JPS59116229A - 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は力［規な細胞毒性複合体とその製造法に関する
。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的細胞という）
のもつ特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン
、あるいはその抗原結合部位を含むフラグメントからな
る構成部分と、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブ
ミンからなる構成部分をＭする、新規な細胞毒性複合体
とその製造法に関するものである。本発明で得られる細
胞毒性複合体ｄ、ｆ／Ｉｌえば、ガン有用である。

ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的として、そ
の標的細胞と特異的に結合しつる免疫グロブリンを種々
の細胞毒性物質と結合させる試みがなされてさた。例え
ば、免疫グロブリンにｐ−ジ（２−クロロエチル）アミ
ノ−Ｌ　−フェールアラニン等を結合しｆｃ複合体（特
開昭５ｌ−６１６４０）、　　免疫グロブリンにメトト
レキセート等を結合した複合体（特開昭５６−６５８２
９）。

免疫グロブリンにクロラムプシル等を結合した複合体（
特開昭５６−６５８２８）、免疫グロブリンにマイトマ
イ／ンーＣ等を結合した複合体（特開昭５５−９２３２
５）、免疫グロブリンにダウノマイシンを結合した複合
体（％開昭５１−１４４７２３　　）等が知られている
。

これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、ガン細胞と
選択的に結合しガン細胞に毒性を発揮することが期待さ
れるものであり、非常に興味のある複合体である。しか
しながら細胞毒性物質を直接抗体に結合する場合は、免
疫グロブリンに多数の細胞毒性物質を結合すると、抗体
の抗原Ｗｔ２　ｍ活性が低下してし１うので、かかる困
難を回避するためには、少数の細胞毒性物質を結合する
にとどめざるをえない。

本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決すべく鋭意
研究を行なった結果、先ず血清アルブミンに多数の細胞
相性物質を結合せしめ、然る後かかる細胞毒性物質を結
合せしめた血清アルブミンを免疫グロブリンまたはその
フラグメントと結合せしめれば、抗体活性を損うことな
く多数の紺胞′ａ性物質全結合した名疫グロブリンー細
胞毒性物質複合体を製１告しイ；）ることを見い出して
本発明に到達した。

すなわち、本発明は殺すべき細胞のもっている特定の抗
原と特異的に結合し得る免疫グロブリン１．たけそのフ
ラグメントと、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブ
ミンを、共有結合させてなる細胞毒性複合体、並びにそ
の製造法に関するものである。

本発明において、殺すべき細胞のもっている特別の抗原
と特異的に結合しうる免疫グロブリン（細胞毒性蛋白複
合体の誘導部）とは次のようなものである。腫瘍細胞あ
るいは特定のリンパ球等の標的細胞あるいはそれらを含
む組繊で免疫されたヒト、ザル、ウマ、つ７．ヤギ、ヒ
ツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウ
ス等の動物から分離でれた抗＋ｔｎ清より、エタノール
分画、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラムクロ
マトグラフィー等の公知の手段によって調製される免疫
グロブリン、あるい（−１標的Ｉ（Ｂ胞で免疫した動物
より採取ぜれた抗体産生ＩＩ′Ｉ′ｌｌ胞を発癌性のあ
る物質で癌化させたり、ミエローマ細胞と融合させてハ
イプリドーマにしたりすることによって得られるモノク
ロナルな抗体をいう。舊た標的細胞に結合した免疫グロ
ブリンを界面活性剤等で分離して得られる、標的細胞に
特異的な免疫グロブリンも本発明の免疫グロブリンに含
捷れる。

免疫グロブリンにはＩｇＧ　、　ＩｇＡ　、　ＩｇＭ　
、　ＩｇＤ。

ＩｇＥの５つのクラスが知られており、さらに各クラス
はいくつかのサブクラスから成っていることが知られて
いる。しかし、その基本構造は、２本の重鎖と２本の軽
鎖とから成る点、また抗原結合活性をもつＦｅｂ部分と
エフェクター活＋１゛をもつＦｃ　　部分から成る点に
おいて一致している。ただし、ＩｇＭけ５を体、　　Ｔ
ｇＡは一部２惜体で存在する。

細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グロブリン
分子全体を用いてもよいが、その抗原結合部位を含むが
、Ｆｃ部分をもたないフラグメントを用いてもよい。Ｆ
ｃ部分を含む複合体にあっては、Ｆｃ部分による標的細
胞以外の細胞に対する非特異的吸着及び細胞膜上のＦｃ
＋）セプターとの結合が起こり、細胞毒性蛋白複合体の
殺すべき、：ｉｌＢ胞に対する遣択性が減じることがあ
り、また免疫グロブリンがヒトにとって異樺蛋白である
場合、その抗原性は、Ｆｃ部分において特に強いので、
蛋白複合体の抗原性を低下させるためｉｃ、Ｆｃ部分の
ない免疫グロブリンの７ラグメントが、細胞毒性蛋白複
合体の誘導部として望ましいことがある。一般に、免疫
グロブリンをパパイ７　（ｐａｐａｉｎ）、　　）リプ
タｙ　（ｔｒｙｐｓｉｎ）、　キモトリプシン（ｃｈｙ
ｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）　、　　プラスミン（ｐｌａｓ−
ｍ１ｎ）等の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分
を１つもつ、いわゆるＦａｂ：７ラグメントが１１ら凡
る。またペブンン（ｐｅｐｓｉｎ）分解９条件によって
はトリプシン分解によっても抗原結合部分を２つもつ、
いわゆるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。この
フラグメントはさらにメルカプタンで処理すると、−価
のＦａｂ’フラグメントになる。さらに免疫グロブリン
を変性させつつ分解させると抗原結合部分（バリアプル
・リージョン　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ　）の
みが得られる。免疫グロブリン及び免疫グロブリン由来
の例えば上記のフラグメントは、免疫グロブリンがいか
なるクラス、サブクラスであれ、いずれも本発明の蛋白
複合体の誘導部として用いることもできる。

本発明の細胞毒性複合体の他方の成分は、細胞糊性物質
を結合せしめた血清アルブミンであるが、かかる細胞毒
性物質の相体となる血清アルブミンとしては入浸び各種
の動物の血清アルブミンが用いられるが、特に好ましく
は人及び牛の血清アルブミンである。捷た血清アルブミ
ンに結合される細胞毒性物質としては、例えば各種の抗
癌剤が適しているが、特に奸才しくけ血清アルブミンの
アミン基と反応して結合する基を有する抗癌剤オフ′こ
は抗癌剤１ヶ導体であり、その具体例としては、吹下の
化学式で表わされる化合物を挙げるととができるが、こ
れらに限られるものではない。

クロラムプシル誘導体 マイトマイシン−Ｃ誘導体 ダウンマイシン誘導体 り ５−フルオロ−２′−デオキシウリジン誘導体Ｔスアセ
チルビンプラスチン酸アジド訪導体アクテノマイシンー
Ｄオキサジノン銹導体本発明の免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントと、細胞お性物ｐｆ：結合亡しめた血清
アルブミンを、共有苗台させてなる細胞毒性複合体の中
では、そのシ造、精製及び活性上、下記式で表わされる
彷合体が好祉しく、その中でも下ｉ己式［ｒ［］−１：
たけ（ｉｌ＋） で表わされる複合体が特に好ましい。

上記式［１１）においてｔ２＝０の場合には、Ｂ２は免
疫グロブリンマ穴ばそのフラグメントに由来する＠ｃ９
ｉ、原子であり、ｔ２＝１の場合には架橋剤により導入
された硫黄原−子である。式〔ｌ〕においてｔ３−０の
場合には、硫黄Ｆ１λ子Ｓ１とＢ２は直接結合［７ジス
ノ７フイド基を形成−ｊ　７）。一方ｔ３−＝ｔの場合
にば、仕込原子Ｓ１とε、ｔ、、ｉ２筒の有機基Ｂ３を
介して結合するが、！′２３！’−ｊチオールみ゛と反
応する２個の官卵基を４１する架橋剤　ｐ６えは下記式
ＣＢｓ８２価の有機基である。〕 で表わされる架橋剤を・るいはベンゾキノンに由来する
２価の有機基であろう式〔旧におりるＢ２け、例えば下
記式〔Ｘ’） で表わされる７Ｊ！：橋剤、下記式Ｃ’、’り、Ｘ　−
Ｓ　−Ｂ、　−Ｃ−Ｚ　　　　　　−−−・−・−・−
・・［ＸＴ］１ Ｈ−ＨＱ で表わされる架橋剤、下記式〔￥１１３で表わされる架
橋剤（２−イミノチオラクトン）下記式〔馴〕 で表わされる架橋剤（Ｎ−アセチルホモシスディン）、
で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基である。

Ｘで表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ンス
ルフイド基を形成し得る１価の有機基の具体例としては
、例えば２−ピリジルチオ基（（ΣＳ−）、４−ピリジ
ルチオ基（Ｑ−８−）。

３−カルボキシ−４−二トロフェニルｆ−Ａ−基ミノー
Ｎ′−ンエニルイミノメチルチオ基ｎ５−またはＢ６で
表わされる２価の有機基は、化学的に不活性であれｒｉ
　％に限定されン’ｓいが、一般的には分岐を有するか
有しないアルキレン基。

フェニレン基等から適宜選ばれる。Ｙで表わされる活性
エステルのアルコール残基の具体例とさができる。Ｚで
表わされるイミドエステルのｆルコール残基の具体例と
してはメ）・キシ、エトキシ遅・笠を挙げることができ
る。Ｑで表わさオＩるノ・ロゲン厚子の具体例としては
塩素、臭素等を挙げることができる。

架橋剤の具体）イ・りと１−７では、式〔ＩＸ〕で辰わ
される架橋剤と（７て　Ｎ、Ｎ’−（１，２−フェニレ
ン）を、式〔Ｘ〕で表わされる架橋剤として、Ｎ−サク
／　ン　イミ　　　シ５　、・し　３　　　　　　（２
−ヒ゛　　リシ　　ル　ン−−）′　ｓ−）　　　フ゛
　ロピオネート、Ｎ−サクンンイミジル３−（２，４−
一シニドＩＪノエノ究ン）７゛プレ一トｒ１式〔Ｘ１〕
で六わさ３する架イ３創として、７′ブノｌ　：（−（
２−、シ ビリノルチオ）フ７ＪピオンイＳγ゛−１・塩酸塩を挙
（ハ）ることが−で６′−る。

手配式ＣＩ’Ｎ〕にｐいてＢ４ｊは、１′；１」えば下
記式（ＸＩ￥１］　。

♀ で？；わされる、マレイミド基を有１−る架橋剤に由来
する２１１１１ｉのイ１！孕）魅゛である。Ｂ７で表わ
される２価の有機？（借、化学的に不１．＜；　Ｊ・′
’Ｈであれば特に限定されないが、一般的には分校を有
するか有しないワ′ルキレン基、フェニレン基等かう適
宜遡（ばれる。

ＣＸ［’；］で表わされＺ）架橋斉（Ｉの具体例として
は、パ列エバメタ−（Ｎ−マレイミド）匁息香ｉＮ−ヒ
メタ−（Ｎ−マレイミド）安息香酸２，４−ジニトロノ
ユニルエノウール、β−（Ｎ−マレイミド）ブ［Ｊビ２
ン酸トーヒドロギシサクノンイミドエスデル笑全ダ、げ
Ｚ、ことができる。

本発明のｌｌＴｌ胞栂性衿合体は、免疫グロブリン１ブ
Ｃはく−のフラグメント脂、細胞毒性物質を結合せしＭ
）プＣｊｒＩＬ？′Ｒアルブミンを、共有結合させるこ
と１（より劾７・えするζ七ができる。例えば、本究明
の細胞毒性複合体の内式［Ｉ’ｌ’−１）で表わされる
複合体は、例えば、発生寸た（ｔｉ導入したチオール基
を有する下記式［ＩＶ） で表ノ）さ７する免疫グロブリンまたけそのフラグメン
トと、下記式〔ｖ〕 ｘｓ、　−Ａ／−（−Ｎ）Ｔ−ｃｙ　）　ｍ　　　・・
・・・・・・・・・いｌ〕で７Ｉｅわされる細胞毒性物
質を結合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブミ
ンを反応せしめるか、または、訪梼または導入した活性
ジスルフィド基を有する下記式〔■１〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
、下記式〔νＭ〕 Ｈ８，−Ａｚ４−ＮＨ−Ｃｙ　）　　　　・・・・・・
・・・・・・〔■１〕で表わさｎる細胞ＴｊＪ性物質を
結合した血清アルブミンを反応せしめることにより製造
することができる。

前記式〔１ｖ〕において、ｔ２−Ｏの場合には、式［Ｔ
Ｖ’］で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントは、Ｆａｂ’、　　ＩｇＭより得られる一量体Ｉ　
ｇＭ、によって代表される如くそれ自体チオール基を有
するか、またはジスルフィド基より発生せしめたチオー
ル基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメントで
ある。ｔ２−１である式（ＩＶ）で表わされる導入され
たチオール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントニ、例えば免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トに前記式〔Ｘ〕または［ＸＩ）で表わされる架橋剤を
反応させた後、導入された活性ジスルフィド基よシ還元
操作によりチオール基を発生せしめるか、または、免疫
グロブリン捷たはそのフラグメントに前記式（Ｘｌｌ）
またはＣＸｆｌｌ）　　で表わされる架橋剤を反応させ
ることにより製造することができる。

上記式（ＶＤにおいて、１２＝０の場合には、かかる活
性ジスルフィド基を有する免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントは、例えば、それ自体のまたは発生せしめた
チオール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントに活性ジスルフィド基導入剤を作用させることによ
り製造することができる。

上記の目的に用いることができる活性ジスルフィド化合
物としては、例えば、２−ビリジルオビス（２−ニトロ
安息香酸） −２−ピリジルジスルフィド ４−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド−ベンゾイミダ
ゾイルジスルフィド きる。

また、前述のＦ　（ａ　ｂ’　）２　　のヒンジ部分の
ジスルフィド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ
化分解して分子中ＫＳ−スルホ基（−Ｓ−ＳＯ３−）を
有するＦ：ａｂ’を得ることができるが、この物も、式
〔■りで表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブ
ミンと好適に反応して、式（：ｆＴ−１〕で表わされる
細胞毒性複合体を生成する。

式［Ｖ）または〔■１〕で表わされる細胞毒性物質を結
合した血清アルブミンの製造方法については後述する。

オた、本発明の細胞毒性複合体の内式［ＪＴ−２］で表
わされる複合体は、例えば、前記式（ｒＶ）で表わされ
る発生捷たは導入したチオール基を有する免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと、前記式〔■〕で表わされ
る細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを、チオール
基と反応し得る笥能基を２個有する架橋剤をルいて結合
することにより製造することができる。本反応を行なう
＃ち合は、２段階の反応として行なうのが好ましい。即
ち、最初に、式〔■〕で表わされる発生または導入した
チオール基をゼする免疫グロブリン−またけそのフラグ
メントか、或いは式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した血清アルブミンに、過剰の、例えば式〔■〕で
表わされる架橋剤を反応させ、精製処理をほどこした後
、得られた中間体に他方の蛋白を作用せしめる。

以上の反応手順により、目的とする式（ＩＩ−２］で表
わされる細胞毒性複合体を得ることができる。

さらに、本発明の細胞毒性複合体の内式（ＩＩＪ）で表
わされる複合体は、例えば、上記式ＯＴ！〕で表わされ
る細胞毒性物質を結合した血清アルブミンと、下記式〔
■〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントを反応せしめることによυ
製造することができる。

上記式〔す１〕で表わされる導入されたマレイミド基を
もつ免疫グロブリン甘たはそのフラグメントは、例えば
、免疫グロブリン捷たにそのフラグメントに前Ｎｅ式［
：Ｘ］Ｖ）　　で表わさｔＩるマレイミド基を有する架
橋剤を反応せしめることにより製造することができる。

次に、前記式ＣＶ〕ｔたは〔■〕で表わされる細胞毒性
物質を結合した血清アルブミンの製造方法について述べ
る。かかる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンは各
種の方法によりネ”１造できるが、例示すれば以下の通
シである。

先ず血清アルブミンが有するチオール基に、前記式〔■
〕で表わされる活性ジスルフィド基を有する免疫グロブ
リン捷たはそのフラグメントの製造法の項で一例示した
２−ピリジルジスルフィド、４−ビシジルジスルフィド
等の活性ジスルフィド化合物を反応させて、下記式［Ｘ
Ｖ）ＸＳ、　−Ａｔ　　　　−・・・・・−［：ＸＶ：
］（Ａ４　Ｓ＋及びＸの定義は式ＣＤに同じ。〕で表わ
される活性ジスルフィド基を育する血清アルブミンを得
る。次いでこれを過当な細胞毒性物質と反応させて、ア
ルブミンのアミン基に細胞乳性物質を結合ぜしめること
により、前記式〔ｖ〕で表わされる細胞毒性物質を結合
した活性ジスルフィド基を有する血清アルブミンを得る
。前記式〔■〕で表わされる血清アルブミン誘２、ｊ一
体は、例えば、上言Ｓの如くして得た式〔ｖ〕で表わさ
れる活性ジスルフィド基を有するアルブミン誘導体を２
−メルカプトエタノールまたはジテオスレイトールで処
胛することにより得ることができる。

本発明の細胞宿性複合体の製造法を例示すれば次の通り
である。

（１）式（ＴＶ）で表わされる一生または導入したチオ
を結合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブミン
を反応させるか、式〔■〕で表わされる活性ジスルフィ
ド基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
式い、’ｌＪ］で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンを反応させる方法。

これらの方法においては、式〔Ｔ〜′〕で表わされるチ
オール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメン
ト１モルに対し、式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブミンを
０．３〜２０モルの割合で使用するのが好ましい。反応
は、両蛋白をｐＨ６〜工０の緩衝液に合計の蛋白濃度が
０．５〜１００■／　＋ｎｌ　（より好ましくは１〜２
０〜／ｍｌ）になるように混じ、０〜６０℃で静置、も
しくは反応混液と同じｐＨの緩衝液に対し透析すること
Ｋより行なうことができる。反応時間は反応スケール、
反応東件によるが、一般には４時間〜３日間である。得
られた細胞毒性複合体の、反応混合物からの分離、精製
は通常用いられる操作、例えば透析１分子ふるいのカラ
ムクロマトグラフィーによって行なうことができる。

（２）式〔Ｉ■〕で表わされるチオール基を有する免疫
グロブリンまたはそのフラグメントと式〔Ｎ丁〕で表わ
される細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを、両者
のチオール基と反応しうる前述した式ＣＩＸ）の架橋剤
を用いて結合する方法。

この方法において、反応はチオール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメント。

架橋剤、細胞毒性物質を結合したｄｎ清アルブミン三者
を同時に接触させて行なうこともできるが、好ましくは
どちらが一方の蛋白に架橋剤を反応させた後、次いで、
その生成物に他方の蛋白を反応せしめることにより製造
される。才ず架橋剤を反応させる蛋白１モルに対し、好
捷しくけ、架橋剤及び他方の蛋白がそれぞれ０．８〜５
０モル、０．８〜１０モル用いられる。反応は捷ず、チ
オール基を有する免疫グロブリン寸たはそのフラグメン
ト或いは細胞毒性物質を結合した血清アルブミンのｐＨ
６〜１０の緩衝液の溶液（蛋白濃度は好ましくけｏ、ｓ
　〜１００　ｍｙ／　ｙｎｌ、　よ）好ましくけ１〜２
０■／艷に調製する）に、０〜６０℃で撹拌しながら、
少量の溶媒、例えば、Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド
、ジメチルスルホキシド、１，２−ジメトキシエタン、
メタノール、エタノール、アセトン等に溶がした架橋剤
を添加して行なわれる。次いで、透析または分子ふるい
のカラムクロマトグラフィーにより、未反応の架橋剤を
除いた後、もう一方の蛋白のｐＨ６〜１ｏの緩衝液の溶
液（好ましい蛋白濃度の範囲は上に記載したのと同じで
ある）を添加して、０〜６０℃で反応せしめる。上記方
法によって得られる細胞毒性複合体の、反応混合物から
の分離。精製は通常用いられる繰作、例えば分子ふるい
のカラムクロマトグラフィーによって行なうことかでア
ルブミンと式〔四〕で表わされる導入されたマレイミド
基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメントを反応
させる方法。

この方法においては、式ＣＶＩＩＩ：］で表わされる導
入されたマレイミド基をもつ免疫グロプリルブミンを０
．３〜１０モルの割合で使用するのが好ましい。反応は
、両蛋白をｐＨ６〜１０の緩衝液に合計の蛋白濃度が０
．５〜１００■／ｍ／！（より好ましくは１〜２０■／
艷）になるように混じ、０〜６０℃で静置して行なうこ
とができる。反応時間は反応スケール、反応条件による
が、一般には４時間〜３日間であ・る。得られた細胞毒
性複合体の、反応混合物からの分離、和製は通常用いら
九る操作、例えば透析１分子ふるいのカラムクロマトグ
ラフィーによって行なうことができる。

エリ、下実施例により不発明を詳述する。

参考例１ （イ）抗マウス白血病Ｌ１２１０　ＩｇＧのｎ製マウス
白血病Ｌ１２１０細胞Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’個を７０インド
完全アジユバントとのエマルジョンとし、家兎に静脈注
射１−た。その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約
Ｉ　Ｘ　１０’個のＬ１２１０細胞をアジュバントと共
に皮下注射し、最終投与口から８日後に採血した。得ら
れた血液をプールし、血清を分離し、その癩清を５６℃
、３０分間加熱、非働化した。こうして得られた抗Ｌ１
２１０血清２００　ｍｌに、硫安の飽和水溶液２００　
ｒｐ！を加えて、生じた沈澱を遠心分離によって分取し
た。この沈澱を。、０１Ｍリン酸緩衝液（＋）Ｈ７，６
）　５０７に溶解し、更に同緩衝液に対して十分に透析
した。この透析内液を同じ緩衝液で平衡化したジエチル
アミノエチルセルロ−スカラムクロマトクンフィー て、未吸着分画と１〜て抗Ｌ１２１０　ＩｇＧを含む溶
液を得た。

（口）　免疫グロブリンよりＦ　（　ａ　ｂ’　）２フ
ラグメントの分離 上記（イ）の如くして得られた抗Ｌ］２１０　ＩｇＧの
１、２２を０．１Ｍ酢酸緩衝液（１）Ｈ４．５　）　４
　ｏｍｌに溶解し、２４〜のペプシンを添加Ｌ”ｒ、３
７℃で約１８時間分解した後、分解生成物を生理食塩水
中でセファデックスＧ２００カラムクロマトグラフイー
（力ンムサイズ３．５、Ｘ１４０α）にかけて、分子量
約１０万のところに流出する蛋白として純粋なＦ（ａｂ
’）２フラグメントを得た。

（ハ）　Ｆａｂ’フラグメントの調製 上記（口）の如くして得られたＦ　（　ａ　ｂ’　）２
　　フラグメント１８．４■を含む０．０　１　Ｍ　ト
リス・塩酸−０．１　４Ｍ塩化す）！ｊウム（以後Ｎａ
Ｃ／−　　ト省略する）　−２ｍ　Ｍエチレンジアミン
四酢酸（す後ＥＤＴＡ　　と省略する）溶液（ｐＨ８゜
３）２．０ｍ／！に、＋５０ｒｎＭの２−メルカプトエ
タノール水溶液を０゜０２献加乏−て、３７℃で１則ｊ
　ｎｌｌ炉口た。反応後、その溶液を５ｍＭ酢酸紛衡液
−０，１４Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭＥＤＴＡ溶液（Ｐ
Ｈ５，５）　（以下、ＡＮＥ緩衡緩衝略す）で平衡化し
たセファデックスＧ２５カラムクロマトグラフイー（１
，０ＣＴｎＸ　２０Ｃｒｎ）にかけて２−メルカプトエ
タノールを除去し、チオール基】飼を有するＦａｂ’フ
ラグメントを得た。

に飽和硫安溶液１．００　ｍｌを添加し、生じた沈溶物
を除いたのち、０．９％塩化す）　ＩＪウム溶液に平衡
化したセファデックＧ・２００カラムクロマトグラフイ
ー（２，２ｃｒｎＸ　１０２　ｃｍ　）にがけ、第１ピ
ークに、ＴｇＭ画分をえた。

こうして得たＩｇＭ画分は、同容積の飽和硫安溶液を加
えて生じた沈澱を遠心分離した後、少量の０．９チ塩化
ナトリウム溶液に溶かし、０．９係塩化ナトリウム溶液
に充分透析した。

（（ホ）　ＩｇＭの調製 ０．９係塩化ナトリウム溶液に溶解したウザギＩｇλｘ
　（９，５ｍｙ／ｌｄ　）　ｔ、ｓ　ｍｌ、に、ＩＭト
リス塩酸緩緩衝（ｌｌｌＨ８，６）に溶解した０、２Ｍ
システィン０．２　ｍｌを混合し、室温１６時間還元し
た後、セファデックスＧ−２５（０，８Ｘ４３ＣＪｎ）
を用いるゲルろ過（５ｍＭ酢酸緩衡溶液−０，１４Ｍ　
ＮａＣＡ　１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ５，５））
により、過剰のシスティンを除いた。

（へ）　抗マウス乳癌ＭＭ４６　　モノクローン抗体の
調製 細胞融合法により得られた抗ＭＭ４６　ＩｇＧ　２　ｂ
抗体産生性ノイプリドーマ（瀬戸加太ら、ジャーナル　
オブ　イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１２
８巻、２０１〜２０５頁、１９８２年参照）を、ヌード
マウヌ１５匹の札′腔に、−匹当ゆ２　Ｘ　］　Ｑ’個
接種し、１０日後に腹水液を採取し、得られｆｒ腹水′
ｇ！Ｌ５０　ｒｒｒｅを５ｔの０．１Ｍ　ＩＪン酸緩緩
衝（ｐＨ８，０）に十分透析した。

透析内液を同じ緩衝液で十分に平衡化されたプロディン
Ａ・セファロースカラム（カラムザイズ１．ｓ　ｘ　１
２．５　ｃｍ　）にかけて、十分に素通り蛋白を流し出
した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）で不純
蛋白を溶出し、その後０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３
゜Ｏ）で吸着していたＩｇＧ　２ｂ　　を溶出し、溶出
液のｐＨｆ：２ＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　緩衝液（ｐＨ８
，２）で中性にもどし、その後５ｔの２０ｍＭリン酸緩
衡液緩衝）Ｈ７，５）に十分透析し、ｔ０５ｉｙ（ｔ７
゜７　ｍｇ　）の抗ＭＭ　４６　　モノクローン抗体（
ＩｇＧ２ｂ　）を得た。

寸た、正乾マウス血清５０　Ｔ、６よシ、上記と同様に
して非免疫ＩｇＧ２ｂ　２　ｓ　ｍｙ　（７，０ｍｌ、
）　ｋ得た。

実施例１ １〜３ １〜４ １−（イ） 参考例−一（ホ）で得られたＩｇＭｓ　　１２．４■を
溶解した緩衝液（５ｍλ４酢酸緩衡液−０，１４Ｔ（塩
化ナトリウＪ−１ｐＨ５，５、以下緩衝液Ａと省略する
）１．８ｍｊ！に、緩衝液Ａに溶解した、架橋剤Ｎ、Ｎ
’−ビス（マレイミドメチル）エーテル（以下肘りＥと
省略する）の飽和溶液１．８−を混合し、室温で３０分
反応させた後、過剰のＢＭＥ　ｆ、セファデックスＧ−
２５（０，８Ｘ４３ｙ＞ｔ、溶媒は緩衝液Ａ）を用いる
ゲルろ過により除いた。相当する両分を集め修飾ＩｇＭ
ｓ　１０．２■を含有する溶液７．７−が得られた（１
〜１）。この溶液は、直ちに、１−（ハ）における反応
に使用した。

１−　（ロ） 一方、公知の方法（シージエイノ、（−ネットら（Ｃ，
Ｊ、　Ｂａｒｎｅｔｔ　）、　　ジャーナル　オブ　メ
デイシナル　ケミストーリー、　　（Ｊｕ？ｎａｌ　ｏ
ｆＭｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第２１
巻、第８８〜９６頁、１９７８年参照）により、式１−
２で示されるデスアセチルビンブラスチン酸アジド中間
体を得た。即ち、デスアセチルビンブラスチン酸ヒドラ
ジド１０■を、ＩＮ塩酸０．５ｍｌに溶解し、０°にて
０．ＩＮ亜硝酸ソーダ溶液を０゜１５ｍ１力口えた。５
分間反応後０°にてテトラヒドロフラン０．５ｍ／！を
加え、ＩＮ水酸化ナトリウム０．５１ｎｌＶで中和する
と、式１〜芝で示される反応性のデスアセチルビンブラ
スチン酸アジド中間体を含む溶液が得られた。

上記溶液に、下記実施例３−（イ）で得られた２−チ万
ピリジル化（７だ人血清アルブミン４６ｎ７を６有する
０、２　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）５．０ｍＡを加
え、室温にて２時間撹拌した。次いでＩＮのアンモニア
０．１ｍｌを加えてさらに２時間反応せしめた。反応液
をセファデックスＧ−２５のカラム（１ｚＸ４０Ｃｒｎ
、溶媒は０．１Ｍリン酸−０゜１Ｍ塩化ナトリウム緩衝
液１）Ｈ７，５）に通して溶媒を交換し、相当する両分
を止めた（　１２．５　ｍｌ　）。

次いで４°にて１Ｍジチオスレイトール（Ｉ７ＴＴ）（
溶媒は、０．］Ｍリン酸緩衡緩衝Ｈ７，５）　４．０ｐ
ａｌを加え、１．５時間反応せしめたのち（１−３）、
反応液をセロファンチューブに入れ、緩衝液Ａに対して
４°にて充分透析した。回収液（１３，０Ｆｆｆｌ）に
含有される生成物の蛋白質及び薬剤濃度は、２つの波長
、即ち、２８０ｎｍと２７０　ｎｍにおける吸光度を測
定し、得られた値を同じ２波長に対する非修飾人血アル
ブミンおよび非修飾ビンブラスチンの吸光度に関連づけ
て決定した。人血清アルブミン蛋白質量は、３５■、デ
スアセオルビンブラスチン残基量と、蛋白量の比より、
人血清アルブミン１分子には薬剤が平均４．９個結合し
ていることが判明した。又、人血清アルブミンのチオー
ル基は下記実施例２−（ハ）の方法で定量ｊ、７た結果
、平均０．６７個であった。

１　−　（）〕 １−（イ）で得られた修飾ＩｇＭｓ　　の溶液２．０　
ｍｌト、】−（ロ）で得られたデスアセチルビンブラス
チンを結合した人崩清アルブミンの溶液３．０−を混合
し、４°で一夜反応せしめた。反応液をノデウムドデシ
ルサルフエー）Ｔｔ気泳動により調べると、生成物はＩ
ｇＭｓ　　にＴ（ＳＡが結合した式１−４で表わされる
複合体を含有する事が判明した。セファデックスＧ−１
５０スーパーフアインのカラム（１゜５　Ｘ　９０　ｃ
ｍ　）を用いるゲルろ過により精製して複合体を得た。

実施例２ ＩｇＧ　：抗Ｌ１２１０ウサギＩｇＧ ■ −１ −２ ２−ユ ２−（イ）マレイミド基を導入した工ｇＧ抗体の調製上
記参考例１−（イ）で得られたウサギエｇＧ３０〜を０
．１Ｍリン酸緩緩衝−０，１Ｍ塩化ナトリウム（以後Ｎ
ａＣｔ　　と省略する）　（ｐＨ７，ｏ　）１．０コの
溶液とし、これにＮ−サクシイミジルｍ−マレイミドベ
ンゾエート（以下ＳＭＢと略す）の１００ｍＭジメチル
ポルムアミド（以下ＤＭＦと省略）溶液２ｏμｔを室温
下に加え、３５分間ゆっくり撹拌したのち、素速くセフ
ァデックスＧ−２５のカラム（１，ＯＸ４０　ｃｍ、　
　０．１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，５）　Ｋ通し、低分
子を除くと、マレイミド基を導入されたウサギｉｇＧを
含む溶液９．５ｍｌが得られた（２−リ。

かくして得られた溶液に含有される蛋白質の母及び、Ｉ
ｇＧ分子に導入されたマレイミド基の数は下記のごとく
に定量した。

ＩｇＧの量は２８０　ｎｍの吸光度測定より２９．２で
あった。

下記のごとく、マレイミド基の１全定量して求めた。溶
液１゜Ｏｍｌを取り、Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル
）−７ステイン（以下ＤＮＰシスティンと省略）　１０
０　ｍ　Ｍ　ＤＭＦ溶液５μｔを加え、４°で一夜放置
した。反ら液をセファデックスＧ−２５（０，０１Ｍ−
リン酸ナトリウム緩衝液−０，１４Ｍ　ＮａＣ／＝　ｐ
Ｈ７，０）に０．０１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液−０
，１４Ｍ　ＮａＣｔで通し、蛋白溶出部をプールした。

２８０ｎｍの吸収極太よりＩｇＧの濃度を、３６００ｍ
の吸収極太より、マレイミド基に反応したＤＮＰ　−シ
ステ１′ン残基の濃度を求めた。ただし、ＤＮＰ−７ス
テイン残基の２８０ｎｍにおける吸光度は、３６Ｑｎｍ
の極大値の２８．１チとして、ＩｇＧ濃度の算出値を補
正した。

以上の手続きにより、ＩｇＧ分子に導入されｆｔ−ＤＮ
Ｐ　−’／　スｆインと反応性のマレイミ基の数を求め
た。

一方、マレイミド基量の定量に用いたＤＮＰ−システィ
ンのＩｇＧへの非特異的吸着による測定値誤差を修正す
るために、次の実験を行なった。

ウサギＩｇＧ　３．１５〜の０．１　Ｍリン酸緩衝液０
．１４　Ｍ　ＮａＣ４（ｐＨ６，５）　１．０　記に、
上記ＤＮＰＮシーティン溶液５．０μｌを加え、４°で
１夜放置したのち、セファデックスＧ−２５で、上記と
同様に分離し、蛋白質溶出部を１とめた。２８０ｎｍと
３６０ｎｍの吸光度より、ＩｇＧ１分子に吸着したＤＮ
Ｐ−システィンの数を求めると、 この値によって、上で求めたマレイミド基数を補正する
と、３．５２−０．１９＝３．３３即ち、ＩｇＧ分子に
導入されたマレイミド基の数は３．３３コである。

−（ロ）２−ピリジルジチオ基を含有する牛血清アルブ
ミンの調製 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）の結晶（市
販品）１３２１ｒＩｇを０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液−０，１Ｍ　Ｎ５ｅｔ　　−１ｍ　ＭＥＤＴＡ溶液
（ｐＨ７，０）　５゜Ｏゴに溶解し、２−ピリジルジス
ルフィド４．４■をＤＭＦ　Ｏ，１ｍｌに溶解した溶液
を添加し、４°で１夜反応し７た。反応液をセロファン
チューフ゛に入れ、４℃にて２日間、直０１Ｍリン酸緩
衡液緩衝、４　Ｍ　ＮａＣ４−１ｍ　ＭＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ７，０）に対して透析した。透析回収液をセファデッ
クスＧ　　２５（０，０ＺＭリン酸緩衡液−０，１４Ｍ
　ＮａＣ１−１ｍＭＥＤＴＡ。

り）Ｉ　７．０　）　（１ｃｍＸ　４０　ｃｍ）のカラ
ムに通し、蛋白質溶出部１０．２−を得た。回収ｌｌ５
Ａ量。

９６．３■（２８０ｎｍの吸光度による）。

得られた２−ピリジルジチオ基を有するＢＳＡ上の活性
ジスルフィド残基の量は、１部のサンプルに過剰のジチ
オスレイトールを作用させ、遊離したチオピリドンの吸
収極大値（３４３ｎｍ）における吸光度を測定して定量
ｌｊｃ。１方、該サンプル中のＢＳＡの量は、２８０ｎ
ｍにおける吸光度を測定して求めた。

ＢＳＡ　１分子に存在する活性ジスルフィド残基の数は
、これらの測定値の比で表わされる。

即ち、濃度比で表わせば、 ２−　（７９−、ｙイトマイシン−〇（以後ＭＭＣト省
略）を結合したＢＳＡ（２−２）　　の調製２−（イ）
で得られた２−ピリジルジチオ基を有するＢ！ＩＩＡ　
１４．１■を溶解した０、０３Ｍ−リンＦｆ’ｆｕ衡液
−０，０３Ｍ　ＮａＣＡ（ｐＨ７，６）　１．５１ｎｌ
に、１ａ　−（３−サクシイミジルオキシブロビη゛ニ
ル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサン４．１１
■をＤＭＦ５０μｔに溶解して加え、４°で５時間撹拌
した後、同じバッファーに溶かした１Ｍジチオスレイト
ール４．２８μｔを加えて、１．５時間４℃に保った。

反応液を０．０１　Ｍ酢酸緩衝液−０，１１４Ｍ　Ｎａ
Ｃｔ−０，０１ｍ　ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ５，２５）に対
して４℃で１７時間透析した。回収液１．６０ｔｄに含
有されるＭＭＣ結合ＢＳＡＯ量は、２８０ｎｍでの吸光
度測定により１４■であった。

さらに、回収液に含有されるＭＭＣ結合ＢＡＡ（２−ｚ
）について、回収液の一部を使って下記の定量全行なっ
た。

Ｒ８Ａ８部に結合したＭＭＣの数（ＭＭＣ／Ｂ　ＳＡ　
）ＭＭＣの吸収極大３６０ｎｍにおける吸光度よりλａ
ｙｃ残基量全基量ＳＡの吸収び犬２８０ｎｍにおける吸
光度よしＢＳＡ　ｚを求めた。ただし、２８０ｎｍにお
けるＭＭＣの吸光度は極太値３６０ｎｍの吸収の４．１
　％として、ＢＳＡの吸光度を補正した。その結果 ＢＳＡ分子に再生したカオールの数（ＭＳ−／ＢＳＡ）
反応生成物の１部を０．１’　Ｍ　ＩＪン酸緩緩衝−０
、Ｉ　ＭＮａＣｌ　　−１ｒｕ　ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７
，６）の溶液中、ａ剰の５，５′−ジチオビス−（２−
二）Ｃ＝安息香酸）　［：ＤＴＮＢ］　　を加え、４℃
で一夜反応した。反応液をセファテックスＧ−２５（０
，０１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液−０，１４Ｍ　Ｎａ
Ｃｔ−１ｒｎ　ＭＥＤＴＡ　）に通し、蛋白部をプール
する。このものについて、２８０ｎｍの吸収よシＢＳＡ
の濃度を求め、さらに、過剰のジテオスレイトールを加
えることにより遊離した５−メルカプト−２−二トロ安
息香酸に由来する４１２ｎｍにおける吸収を測定するこ
とによって、へ１ＭＣ結合ＢＳＡ　Ｋ：含有されるチオ
−Ａ・基の濃度を定量できた。これらの比を求めると、 〔チオール残基）／（ＢＳＡ）＝［：　１．４７　］］
７２．１０　）＝０．７０以上の定量値より、４％られ
たＭＭＣＭＣ結合アル−２ ２−２式で表わされる。

２−に）ＳＭＢ化ＩｇＧとＭＭＣ結合ＢＳＡの反応によ
る複合体（Ｚ−ａ）の調製 上記２−（イ）で得られたマレイミド基を平均３．３３
個含有するＩｇＧの溶液（０，１Ｍリン酸緩衝液−０，
１Ｍ　ＮａＣ１，ｐ）（ｃｔ、ｓ　）　］　、５　ｍｌ
と、上記２−Ｈで得られた、ＭＭＣを平均７．０個結合
したＢＳＡの溶液（０，０１Ｍ酢酸緩緩衝０，１４Ｍ　
ＭＭＣ２−０，０１ｍ　ＭＥＤＴＡ、　ｐＩ（ｓ、ｚ　
５　）　１．５ゴを混合し、４℃で１夜反応せしめた。

反応液をナトリウムドデシルサルフェート（以下ＳＤＳ
と省略する）電気泳動で調べることにより、生成物は、
ＩｇＧにＭＭＣ結合ＢＳＡが１〜３・個結合した複合体
（２−３）ｆｃ主成分とすることが１′＋１明した。セ
ファデックスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（１
，８Ｘ　８０ｃｍ　）を用いることにより、抄合体を枠
壊した。

２−（Ｉ−）　Ｌ］２］０細胞、に対する複合体（２−
見）のｐＨ胞　毒　４仕 手記２−に）の如くして得られた複合体（２−３）の標
的細胞Ｌ１２１０に対する細胞毒性を検Ｒ＝ｔ　した。

２４穴の培養プレートに、５　Ｘ　１０’個の■、１２
１０細胞を含むロズウエルパークメモリアルインステチ
ュート１６４０（以下ＲＰＭＩ　１６４０と省略する）
培地（１０飴牛脂児血清、２０μＭの２−メルカプトエ
タノールと０．１■／ｄのカナマイシンを含む）０．９
ｍＡを分注し、更に種々の濃度の被検サンプル０．１ｍ
ｌを加え、５％Ｃへ雰囲気下で３７℃で４８時間培養後
、トリバンブルー染色法により生細胞数を測定した。

その結果、第１表に示す如く、複合体（２−３）は、標
的細胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に著しい５剌胞増殖
抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその
平均で示した。

第　　１　　表 Ｏ （■懸、６５Ｈ８Ａ例Ｃ０ＹＮＨＹＮいＣｔ）、□　−
４ （３−よ　）＋（３−芝ルー〉 ３−　Ｒ）　２−ピリジルジチオ基を有する人血清アル
ブミンの調製 人血清アルブミン（以下Ｈ３Ａと省略する）の凍結乾燥
品１３２．０■を、０．１ＭＩＪン酸緩衡液緩衝、１　
Ｍ　Ｎ８ＣＬ　−１ｍ　ＭＥＤＴＡ　（ＰＨ７，０）５
’、Ｏｍｌに溶解し、２−ピリジルジスルフィド４．０
ｍ７をｌ）ＭＦ　０．１　ｍｌに溶解した溶液を添加し
、４℃で１夜反応した。反応液をセファデック、（Ｇ−
２５（０，０１Ｍリン酸緩衝液−０，１４ＭＮａＣｔ−
１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，０）　（Ｉ　ＣｒｎＸ　４０
ｃｍ）のカラムに通し、蛋白質溶出部８゜７ｄを得た。

回収Ｈ８Ａ　ｉ、１２２■（２８０ｎｔｏの吸光度測定
による）。

得られた２−チオピリジル化Ｈ８Ａ上の活性ジスルフィ
ド残基の量は、実施例２−（（イ）の２−ピリジルジチ
オ化ＢＳＡの場合と全く同様々手法で定量した結果 〔２−ピリジルジチオ基〕 （ＩＳＡ） であった。

３−（ロ）ニトロンウレア基を結合したＩＳＡ　（３−
２）の評判 前記２−（イ）によって得られた、２−ピリジルジスル
フィド基金Ｈ８Ａ　１分子あたり平均０゜６７個含有す
るＩＳＡそ５Ｓ−２ｐｙ）。、６７１３．２７（りを溶
解した０、１Ｍリン酸ナトリウム−０，１ＭＮｓＣｌ　
　−（ｐＨ７，５）の緩衝液２．Ｏｍｌに、Ｎ−サクシ
イミジル２−Ｃ（３−クロロエチル）−３−二トロソウ
レイト〕プロピオネ−）ｘ、ｏｑを溶解したジメチルホ
ルムアミド溶液２０μｔを４℃にて加え、そのまま８時
間反応せしめた後、同じ緩衝液に溶かした１Ｍジチオス
レイトール４．０μｔを加えて、４℃で１．５時間反応
した。反応液をセロファンチューブに入れ０．９チ食塩
水−１ｍＭＥＤＴＡ　に対して４℃で充分透析して低分
子物質を除くと、ニトロノウレア基を結合した１（ＳＡ
（３−２）を含む回収液３．１　ｍｌを得た。

２８０ｎｍでの吸光度の測定により、溶液中Ｋ］１．７
■のＢＳＡを含有すること、及び得られた修飾ＢＳＡは
、アルキル化能測定（ジ−ピーライージーら（Ｇ、Ｐ、
　Ｗｈｅｅｌｅｒ　）　、キャンサーリザーチ（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　、第３４巻。

第１９４〜２００頁、１９７４年参照）よシ、１　ｍｏ
ｌｅのＢＳＡあたりＮ−サクシイミジル２−Ｃ（３−ク
ロロエチル）−３−ニトロソウレイド〕ブロビオイ’　
　ｈ　］　２　ｍｏｌｅ分のアルキル化能を有すること
が明らかとなった。

又、ＩＳＡ分子に再生したチオールの数は実施例１−（
・→と同じ方法により定量した結果、ＢＳＡ　１分子に
平均０．６５個含有されることが判明した。従って得ら
れたニトロソウレア基を結合したＢＳＡ（３−２）は下
記式のごとくに表わされる。

Ｏ ３−え ３−０）マレイ、、ミド基を導入したＩｇＧと、ニトロ
ノウレア基を結合したＢＳＡの反応による初合体（３−
３）の調製 実施例２−（イ）で得られたマレイミド基が平均３゜３
３個導入されたＩｇＧの０．１ＭＩＪン酸緩衡液緩衝、
１　Ｍ　ＮａＣ１（ｐＩ（６，５）の溶液１．０ゴに、
上記３−（イ）で得られた二ｌ・ロソウレア基を平均１
２個結合したＩ（ＳＡ　（３−２）の溶液（−ｃｉ、９
％食塩水）１．８−を混合し、４℃で１夜反応した。反
応液をｓＤｓ箪気泳動で調べることにより、生成物は、
ＩｇＧにニトロソウレア基結合Ｈ８Ａが１〜３個結結合
た式３−３で表わされる複合体を生成物とすることが判
明しノｉヒ−。

セファデックスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（
１，５Ｘ　８０ｃｒｎ）を用いることにより、複合体を
精ｇツした。

３−ｒ→Ｌ１２１０　細胞ニ対する複合体（３−３）の
細胞劣性 上記３−Ｃつの如くして得られた複合体（３−怠）の枦
的細胞Ｌ１２１０にす・１す枦七キ毒性を倹Ｆｄ　した
。

２４穴の培養プレートに、５　Ｘ　１０’個のＬ１２１
０４Ｂ胞を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（１０％牛脂児
ｉｎ？ｆ！、２ｏμＭの２−メルカプトエタノール（！
：　ｏ、ｔ　ｒｒｒｇ　／　ｍｌのカナマイシンを含む
）０．９ｍ１．を分注し、東に種々の濃度の杉検サンプ
ル０．１−を加え、５係ＣＯ２界囲気下で３７℃で４８
時間培養後、トリバンプルー染色法により生細胞数を測
定した。

その結果、第１表に示す如く複合体（３−逆）は、標的
細胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に著しい細胞増殖抑制
効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその平均
で示した。

Ｐ、１　　　人 実施例４ （４−大）＋（４−兄）−ラ （４−３） ４−０）マレイミド基を導入したＦ（ａｂ’）２の調製
上記参考例１−（ロ）で得られたウサギＦ（ａｂ’）２
２０ｍ１を０．１Ｍリン酸緩衝液−０，１Ｍ　ＮａＣ７
！（ｐＨ７，０）　］、、Ｏｍｌの溶液とし、これに、
４−（マレイミドメチル）フクロヘキサン−１−カルボ
ン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエスデル（以下ＭＣ
Ａ　Ｅ　　と省略する。加藤兼房。

浜ロ好考１石用栄治、化学と生物、第１４巻第８１７頁
（１９７６）参照）の１００ｍＭＤＭＦ溶液１０μＬを
室温下に加え、３０分間ゆっくり撹拌したのち、セファ
デックスＧ−２５（１，，０Ｘ３０側、０．１Ｍリン酸
緩衡ｇ−ｏ、ｉＭ　ＮａＣｔ、　Ｉ）８６．５　）に通
し、低分子・を除くと、ＭＣＡＥが反応したウサギＦ（
ａｂ’）２　　を含む溶液７．６−が得られ、ケ。

得らねた溶液に含有されるマレイミド基を含有するＦ（
ａｂ’）２（４ｚ　）のバ白￥ｊ　ｔは、２８０ｎｍの
吸光度より求めたところ１７．０■であった。Ｆ　（、
ａ　ｂ’　）２　　分子に８人されたマレイミド基の数
は、実施例２−（イ）におりるＩｙ５ＧＩＣ導入された
マレイミド基の定量と全く同じ手順でこれを犬走した結
果平均２．１個であった。

４−（ロ）メトトレキセー１ト（堤、後ＭＴＸと省略す
る）を結合したＩｒ５Ａ　（４−芝）のＦＪＭ製実施例
４−（イ）で得られた、２−ヒ°１ノジルジチオ基全平
均０゜６７個含有するＨ８Ａ　１３．２℃ｇを溶解］−
た０、］］Ｍリン酸ナトリウムー〇、ＩＭＮｓＣｔ−勾
＃↓旧禁（ｐＨ７，５）の緩衝液２．〇−に、すでに公
知の方法（ビー　エヌ　クルカルニら（Ｐ、Ｎ、　Ｋｕ
ｌｋａｒｎｉ　　）　、　　キーヤンーリ“−１ノサー
チ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　、第４１巻
、第２７００〜２７０６頁参照）に従って調製しＴ−Ｆ
ｉＭＴＸのＮ−ヒドロキ／サクシンイミドエ２チル３．
３■を溶解したＤＭＦ溶液１００μｔを４℃にて加え、
１０時間反応せしめた。次い１同じ緩衝液に溶かした１
Ｍ２−メルカプトフタノール５．０μｔを加え、４℃で
１．５時間反貸した。反応液を、セロファンチューブに
入オ０．９チ食塩水１ｍＭＥＤＴＡ　に対して４℃で充
う透析１．て、低分子物質を除くと、λＩＴＸを結４し
ｆＣ，Ｈ８Ａ（４−２）を含有する溶液３．４０ｍが得
られた。

回収液中に有られたタンパク質及び、ＭＴ＞の濃度は２
つの波長、即ち２８０ｎｍと３０’ｉｎｍにおける吸収
を測定し、イ井られた値を同１２波長に対する非修飾Ｈ
＄Ａおよび非修飾ＭＴ）の吸光度に関連づけて決定した
。

次に、ＩＳＡ分子に再生したチオール基の姿は、実施例
３−（ハ）の手順に従ってＤＴＮＢ法１決定した。以上
の結果、回収液中に得られプ蛋白質ｔけ９．８ｍｆ、　
　Ｈ８Ａ８Ａに結合したＭＴ）は１２．４分子、再生し
たＨ８Ａのチオール基れζ　　　平均０６６９個と決定
され、従って、得られたＭＴＸ残基を結合したＩＳＡは
４−芝のごとくに二　　（） Ｌ　　　　　　　　　　　４−之 ）４−ｅう一？Ｌ／イミド基を含有すルＦ　（ａ　ｌ＞
’　）２　　トＭＴＸ結合Ｈ３Ａの反応によるゆ合体（
４−ａ）ｅ　　　　　の調製 実施例４−（イ）で得られた式４−入で表わされるマレ
イミド基が一平均２．１個導入されたＦ（ａｂ’）２　
　の０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液−０，１Ｍ　Ｎ
ａＣｔ（ＰＨ６，５）の溶液１．０ｍｇに、３−（ロ）
で得られた式３−２で表わされるＭＴＸ残基を平均１２
．４個結合ｊ〜だＨ８Ａを含有するり０．９％ＮａＣ１
−、１ｍＭＥＤＴＡ溶液２．ｏｍｌを４℃で混合し、１
夜反一応せしめた。

反応液をＳＤＳ電気泳動によシ調べると、生成物は、Ｆ
（ａｂ’）２　にＭＴＸ結合Ｈ８Ａが１〜３個ｔ　　　
結合した、式４−３で表わされる複合体を主放物とする
ことが判明した。セファデックスＧ−１５０スーパーフ
アインのカラム（１，５Ｘ　８０　ｃｍ　）を用いるこ
とにより、複合体を精ブ！した。

４−に）Ｌ１２１０細胞に対する複合体（４−見）の細
胞毒性 上記４−０９の如くして荘られた複合体（４−３）の標
的細胞ＬＬ２１０に対する細胞毒性を検討した。

２４穴の培養プレートに、５　Ｘ　１０部個のＬ１２１
０細胞を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％牛脂児血ｒ
Ｌ２ｏｐＭの２−メルカプトエタノールとＱ、１１１１
ｐ／−のカナマイシンを含む）０．９ｍｌを分注し、更
に種々の濃度の被検サンプル０．１ｍｌを加え、５％Ｃ
０２雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリバンプル
ー染色法によυ生細胞数を測定した。

その結果、第１表に示す如く、複合体（４Ａ）は、標的
細胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に著しい細胞増殖抑制
効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその平均
で示した。

第１表 実施例５ 実に例４で用いたＭＣＡＢの代わりに、ＳＭＢをを用い
、その他は実施例３の場合と同様にして、フラグメント
Ｆ（ａｂ’）２　　と、ＭＴＸ結合）■ＳＡが、それぞ
れアミン基とチオール基にて、架橋剤ＳＭＢを介して結
合している抗腫瘍性複合体を得た。

６−＾ ６−芝 ６−（イ）ＩｇＧへ活性ジスルフィド基の導入（５−尤
の調製） 上記参考例１−（ホ）で得られた、マウスモノクｏ　−
：／　ＩｇＧ２ｂ抗体２０７９を０．１　Ｍリン酸緩衝
液−０，Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔｖＰ　（ｐＨ７，５）　１．
Ｏｍｌに溶解し、Ｎ−サクシイミジル−３−（２−ピリ
ジルチオ）プロピオネート（以下５ＰＤＰと省略する）
のｌ　ＯＯｍＭＤＭＦ　　溶液８．Ｏｐｌを室温下に加
え、３０分間ゆっくり撹拌したのち、セファデックスＧ
−２５の力７ム（１，ＯＸ３０　ｃｍ、　　０．１　Ｍ
リン酸緩衝液−０、１Ｍ　ＮａＣｔ。

ＰＨ６，５）に通し、低分子を除くと、活性ジスルフィ
ド、基が導入されたマウスＩｇＧ　（６−よ）の溶液７
．５ｒ／！が得られた。

かくして得られた溶液中のＩｇＧの量は、２８０ｈｍの
吸光度より求めたところ１８■であった。ＩｇＧに導入
された活性ジスルフィド基の数は以下の手順で定量した
。

溶液の１部を同−緩衝液で希釈ｊ、２８０ｎｍの吸光度
より、先づＩｇＧのモル濃度を求めた。

次いで、溶液に過剰の２−メルカプトエタノールを加え
、１分間放置の後遊離した２−メルカプトピリジンに由
来する３４３ｎｍの吸光度を測定することにより、活性
ジスルフィド基の濃度を求めた。これらの比より弐６−
１で表わされる生成物においては、ＩｇＧ分子に平均３
．７個の２−ピリジルジチオ基が導入されていることを
決定した。

６−（ロ）活性ジスルフィド含有Ｉ　ｇＧ２　ｂとＡｔ
ａＮＵ　結合Ｈ８Ａ（６−２）の反応にょる夕合体（６
−邊）の調製 上記６−（イ）で得られた、２−ピリジルジチオ基を平
均３．７個含有するＩｇＧの溶液０．５−に、実施例３
−（ロ）と全く同じ手順で調製した弐６−２で表わされ
るニトロソウレア基を結合した人血清アルブミン５．３
■の溶液（０゜９％　ＮＡＣ４−１ｒｎＭＥＤＴＡ溶液
）１．ｓ７を混合し、４℃で１夜反応した。反応液を５
Ｉ）Ｓ電気泳動で調へると、生成物は、ニトロソウレア
基結合ＩＳＡが１〜３個結結合た式６〜３で表わされる
複合体を主成物とすることが判明した。

セファデックスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（
１，５Ｘ　８０Ｃｒｎ）　’；ｃ用いることにより、複
合体を′ｌ′ｆｉ製した。

６−　Ｃ′ｌ　ＭＭ４６細胞に対する複合体（６−３）
の測胞毒性 上記６−（ロ）の如くして得られた複合体（６−見）の
標的細胞Ｌ１２１０に対する細胞毒性を検討した。

９６穴の培養プレートに、５×１０３個のＭＭ４６細胞
を含むＲＰＭＩ　１６．４０培地（１ｏ％牛脂児血清、
２０μＮ丁の２−メルカプトエタノールとＯｏｌ　ｍｙ
　／　ｍｌのカナマイシンを含む）０．２−を分注し、
更に棹々の洟度の被検サンプル２０μｔを加え、５裂Ｃ
Ｏ２雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリパップル
ー染色法により生能１括数を測定した。

その結果、第１表に示す如く、谷合体（６−ユ）は、標
的細胞へＩＭ４６に対し濃度依存的に著しい細胞増殖抑
制効果を示した。尚、培養け２系列行ない、値はその平
均で示した。

第１表 実施例７ ７−兄 （７−エ）＋（７−芝）□→ ７−ゑ ７−（イ）マレイミド基を含有するＦ（ａｂ’）２の調
製上記参考例１−（ロ）で得られたウサギＦ（ａｂ’）
２２０　Ｗｌｑを０．１Ｍリン酸緩緩衝−０，１Ｍ　Ｎ
ａＣ／−（ｐＨ７，０）　１．０　ｍｌの溶液とし、こ
れにＳＭＨの１００　ｍＭＤｌｖＩＦ　　溶液２０ｐｌ
を室温下に加え、３０分間ゆっくり撹拌したのち、素速
くセファデックスＧ−２５のカラム（１，ＯＸ　３０　
ｃｍ。

０．１Ｍリン酸緩緩衝−０，１Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ６，
５）に通し、低分子を除くと、ＳＭＢ化されたウサギＩ
ｇＧを含む溶液６．７コが得られた。

かくして得られた溶液に含有されるＳＭＢ化Ｆ（ａｂ’
）２　　（７１）の蛋白質量は２８０ｎｍの吸光度より
求めたところ１６．１■であっプこ。

Ｆ（ａｂ’）２　　分子に導入されたマレイミド基の数
は、実施例２−（イ）におけるＳＭＢ化ＩｇＧの定量と
全く同じ手順でこれを決定した結果、平均２．４個でち
った。

７−（ｏ）　マレイミド基を含有するＦ（ａｂ’）２（
７−１）と？ｖ１ＭＣ結合ＢＳＡ（７−２）の反応によ
る複合体（６−３）の調製 上記７−（イ）で得られたマレイミド基を平均２．４個
含有するＦ　（ａ　ｂ’　）２　　の溶液（０，１Ｍリ
ン酸Ｍ衡Ｗ　−０，１Ｍ　ＮａＣ１、ＩＩＨ６，５）　
２．、Ｏ艷と、実施例２−０９と全く同様にして得られ
た、ｈｓＭｃ　？：平平均８．例 溶液（　０．０　１　Ｍ　Ａｃ０Ｎａ　−　０．１　４
　Ｍ　ＮａＣ１．　−０、０　１　ｒｎＭＥＤＴＡ　、
　ｐ）Ｔ　５．２　５）　２．８　ｍｅを混合し、４℃
で１夜反応せしめた。反応液をＳＤＳ電気泳動で調べる
ことにより、生成物はＦ　（　ａｂ’　）２にＭＭＣ結
合ＢＳＡが１〜２個結結合た複合体（７−３）を主成分
とすることが判明した。

セファデックスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（
　１．ａ　ｘ　ｓ　ｏ　ｃＴｎ．）を用いることにより
、複合体を精製した。

７−（６’）ｒ，１２１ｏ　ａ胞ＫＮｆ　６８合体（７
−３）の細胞毒性 上記７−（口）の如くして得られた複合体（７−芝）の
標的細胞し１２１０　ｉＣ対する細胞毒性を検討した。

２４大の培養プレートに、５　Ｘ　１　０’個のＬ１２
１０細胞を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０チ牛脂児血
清．２０μＭの２−メルカプトエタノールと０，１■／
　ｍＡのカナマイシンを含む）０．９−を分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル０、１ゴを加え、５チＣへ雰
囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリパンブルー染色
法により生細胞数を測定した。

その結果、第１表に示す如く、複合体７−見は、標的細
胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に著しい細胞増殖抑制効
果を示した。尚、培養け２系列行ない、値はその平均で
示した。

第　　１　　表 実施例 実施例２で用いたＳＭＢの代わりに、ＭＣＡＥを用い、
その他は実施例２の場合と同様にして、ＩｇＧとＭＭＣ
結合ＵＳＡが、それぞれアミノ基とチオール基にて架橋
剤ＭＣＡＥを介して結合している抗ｊ１Φ瘍性複合体を
得た。

実施例 実施例３で用いたＳＭＢの代わりにＭＣＡＥを用い、そ
の他は実施例３の場合と同様にして、ＩｇＧとニトロソ
ウレア結合Ｈ８Ａが、それぞれアミノ基とチオール基に
て、架橋剤ＳＭＢを介して結合している抗腫瘍性複合体
を得た。

実施例１０ １　０−＾ １　０　−　２ （　１０−１　）＋（　１　０−２　）−ラ１　０　−
　３ 参考例１−Ｐｅで得られたウサギＩｇＧの７ラグメント
Ｆａｂ’　１　３．０　”ｆを含む溶液（　５　ｍＭＡ
ｃＯＮａ　−０、１　４　Ｍ　ＮａＣ２，　ｐＨ　５．
５，以下緩衝液Ａと省略する）１．５艷に、Ｎ，Ｎ’−
０−フェニレンジマレイミド（以下ＰＤＡと省略する）
の飽和溶液（溶傳は、緩衝液Ａ）１．５ａｌｌを加えて
室温中で３０分間反応させ、過剰試薬をセファデックス
Ｇ−２　ｓ　（　ｏ．ａ　Ｘ　４　４α，緩衝液Ａ）に
より除去して、式１０−先で表わされるマレイミド基を
含有するＦａｂ’を含む溶液８．６ｍｅを得た。

一方、式１０−２で表わされるＭＭＣを平均９．６個結
合したＩＳＡを、実施例２におけると同じ方法で、ただ
しＢＳＡの代りにＩＳＡを用いることによりこれを評判
した。なお該Ｈ８Ａの含有するチオール基の定量値は実
施例２におけると同様ＶＣ定緻し７た結果０．７２個で
あった。該ＭＭＣ結合Ｈ３Ａ　ｆ　７．９　ｍｔ、＋含
有する溶液（０，０１ＭＡｃＯＮａ−０，１４Ｍ　Ｎａ
Ｃ／、　　−０，０１ｒｎＭＥＤＴＡ（ｐＨ５，２５）
）２．０１ｔ：ｌ！、を上記の式１０−１で表わされる
マレイミド基を含有するＦｅｂ’の溶ａ２．０ｎにに混
合１−１４℃で一夜反応せしめた。反応液をＳＤＳ　Ｋ
気泳動により調べると、生成物は、Ｆａｂ’にＢＳＡが
結合した式】０−３で表わされるトへ）合体を含有する
ことが判明した。セファデックスＧ−１５０スーパーフ
アインのカラム（１，ｓ　ｘ　８０ｍ）を用いると、！
−（τより複合体を精製した。

実施例１１ 火砲例１０で用いた架橋を１ｊｒ’Ｄλ１の代わり（′
ｉ：、架橋剤Ｎ、Ｎ’−ビス（マレイミドメチル）エー
テル（以下ＢＭＥと省略する）（ダブリュービーフリー
ドベルブら（Ｗ、Ｂ、　Ｆｒｃｅｄｂｅｒｇ　）、　ジ
ャーナルオブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｕｒ
ｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　）　　第２４６巻、第１４４９〜１４５９貞、１）
７１年参照少を用い、その他は実施例１０の場合と同様
にして、フラグメントＦｅｂ’と、ＭＭＣｉｆ；’ｉ合
Ｈ−８Ａがそれぞれのチオール基特許出願人　帝人株式
会社 １９６−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　殺すべき細胞のもっている特定の抗原と特異的に結
   合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、細
   胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミンを、共有結合
   させてなる細胞毒性複合体。 ２、　血清アルブミンが人または牛の血清アルブミンで
   ある、特許請求の範囲第１項記載の細胞毒性複合体。 ３　下記式ＣＩ） Ａｂ＋Ｂ、　−Ｓ、　−ｋｌそＮＨ−Ｃ７））　　・・
   ・・・・・・・　ＣＩ）　　ｎ で表わされる、特許請求の範囲第１項および第２項記載
   の＃ｉ胞伊性複合体。 ｔ、　下記式［ＴＴ’） ・・・・・・ＣＩＩ） で表わされる、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
   項記載のＭＩ胞青性複合体。 ５、　下記式［ｎＤ で表わをれる、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
   項記載の細胞毒性複合体。 ６　発生または導入したチオール基を有する下記式［Ｉ
   Ｖ］ で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
   、下記式〔Ｖ〕 Ｘ５ｌ−Ａｔ＋ＮＨ−Ｃｙ）・・・・・・・・・・・・
   〔ｖ〕で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスル
   フィド基を有する血清アルブミンを反応せしめることを
   特徴とする、下記式［：Ｉ［−１１で表わてくれる細胞
   毒性複合棒の製造汐。 ７　誘導まだは導入した活性ジスルフィド基を有する下
   記式いり〕 で表わさねる免疫クロプリン′またはフラグメントと、
   下記式〔〜１１１〕 Ｈ８，−ＡＡ−４−ＮＨ−Ｃｙ　）ｍ　　　　　・・・
   ・・・・・・匡〕で表わされる細胞毒性物質を結合した
   血清アルブミンを反応せしめることを特徴とする、前記
   式［ＩＴ−ｔ〕で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ８　前記式ＩＪＶ］で表わされる発生または導入したチ
   オール基を有する免疫グロブリン捷たはそのフラグメン
   トと、前記式ＣＶｌ＋３で表わされる細胞毒性物質を結
   合した血清アルブミンを、チオール基と反応し得る官能
   基を２個有する加橋剤を用いて結合することを特徴とす
   る、下記式（Ｉｆ−２：］ で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ９　前記式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合した
   血清アルブミンと、下記式〔■〕で表わされる導入され
   たマレイミド基をもつ免疫グロブリンまたばそのフラグ
   メントを反応せしめることを特徴とする、前記式［：ｌ
   Ｔ＋）で表わされる１細胞稀性複合体の製造法。