sekvenci analýzou sekvence uvedené v databázy exprimovaných koncovek sekvencí (EST), která je dostupná od GenBank. Vyhledávání • · · · · · φ • · · · · >♦· · · · • φ φ φ φ φ φ ·. · · ·· ·· ·· ·»· «♦ ···· ·· ·· ·* ··♦· překrývaj ících se EST může být provedeno pomocí známých programů (například NCBI BLAST prohledávání) a takové EST mohou být použity pro generování kontinuální kompletní sekvence. Kompletní DNA sekvence mohou být také získány analýzou genomových fragmentů.
Některé nukleokyselinové sekvence cDNA molekul kódujících části plicních nádorových proteinů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349.
Varianty polynukleotidů mohou být připraveny jakoukoliv metodou známou v oboru, včetně chemické syntézy, napříkad včetně fosforoamiditové syntézy na pevné fázi. Modifikace polynukleotidové sekvence mohou být také připraveny standardními technikami mutagenese, jako je oligonukleotidy řízená místně cílená mutagenese (viz Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Alternativně mohou být RNA molekuly generovány in vitro nebo in vivo transkripcí DNA sekvencí kódujících plicní nádorový protein, nebo jeho část, s podmínkou, že DNA je inkorporována do vektoru s vhodným RNA polymerasovým promotorem (jako je T7 nebo SP6) . Některé části mohou být použity pro přípravu kódovaného polypeptidu, jak je zde popsáno. Dále nebo alternativně může být část podána pacientovi tak, že kódovaný polypeptid je generován in vivo (například transfekcí buněk prezentujících antigen, jako je dendritické buňky, cDNA konstruktem kódujícím plicní nádorový polypeptid, a podáním transfektovaných buněk pacientovi)
Část sekvence komplementární ke kódující sekvenci (t.j. protismyslný polynukleotid) může být také použita jako sonda nebo pro modulování genové exprese. cDNA konstrukty, které mohou být transkribovány do protismyslné RNA, mohou být také vloženy do buněk nebo tkání pro usnadnění produkce protismyslné RNA. Protismyslný polynukleotid může být použit, jak je zde popsáno, ·· ··
9999 * · ·9
9· • ·9
99
999999 pro inhibici exprese nádorového proteinu. Protismyslná technologie může být použita pro-kontrolu genové exprese prostřednictvím tvorby trojšroubovice, která narušuje schopnost dostatečného otevření dvoušroubovice pro umožnění vazby polymeras, transkripčních faktorů nebo regulačních molekul (viz Gee et al., v Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisko, NY; 1994). Alternativně může být protismyslná molekula navržena tak, aby hybridizovala na kontrolní region genu (například na promotor, zesilovač transkripce nebo transkripční iniciační místo) a blokovala transkripci genu; nebo aby blokovala translaci inhibici vazby transkriptu na ribozomy.
Část kódující sekvence, nebo komplementární sekvence, může být také navržena jako sonda nebo primer pro detekci genové exprese. Sondy mohou být značeny různými reportérovými skupinami, jako jsou radionuklidy a enzymy, a tyto sondy mají výhodně délku alespoň 10 nukleotidů, lépe alespoň 20 nukleotidů a nejlépe alespoň 30 nukleotidů. Primery mají, jak bylo uvedeno výše, výhodně délku 22-30 nukleotidů.
Jakýkoliv polynukleotid může být dále modifikován pro zvýšení stability in vivo. Možnými modifikacemi jsou, například, přidání sousedních sekvencí na 5’ a/nebo 3' konce; použití fosforothioatových nebo 2' O-methylových vazeb místo fosfodiesterasových vazeb ve skeletu; a/nebo použití netradičních baží, jako je inosin, quenosin a wybutosin, stejně jako acetyl-, methyl-, thio- a jiné modifikované formy adeninu, cytidinu, guaninu, thymidinu a uridinu.
Nukleotidové sekvence, jak jsou zde popsány, mohou být navázány na různé další nukleotidové sekvence za použití zavedených technik rekombinantní DNA. Mapříklad může být polynukleotid klonován do různých klonovacích vektorů, včetně plasmidů, fágemidů, derivátů ···· ·· ·· »*»· ·· ·» ♦·· »»· ·*«· ♦ · · » · »·· * · « ···· ·· · ···* ·· ·· ·· ··· ·· ···· fágu lambda a kosmidů. Zejména výhodné jsou expresní vektory, replikační vektory, vektory pro generování sond a sekvencovací vektory. Vektor obvykle obsahuje sekvenci rozpoznávající počátek replikace funkční v alespoň jednom organismu, běžná místa pro restrikční endonukleasy a jeden nebo více selektovatelných markérů. Další prvky závisí na zamýšleném použití a jsou zřejmé odborníkům v oboru.
V některých provedeních mohou být polynukleotidy připraveny tak, aby vstupovaly do savčích buněk a tam byly exprimovány. Takové prostředky jsou zejména vhodné pro terapeutické účely, jak jsou popsány dále. Odborníkům v oboru bude jasné, že existuje mnoho způsobů pro dosažení exprese polynukleotidu v cílové buňce a použit může být kterýkoliv z těchto způsobů. Například může být polynukleotid vložen do virového vektoru, jako je například adenovirus, adeno-asociovaný virus, retrovirus nebo virus vakcinie nebo jiný pox-virus (například ptačí pox-virus). Polynukleotidy mohou být také podány jako holé plasmidové vektory. Techniky pro inkorporaci DNA do takových vektorů jsou dobře známé odborníkům v oboru. Retrovirový vektor může dále přenášet nebo obsahovat gen pro selektovatelný markér (za účelem identifikace nebo selekce transformovaných buněk) a/nebo zaměřovači skupinu, jako je gen kódující ligand pro receptor na specifických cílových buňkách, který udílý vektoru specificitu. Specificita vektoru může být také dosažena pomocí protilátky, za použití metod dobře známých odborníkům v oboru.
Dalšími prostředky pro terapeutické účely jsou koloidní disperzní systémy, jako jsou makromolekulové komplexy, nanokapsle, mikrosféry, korálky a systémy na bázi lipidů, včetně emulzí olej-ve-vodě, micel a směsných micel a liposomů. Výhodný koloidní systém pro použití jako přepravní vehikulum in vitro a in vivo jsou liposomy (t.j. artificiální membránové vesikuly). Příprava a • · ·· ·♦ ··»♦ ·» *· • ·♦· ·*·· ♦ ♦ » »·· * · * ···· ·· · * ♦ · ·· ·· ·· ♦·· ·· ···· použití takových systémů je dobře známá v oboru.
Plicní nádorové polypeptidy
V předkládaném vynálezu mohou polypeptidy obsahovat alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu nebo jeho varianty, jak jsou zde popsány. Jak bylo uvedeno výše, plicní nádorový protein je protein, který je exprimovaný buňkami plicního nádoru. Proteiny, které jsou plicními nádorovými proteiny, také detekovatelně reagují v imunotestech (jako je ELISA) s antisérem od pacienta s nádorem plic. Polypeptidy, jak jsou zde popsány, mohou být jakékoliv délky. Mohou obsahovat další sekvence odvozené od přirozeného proteinu a/nebo heterologní sekvence, a takové sekvence mohou (ale nemusí) mít další imunogenní nebo antigenní vlastnosti.
Termín imunogenní část, jak je zde použit, označuje část proteinu, která je rozpoznávána (t.j. specificky vázána) B-lymfocytárním a/nebo T-lymfocytárním povrchovým receptorem pro antigen. Takové imunogenní části obvykle obsahují alespoň 5 aminokyselinových zbytků, lépe alespoň 10 a ještě lépe alespoň 20 aminokyselinových zbytků plicního nádorového proteinu nebo jeho varianty. Některé výhodné imunogenní části zahrnují peptidy, ve kterých byla N-koncová vedoucí sekvence a/nebo transmembránová doména deletována. Jiné výhodné imunogenní části mohou obsahovat malé N- a/nebo C-koncové delece (například 1-30 aminokyselin, výhodně 5-15 aminokyselin) vzhledem k zralému proteinu.
Imunogenní části mohou být identifikovány dobře známými technikami, jako jsou techniky shrnuté v Paul, Fundamental Immunology, 3. vydání, 243-247 (Raven Press, 1993) a odkazech zde citovaných. Mezi takové techniky patří vyšetřování polypeptidů na schopnost reagovat s protilátkami specifickými pro antigen,
• · ·· •* · · • t· • ·· · ♦ »· ·· ···· antisérem a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony. Antisérum a protilátky jsou specifické pro antigen tehdy, když se specificky váží na antigen (t.j. když reagují s proteinem v ELISA nebo v jiných imunotestech a nereagují detekovatelně s nepříbuznými proteiny). Takové antisérum, protilátky a T-lymfocyty mohou být připraveny zde popsaným způsobem a za použití dobře známých technik. Imunogenní část přirozeného plicního nádorového proteinu je část, která reaguje s takovým antisérem, protilátkami a/nebo T-lymfocyty v úrovni, která není významně nižší než reaktivita s kompletním polypeptidem (například v ELISA a/nebo testu reaktivity T-lymfocytů). Takové imunogenní části mohou reagovat v takových testech v úrovni reaktivity, která je stejná nebo vyšší než úroveň reaktivity s kompletním polypeptidem. Taková vyšetření mohou být provedena za použití metod dobře známých v oboru, jako jsou metody popsané v Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Například může být polypeptid imobilizován na pevném nosiči a může být kontaktován se sérem pacienta pro umožnění vazby protilátek v séru na imobilizovaný polypeptid. Nenavázané sérum může být potom odstraněno a navázané protilátky mohou být detekovány za použití, například, 12SI-značeného Proteinu A.
Jak bylo uvedeno výše, prostředky mohou obsahovat varianty přirozeného plicního nádorového proteinu. Termín varianta polypeptidu, jak je zde použit, označuje polypeptid, který se liší od přirozeného plicního nádorového proteinu v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích tak, že imunogenicita polypeptidu není významně snížena. Jinými slovy, schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen je zvýšena nebo nezměněna ve srovnání s přirozeným proteinem, nebo může být snížena o méně než 50% a výhodně o méně než 20% ve srovnání s přirozeným proteinem. Takové varianty mohou být obecně ···· ·» • · • · • · ··*· 9999 • 9 9 9 9 9 99 · 9-999 9-99 ·♦♦♦ 9 9 9 9 99 ♦ ♦ ·♦ 99 999 999999 identifikovány modifikací jedné z výše uvedených polypeptidových sekvencí a hodnocením reaktivity modifikovaného polypeptidu s protilátkami nebo antisérem specifickým pro antigen. Výhodnými variantami jsou ty, ve kterých je odstraněna jedna nebo více částí, jako například N-koncová vedoucí sekvence nebo transmembránová doména. Dalšími výhodnými variantami jsou ty, ve kterých byla z N- a/nebo C-konce zralého proteinu odstraněna malá část (například 1-30 aminokyselin, lépe 5-15 aminokyselin).
Polypeptidové varianty výhodně vykazují alespoň 70%, lépe alespoň 90% a nejlépe alespoň 95% identitu s přirozeným polypeptidem (kde identita je určena způsobem popsaným výše).
Výhodně obsahuje varianta konzervativní substituce. Konzervativní substituce je taková, při které je aminokyselina substituována za jinou aminokyselinu, která má podobné vlastnosti, takže se předpokládá, že sekundární struktura a hydropatický charakter polypeptidu zůstane v podstatě nezměněn. Aminokyselinové substituce mohou být provedeny na základě podobnosti v polaritě, náboji, rozpustnosti, hydrofobnosti, hydrofilnosti a/nebo amfipatického charakteru zbytků. Například, mezi aminokyseliny s negativním nábojem patří kyselina glutamová a kyselina asparagová; mezi aminokyseliny s pozitivním nábojem patří lysin a arginin; a mezi aminokyseliny s nepolárními skupinami mající podobné hodnoty hydrofnosti patří leucin, isoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; a serin, threonin, fenylalanin a tyrosin. Jiné skupiny aminokyselin, které mohou představovat konzervativní změny, jsou: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; a (5) phe, tyr, trp, his. Varianta může také, nebo alternativně, obsahovat nekonzervativní změny. Varianty mohou být také (nebo alternativně) modifikovány například delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální ···· ·· 99 »9·· 9* •49 9 9 · 9 9··
9 9 t 9 9 99 9 9 *
9 9 9 9.9 9 9 9 9 ** ·· 99 999 99 9999 vliv na imunogenicitu, sekundární strukturu a hydropatický charakter polypeptidu.
Jak bylo uvedeno výše, mohou polypeptidy obsahovat signální (nebo vedoucí) sekvenci na N-konci proteinu, která současně s translací nebo post-translačně řídí přesun proteinu. Polypeptid může být také konjugován na spojovací nebo jinou sekvenci pro usnadnění syntézy, přečištění nebo identifikaci polypeptidu (například na poly-His) nebo pro zvýšení vazby polypeptidu na pevný nosič. Například může být polypeptid konjugován na Fc region imunoglobulinu.
Polypeptidy mohou být připraveny za použití různých dobře známých technik. Rekombinantní polypeptidy kódované DNA sekvencemi popsanými výše mohou být snadno připraveny z DNA sekvencí za použití různých expresních vektorů známých odborníkům v oboru. Exprese může být provedena v mnoha vhodných hostitelských buňkách, které mohou být transformovány nebo transfektovány expresním vektorem obsahujícím DNA molekulu kódující rekombinantní polypeptid. Výhodnými hostitelskými buňkami jsou prokaryotické buňky, kvasinky, vyšší eukaryotické a rostlinné buňky. Výhodně jsou použitými hostitelskými buňkami E. coli, kvasinky nebo savčí buněčné linie jako je COS nebo CHO. Supernatanty z vhodných systémů hostitel/vektor, které secernují rekombinantní protein nebo polypeptid do kultivačního media, mohou být nejprve koncentrovány za použití komerčně dostupného filtru. Po koncentrování může být koncentrát aplikován na vhodnou přečišúovací matrici, jako je afinitní matrice nebo iontoměničová pryskyřice. Pro další přečištění rekombinantního polypeptidu může být nakonec použito jednoho nebo více stupňů HPLC s reverzní fází.
Části nebo jiné varianty mající méně než přibližně 100 aminokyselin, a obecně méně než přibližně 50 aminokyselin, mohou ·· ·« • ♦ · 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · tH · · 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 999 9 9 9 9 9 9 ·· ·· ·· 999 99 9999 být také připraveny synteticky, za použití technik dobře známých odborníkům v oboru. Například mohou být takové polypeptidy syntetizovány za použití jakékoliv komerčně dostupné techniky syntézy na pevné fázi, jako je Merrifieldova technika syntézy na pevné fázi, ve které jsou aminokyseliny postupně přidávány k rostoucímu aminokyselinovému řetězci. Viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Vybavení pro automatickou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné od dodavatelů jako jsou Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA) a může být použito podle návodu výrobce.
V některých specifických provedeních může být polypeptid fúzní protein, který obsahuje více polypeptidů, jak jsou zde popsány, nebo který obsahuje jeden zde popsaný polypeptid a nepříbuznou sekvenci, jako je známý nádorový protein. Fúzní partner může, například, napomáhat v poskytnutí epitopů pro T-pomocné lymfocyty (pak se jedná o imunologický fúzní partner), výhodně epitopy pro T-pomocné lymfocyty rozpoznávané člověkem, nebo může napomáhat při expresi proteinu (pak se jedná o zesilovač exprese) a vést k zisku většího výtěžku přirozeného rekombinantního proteinu. Některé výhodné fúzní partnery jsou jak imunologickými fúzními partnery, tak fúzními partnery zesilujícími expresi. Další fúzní partnery mohou být vybrány tak, aby zvyšovaly rozpustnost proteinu nebo aby umožňovaly cílený přesun proteinu do vyraných intracelulárních kompartmentů. Ještě dalšími fúzními partnery jsou afinitní koncovky, které usnadňují přečištění proteinu.
Fúzní proteiny mohou být připraveny standardními technikami, včetně chemické konjugace. Výhodně je fúzní protein exprimován jako rekombinantní protein umožňujíc produkci vyšších množství, ve srovnání s nefúzovaným proteinem, v expresním systému. Stručně, DNA sekvence kódující polypeptidové složky mohou být připraveny samostatně a mohou být ligovány do vhodného expresního vektoru.
···· *· ··»** »· ··
• • • • · • 9 9 * ·
• • • • • *·· · · •
' · • • · • • 9 9 9 · •
• ♦ • • • • 9 9 9 •
·· ·· ·· 999 99 9999
3' konec DNA sekvence kódující jednu polypeptidovou složku je ligován, s nebo bez peptidové spojovací sekvence, na 5' konec DNA sekvence kódující druhou polypeptidovou složku tak, že čtecí rámce sekvencí jsou ve fázi. Toto umožňuje translaci do jediného fúzního proteinu, který si zachovává biologickou aktivitu obou polypeptidových složek.
Peptidová spojovací sekvence může být použita pro separování první a druhé polypeptidové složky takovou vzdáleností, že každý polypeptid se skládá do své správné sekundární a terciární struktury. Taková peptidová spojovací sekvecne je inkorporována do fúzního proteinu za použití standardních technik, které jsou dobře známé v oboru. Vhodné peptidové spojovací sekvence mohou být vybrány podle následujících vlastností: (1) jejich schopnosti přijímat flexibilní konformaci; (2) jejich neschopnosti přijímat takovou sekundární strukturu, která by mohla interagovat s funkčními epitopy na prvním a druhém polypeptidu; a (3) chybění hydrofobních nebo nabitých zbytků, které by mohly reagovat s funkčními epitopy polypeptidu. Výhodné peptidové spojovací sekvence obsahují Gly, Asn a Ser zbytky. Ve spojovacích sekvencích mohou být také použity další téměř neutrální aminokyseliny, jako je Thr a Ala. Mezi aminokyselinové sekvence, které mohou být použity jako spojovací sekvence, patří ty, které jsou popsány v Maratea et al., Gene, 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 8258-8262; US patent č. 4935233 a US patent č. 4751180. Spojovací sekvence mohou mít délku od 1 do přibližně 50 aminokyselin. Spojovací sekvence nejsou nutné, když mají první a druhý polypeptid neesenciální N-koncové aminokyselinové regiony, které mohou být použity pro separování funkčních domén a pro zabránění sterické interference.
Ligované DNA sekvence jsou operativně navázané na vhodné transkripční nebo translační regulační elementy. Regulační
elementy odpovědné za expresi DNA jsou umístěny pouze 5' k DNA sekvenci kódující první polypeptid. Podobně, stop kodony nutné pro ukončení translace a transkripční terminační signály jsou přítomny pouze 3' k DNA sekvenci kódující druhý polypeptid.
Vynález také poskytuje fúzní proteiny, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu společně s nepříbuzným imunogenním proteinem. Výhodně může imunogenní protein vyvolat recall odpověď. Příklady takových proteinů zahrnují proteiny tetanu, tuberkulosy a hepatitidy (viz například Stoute et al., New England J. Med. 336: 86-91, 1997).
Ve výhodných provedeních je imunologický fúzní partner odvozen od proteinu D, povrchového proteinu gram-negativní bakterie Haemophilus influenzae B (WO 91/18926). Výhodně obsahuje derivát proteinu D přibližně první třetinu proteinu (například prvních 100-110 aminokyselin) a derivát proteinu D může být lipidovaný. V některých výhodných provedeních je prvních 109 zbytků lipoproteinu D obsaženo na N-konci a tyto zbytky dodávají další exogenní T-lymfocytární epitop a zesilují expresi v E. coli (a tak účinkují jako zesilovače exprese). Lipidová koncovka zajiščuje optimální prezentaci antigenu buňkám prezentujícím antigen. Dalšími fúzními partnery jsou nestrukturální protein chřipkového viru, NS 1 (hemaglutinin). Obvykle se použije N-koncových 81 aminokyselin, ačkoliv mohou být použity i jiné fragmenty obsahující epitopy pro T-helper lymfocyty.
V jiném provedení je imunologickým fúzním partnerem protein známý jako LYTA, nebo jeho část (výhodně C-koncová část). LYTA je odvozen od Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alanin amidasu známou jako amidasa LYTA (kódovanou LytA genem; Gene 43: 265-292, 1986). LYTA je autolysin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanovém skeletu.
• · · · • · • · · · · · ·· ·· ·· ···
C-koncová doména LYTA proteinu je odpovědná za afinitu k cholinu nebo některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využita pro vývoj E. coli plasmidů exprimujících C-LYTA využitelných pro expresi fúzních proteinů. Přečištění hybridních proteinů obsahujících C-LYTA fragment na amino konci bylo popsáno (viz Biotechnology 10: 795-798, 1992). Ve výhodném provedení může fúzní protein obsahovat opakující se část LYTA. Opakující se část se v C-LYTA nachází v C-koncovém regionu od zbytku 178. Zejména výhodná opakující se část obsahuje zbytky 188-305.
Obecně, polypeptidy (včetně fúzních proteinů) a polynukleotidy, jak jsou zde popsány, jsou izolované. Izolovaný polypeptid nebo polynukleotid je takový, který je odebrán ze svého přirozeného prostředí. Například, přirozený protein je izolovaný, je-li separovaný od některých nebo všech současně se vyskytujících materiálů v přirozeném systému. Výhodně mají takové polypeptidy alespoň 90% čistotu, lépe alespoň 95% čistotu a nejlépe alespoň 99% čistotu. Polynukleotid se považuje za izolovaný, když je, například, klonovaný do vektoru, který není součástí přirozeného prostředí.
Vazebná činidla
Předkládaný vynález dále poskytuje činidla, jako jsou protilátky nebo jejich vazebné fragmenty pro antigen, které se specificky váží na plicní nádorový protein. Protilátka nebo její vazebný fragment pro antigen se specificky váže na plicní nádorový protein tehdy, když reaguje detekovatelně (například v ELISA) s plicním nádorovým proteinem, a nereaguje detekovatelně s nepříbuznými proteiny za podobných podmínek. Termín vazba označuje nekovalentní asociaci mezi dvěma separovanými molekulami, při které vzniká komplex. Schopnost vazby může být hodnocena, například, určením vazebné konstanty pro tvorbu komplexu. Vazebná
• · · · ·« ·· · · · · • · · · · · ·· · · · ··· . · · ··.·.· · • · · · · · · • · ·· ·· · · · konstanta je hodnota získaná při dělení koncentrace komplexu koncentracemi složek. Obecně, v kontextu předkládaného vynálezu se dvě sloučeniny váží tehdy, když vazebná konstanta pro tvorbu komplexu přesahuje přibližně 103 1/mol. Vazebná konstanta může být určena metodami dobře známými v oboru.
Vazebná činidla mohou dále rozlišovat pacienty s a bez nádoru, jako je karcinom plic, za použití reprezentativních testů podle předkládaného vynálezu. Jinými slovy, protilátky nebo jiná vazebná činidla, která se váží na plicní nádorový protein, budou generovat signál ukazující na přítomnost karcinomu u alespoň 20% pacientů s onemocněním, a budou generovat signál ukazující na nepřítomnost onemocnění u alespoň 90% jedinců bez onemocnění. Pro stanovení toho, zda vazebné činidlo splňuje tyto požadavky, mohou být biologické vzorky (například krve, séra, leukoforesy, moči a/nebo nádorových biopsií) od pacientů s a bez karcinomu (jak je určeno standardními klinickými testy) testovány na přítomnost polypeptidů, které se váží na vazebná činidla. Je jasné, že by měl být testován statisticky významný počet vzorků s a bez onemocnění. Každé vazebné činidlo by mělo splňovat tato kriteria; nicméně, odborníkům v oboru bude jasné, že vazebná činidla mohou být použita v kombinaci za účelem zvýšení sensitivity.
Jakékoliv činidlo splňující výše uvedené požadavky může být vazebným činidlem. Například může být vazebným činidlem ribosom, s nebo bez peptidové složky, RNA molekula nebo polypeptid. Ve výhodném provedení je vazebným činidlem protilátka nebo její vazebný fragment pro antigen. Protilátky mohou být připraveny jakoukoliv technikou známou odborníkům v oboru. Viz například Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Obecně, protilátky mohou být produkovány v buněčných kulturách, včetně výroby monoklonálních protilátek, jak je zde popsána, nebo transfekcí genů pro protilátky do • · · vhodných bakteriálních nebo savčích hostitelských buněk, za produkce rekombinantních protilátek. V jedné technice je imunogen obsahující polypeptid nejprve injikován různým savcům (například myším, králíkům, ovcím nebo kozám). V tomto kroku může polypeptid podle předkládaného vynálezu sloužit jako imunogen bez modifikací. Alternativně, zejména pro relativně krátké polypeptidy, může být lepší imunitní reakce vyvolána tehdy, je-li polypeptid navázán na proteinový nosič, jako je hovězí sérový albumin nebo přílipkový hemokyanin. Imunogen se injekčně aplikuje zvířecímu hostiteli, výhodně podle před určeného protokolu zahrnujícího jednu nebo více dosycovacích imunizací, a zvířeti se periodicky odebírá krev. Polyklonální protilátky specifické pro polypeptid mohou být potom přečištěny z takového antiséra pomocí, například, afinitní chromatografie za použití polypeptidu navázaného na vhodný pevný nosič.
Monoklonální protilátky specifické pro daný antigenní polypeptid mohou být připraveny, například, za použití techniky podle Kohlera a Milsteina, Eur. J. Immunology 6: 511-519, 1976, a jejích vylepšení. Stručně, tato metoda vyžaduje přípravu imortalizované buněčné linie schopné produkce protilátek majících požadovanou specificitu (t.j. reaktivitu s daným polypeptidem). Takové buněčné linie mohou být produkovány, například, z buněk sleziny získaných od zvířat imunizovaných způsobem popsaným výše. Buňky sleziny jsou potom imortalizovány, například, fúzí s myelomovými buňkami, výhodně takovými, které jsou syngenní s imunizovaným zvířetem. Mohou být použity různé fúzní techniky. Například mohou být buňky sleziny a myelomové buňky kombinovány v neiontovém detergentním činidle po dobu několika minut a potom mohoubýt umístěny v nízké hustotě na selektivní medium, které podporuje růst hybridních buněk, ale ne myelomových buněk. Výhodnou selekční technikou je použití HAT (hypoxantin, aminopterin, thymidin) selekce. Po dostatečné době, obvykle po 1 až 2 týdnech, se pozorují kolonie hybridů. Vyberou se jednotlivé kolonie a supernatanty jejich kultur se testují na vazebnou aktivitu proti polypeptidu. Výhodně jsou hybridomy s vysokou reaktivitou a specificitou.
Monoklonální protilátky mohou být izolovány ze supernatantů kultivovaných kolonií hybridomů. Dále, různé techniky mohou být použity pro zvýšení -výtěžku, jako je injekce hybridomových buněk do peritoneální dutiny vhodného obratlovce, jako je myš. Monoklonální protilátky mohou být získány z ascitu nebo z krve. Kontaminace může být odstraněna od protilátek běžnými technikami, jako je chromatografie, gelová filtrace, srážení a extrakce. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity v přečištovacím procesu například v stupni afinitní chromatografie.
V některých provedeních může být výhodné použití vazebných fragmentů protilátek pro antigen. Mezi takové fragmenty patří Fab fragmenty, které mohou být připraveny standardními technikami. Stručně, imunoglobuliny mohou být přečištěny z králičího séra afinitní chromatografií na kolonách s protein A korálky (Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) a mohou být tráveny papainem za zisku Fab a Fc fragmentů. Fab a Fc fragmenty mohou být separovány afinitní chromatografií na kolonách obsahujících protein A korálky.
Monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být navázány na jedno nebo více terapeutických činidel. Takovými vhodnými terapeutickými činidly jsou radionuklidy, induktory diferenciace, léky, toxiny a jejich deriváty. Výhodnými radionuklidy jsou 9OY, X23I, X25I, 13XI, x86Re, 2xxAt a 2x2Bi. Výhodnými léky jsou methotrexat a analogy pyrimidinu a purinu. Výhodnými induktory diferenciace jsou estery forbolu a kyselina máselná. Výhodnými toxiny jsou ricin, abrin, difterický toxin, cholera toxin, gelonin, Pseudomonadový exotoxin, Shigella toxin a antivirový protein líčidla amerického.
Terapeutické činidlo může být navázáno (například kovalentně) na vhodnou monoklonální protilátku buď přímo, nebo nepřímo (například prostřednictvím spojovací skupiny). Přímá reakce mezi činidlem a protilátkou je možná tehdy, když každý z nich obsahuje vhodný substituent schopný reakce s jiným substituentem. Například, nukleofilní skupina, jako je amino- nebo sulfhydrylová skupina, na jedné složce může reagovat se skupinou obsahující karbonyl, jako je anhydrid nebo halogenid kyseliny, nebo s alkylovou skupinou obsahující dobře odštěpítelnou skupinu (například halogenid) na druhé složce.
Alternativně může být žádoucí navázání terapeutického činidla a protilátky prostřednictvím spojovací skupiny. Spojovací skupina může působit jako oddělovací skupina pro oddělení protilátky od činidla z toho důvodu, aby se zabránilo interferenci s vazebnou schopností. Spojovací skupina může také sloužit pro zvýšení chemické reaktivity substituentu na činidle nebo protilátce a tak může zvyšovat účinnost vazby. Zvýšení chemické reaktivity může také usnadnit použití činidel, nebo funkčních skupin na činidlech, které by jinak nebylo možno použít.
Odborníkům v oboru bude jasné, že různá bifunkční nebo polyfunkční činidla, jak homo-, tak heterobifunkční (jako jsou činidla popsaná v katalogu Pierce Chemical Co., Rocford, IL), mohou být použita jako spojovací skupiny, navázání může být provedeno, například, prostřednictvím amino- skupin, karboxylových skupin, sulfhydrylových skupin nebo oxidovaných karbohydrátových zbytků. Existuje mnoho odkazů popisujících,takové techniky, například US patent č. 4671958, Rodwell et al.
• · · ·
Když je terapeutické činidlo účinnější tehdy, není-li navázáno na protilátkovou část imunokonjugátu podle předkládaného vynálezu, může být žádoucí použití spojovací skupiny, která se štěpí během nebo po internalizaci do buněk. Bylo popsáno mnoho různých stepitelných spojovacích skupin. Mechanismy pro intracelulární uvolnění činidel z těchto spojovacích skupin zahrnují štěpení redukcí disulfidové vazby (například US patent č. 4489710, Spitler), ozáření fotolabilní vazby (například US patent č. 4625014, Senter et al.), hydrolýzu derivatizovaných aminokyselinových vedlejších řetězců (například US patent č. 4638045, Kohn et al.), hydrolýzu zprostředkovanou sérovým komplementem (například US patent č. 4671958, Rodwell et al.) a hydrolýzu katalyzovanou kyselinou (například US patent č. 4569789, Blatter et al.).
Může být žádoucí navázat na protilátku více než jedno činidlo. V jednom provedení je na jednu molekulu protilátky navázáno více molekul činidla. V jiném provedení je na jednu protilátku navázáno více typů činidel. Bez ohledu na konkrétní provedení mohou být imunokonjugáty s více než jedním činidlem připraveny různými způsoby. Například, více než jedno činidlo může být navázáno přímo na molekulu protilátky, nebo může být použita spojovací skupina poskytující více míst pro navázání. Alternativně může být použit nosič.
Nosič může nést činidla různými způsoby, včetně kovalentní vazby, buď přímé nebo prostřednictvím spojovací skupiny. Vhodnými nosiči jsou albuminy (např. US patent č. 4507234, Kato et al.) , peptidy a polysacharidy jako je aminodextran (např. US patent č. 4699784, Shih et al.). Nosič může přenášet činidlo také nekovalentní vazbou nebo prostřednictvím enkapsulace, jak je tomu například v liposomech (např. US patenty č, 4429008 a 4873088). Nosiče specifické pro radionuklidová činidla zahrnují • · ·· • · · ·· φ · · φ · · ΦΦ· • · · · · . · ·
4Π ··········
Et U ΛΛ ΛΛ ·· *·· ··9999 radiohalogenované malé molekuly a chelatační sloučeniny. Například US patent č. 4735792 popisuje representativní radiohalogenované malé molekuly a jejich syntézu. Radionuklidový chelát může být připraven z chelatačních sloučenin, mezi které patří ty, které obsahují atomy dusíku a síry jako donorové atomy pro vazbu kovu, nebo oxidu kovu, radionuklidu. Například US patent č. 4673562, Davison et al., popisuje representativní chelatační sloučeniny a jejich syntézu.
Pro protilátky a imunokonjugáty mohou být použity různé způsoby podání. Obvykle je podání intravenosní, intramuskulární, podkožní nebo do lůžka resekovaného nádoru. Je jasné, že přesná dávka protilátky/imunokonjugátu závisí na použité protilátce, hustotě antigenu na nádoru a na rychlosti eliminace protilátky.
T-lymfocyty
Imunoterapeutické prostředky mohou také, nebo alternativně, obsahovat T-lymfocyty specifické pro plicní nádorový protein. Takové buňky mohou být připraveny in vitro nebo ex vivo za použití standardních postupů. Například mohou být T-lymfocyty separovány z kostní dřeně, periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve savců, jako jsou pacienti, za použití komerčních systémů pro separaci buněk, jako je Isolex™ systém, který je dostupný od nexel Therapeutics, lne., Irvine, CA (viz též US patent č. 5240856; US patent č. 5215926; WO 89/06280; WO 91/16116 a WO 92/07243). Alternativně mohou být T-lymfocyty získány od příbuzných nebo nepříbuzných lidí, zvířat jiných než člověk, buněčných linií nebo kultur.
T-lymfocyty mohou být stimulovány plicním nádorovým polypeptidem, polynukleotidem kódujícím plicní nádorový polypeptid a/nebo buňkami prezentujícími antigen (APC), které exprimují takový polypeptid. Taková stimulace je provedena za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění tvorby T-lymfocytů, které jsou specifické pro polypeptid. Výhodně je plicní nádorový polypeptid nebo polynukleotid přítomný v přenosovém prostředku, jako je mikrosféra, což usnadní tvorbu specifických T-lymfocytů.
T-lymfocyty jsou považovány za specifické pro plicní nádorový polypeptid tehdy, když T-lymfocyty specificky proliferují, secernují cytokiny nebo zabíjejí cílové buňky potažené polypeptidem nebo exprimující gen kódující takový polypeptid. Specificita T-lymfocytů může být hodnocena za použití jakékoliv z mnoha standardních technik. Například v testu uvolňování chrómu nebo v proliferačním testu ukazuje stimulační index vyšší než 2-násobek v lýze a/nebo proliferaci, ve srovnání s negativními kontrolami, na specificitu T-lymfocytů. Takové testy mohou být provedeny, například, způsobem popsnaým v Chen et al., cancer Res. 54: 1065-1070, 1994. Alternativně může být detekce proliferace T-lymfocytů provedena různými známými technikami. Proliferace T-lymfocytů může být například detekována měřením zvýšení rychlosti syntézy DNA (například pulsním značením kultur T-lymfocytů tritiovaným thymidinem a měřením množství tritiovaného thymidinu inkorporovaného do DNA). Kontakt s plicním nádorovým polypeptidem (100 ng/ml - 100 ug/ml, lépe 200 ng/ml - 25 ug/ml) po dobu 3-7 dnů by měl vést k alespoň dvojnásobnému zvýšení proliferace T-lymfocytů. Kontakt popsaný výše po dobu 2-3 hodin by měl vést k aktivaci T-lymfocytů, jak je měřena standardními cytokinovými testy, která je dvojnásobná v uvolňování cytokinů (například TNF nebo IFN-gama), což ukazuje na aktivaci T-lymfocytů (viz Coligan et al., Current Protocols in Immunology, svazek 1, Wiley Interscience (Greene, 1998). T-lymfocyty, které se aktivují v reakci na plicní nádorový polypeptid, polynukleotid nebo APC exprimující polypeptid, mohou být -CD4* a/nebo CD8-. T-lymfocyty specifické pro plicní nádorový polypeptid mohou být ···· ·· 99 ··♦· ·· ·♦ · · 9 9 9 9 9 9 9
9· 99999 99 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·9 99 999 99 9999 expandovány za použití standardních technik, ve výhodných provedeních jsou T-lymfocyty získány od pacienta nebo od příbuzného nebo nepříbuzného dárce a jsou pacientovi podány po stimulaci a expanzi.
Pro terapeutické účely mohou být CD4+ nebo CD8+ T-lymfocyty, které proliferují v reakci na plicní nádorový polypeptid, polynukleotid nebo APC, zmnoženy bud' in vitro, nebo in vivo. Proliferace takových T-lymfocytů in vitro může být provedena mnoha způsoby. Například mohou být T-lymfocyty opakovaně vystaveny působení plicního nádorového polypeptidu, nebo krátkého peptidů odpovídajícího imunogenní části takového polypeptidu, s nebo bez přidání růstových faktorů pro T-lymfocyty, jako je interleukin 2, a/nebo stimulačních buněk, které syntetizují plicní nádorový polypeptid. Alternativně mohou být jeden nebo více T-lymfocytů, které proliferují za přítomnosti plicního nádorového polypeptidu, zmnoženy klonováním. Způsoby pro klonování buněk jsou dobře známé v oboru a zahrnují limitní ředění.
Farmaceutické prostředky a vakcíny
V některých aspektech mohou být polypeptidy, polynukleotidy, vazebná činidla a/nebo buňky imunitního systému, jak jsou zde popsány, inkorporovány do farmaceutických prostředků nebo do imunogenních prostředků (t.j. vakcín). Farmaceutické prostředky obsahují jednu nebo více takových sloučenin nebo buněk a fyziologicky přijatelný nosič. Vakcíny mohou obsahovat jednu nebo více takových sloučenin nebo buněk a imunostimulační činidlo. Imunostimulačním činidlem může být jakákoliv substance, která zesiluje nebo potencuje imunitní reakci na exogenní antigen. Příklady imunostimulačních činidel zahrnují adjuvans, biodegradovatelné mikrosféry (například polylaktidgalaktid) a liposomy (do kterých je zapracována sloučenina; viz například
Φφ ··♦·
Fullerton, US patent č. 4235877). Příprava vakcín je obecně popsána například ve M.F. Powell and M.J. Newman, ed., Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach), Plenům Press (NY, 1995). Farmaceutické prostředky a vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat další sloučeniny, které mohou být biologicky aktivní nebo inaktivní. Například mohou prostředky nebo vakcíny obsahovat jednu nebo více imunogenních částí jiných nádorových antigenů, buď ve formě fúzního polypeptidu, nebo jako samostatnou sloučeninu.
Farmaceutický prostředek nebo vakcína může obsahovat DNA kódující jeden nebo více z polypeptidů popsaných výše tak, že takový polypeptid je generován in šitu. Jak bylo uvedeno výše, může být DNA přítomna v jakémkoli z mnoha systému pro podání známých odborníkům v oboru, včetně systémů pro expresi nukleových kyselin, bakteriálních a virových expresních systémů. V oboru je známo mnoho technik pro přenos genu, jako jsou například techniky popsané v Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998, o odkazy zde citované. Vhodné systémy pro expresi nukleových kyselin obsahují DNA sekvence nutné pro expresi u pacienta (jako jsou vhodné promotory a terminační signály). Bakteriální systémy vyžadují podání bakterie (jako je Bacillus Calmette-Guerrinové), které exprimují na svém povrchu imunogenní část polypeptidu nebo secernují takový epitop. Ve výhodném provedení může být DNA vložena pomocí virového expresního systému (například viru vakcinie nebo jiného pox viru, retroviru nebo adenoviru), což může vyžadovat použití nepatogenního (defektního) viru schopného replikace. Vhodné systémy jsou popsány, například, ve Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; US patentech č. 4603112, 4769330 a 5017487; WO 89/01973; US patentu č. 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et • φ · ·* · • · • · ·· φ φ ·· • ·* • φ·φ • φ . φ φφφ ·· φφφ · ♦ φ · φ φ al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., PNAS 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; a Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993. Techniky pro inkorporaci DNA do takových expresních systémů jsou dobře známé odborníkům v oboru. DNA může být také holá, jak je popsáno v , například, Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 a přehled těchto technik je uveden v Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. Vychytávání holé DNA může být zvýšeno potažením DNA na biodegradovatelné korálky, které jsou účinně transportovány do buněk.
Jakýkoliv nosič známý odborníkům v oboru může být použit ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu a typ nosiče závisí na způsobu podání. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny pro jakýkoliv způsob podání, včetně například lokálního, orálního, nasálního, intrakraniálního, intraperitoneálního, podkožního nebo intramuskulárního. Pro parenterální podání, jako je podání podkožní injekcí, je nosičem obvykle voda, salinický roztok, alkohol, tuk, vosk nebo pufr. Pro orální podání může být použit jakýkoliv z výše uvedených nosičů a nebo pevný nosič, jako je manitol, laktosa, škrob, stearan horečnatý, sacharin sodný, talek, celulosa, glukosa, sacharosa a uhličitan horečnatý. Biodegradovatelné mikrosféry (například polylaktátpolyglykolát) mohou být také použity jako nosiče pro farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu. Vhodné biodegradovatelné mikrosféry jsou popsány, například, v US patentech č. 4897268 a 5075109.
Takové prostředky mohou také obsahovat pufry (například neutrální pufrovaný salinický roztok nebo fosfátem pufrovaný salinický roztok), uhlovodany (napříkad glukosu, mannosu, sacharosu nebo dextrany), manitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycin, antioxidační činidla, chelatační ···· ·· ♦· ···· ·· ·· • · · · 9 9 9 9 9 ·
9 9 ·.···· 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 999 99 9999 činidla jako je EDTA neo glutathion, adjuvans (například hydroxid hlinitý) a/nebo konzervační činidla. Alternativně může být prostředek podle předkládaného vynálezu připraven jako lyofilizovaný prostředek. Sloučeniny mohou být také obaleny v liposomech, za použití dobře známé technologie.
Ve vakcínách podle předkládaného vynálezu může být použito jakékoliv z mnoha imunostimulačních činidel. Například může být použito adjuvans. Většina adjuvans obsahuje substance chránící antigen před rychlou degradací, jako je hydroxid hlinitný nebo anorganický olej, a činidlo stimulující imunitní odpověď, jako je lipid A nebo proteiny z Bordetella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Vhodná adjuvans jsou komerčně dostupná, jako například Freundovo nekompletní a kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI), Měrek adjuvans 65 (Měrek and Company, lne., Rahway, NJ), soli hliníku, jako je hydroxid hlinitý ve formě gelu (kamenec) nebo fosforečnan hlinitý; soli vápníku, železa nebo zinku; nerozpustné suspenze acylovaného tyrosinu; acylované sacharidy; kationtově nebo aniontově derivatizované pólysacharidy, polyfosfazeny; biodegradovatelné mikrosféry, monofosforyl lipid A a quil A. Jako adjuvans mohou být také použity cytokiny, jako je GM-CSF nebo interleukin-2, -7 nebo -12.
Ve vakcínách podle předkládaného vynálezu je adjuvans takové, aby indukovalo imunitní odpověď především Thl typu. Vysoké koncentrace cytokinů Thl typu (například IFN-gamma, IL-2 a IL-12) indukují převážně buněčnou imunitní reakci na podaný antigen. Naopak, vysoké koncetrace cytokinů Th2-typu (například IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 a TNF-beta) upřednostňují humorální imunitní reakci. Po aplikaci vakcíny podle předkládaného vynálezu dojde u pacienta k imunitní reakci, která zahrnuje reakci Thl- a Th-2 typu. Ve výhodném provedení je reakce převážně Thl-typu a koncentrace cytokinů Thl-typu se zvyšuje více než koncentrace
• 9 ·»·· ·· • Λ • · • 9 9
99 cytokinů Th2-typu. Koncentrace těchto cytokinů mohou být hodnoceny za použití standardních testů. Pro přehled skupin cytokinů viz Mosmann and Cofman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.
Výhodnými adjuvans pro vyvolání odpovědi převážně Thl-typu jsou, například, kombinace monofosforyllipidu A, výhodně 3-de-0-acetyl-monofosforyl-lipidu A (3D-MPL) a soli hliníku. MPL adjuvans jsou dostupná od Ribi ImmunoChem Research lne., Hamilton, MT; viz US patenty č. 4436727; 4877611; 4866034; a 4912094). Oligonukleotidy obsahující CpG (ve kterých je CpG dinukleotid nemethylováný) také indukují přednostně Thl odpověď. Takové oligonukleotidy jsou dobře známé a jsou popsány, například, ve WO 96/02555 a ve WO 99/33488. Imunostimulační DNA sekvence jsou také popsány v, například, Sáto et al., Science 273: 352, 1996. Jiným výhodným adjuvans je saponin, výhodně QS21 (Aquila Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA), který může být použit samostatně nebo v kombinaci s jinými adjuvans. Účinným systémem je například kombinace monofosforyl-lipidu A a saponinového derivátu, jako je kombinace QS21 a 3D-MPL, jak je popsána ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní prostředek, ve kterém je QS21 oslaben cholesterolem, jak je popsána ve WO 96/33739. Dalšími výhodnými prostředky jsou emulze olej-ve-vodě a tokoferol. Zejména účinný adjuvantní prostředek obsahuje QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej-ve-vodě, jak je popsáno ve WO 95/17210.
Mezi další výhodná adjuvans patří Montanide ISA 720 (Seppic, Frane), SAF (Chiron, California, US), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), SBAS série adjuvans (např. SBAS-2 nebo SBAS-4, od SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox (Ribi ImmunoChem Research, lne., Hamilton, MT), RC-529 (Ribi ImmunoChem Research, lne., Hamilton, MT), a aminoalkylglukosamidin 4-fosfáty (AGP).
Jakákoliv zde popsaná vakcína může být připravena za použití
4*44 • 4 • « -» »4 4 ·· 99
• 4 · • • • • · • ♦
€ • · • • >♦* • · 4
• * • 4 • 9 • • · 4 4
• · • « • • • • · 4
• 4 ·· • 4 • 9 · 4» 4 4 4 4
dobře známých metod, které vedou ke smísení antigenu, zesilovače imunitní reakce a vhodného nosiče nebo přísady. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podány jako součást prostředku s prodlouženým uvolňováním (t.j. prostředku jako je kapsle, porézní materiál nebo gel (složený například z polysacharidů), který po aplikaci pomalu uvolňuje sloučeninu). Takové prostředky mohou být připraveny dobře známými technikami (viz Coombes et al., Vaccine 14: 1429-1438, 1996) a jsou podány orálně, rektálně nebo podkožní implantací, nebo implantací do daného cílového místa. Prostředky s prodlouženým uvolňováním mohou obsahovat polypeptid, polynukleotid nebo protilátku obsaženou v matrici a/nebo obsaženou v zásobníku ohraničeném membránou kontrolující rychlost uvolňování.
Nosiče pro použití v takových prostředcích jsou biokompatibilní a mohou být také biodegradovatelné; výhodně poskytuje prostředek relativně konstantní rychlost uvolňování aktivní složky, mezi takové nosiče patří mikročástice póly(laktid-ko-glykolidu), stejně jako polyakrylát, latex, škrob, celulosa a dextran. Mezi další nosiče se zpomaleným uvolňováním patří supramolekulové biovektory, které obsahují non-kapalné hydrofilní jádro (například zesítěný polysacharid nebo oligosacharid, a - volitelně - zevní vrstvu obsahující amfifilní sloučeninu, jako je fosfolipid (viz například US patent č. 5151254 a PCT přihlášky WO 94/20078, WO 94/23701 a WO 96/06638. Množství aktivní sloučeniny obsažené v prostředku s prodlouženým uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a předpokládaném trvání uvolňování a na typu léčeného onemocnění.
Jakékoliv z mnoha známých přepravních vehikul může být použito ve farmaceutických prostředcích a vakcínách pro usnadnění produkce imunitní reakce specifické pro antigen, která je namířena proti nádorovým buňkám. Mezi přepravní vehikula patří buňky prezentující antigen (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy.
··«· ·· ·· ···» ·· *· • 09 0 0 0 · · · 0 • 0 0. · 0 »·· « · «
0 0 0 0 0 · · · 0 0
0 0 0 00 · 0 0 0 *0 00 ·· ··· 0· 0«··
B-lymfocyty a jiné buňky, které mohou být upraveny tak, aby byly účinnými APC. Takové buňky mohou být, ale nemusí, geneticky modifikovány za účelem zvýšení kapacity pro prezentaci antigenu, pro zlepšení aktivace a/nebo udržování aktivity T-lymfocytů, pro to, aby měly sami o sobě protinádorový účinek a/nebo pro to, aby byly imunologicky kompatibilní s příjemcem (například aby měly odpovídající HLA haplotyp). APC mohou být izolovány z různých biologických kapalin a orgánů, včetně nádorových a perinádorových tkání, a mohou být autologní, allogenní, syngenní nebo xenogenní.
Některá výhodná provedení předkládaného vynálezu využívají dendritických buněk nebo jejich progenitorů jako buněk prezentujících antigen. Dendritické buňky jsou výkonými APC (Bancherau and Steinman, Nátuře 392: 245-251) a bylo prokázáno, že jsou účinné jako fyziologické adjuvans pro vyvolání profylaktické nebo terapeutické protinádorové imunity (viz Timmerman and Levý, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999). Obecně, dendritické buňky mohou být identifikovány podle svého typického tvaru (hvězdicovitý in šitu, s vyznačenými cytoplasmatickými výběžky (dendrity) viditelnými in vitro) a podle schopnosti vychytávat, zpracovávat a prezentovat antigen s vysokou účinností, a podle schopnosti aktivovat naivní T-lymfocyty. Dendritické buňky mohou být samozřejmě zpracovány tak, aby exprimovaly na svém povrchu specifické receptory nebo ligandy, které se nevyskytují běžně na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo, a takové modifikované dendritické buňky spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Alternativně k dendritickým buňkám mohou být ve vakcínách použity secernované vešikuly dendritických buněk naplněné antigenem (nazývané exosomy) (viz Zitvogel et al., Nátuře Med. 4: 594-600, 1998).
Dendritické buňky a jejich progenitory mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, buněk infiltrujících nádor, buněk ···· '9 · · · 9 9 9 9 ·· • · · · · · 9 • 9 9 9 9999 9 infiltrujících perinádorovou tkáň, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, pupečníkové krve nebo z jakékoliv vhodné tkáně nebo tekutiny. Dendritické buňky mohou být například diferencovány ex vivo přidáním kombinace cytokinů, jako je GM-CSF, IL4, IL-13 a/nebo TNFalfa, do kultury monocytů získaných z periferní krve. Alternativně mohou být CD34 pozitivní buňky získáné z periferní krve, pupečníkové krve nebo kostní dřeně diferencovány na dendritické buňky přidáním kombinace GM-CSF, IL3, TNFalfa, CD40 ligandu, LPS, flt3 ligandu a/nebo jiných sloučenin, které indukují zrání a proliferací dendritických buněk, do kultivačního media.
Dendritické buňky jsou obecně děleny na nezralé a zralé buňky, což odlišuje dva dobře charakterizované fenotypy. Nicméně, toto rozdělení by nemělo vylučovat všechny možné mezistupně diferenciace. Nezralé dendritické buňky jsou charakterizovány jako APC s vysokou kapacitou pro vychytávání antigenu a jeho zpracování, což koreluje s vysokou expresí Fc-gamma receptoru a mannosového receptoru. Zralý fenotyp je charakterizován nižší expresí těchto markérů, ale vysokou expresí povrchových molekul odpovědných za aktivaci T-lymfocytů, jako jsou MHC třídy I a II, adhesní molekuly (například CD54 a CDU) a kostimulační molekuly (například CD40, CD80, CD86 a 4-1BB).
APC mohou být transfektovány polynukleotidem kódujícím plicní nádorový protein (nebo jeho část nebo variantu) tak, že plicní nádorový polypeptid, nebo jeho imunogenní část, je exprimován na povrchu buněk. Taková transfekce může proběhnout ex vivo a prostředky nebo vakcíny obsahující takové transfektované buňky mohou být potom použity pro terapeutické účely, jak je zde popsáno. Alternativně může být vehikulum pro přenos genu, které je zaměřeno na dendritické buňky nebo na jiné buňky prezentujícía antigen, podáno pacientovi, což vede k transfekci, která probíhá in vivo. In vivo a ex vivo transfekce dendritických buněk může být • ••Φ ·· ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· φφφ φφφφφ ·· · provedena, například, za použití jakýchkoliv metod známých v oboru, jako jsou metody popsané ve WO 97/24447, nebo technika genového děla popsaná v Mahvi et al., Immunology and Cell Biology, 75: 456-460, 1997. Naplnění dendritických buněk antigenem může být dosaženo inkubací dendritických buněk nebo progenitořových buněk s polypeptidem, DNA (holou nebo v plasmidovém vektoru) nebo RNA; nebo s rekombinantní bakterií nebo virem (například virem vakcinie, drůbežích neštovic, adenovirem nebo lentivirem) exprimujícím antigen. Před naplněním může být polypeptid kovalentně konjugován na imunologický partner, který napomáhá T-lymfocytům (například nosič). Alternativně mohou být dendritické buňky pulsovány nekonjugovaným imunologickým partnerem, samostatně nebo za přítomnosti polypeptidu.
Vakcíny a farmaceutické prostředky mohou být připraveny v jednodávkových nebo vícedávkových zásobnících, jako jsou ampule nebo fioly. Takové zásobníky jsou obvykle hermeticky uzavřeny pro zachování sterility prostředku do použití. Obecně, prostředky mohou být skladovány jako suspenze, roztoky nebo emulze v oleji nebo ve vodných vehikulech. Alternativně mohou být vakcíny nebo farmaceutické prostředky uskladněny v lyofilizovaném stavu vyžadujícím pouze přidání sterilního vodného nosiče bezprostředně před použitím.
Protinádorová terapie
V dalších aspektech předkládaného vynálezu mohou být popsané prostředky použity pro imunoterapii nádorů, jako je karcinom plic. V takových metodách jsou farmaceutické prostředky a vakcíny obvykle podány pacientovi. Termín pacient, jak je zde použit, označuje teplokrevného živočicha, výhodně člověka. Pacient může, ale nemusí být postižen nádorem. V souladu-s tím mohou být farmaceutické prostředky a vakcíny podle předkládaného vynálezu • · použity pro prevenci vzniku nádoru nebo pro léčbu pacientů postižených nádorem. Takový nádor může být diagnostikován pomocí kriterií obecně přijímaných v oboru, včetně přítomnosti maligního nádoru. Farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být podány bud' před, nebo po chirurgickém odstranění primárního nádoru a/nebo po aplikaci radioterapie nebo běžné chemoterapie.
V některých provedeních může být imunoterapie aktivní imunoterapií, při které léčba spočívá v in vivo stimulaci endogenního imunitního systému hostitele k reakci proti nádorům pomocí podání činidel modifikujících imunitní odpověď (jako jsou zde popsané polypeptidy a polynukleotidy).
V některých provedeních může být imunoterapie pasivní imunoterapií, při které léčba spočívá v podání činidel majících imunoreaktivitu proti nádoru (jako jsou efektorové buňky nebo protilátky), která mohou přímo nebo nepřímo zprostředkovat protinádorové účinky a nejsou závislá nutně na intaktním imunitním systému hostitele. Příklady efektorových buněk jsou T-lymfocyty jak byly uvedeny výše, T-lymfocyty (například CD8+ cytotoxické T-lymfocyty a CD4+ T-helper nádor infiltrující lymfocyty), zabiječi (jako jsou přirození zabiječi a zabiječi aktivovaní lymfokiny), B-lymfocyty a buňky prezentující antigen (jako jsou dendritické buňky a makrofágy) exprimuj ící polypeptid podle předkládaného vynálezu. Receptory T-lymfocytů a protilátkové receptory specifické pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být klonovány, exprimovány a transfektovány do jiných vektorů nebo efektorových buněk pro adoptivní imunoterapií. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro generování protilátek nebo anti-idiotypových protilátek (jak byly popsány výše a v US patentu č. 4918164) pro pasivní imunoterapií.
··♦· ·· ·· ···· ·· • · · · · · · ·· · · ···· · ·· ·· ·· ··· ·· ···· • ·
Efektorové buňky mohou být získány v dostatečných množstvích pro adoptivní imunoterapii kultivací in vitro, která je zde popsána. Kultivační podmínky pro namnožení jediné efektorové buňky specifické pro antigen na počet několika milionů za zachování rozpoznávání antigenu in vivo jsou dobře známé v oboru. Takové in vitro kultivační podmínky obvykle využívají intermitentní stimulace antigenem, často za přítomnosti cytokinů (jako je IL-2) a nedělících se podpůrných buněk. Jak bylo uvedeno výše, imunoreaktivní polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro rychlou expanzi kultur T-lymfocytů specifických pro antigen za účelem získání dostatečného počtu buněk pro imunoterapii. Konkrétně, buňky prezentující antigen, jako jsou dendritické buňky, makrofágy nebo B-lymfocyty, mohou být pulsovány imunoreaktivními polypeptidy nebo transfektovány jedním nebo více polynukleotidy za použití standardních technik známých v oboru. Například mohou být buňky prezentující antigen transfektovány polynukleotidem majícím promotor vhodný pro zvýšení exprese v rekombinantním viru nebo v jiném expresním systému. Kultivované efektorové buňky pro použití v terapii musí být schopny růstu a distribuce a musí dlouhodobě přežívat in vivo. Studie prokázaly, že růstu a dlouhodobého přežívání kultivovaných efektorových buněk může být in vivo dosaženo opakovanou stimulací antigenem společně s IL-2 (viz například Cheever et al., Immunological Reviews 157: 177, 1999).
Alternativně může být vektor exprimující polypeptid podle předkládaného vynálezu vložen do kmenových buněk získaných od pacienta a ty mohou být klonálně propagovány in vitro a potom autologně transplantovány stejnému pacientovi. Transfektováné buňky mohou být podány zpět pacientovi za použití jakýchkoliv prostředků známých v oboru, výhodně jsou podány ve sterilní formě pomocí intravenosního, intrakavitárního, intraperitoneálního nebo intranádorového podání.
• · · ·
Způsoby a frekvence podání, stejně jako dávkování, se velmi liší mezi jedinci, a může být určeno za použití standardních technik. Obecně, farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být podány injekčně (například podkožně, intrakutáně, intrámuskulárně nebo intravenosně), intranasálně (například aspirací) nebo orálně. Výhodně se během 52 týdnů aplikuje 1 až 10 dávek. Výhodně se podá 6 dávek, v intervalu 1 měsíce, a potom mohou být periodicky aplikovány dosycovací vakcinace. Jiné protokoly mohou být vhodné pro jednotlivé pacienty. Vhodná dávka je množství sloučeniny, které při podání výše uvedenými způsoby vyvolá protinádorovou imunitní reakci, která je alespoň o 10-50% vyšší než bazální reakce. Taková reakce může být sledována měřením protinádorových protilátek u pacienta nebo podle vakcinou indukovaného generování cytolytických efektorových buněk schopných usmrcovat nádorové buňky od pacienta in vitro. Takové vakcíny by také měly být schopny vyvolat imunitní odpověď, která vede ke zlepšení klinického stavu (například častější remise, kompletní nebo parciální, nebo delší intervaly přežívání bez onemocnění) u vakcinovaných pacientů ve srovnání s nevakcinovanými pacienty. Obecně, pro farmaceutické prostředky a vakcíny obsahující jeden nebo více polypeptidů je množství každého polypeptidu v rozmezí od přibližně 25 ug do 5 mg na kg tělesného hmotnosti pacienta. Vhodné dávky se liší podle velikosti pacienta, ale obvykle jsou v rozmezí od přibližně 0,1 ml do přibližně 5 ml.
Obecně, vhodné dávkování a terapeutický režim poskytují aktivní sloučeninu v množství dostatečném pro dosažení terapeutického a/nebo profylaktického účinku. Taková odpověď může být monitorována podle lepšího klinického výsledku (například častějších remisí, kompletních nebo parciálních, nebo delších intervalů přežívání bez onemocnění) u léčených pacientů ve srovnání s neléčenými pacienty. Zvýšení preexistující preexistující imunitní odpovědi na plicní nádorový protein obecně • 9 9*999 9 99 99
999 999 99*9
999 99999 99 9
999 99 9 999
99 99 999 99 99*9 koreluje s lepším klinickým výsledkem. Takové imunitní odpovědi mohou být hodnoceny za použití standardních testů na cytotoxicitu, proliferaci nebo uvolňování cytokinů, které mohou být provedeny za použití vzorků získaných od pacientů před a po léčbě.
Způsoby pro detekci nádorů
Obecně může být nádor detekován u pacienta podle přítomnosti jednoho nebo více plicních nádorových proteinů a/nebo polynukleotidů kódujících takové proteiny v biologickém vzorku (jako je krev, sérum, moč a/nebo nádorová biopsie) získaném od pacienta. Jinými slovy, takové proteinymohou být použity jako markéry ukazující na přítomnost nebo nepřítomnost nádoru, jako je karcinom plic. Dále mohou být takové proteiny užitečné při detekci jiných nádorů. Vazebná činidla podle předkládaného vynálezu umožňují detekci koncentrace proteinu, který se váže na činidlo v biologickém vzorku. Polynukleotidové primery a sondy mohou být použity pro detekci množství mRNA kódující nádorový protein, které také ukazuje na přítomnost nebo nepřítomnost nádoru. Obecně by měly být sekvence plicního nádoru přítomny v koncentracích, které jsou alespoň třikrát vyšší v nádorové tkáni než v normální tkáni.
Odborníci v oboru znají mnoho testovacích formátů, které mohou být použity pro pro detekci polypeptidových markérů ve vzorku za použití vazebného činidla. Viz například Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Obecně, přítomnost nebo nepřítomnost nádoru u pacienta může být stanovena (a) kontaktováním biologického vzorku získaného od pacienta s vazebným činidlem; (b) detekováním koncentrace polypeptidu ve vzorku, který se váže na vazebné činidlo; a (c) srovnáním koncentrace polypeptidu s předem určenou hraniční hodnotou.
9999
4
4 44 • ·♦ · ·· • 4 44 44 444 44 4444
Ve výhodném provedení test obsahuje použití vazebného činidla zmobilizovaného na pevném nosiči pro vazbu a odstranění polypeptidu ze vzorku. Navázaný polypeptid může být potom detekován pomocí detekčního činidla, které obsahuje reportérovou skupinu a které se specificky váže na komplex vazebné činidlo/polypeptid. Takové detekční činidlo může obsahovat, například, vazebné činidlo, které se specificky váže na polypeptid, nebo protilátku nebo jiné činidlo, které se specificky váže na vazebné činidlo, jako je anti-imunoglobulin, protein G, protein A nebo lektin. Alternativně může být použit kompetitivní test, ve kterém je polypeptid značen reportérovou skupinou a váže se na imobilizované vazebné činidlo po inkubaci vazebného činidla se vzorkem. Rozsah, ve kterém složky vzorku inhibují vazbu značeného polypeptidu na vazebné činidlo, ukazuje na reaktivitu vzorku s imobilizováným vazebným činidlem. Vhodnými polypeptidy propoužití v takových testech jsou kompletní plicní nádorové proteiny a jejich části, na které se vazebná činidla váží, jak byly popsány výše.
Pevným nosičem může být jakýkoliv materiál známý odborníkům v oboru, na který může být navázán nádorový protein. Například může být pevným nosičem testovací jamka v mikrotitrační plotně nebo nitrocelulosová nebo jiná vhodná membrána. Alternativně může být nosičem korálek nebo disk, jako je skleněný, latexový plastový materiál, jako je polystyren nebo polyvinylchlorid, nebo materiál ze skelného vlákna. Nosičem může být také magnetická částice nebo sensor optického vlákna, jak je popsáno, například, v US patentu č. 5359681. Vazebné činidlo může být imobilizováno na pevném nosiči za použití různých technik známých odborníkům v oboru, které jsou důkladně popsány v patentové a odborné literatuře.
V předkládaném vynálezu označuje termín imobilizace jak nekovalentní asociaci, jako je adsorpce, tak kovalentní navázání (které může být provedeno jak přímou vazbou mezi činidlem •Φ ··*· • · • ··· ···· ·· a funkčními skupinami na nosiči, tak vazbou prostřednictvím zesilovacího činidla). Výhodná je imobilizace adsorpcí na jamku mikrotitrační plotny nebo na membránu. V takových případech může být adsorpce dosažena kontaktováním vazebného činidla, ve vhodném pufru, s pevným nosičem po dostatečně dlouhou dobu. Doba kontaktu se liší podle teploty, ale obvykle je v rozmezí mezi přibližně 1 hodinou a přibližně 1 dnem. Obecně, kontaktování jamky plastové mikrotitrační plotny (například polystyrénové nebo polyvinylchloridové) s množstvím vazebného činidla v rozmezí od přibližně 10 ng do přibližně 10 ug, a lépe přibližně 100 ng do přibližně 1 ug, je dostatečné pro imobilizaci adekvátního množství vazebného činidla.
Kovalentní navázání vazebného činidla na pevný nosič může být provedeno nejprve reakcí nosiče s bifunkčním činidlem, které reaguje jak s nosičem, tak s funkčními skupinami, jako je hydroxylová a amino skupina, na vazebném činidle. Například může být vazebné činidlo kovalentně navázáno na nosiče mající vhodný polymerový potah za použití benzochinonu nebo kondenzací aldehydové skupiny na nosiči s aminem a aktivním vodíkem na vazebném činidle (viz například Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13).
V některých provedeních je testem dvouprotilátkový sandwichový test. Tento test je provede nejprve kontaktováním protilátky, která byla imobilizována na pevném nosiči, obvykle jamce mikrotitrační plotny, se vzorkem, tak, že polypeptid ve vzorku se může vázat na imobilizovanou protilátku. Nenavázaný vzorek se potom odstraní od imobilizovaných komplexů polypeptid-protilátka a přidá se detekční činidlo (výhodně druhá protilátka vážící se na jiné místo na polypeptidů) obsahující reportérovou skupinu. Množství detekčního činidla, které zůstává-navázané na pevný nosič, se potom určí za použití metody vhodné pro specifickou ·♦ ***· reportérovou skupinu.
Přesněji, když je protilátka imobilizována na nosiči způsobem popsaným výše, tak jsou zbývající vazebná místa pro proteiny na nosiči obvykle blokována. Může být použito jakékoliv blokovací činidlo známé odborníkům v oboru, jako je hovězí sérový albumin nebo Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Imobilizovaná protilátka se potom inkubuje se vzorkem a polypeptid se nechá navázat na protilátku. Vzorek může být před inkubací naředěn vhodným ředidlem, jako je fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS). Obecně, vhodná doba kontaktu (t.j. inkubační čas) je doba, která je dostatečná pro detekci přítomnosti polypeptidu ve vzorku získaného od jedince s karcinomem plic. Výhodně je kontaktní doba dostatečná pro dosažení úrovně vazby, která je alespoň 95% vzhledem k rovnováze mezi navázaným a nenavázaným polypeptidem. Odborníkům v oboru bude jasné, že doba nutná pro dosažení rovnováhy může být snadno určena testováním vazby v závislosti na čase. Při teplotě místnosti je obvykle dostatečná doba přibližně 30 minut.
Nenavázaný vzorek může být potom odstraněn promytím pevného nosiče vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1% Tween 20™. Druhá protilátka, která obsahuje reportérovou skupinu, může být potom přidána k pevnému nosiči. Výhodnými reportérovými skupinami jsou skupiny uvedené výše.
Detekční činidlo se potom inkubuje s imobilizovaným komplexem polypeptid-protilátka po dobu dostatečnou pro detekci navázaného polypeptidu. Vhodná doba se obecně určí hodnocením závislosti vazba-čas. Nenavázané detekční činidlo se potom odstraní a navázané detekční činidlo se detekuje pomocí reportérové skupiny. Způsob použitý pro detekci reportérové skupiny závisí na charakteru použité reportérové skupiny. Pro radioaktivní skupiny • * · •r<· » « • 9 • · 4 ·· ·· ·* ·44· ·4 44 • · ·Λ · 4 · • ··· · · · • · ♦ · · · ·· ·*· 5· ·«·· jsou obvykle vhodné scintilační nebo autoradiografické metody. Spektroskopické metody mohou být použity pro detekci barviv, luminiscentních skupin a fluorescentních skupin. Biotin může být detekován pomocí avidinu, navázaného na různé reportérové skupiny (obvykle radioaktivní nebo fluorescentní skupiny nebo na enzym). Enzymové reportérové skupiny mohou být detekovány adicí substrátu (obvykle na určitou dobu) a potom spektroskopickou nebo jinou analýzou reakčních produktů.
Pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádorů, jako je karcinom plic, je signál detekovaný z reportérové skupiny, která zůstává navázaná na pevný nosič, obvykle srovnáván se signálem korespondujícím s předem určenou hraniční hodnotou. V jednom výhodném provedení je hraniční hodnota pro detekci nádoru průměrný signál získaný tehdy, když je imobilizovaná protilátka inkubována se vzorky od pacientů bez nádoru. Obecně, vzorek generující signál, který je o tři standardní odchylky vyšší než předem určená hraniční hodnota, je považován za pozitivní z hlediska nádoru. V alternativním provedení je hraniční hodnota určena za použití Receiver Operátor Curve, podle metody popsané v Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, str. 106-7. Stručně, v tomto provedení může být hraniční hodnota určena z grafu párů správně pozitivních výsledků (t.j. sensitivity) a falešně pozitivních výsledků (100% specificita), které korespondují každé možné hraniční hodnotě pro výsledek diagnostického testu. Hraniční hodnota v grafu, která je nejvíce v levém horním rohu (t.j. hodnota, která ohraničuje největší plochu), je nejpřesnější hraniční hodnotou, a vzorek generující signál, který je vyšší než hraniční hodnota určená tímto způsobem, může být považován za pozitivní. Alternativně může být hraniční hodnota v grafu posunuta doleva, což minimalizuje falešně pozitivní výsledky, nebo doprava, což minimalizuje falešně negativní výsledky. Obecně, vzorek generující signál, který je • · · ··· ·· 1 f) • · · ····· · · · • · · «· ··· ······ vyšší než hraniční hodnota určená tímto způsobem, může být považován za pozitivní.
V příbuzném provedení je test proveden v průtokovém nebo proužkovém testovacím formátu, ve kterém je vazebné činidlo imobilizováno na membráně, jako je nitrocelulosová membrána. V průtokovém testu se polypeptidy ve vzorku váží na imobilizovaná vazebná činidla při průchodu vzorku membránou. Druhé, značené vazebné činidlo se potom váže na komplex vazebné činidlo-polypeptid při průtoku roztoku obsahujícího druhé vazebné činidlo membránou. Detekce druhého vazebného činidlamůže být provedena způsobem popsaným výše. V proužkovém testovacím formátu je jeden konec membrány, na který je vazebné činidlo navázáno, ponořen do roztoku obsahujícího vzorek. Vzorek migruje membránou skrz region obsahující druhé vazebné činidlo a do oblasti obsahující imobilizované vazebné činidlo. Koncentrování druhého vazebného činidla v oblasti imobilizované protilátky ukazuje na přítomnost nádoru. Obvykle vyvolává koncentrování druhého vazebné činidla v tomto místě jev, jako je proužek, který může být snadno detekován vizuálně. Nepřítomnost takového jevu ukazuje na negativní výsledek. Obecně, množství vazebného činidla imobilizovaného na membráně je vybráno tak, aby byl generován vizuálně odlišitelný efekt tehdy, když biologický vzorek obsahuje takové množství polypeptidu, které bude dostatečné pro generování pozitivního signálu ve dvou-protilátkovém testu, jak byl popsán výše. Výhodnými vazebnými činidly pro použití v těchto testech jsou protilátky a jejich vazebné fragmenty pro antigen. Výhodně je množství protilátky imobilizované na membráně v rozmezí od přibližně 25 ng do přibližně 1 ug, a lépe od přibližně 50 ng do přibližně 500 ng. Takové testy mohou být obvykle provedeny na velmi malém biologickém vzorku.
Samozřejmě, že existuje mnoho jiných testovacích protokolů, které jsou vhodné pro použití s nádorovými proteiny nebo vazebnými činidly podle předkládaného vynálezu. Výše uvedený popis je pouze příkladný. Odborníkům v oboru bude například jasné, že výše uvedené protokoly mohou být snadno modifikovány pro použití plicních nádorových polypeptidů pro detekci protilátek, které se váží na takové polypeptidy v biologickém vzorku. Detekce takových protilátek specifických pro plicní nádorový protein může korelovat s přítomností nádoru.
Nádor může být také, nebo alternativně, detekován podle přítomnosti T-lymfocytů, které specificky reagují s plicním nádorovým proteinem v biologickém vzorku. V některých provedeních je biologický vzorek obsahující CD4 + a/nebo CD8+ T-lymfocyty izolované od pacienta inkubován s plicním nádorovým polypeptidem, polynukleotidem kódujícím takový polypeptid a/nebo APC, které exprimují alespoň imunogenní část takového polypeptidu, a detekuje se přítomnost nebo nepřítomnost specifické aktivace T-lymfocytů. Vhodnými biologickými vzorky jsou, například, izolované T-lymfocyty. T-lymfocyty mohou být izolovány od pacienta za použití běžných technik (jako je odstředění lymfocytů periferní krve pomocí Ficoll/Hypaque densitního gradientu). T-lymfocyty mohou být inkubovány in vitro po dobu 2-9 dnů (obvykle po dobu 4 dnů) při teplotě 37 °C s plicním nádorovým proteinem (například 5-25 ug/ml). Je žádoucí inkubovat jiný podíl vzorku T-lymfocytů za nepřítomnosti plicního nádorového polypeptidu a tento vzorek slouží jako kontrola. Pro CD4+ T-lymfocyty je aktivace výhodně detekována hodnocením proliferace T-lymfocytů. Pro CD8+ T-lymfocyty je aktivace výhodně detekována podle cytolytické aktivity. Úroveň proliferace, která je alespoň 2-krát vyšší a/nebo úroveň cytolytické aktivity, která je alespoň o 20% vyšší než u pacientů bez onemocnění, ukazuje na přítomnost nádoru u pacienta.
Jak bylo uvedeno výše, nádory mohou být také, nebo alternativně, detekovány podle úrovně mRNA kódující plicní nádorový protein v biologickém vzorku. Například mohou být alespoň dva oligonukleotidové primery použity v testu na bázi polymerasové řetězové reakce (PCR) pro amplifikaci části cDNA plicního karcinomového proteinu získané z biologického vzorku, kde alespoň jeden z oligonukleotidových primerů je specifický pro (t.j. hybridituje na) polynukleotid kódující plicní nádorový protein. Amplifikovaná cDNA se potom separuje a detekuje se za použití technik dobře známých v oboru, jako je gelová elektroforesa. Podobně, oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují na polynukleotid kódující plicní nádorový protein, mohou být použity v hybridizačním testu pro detekci přítomnosti polynukleotidu kódujícího nádorový protein v biologickém vzorku.
Pro umožnění hybridizace za testovacích podmínek by oligonukleotidové primery a sondy měly obsahovat oligonukleotidovou sekvenci, která má alespoň 60%, lépe alespoň 75% a nejlépe alespoň 90% identitu s částí polynukleotidu kódujícího plicní nádorový protein, která má délku alespoň 10 nukleotidů, lépe alespoň 20 nukleotidů. Výhodně hybridizují oligonukleotidové primery a/nebo sondy na polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu za středně přísných podmínek, jak byly popsány výše. Oligonukleotidové primery a/nebo sondy, které mohou být použity v diagnostických metodách podle předkládaného vynálezu, mají délku alespoň 10-40 nukleotidů. Ve výhodném provedení obsahují oligonukleotidové primery alespoň 10 kontinuálních oligonukleotidů, lépe alespoň 15 kontinuálních oligonukleotidů, DNA molekuly mající sekvenci podle SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349. Techniky pro testy na bázi PCR a pro hybridizační testy-jsou dobře známé v oboru (viz například Mullis et al., Cold. Spring Harbor Symp.
• · · · ·· ·· • » · · • · ·
Quant Biol 51: 263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, Ν.Y., 1989).
Jeden výhodný test využívá RT-PCR, při kterém je PCR použita společně s reverzní transkripcí. Obvykle je RNA extrahována z biologického vzorku, jako je tkáň získaná při biopsii, a je reverzně transkribována za zisku cDNA molekul. PCR amplifikace za použití alespoň jednoho specifického primeru vede k zisku cDNA molekuly, která může být separována a vizualizována za použití, například, gelové elektroforesy. Amplifikace může být provedena na biologických vzorcích odebraných od testovaného pacienta a od jedince, který není postižen nádorem. Amplifikační reakce může být provedena na několika ředěních cDNA v rozsahu dvou řádů. Dvojnásobné nebo vyšší zvýšení exprese v několika ředěních vzorku od testovaného pacienta ve srovnání se stejnými ředěními vzorku od pacienta bez nádoru se obvykle považuje za pozitivní.
V jiném provedení mohou být popsané prostředky použity jako markéry pro sledování progrese nádoru, v tomto provedení mohou být testy popsané výše pro diagnostiku nádoru prováděny v čase a mohou být hodnoceny změny v koncentraci reaktivních polypeptidů nebo polynukleotidů. Napříkad mohou být testy prováděny každých 24-72 hodin po dobu 6 měsíců až 1 roku a potom podle potřeby. Obecně, nádor progreduje u těch pacientů, u kterých se koncentrace polypeptidů detekovaného vazebnými činidlem zvyšuje v čase. Naopak, nádor neprogreduje, když koncentrace reaktivního polypeptidů bud' zůstává konstantní, nebo se snižuje.
Některé diagnostické testy in vivo mohou být provedeny přímo na nádoru. Jeden takový test zahrnuje kontaktování nádorových buněk s vazebným činidlem. Navázané vazebné činidlo může být potom detekováno přímo nebo nepřímo prostřednictvím reportérové skupiny. Taková vazebná činidla mohou být také použita v histologických • · technikách. Alternativně může být v takových technikách použita polynukleotidová sonda.
Jak bylo uvedeno výše, pro zlepšení sensitivity může být v daném vzorku testováno více proteinových markérů plicního karcinomu. Je jasné, že vazebná činidla specifická pro různé proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být kombinována v jednom testu. Dále, více primerů nebo sond může být použito současně. Výběr nádorových proteinových markérů může být proveden podle rutinních pokusů pro stanovení kombinace, která vede k optimální sensitivitě. Dále, nebo alternativně, testy na nádorové proteiny podle předkládaného -vynálezu mohou být kombinovány s testy na jiné známé nádorové antigeny.
Diagnostické kity
Předkládaný vynález dále poskytuje kity pro použití v jakékoliv z výše uvedených diagnostických metod. Takové kity obvykle obsahují dvě nebo více složek nutných pro provedení diagnostického testu. Složkami mohou být sloučeniny, činidla, zásobníky a/nebo vybavení. Například, jeden zásobník v křtu může obsahovat monoklonální protilátku nebo její fragment, která se specificky váže na plicní nádorový protein. Takové protilátky nebo fragmenty mohou být navázány na nosič, jak je popsáno výše. Jeden nebo více dalších zásobníků může obsahovat prvky, jako jsou činidla nebo pufry, které jsou určeny pro použití v testu. Takové kity mohou také, nebo alternativně, obsahovat detekční činidla, jak jsou popsána výše, která obsahují reportérovou skupinu vhodnou pro přímou nebo nepřímou detekci vazby protilátky.
Alternativně může být kit navržen tak, aby detekoval koncentraci mRNA kódující plicní nádorový protein v biologickém vzorku. Takové kity obvykle obsahují alespoň jednu oligonukleotidovou sondu nebo primer, jak jsou popsány výše, které hybridizují na polynukleotid kódující plicní nádorový protein. Takový oligonukleotid může být použit, například, v PCR nebo hybridizačním testu. Dalšími složkami, které mohou být obsaženy v takových křtech, jsou druhý oligonukleotid a/nebo diagnostické činidlo nebo zásobník, které usnadňují detekci polynukleotidu kódujícího plicní nádorový protein.
Následující příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Izolace a charakterizace cDNA sekvencí kódujících plicní nádorové polypeptidy
Tento příklad ilustruje izolaci cDNA molekul kódujících polypeptidy specifické pro plicní nádory z cDNA knihoven plicního nádoru.
A. Izolace cDNA sekvencí z knihovny spinocelulárního karcinomu plic cDNA expresní knihovna lidského spinocelulárního karcinomu plic byla vyrobena z póly A* RNA od dvou pacientů za použití Superscript Plasmid Systém pro cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD), podle návodu výrobce. Přesněji, tkáně karcinomu plic se homogenizují polytronem (Kinematica, Switzerland) a celková RNA se extrahuje pomocí Trizol činidla (BRL Life Techniologies) podle návodu výrobce. Póly A* RNA se potom přečistí za použití oligo dT celulosové kolony, jak je popsáno v Sambrook et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
9 · · ·· •99 9 · 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 « • · ··· · 9 9 9 ·».»« ·· -,··.
β 5 · · · · 0·«··
První řetězec cDNA se syntetizuje za použití NotI/01igo-dT18 primeru. Syntetizuje se dvouřetězcová cDNA, liguje se s BstXI/EcoRI adaptory (Invitrogen, San Diego, CA) a tráví se Notl. Po frakcionaci podle velikosti na kolonách pro frakcionaci cDNA podle velikosti (BRL Life Technologies) se cDNA liguje do BstXl/Notl místa pcDNA3.1 (Invitrogen) a transformuje se do ElectroMax E.coli DH10B buněk (BRL Life Technologies) elektroporací.
Stejným postupem se cDNA expresní knihovna normálních plic připraví ze souboru vzorků plic. cDNA knihovny se charakterizují určením počtu nezávislých kolonií, procenta klonů nesoucích insert, průměrnou velikostí insertu a analýzou sekvence. Knihovna plicního spinocelulárního karcinomu obsahovala 2,7 x 10s nezávislých kolonií, se 100% klonů obsahujících insert a s průměrnou velikostí insertu 2100 párů baží. cDNA knihovna normálních plic obsahovala 1,4 x 10s nezávislých kolonií, s 90% klonů obsahujících insert a s průměrnou velikostí insertu 1800 párů baží. Pro obě knihovny analýza sekvence ukázala, že většina klonů obsahuje kompletní cDNA sekvence a že tyto sekvence byly syntetizovány z mRNA.
Odečtení cDNA knihoven bylo provedeno za použití výše uvedené cDNA knihovny spinocelulárního karcinomu plic a cDNA knihovny normálních plic, jak je popsáno v Hara et al. (Blood, 84: 189-1999, 1994), s určitými modifikacemi. Přesněji, odečtená cDNA knihovna specifická pro plicní spinocelulámí karcinom byla připravena následujícím způsobem. cDNA knihovna normální tkáně (80 ug) se trávila BamHl a Xhol a potom se provedla doplĚovací reakce s Klenowovým fragmentem DNA polymerasy. Po extrakci fenolem-chloroformem a vysrážení ethanolem se DNA rozpustila ve 133 ul H20, denaturovala se teplem a smísila se s 133 ul (133 ug) Photoprobe biotinem (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Podle doporučení výrobce se získaná směs ozařovala 270 W lampou na ledu po dobu 20 minut. Přidal se další Photoprobe biotin (67 ul) a biotinylační reakce se zopakovala. Po 5-násobné extrakci butanolem se DNA vysrážela ethanolem a rozpustila se ve 23 ul H^O za zisku řídící DNA.
Pro přípravu stopovací DNA se 10 ug cDNA knihovny spinocelulárního karcinomu plic trávilo Notl a Spěl, provedla se extrakce fenol-chloroformem a zpracování na Chromá spin-400 kolonách (Clontech, Palo Alto, CA). Obvykle se z kolony získalo 5 ug cDNA. Po vysrážení ethanolem se stopovací DNA rozpustila v 5 ul H20. Stopovací DNA se smísila s 15 ul řídící DNA a 20 1 2x hybridizačního pufru (1,5 M NaCl/10 mM EDTA/50 mM HEPES, pH 7,5/0,2% dodecylsíran sodný), směs se převrstvila minerálním olejem a zcela se tepelně denaturovala. Vzorek se ihned přenesl do vodní lázně o teplotě 68 °C a provedla se inkubace po dobu 20 hodin (dlouhá hybridizace (LH)). Reakční směs se potom zpracovala streptavidinem a extrahovala se fenolem/chloroformem. Odečtená DNA se vysrážela, rozpustila se ve 12 ul H^O, smísila se s 8 ul řídící DNA a 20 ul 2x hybridizačního pufru a provedla se hybridizace při 68 °C po dobu 2 hodin (krátká hybridizace(SH)). Po odstranění biotinylované dvouřetězcové DNA se odečtená cDNA ligovala do NotI(SpeI místa pBCSK·*· resistentního na chloramfenikol (Stratagene, La Jolla, CA) a transformovala se do ElectroMax E. coli DH10B buněk elektroporací za zisku odečtené cDNA knihovny specifické pro spinocelulární karcinom plic (která je zde označována jako plicní odečet I).
Druhá cDNA knihovna specifická pro spinocelulární karcinom plic (která je zde označována jako plicní odečet II) se připravila podobně jako plicní odečtená knihovna I s tou výjimkou, že 8 často získaných genů z plicního odečtu I se použilo v řídící DNA, a získalo se 24000 nezávislých klonů.
Pro analýzu odečtených cDNA knihoven se z 320 nezávislých klonů, náhodně odebraných z odečtených knihoven specifických pro spinocelulární karcinom plic, připravila plasmidová DNA. Representativní cDNA klony se dále charakterizovaly DNA sekvencováním za použití Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Automated Sequencer Model 373A a/nebo model 377 (Foster City, CA). cDNA sekvence pro šedesát izolovaných klonů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 1-60. Tyto sekvence se srovnávaly se známými sekvencemi v genové bance za použití EMBL a GenBank databází (uvolnění 96). Žádné významné homologie nebyly zjištěny pro sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2, 3, 19, 38 a 46. Pro sekvence SEQ ID NO: 1, 6-8, 10-13, 15, 17, 18, 20-27, 29, 30, 32, 34-37, 39-45, 47-49, 51, 52, 54, 55 a 57-59 byla zjištěna určitá homologie s dříve identifikovanými koncovkami exprimovaných sekvencí (EST). pro sekvence SEQ ID NO: 9, 28, 31 a 33 bylo zjištěno, že mají určitou homologii s dříve identifikovanými sekvencemi non-lidských genů a pro sekvence SEQ ID NO: 4, 5, 14, 50, 53, 56 a 60 bylo zjištěno, že mají určitou homologii s genovými sekvencemi dříve identifikovanými u člověka.
Odečítací postup popsaný výše se opakoval za použiti cDNA knihovny plicního spinocelulárního karcinomu jako stopovací DNA a výše popsané cDNA knihovny normálních plic a cDNA knihovny normálních jater a srdce (připravené z jednoho vzorku z každé tkáně, jak bylo popsáno výše), plus 12 jiných cDNA klonů, které byly často získány v plicních odečtech I a II, jako řídící DNA (plicní odečet III) . cDNA knihovna normálních jater a srdce obsahovala 1,76 x 106 nezávislých kolonií, se 100% klonů obsahujících insert a s průměrnou velikostí insertu 1600 párů baží. Izolovalo se 10 dalších klonů (SEQ ID NO: 61-70). Srovnání těchto cDNA sekvencí se sekvencemi v genové bance, jak bylo popsáno výše, neukázalo žádné významné homologie pro sekvence uvedené v SEQ ID NO: 62 a 67. Pro sekvence SEQ ID NO: 61, 63-66, a 69 bylo zjištěno, že mají určitou homologii s již izolovanými EST a pro sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 70 bylo zjištěno, že má určitou homologii s dříve identifikovaným krysím genem.
Odečítací postup popsaný výše se opakoval za použiti cDNA knihovny plicního spinocelulárního karcinomu jako stopovací DNA a výše popsané cDNA knihovny normálních plic a cDNA knihovny ze souboru normálních plic, ledvin, tlustého steřva, slinivky břišní, mozku, klidových PBMC, srdce, kůže a jícnu jako řídící DNA, kde jícnová cDNA tvořila třetinu materiálu. Předpokládalo se, že protože je jícen bohatý na normální epiteliální buňky, včetně diferencovaných spinocelulámích buněk, zjistí tento postup geny, které jsou specifické pro nádor spíše než pro tkáň. cDNA sekvence 48 klonů získaných v tomto odečtu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 177-224. Sekvence SEQ ID NO: 177, 178, 180, 181, 183, 187, 192, 195-197, 208, 211, 212, 215, 216, 218 a 219 vykazovaly určitou homologii s dříve identifikovanými geny. Sekvence SEQ ID NO: 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220 a 224 vykazovaly určitou homologii s dříve určenými EST. Sekvence SEQ ID NO: 221-223 nevykazovaly žádnou homologii s žádnou dříve určenou sekvencí.
B. Izolace cDNA sekvencí z knihovny plicního adenokarcinomu cDNA expresní knihovna lidského adenokarcinomu plic se připravila způsobem popsaným výše. Knihovna obsahovala 3,2 x 106 nezávislých kolonií, se 100% klonů obsahujících insert a s průměrnou velikostí insertu 1500 párů baží. Odečet knihovny se provedl způsobem popsaným výše za použití cDNA expresních knihoven normálních plic a normálních jater a srdce jako řídící DNA. Získalo se 126 nezávislých klonů.
Počáteční analýza sekvence cDNA ze 100 nezávislých klonů • ·4 · odhalila mnoho genů pro ribosomální proteiny. cDNA sekvence pro 15 klonů izolovaných v tomto odečtu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 71-86. Srovnání těchto sekvencí se sekvencemi v genových bankách, provedené způsobem popsaným výše, neukázalo žádnou významnou homologii pro sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 84. Bylo zjištěno, že sekvence SEQ ID NO: 71, 73, 74, 77, 78 a 80-82 mají určitou homologii s dříve izolovanými EST a že sekvence SEQ ID NO: 72, 75, 76, 79, 83 a 85 mají určitou homologii s dříve izolovanými lidskými geny.
V dalších studiích byla cDNA knihovna (označená jako mets3616A) připravena z metastatického adenokarcinomu plic. Určené cDNA sekvence 25 náhodně sekvencovaných klonů z této knihovny jsou uvedeny v SEQ ID NO: 255-279. Mets3616A cDNA knihovna byla odečtena proti cDNA knihovně připravené ze souboru normálních plic, jater, slinivky břišní, kůže, ledvin, mozku a klidových PBMC. Pro zvýšení specificity odečtu byly v řídící cDNA obsaženy geny, které byly určeny jako nej častější v mets3616A cDNA knihovně, jako je EFl-alfa, integrin-beta a antikoagulační protein PP4, stejně jako cDNA, o kterých bylo dříve zjištěno, že jsou diferenciálně exprimovány v odečtených cDNA knihovnách plicního adenokarcinomu. Určené cDNA sekvence 51 klonů izolovaných z této odečtené knihovny (označené jako mets3616A-Sl) jsou uvedeny v SEQ ID NO: 280-330.
Srovnání sekvencí SEQ ID NO: 255-330 se sekvencemi ve veřejných databázích neukázalo žádné významné homologie pro sekvence SEQ ID NO: 255-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279, 281, 287, 291, 296, 300 a 310. Sekvence SEQ ID NO: 259, 261, 265-269, 271, 273, 274, 277, 278, 282-285, 288-290, 292, 294, 297-299, 301, 303-309, 313, 314, 316, 320-324 a 326-330 vykazovaly určitou homologii s dříve identifikovanými genovými sekvencemi,- zatímco SEQ ID NO: 280, 286, 293, 302, 310, 312, 315, 317-319 a 325 vykazovaly ·♦·· ·· • · • · určitou homologii s dříve izolovanými exprimovanými koncovkami sekvencí (EST).
Příklad 2: Určení tkáňové specificity plicních nádorových polypeptidů
Pomocí genově specifických primerů byla úroveň exprese mRNA pro sedm representativních plicních nádorových polypeptidů popsaných v příkladu 1 určena v různých normálních a nádorových tkáních za použití RT-PCR.
Stručně, celková RNA se extrahovala z různých normálních a nádorových tkání za použití Trizol činidla, jak bylo popsáno výše. Syntéza prvního řetězce se provedla za použití 2 ug celkové RNA s SuperScript II reverzní transkriptasou (BRL Life Techniologies) při 42 °C po dobu 1 hodiny. cDNA se potom amplifikovala PCR s genově specifickými primery. Pro zajištění semi-kvantitativního charakteru RT-PCR se beta-aktin použil jako vnitřní kontrola pro každou vyšetřovanou tkáň. 1 ul ředění 1:30 cDNA se použil pro zajištění lineární škály amplifikace beta-aktinového templátu a toto bylo dostatečně sensitivní pro zjištění rozdílů v počátečním počtu kopií. Za použití těchto podmínek se hladiny beta-aktinu určily pro každou reversní transkripci z každé tkáně. Kontaminace DNA byla minimalizována zpracováním DNAsou a ověřením negativního výsledku PCR při použití prvního řetězce cDNA, který byl připraven bez přidání reverzní transkriptasy.
Úrovně exprese mRNA se testovaly v pěti různých typech nádorových tkáních (spinocelulární karciom plic od 3 pacientů, adenokarcinom plic, nádor tlustého střeva od 2 pacentů, karcinom prsu a karcinom prostaty), a ve třinácti různých normálních tkáních (od 4 dárců, prostata, mozek, ledviny, játra, vaječníky, kosterní sval, kůže, tenké střevo, žaludek, myokard, sítnice a varlata). Při použití 10-násobného množství cDNA bylo zjištěno, že antigen LST-S1-90 (SEQ ID NO: 3) je exprimován ve značném množství ve spinocelulárním karcinomu plic a v karcinomu prsu, a v téměř nedetekovatelném množství v jiných testovaných tkáních.
Antigen LST-S2-68 (SEQ ID NO: 15) je patrně specifický pro karcionomy prsu a plic, nicméně, jeho exprese je také detekovatelná v normálních ledvinách. Antigeny LST-S1-169 (SEQ ID NO: 6) a LST-S1-133 (SEQ ID NO: 5) jsou velmi hojné v plicní tkáni (jak normální, tak nádorové), a exprese těchto dvou genů je snížena ve většině normálních testovaných tkání. Jak LST-S1-196, tak LST-S1-133 jsou také exprimovány v nádorech prsu a tlustého střeva. Antigeny LST-S1-6 (SEQ ID NO: 7) a LST-S2I2-5F (SEQ ID NO: 47) nevykazovaly žádnou nádorově nebo tkáňově specifickou expresi, ale exprese LST-S1-28 byla vzácná a pouze detekovatelná v několika tkáních. Antigen LST-S3-7 (SEQ ID NO: 63) vykazoval expresi specifickou pro nádory plic a prsu, a také byl detekovatelný v normálních varlatech pro provedení 30 cyklů PCR. Nízká hladina exprese byla detekována v některých normálních tkáních, když byl počet cyklů zvýšen na 35. Bylo zjištěno, že antigen LST-S3-13 (SEQ ID NO: 66) je exprimován ve 3 ze 4 plicních nádorů, jednom nádoru prsu a obou nádorech tlustého střeva. Jeho exprese v normálních tkáních byla nízká ve srovnání s nádory a byla detekována pouze v 1 ze 4 normálních plicních tkání a v normálních tkáních ledvin, vaječníku a sítnice. Exprese antigenů LST-S3-4 (SEQ ID NO: 62) a LST-S3-14 (SEQ ID NO: 67) byla vzácná a nebyla specifická pro nádorové ani normální tkáně. V souladu s Northerovým přenosem ukazují výsledky RT-PCR pro antigen LAT-S1-A-10A (SEQ ID NO: 78), že jeho exprese je vysoká v plících, tlustém střevu, žaludku a tenkém střevu, včetně nádorů plic a tlustého střeva, zatímco jeho exprese je nízká nebo nedetekovatelná v jiných tkáních.
Celkem 2002 cDNA fragmentů izolovaných plicních odečtech I, II ·· ·Φ·Φ • φ * ♦·· a III, jak bylo popsáno výše, se amplifikovalo v colony PCR a jejich exprese mRNA v plicních nádorech, normálních plících a různých jiných normálních a nádorových tkáních se určila za použití technologie mikrosestav (Synteni, Palo Alto, CA). Stručně, produkty PCR amplifikace se nanesly na blány ve formátu sestavy, ve které obsazoval každý produkt jedno určité místo. mRNA se extrahovala z testovaného vzorku tkáně, reversně se transkribovala a připravily se fluorescenčně značené cDNA sondy. Mikrosestavy se sondovaly značenými cDNA sondami, blány se skenovaly a změřila se intenzita fluorescence. Tato intenzita koreluje s intenzitou hybridizace. 17 cDNA klonů vykazovalo nadměrnou exprese ve spinocelulárním nádoru plic, kdy exprese těchto klonů v normálních testovaných tkáních (plících, kůži, lymfatické uzlině, tlustém střevu, játrech, slinivce břišní, prsu, srdci, kostní dřeni, tlustém střevu, ledvině, žaludku, mozku, tenkém střevu, močovém měchýři a slinné žláze) byla buď nedetekovatelná, nebo 10-krát nižší. Určené částečné cDNA sekvence pro klon L513S jsou uvedeny v SEQ ID NO: 87 a 88; sekvence pro L514S jsou uvedeny v SEQ ID NO: 89 a 90; sekvence pro L519S je uvedena v SEQ ID NO: 94; sekvence pro L520S jsou uvedeny v SEQ ID NO: 95 a 96; sekvence pro L521S jsou uvedeny v SEQ ID NO: 97 a 98; sekvence pro L522S je uvedena v SEQ ID NO: 99; sekvence pro L523S je uvedena v SEQ ID NO: 100; sekvence pro L524S je uvedena v SEQ ID NO: 101; sekvence pro L525S je uvedena v SEQ ID NO: 102; sekvence pro L526S je uvedena v SEQ ID NO: 103; sekvence pro L527S je uvedena v SEQ ID NO: 104; sekvence pro L528S je uvedena v SEQ ID NO: 105; sekvence pro L529S je uvedena v SEQ ID NO: 106; sekvence pro L530S jsou uvedeny v SEQ ID NO: 107 a 108. Dále, kompletní cDNA sekvence pro L530S je uvedena v SEQ ID NO: 151 a příslušná předpokládaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 152. L530S vykazuje homologii se sestřihovou variantou homologu tumor-supresorového genu p53, s p63. cDNA sekvence sedmi známých izoforem p63 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 331-337 a příslušné předpokládané aminokyselinové sekvence
• · ··· • · · ·· ·« · jsou uvedeny v SEQ ID NO: 338-344, v příslušném pořadí.
Zdá se, že z důvodu polymorfismu má klon L531S dvě formy. První určená kompletní cDNA sekvence pro L513S je uvedena v SEQ ID NO: 109 příslušná předpokládaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 110. Druhá určená kompletní cDNA sekvence pro L513S je uvedena v SEQ ID NO: 111 příslušná předpokládaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 112. Sekvence SEQ ID NO: 111 je identická se SEQ ID NO: 109 s tou výjimkou, že obsahuje 27 bp insert. Obdobně, L514S má také dvě alternativně sestřižené formy; první varianta cDNA je uvedena v SEQ ID NO: 153, s příslušnou předpokládanou aminokyselinovou sekvence uvedenou v SEQ ID NO: 155. Druhá varianta kompletní cDNA je uvedena v SEQ ID NO: 154, s příslušnou předpokládanou aminokyselinovou sekvence uvedenou v SEQ ID NO: 156.
Kompletní klonování pro L524S (SEQ ID NO: 101) vedlo k zisku dvou variant (SEQ ID NO: 163 a 164) s příslušnými předpokládanými aminokyselinovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 165 a 166, v příslušném pořadí. Bylo zjištěno, že obě varianty kódují peptid příbuzný s parathyroidálním hormonem.
Pokusy o izolaci kompletní cDNA pro L519S vedly k izolaci rozšířené cDNA sekvence uvedené v SEQ ID NO: 173, která obsahuje potenciální otevřený čtecí rámec. Předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 173 je uvedena v SEQ ID NO: 174. Dále, kompletní cDNA sekvence pro klon SEQ ID NO: 100 (L523S), známý gen, je uvedena v SEQ ID NO: 175, a příslušná předpokládaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 176. V dalších studiích byla kompletní cDNA sekvence pro L523S izolována z L523S-pozitivní nádorové cDNA knihovny pomocí PCR amplifikace za použití genově specifických-primerů navržených ze sekvence SEQ ID NO: 175. Určená cDNA sekvence je uvedena v SEQ ID
'··· ·» 99 999 9 ··
• « · 9 « • • · • ·
• • ♦ • 9 ··· • · •
• » 9 ♦ · • β ♦ 9 φ
• • · • • • • · •
99 * 4» ·· • · * ·
NO: **. Aminokyselinová sekvence kódovaná touto sekvencí je uvedena v SEQ ID NO: **. Tato proteinová sekvence se liší od dříve publikované proteinové sekvence ve dvou aminokyselinových pozicích, konkrétně v pozicích 158 a 410.
Srovnání sekvencí L514S a L531S (SEQ ID NO: 87 a 88, 89 a 90, a 109, v příslušném pořadí) se sekvencemi v genové abnce, jak bylo popsáno výše, neukázalo žádné významné homologie se známými sekvencemi. Sekvence L513S, L516S, L517S, L519S, L520S (SEQ ID NO: 87 a 88, 91 a92, 93, 94, 95 a 96, 107 a 108, v příslušném pořadí) vykazovaly určitou homologii s dříve identifikovanými EST. Sekvence L521S, L522S, L523S, L524S, L525S, L526S, L527S, L528S a L529S (SEQ ID NO: 97 a 98, 99, 101, 102,. 103, 104, 105 a 106, v příslušném pořadí) představují známé geny. Určená kompletní cDNA sekvence pro L520S je uvedena v SEQ ID NO: 113 a příslušná předpokládaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 114. Následná analýza pomocí mikrosestav ukázala, že L520S je nadměrně exprimován také u nádorů prsu, kromě spinocelulárních nádorů plic.
Další analýza ukázala, že L529S (SEQ ID NO: 106 a 115), L525S (SEQ ID NO: 102 a 120) a L527S (SEQ ID NO: 104) jsopu cytoskeletové komponenty a potenciální proteiny specifické pro spinocelulární buňky. L529S je konexin 26, protein mezibuněčných spojení, je vysoce exprimován ve spinocelulárním nádoru 9688T a středně silně exprimován ve dvou dalších nádorech. Nicméně, slabá exprese konexinu 26 je také detekovatelná v normální kůži, tlustém střevu, játrech a žaludku. Byla popsána nadměrná exprese konexinu 26 v některých nádorech prsu a mutovaná forma L529S může vést k nadměrné exprese v plicních nádorech. L525S je plakofilin I, desmosomální protein nacházený v plakách při adhesních spojeních kůže. Exprese L525S mRNA je značně zvýšena-u tří ze čtyř testovaných spinocelulárních nádorů a v normální kůži. L527S byl ·*·· • · · • · « • · · · • · · · ·♦ Μ
«* ·· ··
• · • > 9 • ·
• • • f * • • •
• • • · • ·· ♦ •
• « • • • •
B· • 9 fr ··> ·
identifikován jako isoforma 6 keratinu, keratin typu II velikosti 58 kD a cytokeratin 13 a vykazuje nadměrnou expresi ve spinocelulárních nádorech a slabou expresi v normální kůži, psru a tlustém střevu. Významné je to, že geny pro keratin a příbuzné proteiny byly popsány jako potenciální markéry pro karcionom plic, včetně CYFRA2.1 (Pastor et al., Eur. resp. J. 10: 603-609, 1997). L513S (87 a 88) vykazuje mírnou nadměrnou expresi v několika testovaných nádorech a kóduje protein, který byl poprvé izolován jako antigen pemphigus vulgaris.
L520S (SEQ ID NO: 95 a 96) a L521S (SEQ ID NO: 97 a 98) jsou také značně exprimovány ev spinocelulárních karcinomech plic a L520S je nadměrně exprimován v normální slinné žláze a L521S je nadměrně exprimován v normální kůži. Oba patří do rodiny malých proteinů bohatých na glycin a představují markéry pro plně diefrencované spinocelulární buňky. L521S byl popsán jako specifický markér pro spinocelulární nádor (Hu, R. et al., Lung Cancer, 20: 25-30, 1988). L515S (SEQ ID NO: 162) kóduje IGF-beta2 a L5.16S je homolog aldosa-reduktasy a oba jsou středně silně exprimovány v plicních spinocelulárních nádorech a v normálním tlustém steřvu. Významné je to, že L516S (SEQ ID NO: 91 a 92) je nadměrně exprimován v metastatickém, ale nikoliv v primárním adenokarcinomu plic, což ukazuje na jeho potenciální úlohu při metastasování a na to, že může být použit jako potenciální prognostický markér. L522S (SEQ ID NO: 99) je středně silně exprimován ve spinocelulárních karcinomech plic, ale pouze minimálně exprimován v normálních tkáních. L522S náleží do třídy IV alkohol dehydrogenasy, ADH7, a profil jeho exprese ukazuje, že se jedná o antigen specifický pro spinocelulární buňky. L523S SEQ ID NO: 100) je středně silně nadměrně exprimován v plicních spinocelulárních nádorech, lidské nádorové buněčné linii slinivky břišní a nádorové tkáni slinivky břišní, což naznačuje, že tento gen může být společným antigenem spinocelulárního karcinomu plic a
·· ·· •w* 0» 00
0 • 9 ♦ 0 • • · 9 0
• • • • • ·*· « · •
• • • ♦ · • . * .
• ♦ • · • • 0 • • 0
·· ·· ·· 000 00 ·>·♦ 0
karcinomu pankreasu.
L524S (SEQ ID NO: 101) je nadměrně exprimován ve většině testovaných spinocelulárních nádorů a je to homolog peptidů příbuzného s parathyoidáním hormonem (PTHrP), o kterém je dobře známo, že způsobuje humorální hyperkalcemii při maligních nádorech, jako je leukemie, karcinom prostaty a karcinom prsu. Také se předpokládá, že PTHrP je nejčastěji asociován se spinocelulárním karcinomem plic a vzácně s adenokarcinomem plic (Davidson, L.A. et al., J. Pathol. 178: 38-401, 1996). L528S (SEQ ID NO: 105) je značen nadměrně exprimován ve dvou spinocelulárních karcinomech plic a středně silně exprimován ve dvou dalších spinocelulárních karcinomech plic, jednom adenokarcinomu plic a v několika normálních tkáních, jako je kůže, lymfatická uzlina, srdce, žaludek a plíce. Tento protein je kódovaný NMB genem, který je podobný jako gen Pmell specifický pro prekursory melanocytů a který je často exprimován v melanomových buněčných liních s nízkým metastatickým potenciálem. Toto naznačuje, že LS může být společným antigenem pro melanom a spinocelulární karcinom plic. L526S (SEQ ID NO: 103) je nadměrně exprimován ve všech testovaných spinocelulárních karcinomech plic a bylo ukázáno, že je homologický s genem (ATM), jehož mutace způsobuje ataxia teleangiecattica, genetické onemocnění člověka způsobující predispozici k nádorům, kromě jiných příznaků. ATM kóduje protein, který aktivuje kontrolní mechanismy buněčného cyklu řízené p53 prostřednictvím přímé vazby a fosforylace p53 molekuly. Přibližně 40% karcinomů plic je asociováno s mutací p53 a předpokládá se, že nadměrná exprese ATM je důsledkem kompenzace ztráty funkce p53, ale není známo, zda je nadměrná exprese příčinou spinocelulárního karcinomu. Dále, exprese L526S (ATM) ke také detekovatelná v metastatickém, ale ne v primárním adenokarcinomu plic, což naznačuje úlohupři metastasování.
• · · • o · ·
Exprese L523S (SEQ ID NO: 175) byla také testována RT-PCR v reálném čase, jak je-popsáno výše. V prvním testu za použití panelu plicních spinocelulárních nádorů bylo zjištěno, že L523S je nadměrně exprimován ve 4/7 spinocelulárních karcinomů plic, 2/3 spinocelulárních karcinomů, hlavy a krku a 2/2 adenokarcinomů plic, a slabá exprese byla zjištěna v kosterním svalu, měkkém patru a mandli. Ve druhém testu za použití panelu plicních adenokarcinomů bylo zjištěno, že L523S je exprimován u 4/9 primárních adenokarcinomů plic, 2/2 plicních pleurálních výpotků, 1/1 metastatické adenokarcinomů plic a 2/2 apinocelulárních karcinomů plic, a v normálních tkáních byla pozorována slabá exprese.
Exprese L523S v plicních nádorech a různých normálních tkáních byla také testována Northernovým přenosem, za použití standardních technik. V prvním testu bylo zjištěno, že L523S je exprimován v mnoha adenokarcinomech plic a ve spinocelulárních karcinomech plic, stejně jako v normální tonsile. Žádná exprese nebyla pozorována v normálních plících. Ve druhém testu za použití membrán pro normální tkáně (HB-12) od Clontech nebyla žádná exprese pozorována v mozku, kosterním savlu, tlustém střevu, thymu, slezině, játrech, ledvině, tenkém střevu, plících nebo PBMC, ačkoliv byla silná exprese pozorována v placentě.
Příklad 3: Izolace a charakterizace plicních nádorových polypeptidů pomocí PCR-odečtu
857 klonů z cDNA odečtené knihovny, obsahující cDNA ze souboru dvou lidských spinocelulárních karcinomů plic odečtených proti cDNA osmi normálních lidských tkání, včetně plic, PBMC, mozku, srdce, ledvin, jater, slinivky břišní a kůže (Clontech, Palo Alto, CA) se zpracovalo v prvním kole PCR amplifikace. Tato knihovna se zpracovala ve druhém kole PCR amplifikace, podle návodu výrobce. Získané cDNA fragmenty se subklonovaly do vektoru P7-Adv ·· (Clontech, Palo Alto, CA) transformovaly se do DH5alfa E. coli (Gibco, BRL). DNA se. izolovala z jednotlivých klonů a sekvencovala se za použití Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Automated Sequencer Model 373A.
Sekvencovalo se 162 pozitivních klonů. Srovnání DNA sekvencí těchto klonů se sekvencemi v EMBL a GenBank databázích, jak bylo popsáno výše, neukázalo žádné významné homologie pro 13 těchto klonů, které jsou zde označeny jako soubory 13, 16, 17, 19, 22, 24, 29, 47, 49, 56-59. Určené cDNA sekvecne pro tyto klony jsou uvedeny v SEQ ID NO: 125, 127-129, 131-133, 142, 144, 148-150 a 157, v příslušném pořadí. Bylo zjištěno, že soubory 1, 3-5, 7,10, 12, 11, 15, 20, 31, 33, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 48, 50, 53, 54 (SEQ ID NO: 115-124, 126, 130, 134-141, 143, 145-147, v příslušném pořadí), mají určitou homologii s dříve identifikovanými DNA sekvencemi. Bylo zjištěno, že soubor 57 (SEQ ID NO: 149) představuje klon L519S (SEQ ID NO: 94) popsaný v US paetntové přihlášce č. 09/123912, podané 27.7.1998. Podle znalostí předkladatelů vynálezu nebylo dříve prokázáno, že by nějaká z těchto sekvencí byla nadměrně exprimována v karcinomech plic.
Úroveň exprese mRNA pro reprezentativní klony v plicních nádorových tkáních, normálních plicních tkáních (n=4), klidových PBMC, slinné žláze, srdci, žaludku, lymfatických uzlinách, kosterním svalu, měkkém patru, tenkém střevu, tlustém střevu, bronchu, močovém měchýři, tonsile, ledvině, jícnu, kostní dřeni, tlustém střevu, nadledvině, pankreasu a kůži (všechny tkáně lidské) byla určena RT-PCR, jak byla popsána výše, vzorky všech tkání byly testovány za použití techniky mikrosestav, jak byla popsána výše, pokud není uvedeno jinak.
Bylo zjištěno, že soubor 3 (SEQ ID NO: 116) je značně exprimován ve všech testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku • · ·· (17/17) a ve většině (8/12) spinocelulárních nádorů plic (vysoká exprese v 7/12), střední v 2/12 a nízká ve 2/12), zatímco negativní exprese byla ve 2/4 normálních plicních tkáních a slabá exprese byla ve dvou zbývajících vorcích. Soubor 3 vykazoval střední exprese v kůži a měkkém patru, a slabou exprese v klidových PBMC, tlustém střevu, slinné žláze, tonsile, slinivce břišní, jícnu a tlustém střevu. Soubor 11 (SEQ ID NO: 124) byl značně exprimován ve všech testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (17/17); silně v 14/17 a středně silně v 3/17. Dále, exprese v spinocelulárních nádorech plic byla vysoká v 3/12 a středně silná ve 4/12. Soubor 11 byl negativní pro 3/4 normálních vzorků plic a zbývající vzorek měl pouze slabou expresi. Soubor 11 vykazoval slabou až střední reaktivitu ve slinné žláze, měkkém patru, močovém měchýři, tonsile, kůži, jícnu a tlustém střevu. Soubor 13 (SEQ ID NO: 125) byl značně exprimován ve všech testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (17/17); silně v 12/17 a středně silně v 5/17. Soubor 13 byl exprimován v 7/12 spinocelulárních nádorech plic, se silnou expresí v 4/12 a středně silnou expresí ve 3 vzorcích. Analýza vzorků normálních plic ukázala negativní expresi pro 2/4 a slabou až středně silnou expresi pro zbylé dva vzorky. Soubor 13 vykazoval slabou až středně silnou reaktivitu pro klidové PBMC, slinnou žlázu, močový měchýř, pankreas, tonsilu, kůži, jícen a tlusté střevo, stejně jako silnou expresi v měkkém patru. Soubor 16 (SEQ ID NO: 127) byl středně silně exprimován v některých spinocelulárních nádorech hlavy a krku (6/17) a jednom spinocelulárním karcinomu plic, ale nevykazoval žádnou expresi v žádném testovaném vzorku plic. Soubor 16 vykazoval slabou reaktivitu pro klidové PBMC, slinnou žlázu, kůži, tlusté střevo a měkké patro. Soubor 17 (SEQ ID NO: 128) byl exprimován ve všech testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (17/17); silně v 5/17 a středně silně v 12/17. Exprese v spinocelulárních nádorech plic byla vysoká v 1 vzorku a středně silná ve 3/12 ·
• · vzorků. Soubor 17 byl negativní pro 2/4 normálních vzorků plic a zbývající vzorky měly pouze slabou expresi. Dále byla slabá exprese prokázána v jícnu a v měkkém patru. Soubor 19 (SEQ ID NO: 129) byl exprimován ve většině testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (11/17); silně ve 2/17, středně silně v 6/17 a slabě v 3/17. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla středně silná ve 3/12 vzorků. Exprese ve 2/4 vzorků normálních plic byla negativní a a zbývající dva vzorky měly pouze slabou expresi. Soubor 19 vykazoval slabou expresi v jícnu, klidových PBMC, slinné žláze, močovém měchýři, měkkém patru a slinivce břišní.
Soubor 22 (SEQ ID NO: 131) byl exprimován ve většině testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (13/17); silně ve 4/17, středně silně v 6/17 a slabě ve 3/17. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla střední až silná ve 3/12 vzorků, byla negativní ve 2/4 vzorcích normálních plic a zbývající dva vzorky měly pouze slabou expresi (n=4). Soubor 22 vykazoval slabou expresi v kůži, slinné žláze a měkkém patru. Podobně, soubor 24 (SEQ ID NO: 132) byl exprimován ve většině testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (13/17); silně ve 3/17, středně silně v 6/17 a slabě ve 4/17. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla střední až silná ve 3/12 vzorků, byla negativní ve 3/4 vzorků normálních plic a zbývající jeden vzorek měl pouze slabou expresi (n=4). Soubor 22 vykazoval slabou expresi v kůži, slinné žláze a měkkém patru. Soubor 29 (SEQ ID NO: 133) byl exprimován ve většině testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (16/17); silně ve 4/17, středně silně v 11/17 a slabě v 1/17. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla střední ve 3/12 vzorků a byla negativní ve 2/4 vzorků normálních plic. Soubor 29 vykazoval slabou expresi v tlustém střevu, kůži, slinné žláze, slinivce břišní, tonsile, srdci a měkkém patru. Soubor 47 (SEQ ID NO: 142) byl exprimován ve většině testovaných spinocelulárních • · ·· • * • · · · • · • · « · • · ·· · · nádorech hlavy a krku (12/17) ; středně silně v 10/17 a slabě ve 2/17. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla silná v jednom vzorku a střední ve dvou dalších (n=13). Soubor 47 byl negativní ve 2/4 vzorků normálních plic a ov dalších dvou vzorcích byla prokázána středně silná exprese. Soubor 47 vykazoval také středně silnou expresi v tlustém střevu a pankreasu, a slabou expresi v kůži, slinné žláze, měkkém patru, žaludku, močovém měchýři, klidových PBMC a tonsile.
Soubor 48 (SEQ ID NO: 143) byl exprimován ve všech testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku (17/17); silně v 8/17, středně silně v 8/17 a slabě ve 2/17. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla silná až střední ve třech vzorcích (n=13). Soubor 48 byl negativní v 1/4 vzorků normálních plic a v dalších vzorcích byla prokázána slabá nebo středně silná exprese. Soubor 48 vykazoval také středně silnou expresi v měkkém patru, tlustém střevu, pankreasu a močovém měchýři, a slabou expresi v jícnu, slinné žláze, klidových PBMC a srdci. Soubor 49 (SEQ ID NO: 144) byl exprimován slabě až středně silně v 6/17 testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla střední ve třech vzorcích (n=13). Soubor 49 byl negativní ve 2/4 vzorků normálních plic a v dalších vzorcích byla prokázána slabá exprese. Středně silná exprese byla prokázána v kůži, slinné žláze, tlustém střevu, pankreasu, močovém měchýři a klidových PBMC, a slabá exprese byla prokázána v měkkém patře, lymfatických uzlinách a tonsile. Soubor 59 (SEQ ID NO: 148) byl exprimován slabě až středně silně ve 3/17 testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku a exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla slabá až střední ve 3/13 vzorcích. Významné je to, že slabá exprese byla detekována v jednom vzorku adenokarcinomu plic (n=2). Soubor 56 byl negativní ve 3/4 vzorků normálních plic a středně silná exprese byla prokázána pouze v tlustém střevu a slabá exprese v slinné žláze, pankreasu, močovém měchýři, měkkém patru a klidových PBMC. Soubor 58, též známý jako 1/7 6 9P, (SEQ ID NO: 150) byl exprimován středně silně v 11/17 testovaných spinocelulárních nádorech hlavy a krku a slabá exprese byla detekována v jednom dalším vzorku. Exprese ve spinocelulárních nádorech plic byla slabá až střední ve 3/13 vzorků. Soubor 58 byl negativní ve 3/4 vzorků normálních plic a slabá exprese byla detekována v jednom vzorku. Středně silná exprese byla prokázána v kůži, tlustém střevu a klidových PBMC, a slabá exprese byla detekována v slinné žláze, pankreasu, močovém měchýři a měkkém patru. Soubor 59 {SEQ ID NO: 157) byl exprimován v některých spinocelulárních nádorech hlavy a krku a plic. Slabá exprese souboru 59 byla detekována také ve slinné žláze a v tenkém střevu.
Kompletní cDNA sekvence pro soubor 22, též označovaný jako L763P, je uvedena v SEQ ID NO: 158, s příslušnou předpokládanou aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 159. RT-PCR analýza L763P v reálném čase ukázala, že tento klon je silně exprimován ve 3/4 spinocelulárních nádorech plic, stejně jako ve 4/4 spinocelulárních nádorech hlavy a krku, se slabou expresí pozorovanou v normálním mozku, kůži, měkkém patru a průdušnici. Následné prohledávání databází ukázalo, že sekvence SEQ ID NO: 158 obsahuje mutaci vedoucí k posunu čtecího rámce v příslušné proteinové sekvenci. Druhá cDNA sekvence pro L763P je uvedena v SEQ ID NO: 345, s příslušnou aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 346. Sekvence SEQ ID NO: 159 a 346 jsou identické s výjimkou C-koncových 33 aminokyselin SEQ ID NO: 159.
Kompletní cDNA sekvence pro soubory 17, 19 a 24, též označovaný jako L762P, je uvedena v SEQ ID NO: 160, s příslušnou předpokládanou aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 161. Další analýza L762P ukázala, že se jedná o membránový protein typu I a byly sekvencovány další 2 varianty. Varianta 1 {SEQ ID ··♦· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · ♦ · · ···· · · · ··· ·· ·· ·· ··· ·· ····
NO: 167, s příslušnou aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 169), je alternativně sestřiženou formou SEQ ID NO: 160 s delecí 503 nukleotidů, stejně jako s delecí krátkého segmentu exprimovaného proteinu. Varianta 2 (SEQ ID NO: 168, s příslušnou aminokyseliovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 160) má delecí dvou nukleotidů v 3' kódujícím regionu ve srovnání se SEQ ID NO: 160, což vede k zisku secemované formy exprimovaného proteinu. RT-PCR analýza v reálném čase ukázala, že L762P je nadměrně exprimován ve 3/4 spinocelulámích nádorech plic, stejně jako ve 4/4 spinocelulárních nádorech hlavy a krku, se slabou expresí pozorovanou v normálním mozku, kůži, měkkém patru a průdušnici.
Kompletní cDNA sekvence pro soubor 56 (SEQ ID NO: 148), též označovaný jako L773P, je uvedena v SEQ ID NO: 171, s příslušnou předpokládanou aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 172. Bylo zjištěno, že L773P je identický s dihydroxyldehydrogenasou na 3'-konci genu, s odlišnou 5' sekvencí. V důsledku toho je N-koncových 69 aminokyselin jedinečných. cDNA sekvence kódující 69 N-koncových aminokyselin je uvedena v SEQ ID NO: 349, a N-koncová aminokyselinová sekvence je uvedena v 350. RT-PCR analýza v reálném čase ukázala, že L773P je silně exprimován v spinocelulárním karcinomu plic a v adenokarcinomu plic, s nedetekovatelnou expresí v normálních tkáních. Následná Northemova hybridizace L773P ukázala, že tento transkript je nadměrně exprimován ve spinocelulárních nádorech a detekovala přibližně 1,6 kb v primární plicní nádorové tkáni a přibližně 1,3 kb v nádorové tkáni primárních nádorů hlavy a krku.
Následná analýza pomocí mikrosestav ukázala, že soubor 58, též označovaný jako L769S (SEQ ID NO: 150), je nadměrně exprimován kromě spinocelulárních karcinomů plic také u nádorů prsu.
0
0 0 00 00 00*0 0 0 0 0 · 0 0
000 00000 0* ·
000 0 000 0 0 0 0 0 0 00 0 000
00 00 0·0 00 0000
Příklad 4: Syntéza polypeptidů
Polypeptidy mohou být syntetizovány na Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A peptidovém syntezátoru za použití FMOC techniky s HPTU (O-benzotriazol-Ν,Ν,Ν1,N'-tetramethyluroniumhexafluorfosfát) aktivací. gly-Cys-Gly sekvence může být navázána na amino-konec peptidu pro dodání skupiny pro konjugaci, vazbu na imobilizovaný povrch nebo značení peptidu. Odštěpení peptidu od pryskyřice může být provedeno za použití následující štěpící směsi: kyselina trifluoroctová, ethandithiol:thioanisol:voda: fenol (40:1:2:2:3) . Po štěpení po dobu 2 hodin mohou být peptidy vysráženy v chladnémmethyl-terč.butyl-etheru. Peptidové pelety mohou být potom rozpuštěny ve vodě obsahující 0,1% kyselinu trifluoroctovou (TFA) a mohou být lyofilizovány před přečištěním pomocí C18 HPLC s reevrzní fází. Gradient 0%-60% acetonitrilu (obsahujícího 0,1% TFA) ve vodě (obsahující 0,1% TFA) může být použit pro eluci peptidů. Po lyofilizaci čistých frakcí mohou být peptidy charakterizovány pomocí elektrospreyové nebo jiné hmotnostní spektrometrie a aminokyselinové analýzy.
Příklad 5: Příprava protilátek proti antigenům nádorů plic
Polyklonální protilátky proti plicním nádorovým antigenům L514S, L525S a L531S (SEQ ID NO: 155, 225 a 112, v příslušném pořadí) se připraví následujícím způsobem.
Králíci se imunizují rekombinantním proteinem exprimovaným apřečištěným z E.coli způsobem popsaným výše. Pro počáteční imunizaci se 400 ug antigenu ve směsi s muramyldipeptidem (MDP) injekčně aplikuje podkožně (s.c.). Zvířatům se podá dosycovací imunizace s.c. o 4 týdny později (200 ug antigenu ve směsi s nekompletním Freundovým adjuvans (IFA)). Další dosycovací imunizace 100 ug antigenu ve směsi s IFA se podá injekčně s.c., •9 99*9 ·*|· 99
9 pokud je nutná pro indukci vysokého titru protilátek. Sérum od imunizovaných králíků se testuje na specifickou reaktivitu s antigenem za použití ELISA testů s přečištěným proteinem. Polyklonální protilátky proti L514S, L528S a L531S se afinitně přečistí z polyklonálního séra s vysokým titrem za použití přečištěného proteinu navázaného na pevný nosič.
Imunohistochemická analýza za použití polyklonálních protilátek proti L514S se provede na panelu 5 vzorků nádorů plic, 5 vzorků normální plicní tkáně a vzorků z normálního tlustého střeva, ledvin, jater, mozku a kostní dřeně. Konkrétně, vzorky se fixují ve formalinovém roztoku po dobu 24 hodin, ponoří se do parafinu a nařežou se na 10 mikronové řezy. Tkáňové řezy se permeabilizují a inkubují se s protilátkou po dobu 1 hodiny. Anti-myší protilátka značená HRP a inkubace s DAB chromogenem se použije k vizualizaci L514S imunoreaktivity. Zjistilo se, že L514S je silně exprimován v plicní nádorové tkáni, se slabou nebo žádnou expresí v normálních plících, mozku nebo kostní dřeni. Slabé zbarvení se pozorovalo v tlustém střevu a ledvinách. Barvení bylo také detekovatelné normálních játrech, ale v této tkáni nebyla detekována žádná mRNA, což činí tento výsledek sporným.
Příklad 6: Priming myší peptidem a propagace CTI» linií
Imunogenní peptidy z plicního nádorového antigenu L762P (SEQ ID NO: 161) pro HLA~A2/Kto-restrihované CD8+ T-lymfocyty se identifikovaly následujícím způsobem.
Lokalizace HLA-A2 vazebných peptidů v plicním nádorovém antigenu L762P (SEQ ID NO: 161) se předpověděla pomocí počítačového programu, který určuje peptidové sekvence, které budiou pravděpodobně odpovídat HLA-A*0201, podle známého peptidového motivu pro HLA-A*0201 (Rupert et al. (1993) Cell 74:
•4 ··»· • 4 · 4 ·
929; Rammensee et al., (1995) Immunogenetics 41: 178-228). Série syntetických peptidů odpovídajících vybrané sadě předpokladných vazebných peptidů pro HLA-A*0201 se připravila způsobem popsaným výše.
Myši exprimující transgen pro lidský HLA A2/Kto (od Dr. L. Sherman, the Scripps Research Institute, La Jolla, CA) se imunizovaly syntetickými peptidy, jak je popsáno v Theobald et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 11993-11997, s následujícími modifikacemi. Myši se imunizovaly 50 ug L726P peptidů a 120 ug I-Ato vazebného peptidů odvozeného od proteinu viru hepatitidy B emulsifikovaného v nekompletním Freundově adjuvans. 0 tři týdny později se myši utratily a připravila se jednobuněčná suspenze. Buňky se resuspendovaly v 7 x 10s buněk/ml v kompletním mediu (RPMI-1640; Gibco BRL, Githersburg, MD) obsahujícím 10% FCS, 2 mM Glutamin (Gibco BRL), natrium-pyruvát (Gibco BRL), neesenciální aminokyseliny (Gibco BRL), 2 x 10_s M 2-merkaptoethanol, 50 U/ml penicilín a streptomycin, a kultivovaly se za přítomnosti ozářených (3000 rad) L762P peptid- (5 ug/ml) a 10 mg/ml B^-mikroglobulin- (3 ug/ml) LPS blastů (A2 transgenní buňky sleziny kultivované za přítomnosti 7 ug/ml dextransíranu a 25 ug/ml LPS po dobu 3 dnů). Po šesti dnech se buňky (5 x 105/ml) restimulovaly 2,5 x 106/ml peptidem pulsovaných ozářených (20000 rad) EL4A2Kb buněk (Sherman et al., Science 258: 815-818, 1992) a 5 x 106/ml ozářených (3000 rad) A2/Kto-transgenních podpůrných buněk sleziny. Buňky se kultivovaly za přítomnosti 10 U/ml IL-2. Buňky se restimulovaly jednou týdně, jak je popsáno, pro přípravu proklonování linie.
Buněčné linie specifické pro peptid se klonovaly analýzou limitním ředěním s ozářenými (20000 rad) EL4 A2Kb nádorovými buňkami pulsovanými peptidem L762P (1 χ 104 buněk/jamku) jako stimulátory a s ozářenými (3000 rad) A2/Kto-transgenními buňkami sleziny (5 x 10s buněk/jamku) jako podpůrnými buňkami, za přítomnosti 10 U/ml -IL-2. V den 7 se buňky restimulovaly stejným způsobem, jako je způsob popsaný výše. V den 14 se rostoucí klony izolovaly a kultivovaly se.
Buněčné linie specifické pro L762P-87 (SEQ ID NO: 226; odpovídající aminokyselinám 87-95 SEQ ID NO: 161), L726P-145 (SEQ ID NO: 227; odpovídající aminokyselinám 145-153 SEQ ID NO: 161), L726P-585 (SEQ ID NO: 228; odpovídající aminokyselinám 585-593 SEQ ID NO: 161), L726P-425 (SEQ ID NO: 229; odpovídající aminokyselinám 425-433 SEQ ID NO: 161), L726P(10)-424 (SEQ ID NO: 230; odpovídající aminokyselinám 424-433 SEQ ID NO: 161), a L726P(10)-458 (SEQ ID NO: 231; odpovídající aminokyselinám 458-467 SEQ ID NO: 161), vykazují významně vyšší reaktivitu (jak je měřena procentem specifické lýzy) proti L762P peptidem pulsovaným E14-A2/Kto nádorovým cílovým buňkám než proti kontrolním peptidem pulsovaným E14-A2/Kto nádorovým cílovým buňkám.
Příklad 7: Identifikace CD4 imunogenních T-lymfocytárních epitopů odvozených z plicního nádorového antigenu L762P
CD4 T-lymfocytární linie specifické pro antigen L762P (SEQ ID NO: 161) byly připraveny následujícím způsobem.
Syntetizovala se série 28 překrývajících se peptidů, která pokrývala přibližně 50% L762P sekvence. Pro priming se peptidy kombinovaly do souborů 4-5 peptidů a pulsovaly se v dávce 20 ug/mlpo dobu 24 hodin do dendritických buněk. Dendritické buňky se potom promyly a smísily se s pozitivně selektovanými CD4+ T-lymfocyty v 96-jamkových plotnách s U-dnem. 40 kultur se připravilo pro každý soubor. Kultury se restimulovaly jednou za týden čerstvými dendritickými buňkami naplněnými peptidovými soubory. Po celkem 3 cyklech restimulace se nechaly buňky
9*99 9« ··*· • 9 • 9 9 · odpočinout jeden týden a potom se testovaly na specificitu k buňkám prezentujícím antigen (APC) pulsovaným peptidovými soubory za použití interferon-gamma ELISA a proliferačních testů. Pro tyto testy se adherentní monocyty naplněné buď relevantním souborem peptidů nebo irelevantním peptidem použily jako APC. Pro každý soubor se identifikovaly T-lymfocytární linie, které specificky rozpoznávaly L762 peptidové soubory jak podle uvolňování cytokinů, tak podle proliferace. Důraz se kladl na identifikaci T-lymfocytů s proliferativní odpovědí. T-lymfocytární linie vykazující L762P-specifickou sekreci cytokinů a proliferaci, nebo silnou proliferaci samotnou, byly dále expandovány pro testování na rozpoznávání jednotlivých peptidů ze souborů, stejně jako na rozpoznávání rekombinantního L762P. Zdrojem rekombinantního L762P byla E. coli a materiál byl částečně přečištěn a byl pozitivní na endotoxin. Tyto testy využívaly 10 ug jednotlivých peptidů, 10 nebo 2 mg irelevantního peptidu a 2 nebo 0,5 ug buď L762P proteinu, nebo irelevantního, stejně čistého, rekombinantního proteinu připraveného v E. coli. Signifikantní produkce interferonu gamma a proliferace CD4 T-lymfocytů byla indukována mnoha peptidy dovoženými od L762P v každém souboru. Aminokyselinové sekvence pro tyto peptidy jsou uvedeny v SEQ ID
NO: 232-251. tyto
676-696,
526-545,
795-815,
556-575,
736-755,
616-635, peptidy odpovídajaminokyselinám 661-680,
874-893,
706-725,
646-665,
811-830,
706-725,
631-650,
871-891, 856-875, 826-845,
691-710, 601-620, 571-590,
541-560586-605,
příslušném pořadí.
CD4 T-lymfocytární liie, které byly specifické pro jednotlivé peptidy odvozené od L762P, se dále expandovaly stimulací relevantním peptidem v dávce 10 ug/ml. Dva týdny po stimulaci se T-lymfocytární linie testovaly proliferačním a IFN-gamma ELISA testem na rozpoznávání specifického peptidu. Mnoho dříve identifikovaných T-lymfocytů dále vykazovalo specifickou aktivitu
9 9 ♦ • • • · • • Φ 9» 9 9 • 9
• • • •
• · • • 9 9 • 9 9 9
99 ·· • » 9 · · 9« f »*·
pro L762P peptid. Každá z těchto linií byla dále expandována pomocí relevantního peptidů a dva týdny po expanzi byla testována na specifické rozpoznávání L762P peptidů v titračních pokusech, a na rozpoznávání rekombinantního L762P proteinu připraveného v E. coli. Pro tyto pokusy byly autologní adherentní monocyty pulsovány relevantním L762P peptidem nebo irelevantním peptidem odvozeným od mammaglobinu, nebo rekombinantním L762P připraveným v E. coli (přibližně 50% čistota) nebo irelevantním proteinem připraveným v E. coli. Bylo zjištěno, že většina T-lymfocytámích linií vykazuje slabou afinitu pro relevantní peptid, protože specifická proliferace a produkce IFN-gamma rychle klesaly při ředění L762P peptidů. Nicméně, byly identifikovány 4 buněčné linie, které byly významně aktivní i při 0,1 ug/ml peptidů. Každá z těchto linií (označených jako A/D5, D/F5, E/A7 a E/B6) také specificky proliferovala v reakci na L762P protein připravený v E. coli, ale ne v reakci na irelevantní protein. Aminokyselinové sekvence peptidů odvozených od L762P rozpoznávané těmito liniemi jsou uvedeny v SEQ ID NO: 234, 249, 236 a 245, v příslušném pořadí. Žádný protein specifický pro IFN-gamma nebyl detekován pro žádnou z těchto linií. Linie A/D5, E/A7 a E/B6 byly klonovány na autologních adheemtních monocytech pulsovaných relevantním peptidem v dávce 0,1 (A/D5 a E/A7) nebo 1 (D/F5) ug/ml. Po kultivaci se klony testovaly na specificitu pro relevantní peptid. Mnoho klonů specifických pro relevantní peptid se identifikovalo pro linie A/D5 a E/A7.
Příklad 8: Exprese proteinových antigenů specifických pro nádory plic
a) Exprese L514S v E. coli
Plicní nádorový antigen L514S (SEQ ID NO: 89) se subklonoval do expresního vektoru pE32b v Ncol a Notl místě a vektor se
«9* t •9 r · 9«
9 9 9 • · 9 9 9 9 *
• • • • 99· 9 * 9
« • • • 9 9 9 9 9 « 9
• 9 • • • · • 9 · 9
• 9 ·· 99 • 99 ·· 9···
transformoval do E. coli za použití standardních technik. Protein se exprimoval od zbytků 3-153 SEQ ID NO: 89. Exprimovaná aminokyselinová sekvence a příslušná DNA sekvence jsou uvedeny v SEQ ID NO: 25 a 253, v příslušném pořadí.
b) Exprese L762P
Aminokyseliny 32-944 plicního nádorového antigenu L762P (SEQ ID NO: 161) s 6X His koncovkou, se subklonovaly do modifikovaného pET28 expresního vektoru, za použití resistence na kanamycin, a vektor se transformoval do BL21 CodonPlus za použití standardních technik. Pozorovala se slabá až středně silná exprese. Určená DNA sekvence L762P expresního konstruktu je uvedena v SEQ ID NO: 254.
Z uvedeného popisu je jasné, že ačkoliv byla popsána specifická provedení vynálezu, existují různé modifikace, které také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Proto je předkládaný vynález omezen pouze připojenými patentovými nároky.

Claims (60)

  1. (1) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    (1) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113,
    115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59,
    61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179 , 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253,
    254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300, 302, 308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek; a (c) sekvence komplementární k sekvencím uvedeným v (a) a (b).
    1. Izolovaný polypeptid obsahující alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu, nebo jeho varianty, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
    (a) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30,
  2. (2) sekvence, které hybridizují na jakoukoliv ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek; a (3) sekvence komplementární k sekvencím uvedeným v (1) a (2);
    (ii) polynukleotidy kódující takové polypeptidy; a/nebo (iii) buňky prezentující antigen, které exprimují polypeptid podle (i);
    tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů; a (b) klonování alespoň jedné proliferované buňky za zisku klonovaných T-lymfocytů;
    (c) podání účinného množství klonovaných T-lymfocytů pacientovi a tím inhibici vývoje nádoru u pacienta.
    (2) sekvence, které hybridizují na jakoukoliv ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek; a (3) sekvence komplementární k sekvencím uvedeným v (1) a (2) ;
    (ii) polynukleotidy kódující takové polypeptidy; a/nebo (iii) buňky prezentující antigen, které exprimují polypeptid podle (i);
    tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů; a (b) podání účinného množství proliterovaných T-lymfocytů ·♦ • ·
    269 • · • · pacientovi a tím inhibici vývoje nádoru u pacienta.
    2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, ♦ · ♦ ·
    261
    84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300, 302, 308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349 a sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím.
  3. 3. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci uvedenou v jakékoliv ze SEQ ID NO: 110, 112, 114, 152, 155, 156, 159, 161, 165, 166, 169, 170, 172, 174, 176, 226-252, 346, 348 a 350.
  4. 4. Izolovaný polypeptid kódující alespoň 15 aminokyselinových zbytků plicního nádorového proteinu, nebo jeho varianty, která se liší jednou nebo více substitucemi, delecemi, adicemi a/nebo insercemi tak, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým antigen není významně snížena, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv z SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133,
    142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184 -186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220 -224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300 , 302,
    308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349 a sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím.
  5. 5. Izolovaný polynukleotid kódující plicní nádorový protein, nebo jeho variantu, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv z SEQ ID NO: 1-3,
    262
  6. 6. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69,
    71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125,
    127, 128, 129, 131- 133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173 , 175 , 179 , 182, 184 -186 , 188 -191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220- 224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300, 302, 308 -310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349.
    6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59,
    61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131 -133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171 , 173, 175 , 179 , 182, 184-186 , 188 -191, 193, 194, 198- 207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300 , 302, 308 -310, 313, 315-317, 323, 345,
    347 a 349 a sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím.
  7. 7. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci, která hybridizuje na sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300, 302, 308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek.
  8. 8. Izolovaný polynukleotid komplementární k polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 4-7.
    263
  9. 9 ♦9
    99·«·
    9 9 99
    9 ·9 99
    9 ··
    9 9999 9
    9 9 9
    99 9999
    273 ·*♦· ·· • ·· • 9 ·9 • ♦· ·· ·*
    9 9 9
    9 9 9
    ·· ·* • 9 9 9
    9. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle jakéhokoliv z nároků 4-8.
  10. 10. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektováná expresním vektorem podle nároku 9.
  11. 11. Izolovaná protilátka nebo ejjí vazebný fragment pro antigen, která se specificky váže na plicní nádorový protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30,
  12. 12. Fúzní protein obsahující alespoň jeden polypeptid podle nároku 1.
  13. 13. Fúzní protein podle nároku 12, který obsahuje zesilovač exprese, který zesiluje expresi fúzního proteinu v hostitelské buňce transfektované polynukleotidem kódujícím fúzní protein.
  14. 14. Fúzní protein podle nároku 12, který obsahuje epitop pro pomocné T-lymfocyty, který není přítomen v polypeptidu podle nároku 1.
  15. 15. Fúzní protein podle nároku 12, který obsahuje afinitní koncovku.
    * ·
    264
  16. 16. Izolovaný olynukleotid kódující fúzní protein podle nároku 12.
  17. 17. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje fyziologicky přijatelný nosič a alespoň jednu složku vybranou ze skupiny zahrnující:
    (a) polypeptid podle nároku 1;
    (b) polynukleotid podle nároku 4;
    (c) protilátku podle nároku 11;
    (d) fúzní protein podle nároku 12; a (e) polynukleotid podle nároku 16.
  18. 18. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje imunostimulační činidlo a alespoň jednu složku vybranou ze skupiny zahrnuj ící:
    (a) polypeptid podle nároku 1;
    (b) polynukleotid podle nároku 4;
    (c) protilátku podle nároku 11;
    (d) fúzní protein podle nároku 12; a (e) polynukleotid podle nároku 16.
  19. 19. Vakcína podle nároku 18 vyznačující se tím, že imunostimulačním činidlem je adjuvans.
  20. 20. Vakcína podle nároku 18 vyznačující se tím, že imunostimulační činidlo indukuje především reakci 1. typu.
  21. 21. Způsob pro inhibici vývoje nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství farmaceutického prostředku podle nároku 17 pacientovi.
  22. 22. Způsob pro inhibici vývoje nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství vakcíny podle nároku 18 pacientovi.
    265
  23. 23. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje buňku prezentující antigen, která exprimuje polypeptid podle nároku 1, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo přísadou.
  24. 24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že buňkou prezentující antigen je dendritická buňka nebo makrofág.
  25. 25. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje buňku prezentující antigen, která exprimuje polypeptid, který obsahuje alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu, nebo jeho varianty, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnuj ící:
    (a) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    (b) sekvence, které hybridizují na jakoukoliv ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek; a (c) sekvence komplementární k sekvencím uvedeným v (a) a (b);
    v kombinaci s imunostimulačním činidlem.
  26. 26. Vakcína podle nároku 25 vyznačující se tím, že imunostimulačním činidlem je adjuvans.
  27. 27. Vakcína podle nároku 25 vyznačující se tím, že imunostimulační činidlo indukuje především reakci 1. typu.
  28. 28. Vakcína podle nároku 25 vyznačující se tím, že buňkou prezentující antigen je dendritická buňka.
    266
  29. 29. Způsob pro inhibici vzniku nádoru u pacienta vyznačující se tím, že pacientovi je podáno účinné množství buněk prezentujících antigen, které exprimují polypeptid, který obsahuje alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu, nebo jeho varianty, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
    (a) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    (b) sekvence, které hybridizují na jakoukoliv ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek; a (c) sekvence komplementární k sekvencím uvedeným v (a) a (b) kódovaným polynukleotidem uvedeným v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    a tím je dosaženo inhibice vzniku nádoru u pacienta.
  30. 30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že buňkou prezentující antigen je dendritická buňka.
  31. 31. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 21, 22 a 29 vyznačující se tím, že nádorem je nádor plic.
  32. 32. Způsob pro odstranění nádorových buněk z biologického vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování biologického vzorku s T-lymfocyty, které specificky reagují s plicním nádorovým proteinem, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
    267 (i) polynukleotidy uvedené v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    (ii) polynukleotidy komplementární k uvedeným polynukleotidům; kde krok kontaktování je proveden za podmínek a po dobu dostatečnou pro odstranění buněk exprimujících antigen ze vzorku.
    32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78,
    80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133,
    142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184 -186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220 -224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300 , 302,
    308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349 a sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím.
    32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78,
    80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133,
    142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184 -186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220 -224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300 , 302,
    308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349;
    (b) sekvence, která hybridizují na sekvence uvedené v SEQ ID NO:
  33. 33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je krev nebo její frakce.
  34. 34. Způsob pro inhibici vzniku nádoru u pacienta vyznačující se tím, že pacientovi je podán biologický vzorek zpracovaný způsobem podle nároku 32.
  35. 35. Způsob pro stimulaci a/nebo namnožení T-lymfocytů specifických pro plicní nádorový protein vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování T-lymfocytů s alespoň jednou složkou vybranou ze skupiny zahrnující:
    (a) polypeptidy, které obsahují alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu, nebo jejich varianty, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
    (i) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151,
    153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349;
    (ii) sekvence, které hybridizují na jakoukoliv ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 za středně přísných podmínek; a (iii) sekvence komplementární k sekvencím uvedeným v (i) a (ii) ;
    (b) polynukleotidy kódující takové polypeptidy; a/nebo (c) buňky prezentující antigen, které exprimují polypeptid podle
    268 (a) ;
    za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění stimulace a/nebo namnožení T-lymfocytů.
  36. 36. Izolovaná populace T-lymfocytů vyznačující se tím, že obsahuje T-lymfocyty připravené způsobem podle nároku 35.
  37. 37. Způsob pro inhibici vzniku nádoru u pacienta vyznačující se tím, že pacientovi je podáno účinné množství populace T-lymfocytů podle nároku 36.
  38. 38. Způsob pro inhibici vzniku nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) inkubaci CD4 + a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s alespoň jednou složkou ze skupiny zahrnující:
    (i) polypeptidy, které obsahují alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu, nebo jejich varianty, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
  39. 39. Způsob pro inhibici vzniku nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s alespoň jednou složkou ze skupiny zahrnující:
    (i) polypeptidy, které obsahují alespoň imunogenní část plicního nádorového proteinu, nebo jejich varianty, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
  40. 40. Způsob pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta s vazebným činidlem, které se váže na plicní nádorový protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID
    270 ·«·· 4« ·♦
    NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, .175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 nebo sekvence komplementární k uvedeným sekvencím;
    (b) detekování množství polypeptidu ve vzorku, který se váže na vazebné činidlo; a (c) srovnání množství polypeptidu s předem určenou hraniční hodnotou a tím stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta.
  41. 41. Způsob podle nároku 40 v y z n a vazebným činidlem je protilátka.
    m, že
  42. 42. Způsob podle nároku 43 protilátka je monoklonální sz c vyzná protilátka.
    m, v ze
  43. 43. Způsob podle nároku 40 nádorem je plicní nádor.
    vyznač m,
    XZ ze
  44. 44. Způsob pro sledování progrese nádoru vyznačující se tím, pacienta že zahrnuje kroky:
    (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta době s vazebným činidlem, které se váže na plicní nádorový protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, v první
    167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 nebo sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím;
    (b) detekování množství polypeptidu ve vzorku, který se váže na vazebné činidlo; a (c) opakování kroků (a) a (b) za použití biologického vzorku získaného od pacienta v další době; a (d) srovnání množství polypeptidu detekovaného v kroku (c) s množstvím detekovaným v kroku (b) a z toho sledování progrese ♦ ··· «·
    271 ·♦ * ♦ * · ·· nádoru u pacienta.
  45. 45. Způsob podle nároku 44 v y z n a č vazebným činidlem je protilátka.
    m, že
  46. 46. Způsob podle nároku 45 protilátka je monoklonální vyznač protilátka.
    m, že
  47. 47. Způsob podle nároku 44 nádorem je plicní nádor.
    vyzná m, že
  48. 48. Způsob pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta s oligonukleotidem, který hybridizuje na polynukleotid, který kóduje plicní nádorový protein, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 nebo sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím;
    (b) detekování množství polynukleotidu ve vzorku, který hybridizuje na oligonukleotid; a (c) srovnání množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, s předem určenou hraniční hodnotou a tím stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti nádoru u pacienta.
  49. 49. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, je určeno pomocí polymerasové řetězové reakce.
  50. 50. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, je
    99·Λ • * • · ··
    272 ·· ·* »· určeno pomocí hybridizačního testu.
  51. 51. Způsob pro sledování progrese nádoru u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) kontaktování biologického vzorku získaného od pacienta s oligonukleotidem, který hybridizuje na polynukleotid, který kóduje plicní nádorový protein, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 a 349 nebo sekvence komplementární k uvedeným polynukleotidovým sekvencím;
    (b) detekování množství polynukleotidu ve vzorku, který hybridizuje na oligonukleotid; a (c) opakování kroků (a) a (b) za použití biologického vzorku získaného od pacienta v další době; a (d) srovnání množství polynukleotidu detekovaného v kroku (c) s množstvím detekovaným v kroku (b) a z toho sledování progrese nádoru u pacienta.
  52. 52. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, je určeno pomocí polymerasové řetězové reakce.
  53. 53. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, je určeno pomocí hybridizačního testu.
  54. 54. Diagnostický kit vyznačující se tím, že obsahuj e:
    (a) jednu nebo více protilátek podle nároku 11; a (b) detekční činidlo obsahující reportérovou skupinu.
  55. 55. Kit podle nároku 54 vyznačující se tím, že protilátky jsou imohilizované na pevném nosiči.
  56. 56. Kit podle nároku 54 vyznačuj ící se t í m, že detekční činidlo obsahuje anti-imunoglobulin, protein G, protein A nebo lektin.
  57. 57. Kit podle nároku 54 vyznačující se tím, že reporterová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující radioizotopy, fluorescentní skupiny, luminiscentní skupiny, enzymy, biotin a barviva.
  58. 58. Oligonukleotid obsahující 10 až 40 sousedních nukleotidů, který hybridizuje za středně přísných podmínek na polynukleotid, který kóduje plicní nádorový protein, kde nádorový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná polynukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154,
    157, 158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253, 254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287, 291, 293, 295, 296, 300, 302, 308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349 nebo sekvence komplementární k jakékoliv z výše uvedených sekvencí.
  59. 59. Oligonukleotid podle nároku 58, který obsahuje 10-40 sousedních oligonukleotidů uvedených v jakékoliv ze SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157,
    158, 160, 167, 168, 171, 173, 175, 179, 182, 184-186, 188-191,
    274
    9999 99 99 9··· 99 99 • 9 • 9 9 • • 9 9 9 • • • 9 • 99« 9 9 9 • • 9 9 9 • 9 9 9 • 9 9 · • • 9 • 9 • 9 • 9 99 ♦ 9 999 99 9999
    193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253,
    254-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279-281, 286, 287,
    291, 293, 295, 296, 300, 302, 308-310, 313, 315-317, 323, 345, 347 a 349.
  60. 60. Diagnostický kit vyznačující se tím, že obsahuje:
    (a) oligonukleotid podle nároku 59; a (b) diagnostické činidlo pro použití v polymerasové řetězové reakci nebo hybridizačním testu.
CZ20013527A 1999-04-02 2000-04-03 Sloučeniny a způsoby pro terapii a diagnostiku karcinomu plic CZ20013527A3 (cs)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/285,479 US6821518B1 (en) 1998-03-18 1999-04-02 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US09/466,396 US6696247B2 (en) 1998-03-18 1999-12-17 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US09/476,496 US6706262B1 (en) 1998-03-18 1999-12-30 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US09/480,884 US6482597B1 (en) 1999-12-17 2000-01-10 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US51037600A 2000-02-22 2000-02-22
PCT/US2000/008896 WO2000061612A2 (en) 1999-04-02 2000-04-03 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013527A3 true CZ20013527A3 (cs) 2002-10-16

Family

ID=27540689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013527A CZ20013527A3 (cs) 1999-04-02 2000-04-03 Sloučeniny a způsoby pro terapii a diagnostiku karcinomu plic

Country Status (20)

Country Link
EP (2) EP1169347B1 (cs)
JP (1) JP2002543769A (cs)
KR (1) KR20020007354A (cs)
CN (1) CN1370182A (cs)
AT (1) ATE399793T1 (cs)
AU (1) AU4069200A (cs)
BR (1) BR0009505A (cs)
CA (1) CA2369578A1 (cs)
CZ (1) CZ20013527A3 (cs)
DE (1) DE60039353D1 (cs)
EA (1) EA005140B1 (cs)
ES (1) ES2308976T3 (cs)
HK (1) HK1049848A1 (cs)
HU (1) HUP0200760A2 (cs)
IL (1) IL145731A0 (cs)
MX (1) MXPA01009962A (cs)
NZ (1) NZ514818A (cs)
PL (1) PL354348A1 (cs)
WO (1) WO2000061612A2 (cs)
YU (1) YU72901A (cs)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7338937B2 (en) * 1997-11-17 2008-03-04 Cornell Research Foundation, Inc. Calcium-activated chloride channel proteins and their use in anti-metastatic therapy
US6706262B1 (en) 1998-03-18 2004-03-16 Corixa Corporation Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US6960570B2 (en) 1998-03-18 2005-11-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030236209A1 (en) * 1998-03-18 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6696247B2 (en) 1998-03-18 2004-02-24 Corixa Corporation Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US20040235072A1 (en) * 1998-03-18 2004-11-25 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6737514B1 (en) 1998-12-22 2004-05-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7258860B2 (en) 1998-03-18 2007-08-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7579160B2 (en) 1998-03-18 2009-08-25 Corixa Corporation Methods for the detection of cervical cancer
US20020147143A1 (en) * 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7049063B2 (en) 1998-03-18 2006-05-23 Corixa Corporation Methods for diagnosis of lung cancer
WO2001016324A2 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions of a novel serine protease inhibitor
EP1234031B2 (en) 1999-11-30 2021-11-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
WO2001090353A1 (en) * 2000-05-19 2001-11-29 F.Hoffmann-La Roche Ag A process for determining the tumoricidal potential of a sample by the use of a nucleic acid which is downregulated in human tumor cells
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2412377A1 (en) 2000-06-06 2001-12-13 Bristol-Myers Squibb Company B7-related nucleic acids and polypeptides and their uses for immunomodulation
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
DE60134158D1 (de) * 2000-06-28 2008-07-03 Corixa Corp Zusammensetzungen und verfahren für therapie und diagnose von lungenkrebs
JP2004501631A (ja) * 2000-06-28 2004-01-22 ジェネティックス・インスチチュート・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー Ｐｄ−ｌ２分子：新規ｐｄ−１リガンドおよびその使用
US6635750B1 (en) 2000-07-20 2003-10-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. B7-H2 nucleic acids, members of the B7 family
US20020168647A1 (en) * 2000-08-03 2002-11-14 Tongtong Wang Compositions and methods for the therapy and diagnosis of head and neck cancer
ES2372522T3 (es) 2000-09-20 2012-01-23 Amgen Inc. Moléculas de tipo b7 y usos de las mismas.
AU2006202524B2 (en) * 2000-09-20 2009-12-03 Amgen, Inc. B7-Like Molecules and Uses Thereof
DK1385993T3 (da) 2000-12-08 2011-06-27 Celldex Therapeutics Inc Fremgangsmåde til detektering og behandling af tuberøs sclerose kompleksrelaterede lidelser
WO2002097434A1 (en) * 2001-05-29 2002-12-05 Syddansk Universitet Proteins in diabetes proteome analysis
WO2003018807A1 (fr) * 2001-08-24 2003-03-06 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Acides nucleiques presentant une difference d'expression dans l'hepatoblastome et dans le foie normal
WO2004002516A1 (ja) * 2002-06-28 2004-01-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. 呼吸器疾患の診断・予防・治療剤
AU2003251202A1 (en) * 2002-08-14 2004-03-03 Lg Life Sciences Ltd. Gene families associated with stomach cancer
US7378495B2 (en) 2002-10-21 2008-05-27 Pevion Biotech, Ltd. PTH-rP related peptide cancer therapeutics
EP1469064A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-20 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Expression of proteins in endothelial cells derived from precursor cells from cord blood
DK3428191T3 (da) 2004-10-06 2025-01-02 Mayo Found Medical Education & Res B7-h1 og pd-1 til behandling af renalcellekarcinom
WO2006105642A1 (en) * 2005-04-05 2006-10-12 British Columbia Cancer Agency Biomarkers for the detection of lung cancer and uses thereof
SI1907000T2 (sl) 2005-06-08 2020-07-31 Dana-Farber Cancer Institute Postopki in sestavki za zdravljenje persistentne HIV infekcije z inhibicijo programiranih celični smrtnih 1 (PD-1) poti
MX2009007008A (es) * 2006-12-28 2009-07-10 Int Inst Cancer Immunology Inc Peptido wt1 restringido a hla-a*1101 y composicion farmaceutica que comprende el mismo.
KR100873629B1 (ko) * 2007-01-05 2008-12-12 경북대학교 산학협력단 신규한 폐암 진단용 마커
KR101721707B1 (ko) 2008-11-28 2017-03-30 에모리 유니버시티 감염 및 종양 치료 방법
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US9302005B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
US10259875B2 (en) 2013-10-01 2019-04-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating cancer in patients with elevated levels of BIM
EP3090059B1 (en) * 2014-01-05 2018-06-06 Biomirna Holdings Ltd. Lung cancer determinations using mirna ratios
US10302653B2 (en) 2014-05-22 2019-05-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Distinguishing antagonistic and agonistic anti B7-H1 antibodies
EP3171896A4 (en) 2014-07-23 2018-03-21 Mayo Foundation for Medical Education and Research Targeting dna-pkcs and b7-h1 to treat cancer
SG11201706529TA (en) 2015-02-10 2017-09-28 Univ Hong Kong Chinese Detecting mutations for cancer screening and fetal analysis
CN108026572B (zh) 2015-07-23 2022-07-01 香港中文大学 游离dna的片段化模式的分析
WO2017075045A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Mayo Foundation For Medical Education And Research Antibodies to b7-h1
ES2990117T3 (es) 2017-01-25 2024-11-28 Univ Hong Kong Chinese Aplicaciones de diagnóstico que utilizan fragmentos de ácido nucleico
IL272030B2 (en) 2017-07-26 2025-03-01 Univ Hong Kong Chinese Improving cancer screening using cell-free viral nucleic acids
EP3873500A4 (en) 2018-10-31 2023-01-11 Mayo Foundation for Medical Education and Research CANCER TREATMENT METHODS AND MATERIALS
WO2020092736A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4489710A (en) 1981-06-23 1984-12-25 Xoma Corporation Composition and method for transplantation therapy
US4429008B1 (en) 1981-12-10 1995-05-16 Univ California Thiol reactive liposomes
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
JPS59116229A (ja) 1982-12-24 1984-07-05 Teijin Ltd 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法
US4673562A (en) 1983-08-19 1987-06-16 The Children's Medical Center Corporation Bisamide bisthiol compounds useful for making technetium radiodiagnostic renal agents
US4873088A (en) 1983-09-06 1989-10-10 Liposome Technology, Inc. Liposome drug delivery method and composition
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4918164A (en) 1987-09-10 1990-04-17 Oncogen Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies
US4638045A (en) 1985-02-19 1987-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Non-peptide polyamino acid bioerodible polymers
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US4735792A (en) 1987-04-28 1988-04-05 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Radioiodinated maleimides and use as agents for radiolabeling antibodies
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
EP0398880A4 (en) 1988-01-04 1990-12-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Multiple stage affinity process for isolation of specific cells from a cell mixture
US5215926A (en) 1988-06-03 1993-06-01 Cellpro, Inc. Procedure for designing efficient affinity cell separation processes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
WO1991016116A1 (en) 1990-04-23 1991-10-31 Cellpro Incorporated Immunoselection device and method
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
DE69126620T2 (de) 1990-10-18 1997-10-02 Cellpro Inc Vorrichtung und verfahren zur trennung von partikeln mittels eines biegsamen gefässes
US5240856A (en) 1991-10-23 1993-08-31 Cellpro Incorporated Apparatus for cell separation
KR100278157B1 (ko) 1992-06-25 2001-01-15 장 스테판느 보조약을 함유하는 백신 조성물
US5614373A (en) * 1992-09-17 1997-03-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Tumor-specific antibodies and antigen
US5359681A (en) 1993-01-11 1994-10-25 University Of Washington Fiber optic sensor and methods and apparatus relating thereto
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
EP1167378B1 (en) 1994-07-15 2011-05-11 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5589579A (en) * 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
EP0695760A1 (en) * 1994-08-05 1996-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tumor marker for lung cancer
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5744585A (en) * 1995-03-16 1998-04-28 Medenica; Rajko D. Human monoclonal antibody against lung carcinoma
US5633161A (en) * 1995-03-29 1997-05-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Murine gene fomy030 coding for tumor progression inhibitor
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
CA2220530A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Improved method for obtaining full-length cdna sequences
WO1997007244A1 (en) * 1995-08-11 1997-02-27 The United States Of America, Represented By The ISOLATION OF AMPLIFIED GENES VIA cDNA SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION
EP0871747A1 (en) 1996-01-02 1998-10-21 Chiron Viagene, Inc. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
AU6111298A (en) * 1997-02-12 1998-09-08 Samir M. Hanash Protein markers for lung cancer and use thereof
JP2002514076A (ja) * 1997-04-11 2002-05-14 マイクロメット アーゲー 散在性腫瘍細胞の検出のための新規プライマー及び方法
CA2292788A1 (en) * 1997-06-11 1998-12-17 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the lung
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ID27813A (id) * 1998-01-28 2001-04-26 Corixa Corp Senyawa-senyawa untuk terapi dan diagnosa kanker paru-paru dan metoda untuk penggunaannya
JP2002533056A (ja) * 1998-03-18 2002-10-08 コリクサ コーポレイション 肺癌の治療および診断のための化合物および方法
US6312695B1 (en) 1998-03-18 2001-11-06 Corixa Corporation Compounds and methods for therapy of lung cancer
US6297364B1 (en) * 1998-04-17 2001-10-02 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PL354348A1 (en) 2004-01-12
EP1169347B1 (en) 2008-07-02
WO2000061612A3 (en) 2001-04-26
MXPA01009962A (es) 2002-08-20
AU4069200A (en) 2000-11-14
YU72901A (sh) 2004-07-15
EP2028190A1 (en) 2009-02-25
DE60039353D1 (de) 2008-08-14
NZ514818A (en) 2004-04-30
IL145731A0 (en) 2002-07-25
KR20020007354A (ko) 2002-01-26
CA2369578A1 (en) 2000-10-19
JP2002543769A (ja) 2002-12-24
HK1049848A1 (zh) 2003-05-30
HUP0200760A2 (en) 2002-06-29
EA200101037A1 (ru) 2002-06-27
EA005140B1 (ru) 2004-12-30
EP1169347A2 (en) 2002-01-09
BR0009505A (pt) 2002-06-11
ES2308976T3 (es) 2008-12-16
WO2000061612A2 (en) 2000-10-19
ATE399793T1 (de) 2008-07-15
CN1370182A (zh) 2002-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1169347B1 (en) Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
EP1183348B1 (en) Compositions for the treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use
EP1064372B1 (en) Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
EP1870466A2 (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer
AU2197800A (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
WO2002013847A2 (en) Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CA2383615A1 (en) Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
EP1767636A2 (en) Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use
JP2010239970A (ja) 乳癌の処置および診断のための組成物ならびにそれらの使用方法
US20010055596A1 (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of colon cancer
US20020150588A1 (en) SPAS-1 cancer antigen
JP2002540789A5 (cs)
WO2001051513A2 (en) Ovarian tumor-associated sequences
NZ567750A (en) Compositions and uses for cancer therapy
US20020058292A1 (en) Ovarian tumor antigen and methods of use therefor
US6933363B1 (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US20020064815A1 (en) Ovarian tumor antigen and methods of use therefor
US20030045468A1 (en) Compositions and methods for the therapy, diagnosis and monitoring of breast cancer
JP4942906B2 (ja) 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法
CA2375049A1 (en) Compositions and methods for the therapy, diagnosis and monitoring of breast cancer
WO2001027276A2 (en) Dna sequences from breast tumor and uses thereof
CA2613125A1 (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer