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JP4942906B2 - 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法 Download PDF

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JP4942906B2 JP2002512217A JP2002512217A JP4942906B2 JP 4942906 B2 JP4942906 B2 JP 4942906B2 JP 2002512217 A JP2002512217 A JP 2002512217A JP 2002512217 A JP2002512217 A JP 2002512217A JP 4942906 B2 JP4942906 B2 JP 4942906B2
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Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、卵巣癌の治療に関する。本発明は、より詳細には、卵巣癌タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリペプチドを特異的に認識する抗体および免疫系細胞に関する。このようなポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体および細胞は、卵巣癌の処置のためのワクチンおよび薬学的組成物において使用され得る。
【０００２】
（発明の背景）
卵巣癌は、米国および全世界において女性についての重大な健康問題である。この癌の検出および治療においての進歩がなされたが、現在利用可能な、予防または処置のためのワクチンも他の普遍的に首尾よい方法もない。現在、この疾患の対応は、早期の診断および積極的な処置の組み合わせに依存しており、この積極的な処置としては、手術、放射線治療、化学療法およびホルモン療法のような種々の処置の１つ以上が挙げられ得る。特定の癌についての処置の過程は、しばしば、種々の予後パラメータ（特定の腫瘍マーカーの分析を含む）に基づいて選択される。しかし、確立されたマーカーの使用は、しばしば、理解が困難な結果をもたらし、そして多くの癌患者において高い死亡率が観察され続けている。
【０００３】
免疫治療は、癌の処置および生存を実質的に改善する可能性を有する。このような治療は、卵巣癌抗原に対する免疫応答の生成または増大を含み得る。しかし、現在まで、比較的少数の卵巣癌抗原しか知られておらず、そしてこのような抗原に対する免疫応答の生成は、治療的に有利であるとは示されていない。
【０００４】
従って、卵巣腫瘍抗原を同定するための改善された方法、および卵巣癌の治療におけるこのような抗原の使用についての必要性が当該分野に存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【０００５】
（発明の要旨）
簡単に述べると、本発明は、癌（例えば卵巣癌）の治療のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチド、またはその改変体（これは、卵巣癌タンパク質に特異的な抗血清と反応するこの改変体の能力が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる）を提供する。特定の実施形態において、この卵巣癌タンパク質は、配列番号４５６〜４５７、４６０〜４７７および５１２〜５７０からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列、ならびにこのようなポリヌクレオチドの相補体によってコードされる配列を含む。
【０００６】
本発明はさらに、上記のポリペプチドまたはその部分をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、配列番号３９４〜４５５、４５８〜４５９、４７８〜５１１、および５７１〜５９６に列挙される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【０００８】
他の局面において、本発明は、薬学的組成物およびワクチンを提供する。薬学的組成物は、以下：（ｉ）卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチド、もしくはその改変体（これは、卵巣癌タンパク質に特異的な抗血清と反応するこの改変体の能力が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる）、ここで、この卵巣癌タンパク質は、配列番号４５６〜４５７、４６０〜４７７および５１２〜５７０のいずれか１つに列挙される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含み、または（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）このようなポリペプチドに特異的に結合する抗体；（ｉｖ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、ならびに／あるいは（ｖ）このようなポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞、の１つ以上と組み合わせて、生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含み得る。ワクチンは、以下：（ｉ）卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチド、もしくはその改変体（これは、卵巣癌タンパク質に特異的な抗血清と反応するこの改変体の能力が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる）、ここで、この卵巣癌タンパク質は、配列番号３９４〜４５５、４５８〜４５９、４７８〜５１１、および５７１〜５９６に示されるアミノ酸配列、もしくは配列番号４５６〜４５７、４６０〜４７７および５１２〜５７０のいずれか１つに列挙される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、または（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）このようなポリペプチドに特異的に結合する抗体によって特異的に結合される、抗イディオタイプ抗体；（ｉｖ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、ならびに／あるいは（ｖ）このようなポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞、の１つ以上と組み合わせて、非特異的免疫応答エンハンサーを含み得る。
【０００９】
本発明はさらに、他の局面において、上記の少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
関連する局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物が提供される。
【００１１】
他の局面において、非特異的免疫応答エンハンサーと組み合わせて、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンがさらに提供される。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発症を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記の薬学的組成物またはワクチンを患者に投与する工程を包含する。
【００１３】
本発明はさらに、他の局面において、Ｔ細胞の刺激および／または拡大のための方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞を、（ａ）卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチド、もしくはその改変体（これは、卵巣癌タンパク質に特異的な抗血清と反応するこの改変体の能力が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる）、ここで、この卵巣癌タンパク質は、配列番号３９４〜４５５、４５８〜４５９、４７８〜５１１、および５７１〜５９６に示されるアミノ酸配列、もしくは配列番号４５６〜４５７、４６０〜４７７および５１２〜５７０のいずれか１つに列挙される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む；（ｂ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに／あるいは（ｃ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞と、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる工程を包含する。このようなポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または抗原提示細胞は、哺乳動物におけるＴ細胞の刺激および／または拡大における使用のための薬学的組成物またはワクチン内に存在し得る。
【００１４】
他の局面において、本発明は、患者における卵巣癌の発症を阻止するための方法を提供し、この方法は、上記のように調製されたＴ細胞を患者に投与する工程を包含する。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、患者における卵巣癌の発症を阻止するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：（ｉ）卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチド、もしくはその改変体（これは、卵巣癌タンパク質に特異的な抗血清と反応するこの改変体の能力が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる）、ここで、この卵巣癌タンパク質は、配列番号４５６〜４５７、４６０〜４７７および５１２〜５７０のいずれか１つに列挙される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上と共に、患者から単離したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞をインキュベートし、その結果、Ｔ細胞が増殖する工程；ならびに（ｂ）増殖したＴ細胞の有効量をこの患者に投与して、そしてこれによってこの患者における卵巣癌の発症を阻止する工程。この増殖した細胞は、この患者への投与の前にクローニングされ得る。
【００１６】
本発明はまた、他の局面において、分泌された腫瘍抗原を同定するための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）腫瘍細胞を、免疫不全哺乳動物に移植する工程；（ｂ）血清への腫瘍抗原の分泌を可能にするのに十分な時間の後に、この免疫不全哺乳動物から血清を得る工程；（ｃ）免疫応答性哺乳動物を、この血清で免疫する工程；（ｄ）この免疫応答性動物から抗血清を得る工程；および（ｅ）この抗血清を用いて腫瘍発現ライブラリーをスクリーニングし、そしてそれから、分泌された腫瘍抗原を同定する工程。分泌された卵巣癌抗原を同定するための好ましい方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＳＣＩＤマウスに卵巣癌細胞を移植する工程；（ｂ）血清への卵巣癌抗原の分泌を可能にするのに十分な時間の後に、このＳＣＩＤマウスから血清を得る工程；（ｃ）免疫応答性マウスをこの血清で免疫する工程；（ｄ）この免疫応答性マウスから抗血清を得る工程；および（ｅ）この抗血清を用いて卵巣癌発現ライブラリーをスクリーニングし、そしてそれから、分泌された卵巣癌抗原を同定する工程。
【００１７】
本発明はまた、Ｏ８Ｅポリクローナル抗血清によって認識される抗体エピトープを開示し、このエピトープは、本明細書中に配列３９４〜４１５として示される。
【００１８】
さらに、ＨＬＡ−０２０１に結合すると予想される１０マーおよび９マーのペプチドが本発明によって開示され、このペプチドは、それぞれ、配列番号４１６〜４３５および配列番号４３６〜４５５として本明細書中に開示される。
【００１９】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかとなる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々が個別に援用されるように、その全体において本明細書中で参考として援用される。
【００２０】
本発明の別の局面において、本出願人らは、予想外にも、Ｏ７７２Ｐをコードする遺伝子の５’末端において、一連の新規な反復する配列エレメントを同定した。従って、本発明は、Ｘｎ−Ｙによって表される構造を有するＯ７７２Ｐポリペプチドを提供し、ここで、Ｘは、配列番号５９６に示されるＯ７７２Ｐ反復配列と少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。Ｙは、代表的には、配列番号５９４に示されるＯ７７２Ｐ定常領域配列と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。この実施形態によれば、ｎは、一般に、１〜３５の整数であり、好ましくは１５〜２５の整数であり、そしてＸは、同じかまたは異なり得る。
【００２１】
１つの好ましい実施形態において、Ｘは、配列番号５７４〜５９３のいずれか１つからなる群より選択される配列を含み、そしてＹは、配列番号５９４に示される配列を含む。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、例示的なＯ７７２Ｐポリペプチドは、２０個反復する配列エレメント（すなわち、Ｘ２０）を含む、配列番号５９５に示される配列を含み、ここで、Ｘエレメントは、以下の順序で配置される（Ｏ７７２Ｐ反復領域のＮ末端からＣ末端へと移動する）：配列番号５７４−配列番号５７５−配列番号５７６−配列番号５７７−配列番号５７８−配列番号５７９−配列番号５８０−配列番号５８１−配列番号５８２−配列番号５８３−配列番号５８４−配列番号５８５−配列番号５８６−配列番号５８７−配列番号５８８−配列番号５８９−配列番号５９０−配列番号５９１−配列番号５９２−配列番号５９３。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、構造Ｘｎ−Ｙを有するＯ７７２Ｐポリヌクレオチドが提供され、ここで、Ｘは、配列番号５１２〜５４０、５４２〜５４６および５４８〜５６７のいずれか１つからなる群より選択されるＯ７７２Ｐ反復配列エレメントを含む。Ｙは、一般に、配列番号５６８に示されるＯ７７２Ｐ定常領域配列と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。この実施形態において、ｎは、代表的には、１〜３５の整数であり、好ましくは１５〜２５であり、そしてＸは、同じかまたは異なり得る。
【００２４】
別の実施形態において、例示的なＯ７７２Ｐポリヌクレオチドは、２０個反復する配列エレメント（すなわち、Ｘ２０）を含む、配列番号５６９に示される配列を含む。
【００２５】
本発明の別の局面に従って、配列番号４９０〜５１１のいずれか１つに示される抗体エピトープ配列を少なくとも含むＯ７７２ポリペプチドが提供される。
【００２６】
本発明の別の局面に従って、配列番号３９４〜４１５のいずれか１つに示される抗体エピトープ配列を少なくとも含むＯ８Ｅポリペプチドが提供される。
【００２７】
（配列識別子の簡単な説明）
配列番号１〜７１は、図１Ａ〜１Ｓに示される卵巣癌抗原ポリヌクレオチドである。
配列番号７２〜７４は、図２Ａ〜２Ｃに示される卵巣癌抗原ポリヌクレオチドである。
配列番号７５は、卵巣癌ポリヌクレオチド３ｇ（図４）である。
配列番号７６は、卵巣癌ポリヌクレオチド３ｆ（図５）である。
配列番号７７は、卵巣癌ポリヌクレオチド６ｂ（図６）である。
配列番号７８は、卵巣癌ポリヌクレオチド８ｅ（図７Ａ）である。
配列番号７９は、卵巣癌ポリヌクレオチド８ｈ（図７Ｂ）である。
配列番号８０は、卵巣癌ポリヌクレオチド１２ｅ（図８）である。
配列番号８１は、卵巣癌ポリヌクレオチド１２ｈ（図９）である。
配列番号８２〜３１０は、図１５Ａ〜図１５ＥＥＥに示される卵巣癌抗原ポリヌクレオチドである。
配列番号３１１は、卵巣癌ポリヌクレオチドＯ７７２Ｐの全長配列である。
配列番号３１２は、Ｏ７７２Ｐアミノ酸配列である。
配列番号３１３〜３８４は、卵巣癌抗原ポリヌクレオチドである。
配列番号３８５は、２１０１３と示されるクローンＯ７７２Ｐの形態のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号３８６は、２１００３と示されるクローンＯ７７２Ｐの形態のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号３８７は、２１００８と示されるクローンＯ７７２Ｐの形態のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号３８８は、配列番号３８５に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３８９は、配列番号３８６に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３９０は、配列番号３８７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３９１は、卵巣癌ポリヌクレオチドＯ８Ｅの全長配列である。
配列番号３９２〜３９３は、Ｏ８Ｅによってコードされるタンパク質配列である。
配列番号３９４〜４１５は、ＯＥ８抗体エピトープに対応するペプチド配列である。
配列番号４１６〜４３５は、ＯＥ８由来の全長オープンリーディングフレームを使用して推定された、潜在的ＨＬＡ−Ａ２ １０マー結合ペプチドである。
配列番号４３６〜４５５は、ＯＥ８由来の全長オープンリーディングフレームを使用して推定された、潜在的ＨＬＡ−Ａ２ ９マー結合ペプチドである。
配列番号４５６は、Ｏ７７２Ｐに対して相同性を示す全長Ｇｅｎｂａｎｋ配列の、短縮型ヌクレオチド配列である。
配列番号４５７は、Ｏ７７２Ｐに対して有意な相同性を示す全長Ｇｅｎｂａｎｋ配列である。
配列番号４５８は、Ｏ７７２Ｐに対して相同性を示す全長Ｇｅｎｂａｎｋ配列の短縮バージョンをコードするタンパク質である。
配列番号４５９は、Ｏ７７２Ｐについてのタンパク質配列に対して有意な相同性を示すＧｅｎｂａｎｋ由来の全長タンパク質配列である。
配列番号４６０は、残基１〜７０に含まれるＯ７７２Ｐの独特のＮ末端部分をコードする。
配列番号４６１は、配列番号４５６の残基１〜３１３をコードする独特の配列を含む。
配列番号４６２は、クローンＯ７７２Ｐについての仮想配列である。
配列番号４６３は、クローンＦＬＪ１４３０３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６４は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６５は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６６は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６７は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６８は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６９は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７０は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７１は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７２は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７３は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７４は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７５は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７６は、クローンＯ７７２Ｐについての部分的ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７７は、卵巣腫瘍抗原Ｏ７７２Ｐの新規な５’末端を表す。
配列番号４７８は、配列番号４６２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４７９は、配列番号４６３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４８０は、配列番号４７２によってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８１は、配列番号４７１の可能なオープンリーディングフレームによってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８２は、配列番号４７１の可能な第２のオープンリーディングフレームによってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８３は、配列番号４６７によってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８４は、配列番号４６６の可能なオープンリーディングフレームによってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８５は、配列番号４６６の可能な第２のオープンリーディングフレームによってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８６は、配列番号４６５によってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８７は、配列番号４６４によってコードされる部分的アミノ酸配列である。
配列番号４８８は、Ｏ７７２Ｐの細胞外領域、膜貫通領域、および細胞質領域を表す。
配列番号４８９は、Ｏ７７２Ｐの推定細胞外ドメインを表す。
配列番号４９０は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃２のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９１は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃６のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９２は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃７のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９３は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃８のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９４は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃９のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９５は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃１１のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９６は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃１３のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９７は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃２２のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９８は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃２４のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９９は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃２７のアミノ酸配列を表す。
配列番号５００は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃４０のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０１は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃４１のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０２は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃４７のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０３は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃５０のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０４は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃５１のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０５は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃５２のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０６は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃５３のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０７は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃５８のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０８は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃５９のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０９は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃６０のアミノ酸配列を表す。
配列番号５１０は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃６１のアミノ酸配列を表す。
配列番号５１１は、Ｏ７７２Ｐ特異的抗体エピトープに対応する、ペプチド＃７１のアミノ酸配列を表す。
配列番号５１２（Ｏ７７２Ｐ反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１３（Ｏ７７２Ｐ反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１４（Ｏ７７２Ｐ反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１５（Ｏ７７２Ｐ反復４）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１６（Ｏ７７２Ｐ反復５）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１７（ＨＢ反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１８（ＨＢ反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５１９（ＨＢ反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２０（ＨＢ反復４）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２１（ＨＢ反復５）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２２（ＨＢ反復６ ５’末端）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１６に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２３（１０４３４００．１反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２４（１０４３４００．１反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２５（１０４３４００．１反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１０／１１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２６（１０４３４００．１反復４）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２７（１０４３４００．１反復５）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１４に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２８（１０４３４００．１反復６）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５２９（１０４３４００．３反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３０（１０４３４００．３反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３１（１０４３４００．５反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３２（１０４３４００．５反復２）は、イントロン配列を含むことに加えて、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３３（１０４３４００．５反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３４（１０４３４００．８反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３５（１０４３４００．８反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３６（１０４３４００．８反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３７（１０４３４００．９反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数４に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３８（１０４３４００．９反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数５に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５３９（１０４３４００．９反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４０（１０４３４００．９反復４）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４１（１０４３４００．１１反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４２（１０４３４００．１１反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４３（１０４３４００．１１反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数３に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４４（１０４３４００．１１反復４）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４５（１０４３４００．１１反復５）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１２に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４６（１０４３４００．１２反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４７（ＰＢ反復Ａ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４８（ＰＢ反復Ｂ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５４９（ＰＢ反復Ｅ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数３に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５０（ＰＢ反復Ｇ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数４に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５１（ＰＢ反復Ｃ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数４に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５２（ＰＢ反復Ｈ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数６に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５３（ＰＢ反復Ｊ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５４（ＰＢ反復Ｋ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５５（ＰＢ反復Ｄ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５６（ＰＢ反復Ｉ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５７（ＰＢ反復Ｍ）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５８（ＰＢ反復９）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１２に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５５９（ＰＢ反復８．５）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１３に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６０（ＰＢ反復８）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１４に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６１（ＰＢ反復７）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１５に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６２（ＰＢ反復６）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１６に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６３（ＰＢ反復５）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１７に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６４（ＰＢ反復４）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１８に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６５（ＰＢ反復３）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数１９に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６６（ＰＢ反復２）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２０に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６７（ＰＢ反復１）は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域からの反復数２１に対応するｃＤＮＡ配列の例を表す。
配列番号５６８は、３’定常領域由来のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号５６９は、２１反復のコンセンサス配列、３’定常領域および３’非翻訳領域を含むｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号５７０は、コンセンサス反復配列のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号５７１は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１の潜在的オープンリーディングフレームのコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７２は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１の第２の潜在的オープンリーディングフレームのコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７３は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１の第３の潜在的オープンリーディングフレームのコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７４は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数２のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７５は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数３のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７６は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数４のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７７は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数５のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７８は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数６のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５７９は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数７のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８０は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数８のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８１は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数９のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８２は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１０のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８３は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１１のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８４は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１２のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８５は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１３のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８６は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１４のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８７は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１５のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８８は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１６のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５８９は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１７のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５９０は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１８のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５９１は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数１９のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５９２は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数２０のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５９３は、Ｏ７７２Ｐの５’可変領域由来の反復数２１のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号５９４は、３’定常領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号５９５は、２１反復のコンセンサス配列および３’定常領域を含むアミノ酸配列を表す。
配列番号５９６は、コンセンサス反復配列のアミノ酸配列を表す。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、一般に、癌（例えば、卵巣癌）の治療のための組成物および方法に関する。本明細書中に記載される組成物は、免疫原性ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドに結合する結合因子（例えば、抗体）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）を含み得る。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、一般に、卵巣癌タンパク質またはその改変体の、少なくとも免疫原性部分を含む。特定の卵巣癌タンパク質が、イムノアッセイ技術を使用して同定されており、そして本明細書中で卵巣癌抗原といわれる。「卵巣癌抗原」は、正常な卵巣細胞におけるレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで、卵巣腫瘍細胞（好ましくは、ヒト細胞）によって発現されるタンパク質である。特定の卵巣癌抗原は、ヒト卵巣腫瘍を移植した免疫不全動物由来の血清に対して生成された抗血清と検出可能に反応する（ＥＬＩＳＡまたは薄端ブロットのようなイムノアッセイにおいて）。このような卵巣癌抗原は、卵巣腫瘍からこの免疫不全動物の血清へと放出（ｓｈｅｄ）または分泌される。従って、本明細書中で提供される特定の卵巣癌抗原は、分泌抗原である。本願発明の特定の核酸配列は、一般に、このようなポリペプチドの全てまたは一部をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むか、あるいはこのような配列に相補的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含む。
【００３０】
本発明はさらに、卵巣腫瘍内での変化した発現を評価するための技術を使用して同定される卵巣癌配列を提供する。このような配列は、ポリヌクレオチド配列またはタンパク質配列であり得る。卵巣癌配列は、一般に、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、卵巣腫瘍において、正常な卵巣組織の発現レベルよりも少なくとも２倍、そして好ましくは少なくとも５倍高いレベルで発現する。特定の部分的卵巣癌ポリヌクレオチド配列が、本明細書中に示される。このようなポリヌクレオチド配列（またはその相補体）を含む遺伝子によってコードされるタンパク質もまた、卵巣癌タンパク質であるとみなされる。
【００３１】
抗体は、一般に、免疫系タンパク質、またはその抗原結合フラグメントであり、これらは、本明細書中に記載される卵巣癌ポリペプチドの少なくとも一部に結合し得る。本明細書中に提供される組成物内で使用され得るＴ細胞は、一般に、このようなポリペプチドに特異的なＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）である。本明細書中に記載される特定の方法は、さらに、本明細書中で提供される卵巣癌ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞またはマクロファージ）を利用する。
【００３２】
（卵巣癌ポリヌクレオチド）
卵巣癌タンパク質またはその一部もしくは本明細書中に記載される他の改変体をコードする任意のポリヌクレオチドが、本発明に含まれる。好ましいポリヌクレオチドは、卵巣癌タンパク質の一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも４５個連続したヌクレオチドを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、卵巣癌タンパク質の免疫原性部分（例えば、卵巣癌抗原）をコードする。任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、そしてＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または固体支持体に連結してもよいが、その必要はない。
【００３３】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、卵巣癌タンパク質またはその一部をコードする内因性配列）を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブの卵巣癌タンパク質と比較して、このコードされたポリペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。このコードされたポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。改変体は、ネイティブの卵巣癌タンパク質またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００３４】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列についてのパーセント同一性は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズム（例えば、デフォルトパラメータを使用するＭｅｇａｌｉｇｎ）を使用して、配列を比較することによって容易に決定され得る。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、または４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列の最適な整列は、例えば、バイオインフォマティックスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。好ましくは、配列同一性のパーセンテージは、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここでこのウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセント同一性は、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出され得る。
【００３５】
改変体はまた、またはあるいは、ネイティブの遺伝子またはその一部あるいは相補体に対して実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチド改変体は、ネイティブの卵巣癌タンパク質（またはその相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
【００３６】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、種々の技術のいずれかを使用して調製され得る。例えば、卵巣癌ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、後期継代卵巣腫瘍を移植したＳＣＩＤマウス由来の血清をこのような免疫応答性マウスに注射した後に、この免疫応答性マウスの血清に対して生成された抗血清で後期継代卵巣腫瘍発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、同定され得る。卵巣癌ポリヌクレオチドはまた、差示的な遺伝子発現を評価するために設計された種々の技術のいずれかを使用して同定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、卵巣腫瘍細胞から調製されたｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、本明細書中に提供される配列に基づいて、配列特異的プライマーが設計され得、そして購入されるかまたは合成され得る。
【００３８】
増幅された部分は、周知の技術を使用して、適切なライブラリー（例えば、卵巣癌ｃＤＮＡライブラリー）から全長遺伝子を単離するために使用され得る。このような技術において、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）は、増幅に適切な１つ以上のポリヌクレオチドプライマーを使用して、スクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーは、より大きな分子を含むようにサイズ選択される。ランダムプライムしたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【００３９】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識によって）標識され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、標識されたプローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限酵素地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【００４０】
あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るための多数の増幅技術が存在する。このような技術において、増幅は、一般に、ＰＣＲを介して実施される。種々の市販のキットのいずれかは、この増幅工程を実施するために使用され得る。プライマーは、例えば、当該分野で周知のソフトウェアを使用して設計され得る。プライマーは、好ましくは２２〜３０ヌクレオチド長であり、少なくとも５０％のＧＣ含有率を有し、そして約６８℃〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングされる。この増幅された領域は、上記のように配列決定され得、そして重複配列が、連続配列へと構築される。
【００４１】
このような増幅技術の１つは、逆ＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内にフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ ９６／３８５９１に記載される。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【００４２】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより利用可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。
【００４３】
卵巣癌抗原の部分をコードするｃＤＮＡ分子の特定の核酸配列は、図１Ａ〜１Ｓ（配列番号１〜７１）および図１５Ａ〜１５ＥＥＥ（配列番号８２〜３１０）において提供される。図１Ａ〜１Ｓに提供される配列は、新規であるようである。図１５Ａ〜１５ＥＥＥ中の配列について、データベース検索によって、実質的な同一性を有する一致が明らかとなった。これらのポリヌクレオチドは、分泌された腫瘍抗原を同定するために設計された技術を使用して、卵巣腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清学的スクリーニングによって単離された。手短に言うと、後期継代卵巣腫瘍発現ライブラリーを、ベクターλ−ｓｃｒｅｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のＳＣＩＤ由来のヒト卵巣腫瘍（ＯＶ９３３４）から調製した。スクリーニングに使用したこの血清は、１つの後期継代卵巣腫瘍を移植したＳＣＩＤマウス由来の血清を免疫応答性マウスに注射することによって得た。この技術によって、分泌された腫瘍抗原の免疫原性部分をコードするｃＤＮＡ分子の同定が可能になる。
【００４４】
本明細書中に列挙されるポリヌクレオチド、ならびにこのような配列を含む全長ポリヌクレオチド、このような全長ポリヌクレオチドの他の部分、およびこのような全長分子の全てまたは一部に相補的な配列は、特に本発明に含まれる。この技術がまた、他の型の腫瘍から分泌された抗原の同定のために適用され得ることも、当業者に明らかである。
【００４５】
卵巣癌タンパク質の部分をコードするｃＤＮＡ分子の他の核酸配列は、図４〜９（配列番号７５〜８１）、ならびに配列番号３１３〜３８４に提供される。これらの配列を、腫瘍関連発現（すなわち、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な卵巣組織よりも少なくとも５倍高い卵巣腫瘍における発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって同定した。このようなスクリーニングを、製造者の指示に従って（そして本質的には、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されるように）、Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して実施した。配列番号３１１および３９１は、これらの特定の核酸配列を組み込む全長配列を提供する。
【００４６】
種々の周知の技術のいずれかが、ｃＤＮＡの腫瘍関連発現を評価するために使用され得る。例えば、標識されたポリヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーション技術が使用され得る。あるいは、またはさらに、リアルタイムＰＣＲのような増幅技術が使用され得る（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１，１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４，１９９６を参照のこと）。リアルタイムＰＣＲは、増幅の間のＰＣＲ産物の蓄積レベルを評価する技術である。この技術によって、複数のサンプル中のｍＲＮＡレベルの定量的評価が可能になる。手短に言うと、ｍＲＮＡが腫瘍から抽出され、そして正常な組織およびｃＤＮＡが、標準的な技術を使用して調製される。リアルタイムＰＣＲは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）７７００ Ｐｒｉｓｍ機器を使用して実施され得る。一致する（ｍａｔｃｈｉｎｇ）プライマーおよび蛍光プローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって提供されるプライマー発現プログラムを使用して、目的の遺伝子について設計され得る。プライマーおよびプローブの最適濃度は、最初に当業者によって決定され得、そしてコントロール（例えば、β−アクチン）プライマーおよびプローブが、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から商業的に入手され得る。サンプル中の特定のＲＮＡの量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドを使用して、並んで標準曲線が作成される。標準曲線は、リアルタイムＰＣＲにおいて決定されたＣｔ値を使用して作成され得、これは、このアッセイにおいて使用される初期ｃＤＮＡ濃度に関連する。目的の遺伝子の１０〜１０６コピーの範囲の標準希釈が、一般に十分である。さらに、標準曲線は、コントロール配列について作成される。これによって、比較目的で、コントロールの量に対する組織サンプルの初期ＲＮＡ含有量の標準化が可能になる。
【００４７】
ポリヌクレオチド改変体は、一般に、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成による化学合成を含む、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。ポリヌクレオチド配列における改変はまた、標準的な変異誘発技術（例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ ２：１８３，１９８３を参照のこと））を使用して導入され得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、卵巣癌抗原をコードするＤＮＡ配列、またはその部分のインビトロまたはインビボでの転写によって生成され得るが、ただし、このＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて、ベクターへと組み込まれる。特定の部分は、本明細書中に記載されるコードされたポリペプチドを調製するために使用され得る。さらに、またはあるいは、部分は、コードされたポリペプチドがインビボで生成されるように、患者に投与され得る。
【００４８】
コード配列に相補的な配列（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）の部分はまた、プローブとして、または遺伝子発現を調節するために使用され得る。アンチセンスＲＮＡへと転写され得るｃＤＮＡ構築物はまた、アンチセンスＲＮＡの生成を促進するために、細胞または組織へと導入され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるように、卵巣癌タンパク質の発現を阻害するために使用され得る。アンチセンス技術は、三重らせんの形成の間の遺伝子発現を制御するために使用され得、この三重らせんの形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために二重らせんが十分に開く能力を損なう（Ｇｅｅら、Ｉｎ Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ；１９９４）を参照のこと）。あるいは、アンチセンス分子は、遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター部位、エンハンサー部位、または転写開始部位）とハイブリダイズし、そしてこの遺伝子の転写をブロックするように；あるいはリボソームへの転写物の結合を阻害することによって翻訳をブロックするように、設計され得る。
【００４９】
任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加するためにさらに改変され得る。可能な改変としては、５’および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいはイノシン、キューオシン、およびワイブトシンのような非伝統的塩基、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、および他の改変形態の包含が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５０】
本明細書中に記載のヌクレオチド配列は、確立された組換えＤＮＡ技術を使用して、種々の他のヌクレオチド配列に結合され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、λファージ誘導体およびコスミドを含む、種々のクローニングベクターのいずれかにクローニングされ得る。特に目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。一般に、ベクターは、少なくとも１つの生物体において機能的な複製起点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望の用途に依存し、そして当業者に明らかである。
【００５１】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞への侵入、およびその中での発現を可能にするように、処方され得る。このような処方物は、以下に記載されるような治療目的のために特に有用である。当業者は、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を達成するための多くの方法が存在することを理解し、そして任意の適切な方法が使用され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、アデノウイルス、アデノアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニア、あるいは他のポックスウイルス（例えば、鳥類ポックスウイルス）のようなウイルスベクターへと組み込まれ得る（しかし、これらに限定されない）。ＤＮＡをこのようなベクターへと組み込むための技術は、当業者に周知である。レトロウイルスベクターは、さらに、（形質導入された細胞の同定または選択を助けるために）選択マーカーについての遺伝子を移入または組み込み得、そして／あるいは、このベクターを標的特異的にするように、ターゲティング部位（例えば、特定の標的細胞上にレセプターのためのリガンドをコードする遺伝子）を移入または組み込み得る。ターゲティングはまた、当業者に公知の方法によって、抗体を使用して達成され得る。
【００５２】
治療目的のための他の処方物としては、コロイド状分散系（例えば、高分子複合体）、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド状の系は、リポソーム（すなわち、人工的な膜小胞）である。このような系の調製および使用は、当該分野で周知である。
【００５３】
（卵巣癌ポリペプチド）
本発明の状況において、ポリペプチドは、少なくとも、卵巣癌タンパク質の免疫原性部分、または本明細書中に記載されるその改変体を含み得る。上記のように、特定の卵巣癌タンパク質は、卵巣腫瘍細胞によって発現され、そしてイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）において、卵巣腫瘍を移植した免疫不全動物由来の血清に対して生成された抗血清と検出可能に反応する卵巣癌抗原である。他の卵巣癌タンパク質は、本明細書中に列挙される卵巣癌ポリヌクレオチドによってコードされる。本明細書中に記載されるポリペプチドは、任意の長さであり得る。ネイティブのタンパク質由来のさらなる配列、および／または異種配列が存在し得、そしてこのような配列は、さらなる免疫原性特性または抗原性特性を有し得る（しかし、その必要はない）。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「免疫原性部分」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合する）抗原の部位である。このような免疫原性部分は、一般に、卵巣癌タンパク質またはその改変体の、少なくとも５アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基を含む。好ましい免疫原性部分は、本明細書中に記載されるように単離されたｃＤＮＡ分子によってコードされる。さらに、免疫原性部分は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに列挙される参考文献に要約される技術）を使用して同定され得る。このような技術は、卵巣癌タンパク質特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることを含む。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、これらが、卵巣癌タンパク質に特異的に結合する（すなわち、これらがＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイにおいて卵巣癌タンパク質と反応し、そして無関係のタンパク質とは反応しない）場合に、「卵巣癌タンパク質特異的」である。このような抗血清、抗体およびＴ細胞は、本明細書中に記載されるように、そして周知の技術を使用して調製され得る。ネイティブの卵巣癌タンパク質の免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおける反応性）よりも実質的に低くないレベルでこのような抗血清、抗体および／またはＴ細胞と反応する部分である。このような免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、全長タンパク質の反応性と同じかまたはそれより高いレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般に、当業者に周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載される方法）を使用して実行され得る。例えば、ポリペプチドは、固体支持体上に固定され得、そして患者の血清と接触されて、この血清内の抗体が固定されたポリペプチドに結合することが可能になる。次いで、未結合の血清が除去され得、そして結合した抗体が、例えば１２５Ｉ−標識されたプロテインＡを使用して検出される。
【００５５】
上記のように、組成物は、ネイティブの卵巣癌タンパク質の改変体を含み得る。ポリペプチド「改変体」は、本明細書中で使用される場合、このポリペプチドの免疫原性が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入においてネイティブの卵巣癌タンパク質と異なるポリペプチドである。言い換えると、卵巣癌タンパク質特異的抗血清と反応する改変体の能力は、ネイティブの卵巣癌タンパク質と比較して、増大し得るかまたは変化しないか、あるいはネイティブの卵巣癌タンパク質と比較して、５０％未満、そして好ましくは２０％未満減少し得る。このような改変体は、一般に、上記のポリペプチド配列の１つを改変し、そしてこの改変されたポリペプチドの、本明細書中に記載されるような卵巣癌タンパク質特異的抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。好ましい改変体としては、１つ以上の位置（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去された改変体が挙げられる。他の好ましい改変体としては、小部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、この成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された改変体が挙げられる。
【００５６】
ポリペプチド改変体は、ネイティブのポリペプチドに対して、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、ポリペプチドの二次構造および疎水的性質が実質的に変化していないことをペプチド化学の当業者が期待するように、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；そして類似の親水性値を有する非荷電性の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。改変体はまた、（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００５７】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【００５８】
ポリペプチドは、種々の周知技術のいずれかを使用して調製され得る。上記のようなＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の種々の発現ベクターのいずれかを使用して、ＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、および高等真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、市販のフィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物を、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【００５９】
約１００アミノ酸未満、そして一般に、約５０アミノ酸未満のアミノ酸を有する部分および他の改変体もまた、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、市販の固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここでは、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【００６０】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の１つのポリペプチドおよび公知の腫瘍抗原（例えば、卵巣癌タンパク質またはこのようなタンパク質の改変体）を含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得る（免疫学的融合パートナー）か、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、タンパク質の精製を容易にする）が挙げられる。
【００６１】
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、発現系において、非融合タンパク質と比較して、増加したレベルの産生を可能にする組換えタンパク質として発現される。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同位相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【００６２】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長した可変コンホメーションを取る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【００６３】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００６４】
無関係の免疫原性タンパク質と共に、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質もまた提供される。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【００６５】
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質のほぼ３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【００６６】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性についての原因である。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ酸末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【００６７】
一般に、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドが単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部でないベクターにクローニングされる場合、単離されているとみなされる。
【００６８】
（結合因子）
本発明は、卵巣癌タンパク質に特異的に結合する因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）をさらに提供する。本明細書において用いる場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、卵巣癌タンパク質と検出可能レベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、そして類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない場合、卵巣癌タンパク質に「特異的に結合する」といわれる。本明細書において用いる場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、複合体が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中で「結合している」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。
【００６９】
結合因子は、本明細書において提供される代表的なアッセイを用いて、癌（例えば、卵巣癌）を有する患者と有さない患者の間でさらに区別され得る。言い換えれば、卵巣癌抗原に結合する抗体または他の結合因子は、疾患を有する患者の少なくとも約２０％において癌の存在を示すシグナルを生成し、そして癌を有さない個体の少なくとも約９０％において疾患が存在しないことを示すネガティブなシグナルを生成する。結合因子がこの要件を満たすか否かを決定するために、癌を有する患者および癌を有さない患者（標準的臨床試験を用いて決定した場合）由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、白血球便乗（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、尿、および／または腫瘍生検）は、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。疾患を有するサンプルおよび疾患を有さないサンプルの、統計的に有意な数のサンプルをアッセイすべきであることが明白である。それぞれの結合因子は、上記の基準を満たすべきであるが；当業者は、結合因子が感受性を改善するために組み合わせて用いられ得ることを認識する。
【００７０】
上記の要件を満たす任意の因子が結合因子であり得る。例えば、結合因子はリボソーム（ペプチド成分を伴うかまたは伴わない）、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、組換え抗体の産生を可能にするために、細胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）によってか、または適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、抗体は産生され得る。１つの技術では、ポリペプチドを含む免疫原は、広範な種々の哺乳動物のいずれか（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）にまず注射される。この工程で、本発明のポリペプチドは、改変なしの免疫原として働き得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合する場合、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合しているポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【００７１】
目的の抗原性ポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上で低密度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００７２】
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注入）が、収量を増大させるために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物を、通常の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製工程において使用し得る。
【００７３】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり得る。このようなフラグメントは、標準的な技術を使用して調製され得るＦａｂフラグメントを含む。手短に言うと、免疫グロブリンを、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィー（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）によってウサギ血清から精製し得、そしてパパインによって消化して、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生し得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る。
【００７４】
本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。この点に関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【００７５】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【００７６】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるためにはたらき得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用（さもなければ、可能ではない）を促進し得る。
【００７７】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【００７８】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【００７９】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【００８０】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【００８１】
抗体および免疫結合体についての投与の種々の経路が使用され得る。代表的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除した腫瘍の基底での投与である。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、腫瘍上の抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変化することは明白である。
【００８２】
卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体もまた、本明細書中で提供される。このような抗体は、卵巣癌タンパク質の免疫原性部分に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントに対して、周知の技術を使用して惹起され得る。卵巣癌タンパク質の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体は、本明細書中に記載されるような卵巣癌タンパク質の免疫原性部分に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントに結合する抗体である。
【００８３】
（Ｔ細胞）
免疫治療組成物はまた、またはあるいは、卵巣癌タンパク質に特異的なＴ細胞を含み得る。このような細胞は、一般的に、標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＣｅｌｌＰｒｏ Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡから入手可能なＣＥＰＲＡＴＥＴＭシステム（米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと））を使用して、哺乳動物（例えば、患者）の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分に存在し（または、それから単離され）得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【００８４】
Ｔ細胞は、卵巣癌ポリペプチド、卵巣癌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、このポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、卵巣癌ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
【００８５】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、卵巣癌ポリペプチドで被覆される標的細胞またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、卵巣癌ポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の卵巣癌ポリペプチド（２００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じるはずであり、そして／または２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ １９９８）を参照のこと）。卵巣癌ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは卵巣癌ポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。卵巣癌ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、あるいは関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および拡大後にその患者に投与される。
【００８６】
治療目的で、卵巣癌ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に拡大され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、卵巣癌ポリペプチドに対して再曝露され得、そして／または卵巣癌ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、卵巣癌ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。発現後に、この細胞は、例えば、Ｃｈａｎｇら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ ２２：２１３，１９９６に記載されるように、患者に投与して戻され得る。
【００８７】
（薬学的組成物およびワクチン）
特定の局面において、本明細書中に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、結合因子、および／または免疫系細胞は、薬学的組成物またはワクチンに組み込まれ得る。薬学的組成物は、１つ以上のこのような化合物または細胞、および生理学的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、１つ以上のこのような化合物または細胞、および非特異的免疫応答エンハンサーを含み得る。非特異的免疫応答エンハンサーは、外因性抗原に対する免疫応答を増大する任意の物質であり得る。非特異的免疫応答エンハンサーの例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）およびリポソーム（この中に、化合物が組み込まれる；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号を参照のこと）が挙げられる。ワクチン調製物は、一般に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ偏「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、他の化合物を含み得、この化合物は生物学的に活性であっても不活性であってもよい。例えば、融合ポリペプチドに組み込まれるか、または別個の化合物としてこの組成物またはワクチン内に組み込まれるかのいずれかで、他の腫瘍抗原の１つ以上の免疫原性部分が存在し得る。
【００８８】
薬学的組成物またはワクチンは、ポリペプチドがインサイチュで生成されるように、上記のようなポリペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み得る。上記のように、このＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系（核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む）のいずれかに存在し得る。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル）を含む。細菌送達系は、その細胞表面にこのポリペプチドの免疫原性部分を発現する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含む。好ましい実施形態において、このＤＮＡは、ウイルス発現系．例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され得、このウイルス発現系は、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下に記載される：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ ８６：３１７−３２１，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ ２，２００，６５１；ＥＰ ０，３４５，２４２；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４，１９９１；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ ９１：２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ ９０：１１４９８−１１５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８，１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７，１９９３。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９、１９９３に記載されそしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２、１９９３により概説されるように、「裸」であってもよい。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【００８９】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、キャリアの型は、投与様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、そのキャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝剤を含む。経口投与のために、上記のキャリアのいずれか、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、および炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示される。
【００９０】
このような組成物はまた、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。
【００９１】
種々の非特異的免疫応答エンハンサーのいずれかが、本発明のワクチンにおいて使用され得る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のタンパク質またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）、ミョウバン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはインターロイキン−２、インターロイキン−７、またはインターロイキン−１２）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【００９２】
本明細書中に提供されるワクチンにおいて、そのアジュバント組成物は、好ましくは、優勢にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−β）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【００９３】
優勢なＴｈ１型応答を惹起する際の使用に好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ））とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）もまた、好ましい。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（そのＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、優勢なＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ ９６／０２５５５に記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン（好ましくはＱＳ２１）であり、これは、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて、使用され得る。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）またはＷＯ ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応生成が低い（ｌｅｓｓ ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む、特に強力なアジュバント処方物が、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。本明細書中で提供される任意のワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーと適切なキャリアまたは賦形剤との組み合わせを生じる周知の方法を使用して調製され得る。
【００９４】
本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物のゆっくりした放出をもたらす、カプセルまたはスポンジのような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般に、周知の技術を使用して調製され得、そして例えば、経口投与、直腸投与もしくは皮下移植によって、または所望の標的部位への移植により投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックス中に分散され、そして／または速度制御膜により囲まれた貯蔵所中に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含み得る。このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた、生分解性であり得；好ましくはその処方物は、比較的一定レベルの活性成分放出を提供する。徐放性処方物中に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに処置もしくは予防される状態の性質に依存する。
【００９５】
種々の任意の送達ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の生成を促進するために、薬学的組成物およびワクチン内で使用され得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、抗原を提示するための能力を増加するように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、それ自体が抗腫瘍効果を有するように、そして／または受容物と免疫学的に適合性（すなわち、一致したＨＬＡハロタイプ）であるように、遺伝子改変され得るが、必ずしもその必要はない。ＡＰＣは、一般的には、種々の生物学的流体ならびに器官（腫瘍組織および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離され得、そして自系細胞でも、同種異系細胞でも、同系細胞でも、または異種細胞でもよい。
【００９６】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹状突起）を有する）に基づいて、ならびに標準的なアッセイを使用して決定される、Ｂ細胞（ＣＤ１９およびＣＤ２０）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、単球（ＣＤ１４）、およびナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６）の分化マーカーの欠如に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原ロード樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【００９７】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の成熟および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【００９８】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することを可能にする。しかしこの命名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプター、マンノースレセプターおよびＤＥＣ−２０５マーカーの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【００９９】
ＡＰＣは、一般的には、卵巣癌抗原（あるいはその一部もしくは他の改変体）をコードするポリヌクレオチドで、その抗原またはその免疫原性部分が細胞表面上で発現されるように、トランスフェクトされ得る。このようなトランスフェクションは、エキソビボで生じ得、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書中に記載されるような治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが患者に投与され得、インビボで生じるトランスフェクションをもたらす。例えば、樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、一般的には、当該分野で公知の任意の方法（例えば、ＷＯ ９７／２４４４７に記載される方法、あるいはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６〜４６０、１９９７により記載される遺伝子銃アプローチ）を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞をこのポリペプチド、ＤＮＡ（裸またはプラスミドベクター内）もしくはＲＮＡとともに、または抗原を発現する組換え細菌もしくは組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター）とともに、インキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、そのポリペプチドは、Ｔ細胞の補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合により結合体化され得る。あるいは、樹状細胞は、非結合体化免疫学的パートナーを用いて、別々にかまたはそのポリペプチドの存在下で、パルスされ得る。
【０１００】
（癌治療）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される組成物は、癌（例えば、卵巣癌）の免疫治療に使用され得る。このような方法において、薬学的組成物およびワクチンは代表的には、患者に投与される。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくはヒト）をいう。患者は、癌に冒されていてもよいしまたはそうでなくてもよい。従って、上記薬学的組成物およびワクチンは、癌の発症を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために、使用され得る。特定の好ましい実施形態において、患者は、卵巣癌に冒されている。このような癌は、当該分野で一般的に認められた基準（悪性腫瘍の存在を含む）を使用して診断され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／もしくは処置（例えば、放射性治療もしくは従来の化学療法薬物の投与）の前あるいは後のいずれかに投与され得る。
【０１０１】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法にける処置は、免疫応答改変剤（例えば、腫瘍ワクチン、細菌性アジュバント、および／またはサイトカイン）の投与を用いる、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０１０２】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法における処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（これらは、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そして必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０１０３】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存し得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存するように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０１０４】
あるいは、本明細書中に列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた幹細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す自己移植のために、インビトロでクローン的に増殖され得る。
【０１０５】
投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）、経口的に、または切除された腫瘍の床に投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約１００μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０１０６】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者と比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。卵巣癌抗原に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０１０７】
（分泌された卵巣癌抗原を同定するためのスクリーニング）
本発明は、分泌された腫瘍抗原を同定するための方法を提供する。このような方法において、腫瘍は、ＳＣＩＤマウスのような免疫不全動物に移植され、そして血清への腫瘍抗原の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって維持される。一般に、腫瘍は、皮下的に、または免疫不全動物の性腺脂肪パッドに移植され得、そして１〜９ヶ月、好ましくは１〜４ヶ月維持される。移植は、一般に、ＷＯ９７／１８３００に記載されるように実施され得る。分泌抗原を含む血清は、次いで、標準的技術を使用して、本明細書中に記載されるように免疫応答性マウスにおいて抗血清を調製するために使用される。手短に言うと、５０〜１００μＬの血清（３セットの免疫不全マウスからプールした。各セットは、異なるＳＣＩＤ由来ヒト卵巣腫瘍を有する）を、適切なアジュバント（例えば、ＲＩＢＩ−ＭＰＬまたはＭＰＬ＋ＴＤＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））と１：１（容量：容量）で混合し得、そして合計５ヶ月間にわたって、１ヶ月間隔で同系の免疫応答性動物に腹腔内注射し得る。このような様式で免疫した動物由来の抗血清を、３回目、４回目および５回目の免疫後に採血することによって入手し得る。得られた抗血清は、一般に、Ｅ．ｃｏｌｉおよびファージ抗原を予め清澄化（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅ）し、そして血清学的発現スクリーニングにおいて（一般に、希釈（例えば、１：２００）の後に）使用した。
【０１０８】
このライブラリーは、代表的に、ＳＣＩＤマウスに移植した型の１つ以上の腫瘍由来のｃＤＮＡを含む発現ライブラリーである。この発現ライブラリーは、任意の適切なベクター（例えば、Ｂ−ｓｃｒｅｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ））において調製され得る。この抗血清と反応するポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、標準的な技術を使用して同定され、そして配列決定され得る。このようなｃＤＮＡ分子は、腫瘍組織および正常組織における発現を評価するために、そして患者における抗原の分泌を評価するために、さらに特徴付けられ得る。
【０１０９】
本明細書中で提供される方法は、腫瘍抗原の発見のためのほかの方法を超える利点を有する。特に、このような方法によって同定される全ての抗原は、腫瘍細胞の壊死を介して分泌または放出されるはずである。このような抗原は、ワクチン接種の後に、免疫系によるターゲティングおよび殺傷を可能にするのに十分な時間量にわたって、腫瘍細胞の表面に存在し得る。
【０１１０】
（癌の検出方法）
一般的に、癌は、この患者から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血清、尿および／または腫瘍生検材料）中の卵巣癌タンパク質および／または、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１以上の存在に基づいてその患者において検出され得る。言いかえると、このようなタンパク質は、卵巣癌のような癌の存在または非存在を示すマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中で提供される結合因子は、一般的に、この生物学的サンプルにおいてこの因子に結合するタンパク質のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これはまた、癌の存在または非存在を示す。一般的に、卵巣癌関連配列は、正常組織においてよりも少なくとも３倍高いレベルで腫瘍組織において存在するはずである。
【０１１１】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定された結合因子の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子あるいは結合因子に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合因子のインキュベーション後にその固定された結合因子に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合因子への結合を阻害する程度は、サンプルの固定された結合因子との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長卵巣癌タンパク質および結合因子が結合するその部分を含む。
【０１１３】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合因子は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は、好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間量で結合因子に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合因子を固定化するのに十分である。
【０１１４】
固体支持体への結合因子の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合因子上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０１１５】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定された抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０１１６】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。次いで、固定された抗体を、サンプルとインキュベートし、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、卵巣癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０１１７】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０１１８】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定された抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０１１９】
癌（例えば、卵巣癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルを、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較する。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。別の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０１２０】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上に固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定された結合因子の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０１２１】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコルが、卵巣癌ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような卵巣癌タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０１２２】
癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の卵巣癌タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、卵巣癌タンパク質、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にて卵巣癌タンパク質（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、卵巣癌タンパク質の非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０１２３】
上記のように、癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の卵巣癌タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する卵巣癌タンパク質ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、卵巣癌タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。同様に、卵巣癌タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０１２４】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、卵巣癌タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中で提供される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０１２５】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０１２６】
別の実施形態において、卵巣癌タンパク質およびこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌の進行をモニタリングするためのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断のための上記のようなアッセイが、経時的に実施され得、そして反応性ポリペプチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間に２４〜７２時間ごとに実施され得、その後も必要に応じて実施され得る。一般に、癌は、結合因子によって検出されるポリペプチドのレベルが経時的に増加する患者において進行している。対照的に、この癌は、反応性ポリペプチドのレベルが一定のままであるかまたは時間とともに減少するかのいずれかである場合には、進行していない。
【０１２７】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子が、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用において使用され得る。
【０１２８】
上記のように、感度を改善するために、複数の卵巣癌タンパク質マーカーが、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合因子が、単一のアッセイ中で組み合わされ得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイが、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わされ得る。
【０１２９】
（診断キット）
本発明は、上記の診断方法のうちのいずれかにおける使用のためのキットをさらに提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイを実施するために必要な２つ以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット中の１つの容器は、卵巣癌タンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供され得る。１つ以上のさらなる容器が、このアッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、またはあるいは、抗体結合の直接検出または間接検出に適切なレポーター基を含む、上記のような検出試薬を含み得る。
【０１３０】
あるいは、生物学的サンプル中の卵巣癌タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するためのキットが設計され得る。このようなキットは、一般的に、上記のような、卵巣癌タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット中に存在し得るさらなる成分としては、卵巣癌タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは診断容器が挙げられる。
【０１３１】
以下の実施例は、例示として提供され、限定として提供されるものではない。
【０１３２】
（実施例）
（実施例１）
（代表的な卵巣癌腫タンパク質ｃＤＮＡの同定）
本実施例は、卵巣癌腫タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の同定を例示する。
【０１３３】
Ｅ．ｃｏｌｉおよびファージ抗原の抗ＳＣＩＤマウス血清（後期継代（ｌａｔｅ ｐａｓｓａｇｅ）卵巣癌腫を保有するＳＣＩＤマウス由来の血清に対して作製された）を、あらかじめ浄化し、そして血清学的発現スクリーンにおいて、１：２００希釈で用いた。スクリーニングされたこのライブラリを、指向性ＲＨオリゴ（ｄＴ）プライミングｃＤＮＡライブラリ構築キットおよびλＳｃｒｅｅｎベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、ＳＣＩＤから誘導されたヒト卵巣癌（ＯＶ９３３４）から作製した。バクテリオファージλスクリーンを利用した。およそ４００，０００ｐｆｕの増幅ＯＶ９３３４ライブラリをスクリーニングした。
【０１３４】
１９６のポジティブクローンを単離した。新規のようである特定の配列を、図１Ａ〜１Ｓおよび配列番号１〜７１に提供する。３つの完全な挿入配列を、図２Ａ〜２Ｃ（配列番号７２〜７４）に示す。既知の配列を有する他のクローンを、図１５Ａ〜１５ＥＥＥ（配列番号８２〜３１０）に示す。データベース検索は、図１５Ａ〜１５ＥＥＥに示される配列に実質的に同一であった以下の配列を同定した。
【０１３５】
これらのクローンを、マイクロアレイ技術を使用して、さらに特徴付けて、種々の腫瘍および正常組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを決定した。このような分析を、Ｓｙｎｔｅｎｉ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）マイクロアレイを用いて、製造業者の指示書に従って行った。ＰＣＲ増幅産物を、スライド上に配置し、各々の産物は、アレイにおいて、独特の位置を占有した。ｍＲＮＡを、試験されるべき組織サンプルから抽出し、逆転写し、そして蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを作製した。このマイクロアレイを、標識されたｃＤＮＡプローブとプローブ化し、そしてスライドをスキャンして、蛍光強度を測定した。データを、Ｓｙｎｔｅｎｉが提供するＧＥＭｔｏｏｌｓソフトウェアを用いて分析した。１つのクローン（１３６９５、Ｏ８Ｅともいわれる）についての結果を、図３に示す。
【０１３６】
（実施例２）
（マイクロアレイ技術を用いた、卵巣癌腫ｃＤＮＡの同定）
本実施例は、ＰＣＲサブトラクションおよびマイクロアレイ分析による卵巣癌腫ポリヌクレオチドの同定を例示する。ｃＤＮＡのマイクロアレイを、Ｓｙｎｔｅｎｉ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）マイクロアレイを用いて、製造業者の指示書に従って（そして本質的に、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４〜１０６１９、１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０〜２１５５、１９９７によって記載されるように）、卵巣腫瘍特異的発現について分析した。
【０１３７】
ＰＣＲサブトラクションを、４つの卵巣腫瘍（これらのうちの３つは、転移性腫瘍であった）のｃＤＮＡを含むテスターならびに５つの正常組織（副腎、肺、膵臓、脾臓および脳）についてのｃＤＮＡのドライバを用いて行った。このサブトラクションから回収されたｃＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡマイクロアレイ分析に供し、ここで、このフラグメントは、ＰＣＲ増幅され、チップに付着し、そしてヒト卵巣腫瘍および種々の正常ヒト組織のｍＲＮＡに由来する蛍光標識されたプローブとハイブリダイズした。この分析において、スライドをスキャンし、そして蛍光強度を測定し、そしてデータを、ＳｙｎｔｅｎｉのＧＥＭｔｏｏｌｓソフトウェアを用いて分析した。一般に、腫瘍細胞における発現において、（正常細胞に関して）少なくとも５倍の増大を示す配列を、卵巣腫瘍抗原とみなした。蛍光の結果を分析し、そして卵巣腫瘍において発現の増大を示したクローンを、ＤＮＡ配列決定およびデータベース検索によってさらに特徴付けて、配列の新規性を決定した。
【０１３８】
このようなアッセイを使用して、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型腫瘍タンパク質ＴＡＸ（Ｊｉｎら、Ｃｅｌｌ ９３：８１〜９１、１９９８を参照のこと）とオステオネクチンとよばれる細胞外マトリックスタンパク質との間のスプライス融合である卵巣腫瘍抗原を同定した。スプライス部位配列は、融合点に存在する。このクローンの配列を、図４および配列番号７５に示す。スプライシングされず、そして変更されないオステオネクチンをまた、このようなアッセイから独立して同定した。
【０１３９】
この方法によって同定されるさらなるクローンを、本明細書中で、３ｆ、６ｂ、８ｅ、８ｈ、１２ｃおよび１２ｈという。これらのクローンの配列を、図５〜９および配列番号７６〜８１に示す。マイクロアレイ分析を、上記のように行い、そして図１０〜１４に示す。クローン３ｆ、６ｂ、８ｅおよび１２ｈを包含する全長配列を、卵巣腫瘍（ＳＣＩＤから誘導された）ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングによって得た。この２９９６の塩基対配列（Ｏ７７２Ｐと示される）を、配列番号３１１に示し、そしてこのコードされた９１４のアミノ酸タンパク質配列を、配列番号３１２に示す。ＰＳＯＲＴ分析は、細胞膜に局在する１ａ型膜貫通タンパク質を示す。
【０１４０】
上記の配列のうちのいくつかに加えて、このスクリーンは、表１に詳細に記載される以下の配列を同定した：
【０１４１】
【表１】
Figure 0004942906
Figure 0004942906
Figure 0004942906
このスクリーンは、本明細書中で、２１０１３、２１００３および２１００８といわれる複数の形態のクローン、Ｏ７７２Ｐをさらに同定した。ＰＳＯＲＴ分析は、２１００３（配列番号３８６；配列番号３８９として翻訳される）および２１００８（配列番号３８７；配列番号３９０として翻訳される）が、Ｏ７７２Ｐの１ａ型膜貫通タンパク質形態を表すことを示す。２１０１３（配列番号３８５；配列番号３８８として翻訳される）は、このタンパク質の短縮型形態のようであり、そしてＰＳＯＲＴ分析によって、分泌タンパク質であると予測される。
【０１４２】
さらなる配列分析は、Ｏ８Ｅについての全長クローン（２６２７ｂｐ、これは、ノーザン分析によって観察されるメッセージサイズと一致する；配列番号３９１）をもたらした。このヌクレオチド配列を、以下のように得た：オリジナルのＯ８Ｅ配列（ＯｒｉｇＯ８Ｅｃｏｎｓ）が、ＥＳＴクローン（ＩＭＡＧＥ番号１９８７５８９）由来の配列と、３３ヌクレオチド重複したことを見出した。このクローンは、オリジナルのＯ８Ｅ配列の上流に、１０４２のさらなるヌクレオチドを提供した。ＥＳＴとＯ８Ｅとの間の関連を、独特のＥＳＴ配列およびＯ８Ｅ配列に対するプライマーを用いて、卵巣原発性腫瘍ライブラリから作製される複数のＰＣＲフラグメントを配列決定することによって確認した（ＥＳＴｘＯ８ＥＰＣＲ）。卵巣腫瘍ライブラリ由来のアンカーＰＣＲが、いくつかのクローンを与えた場合の全長状態をさらに示し（ＡｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ ｃｏｎｓ）、これは、推定の開始メチオニンの上流ですべて終結したが、任意のさらなる配列情報の獲得はできなかった。図１６は、全長Ｏ８Ｅ配列内部の各々の部分配列の位置を例示する図を示す。
【０１４３】
２つのタンパク質配列が、全長Ｏ８Ｅから翻訳され得る。「ａ」（配列番号３９３）については、推定の開始メチオニンから始まる。第二の形態「ｂ」（配列番号３９２）は、ヌクレオチド配列の５’末端に２７のさらなる上流残基を含む。
【０１４４】
（実施例３）
本実施例は、Ｏ８Ｅポリクローナル抗血清によって認識される抗体エピトープの同定および特徴付けを開示する。
【０１４５】
ウサギ抗血清を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯ８Ｅ組換えタンパク質に対して惹起し、そしてＯ８Ｅアミノ酸配列に対応する２０マーまたは２１マーのペプチドに対する抗体エピトープ認識について試験した。全長Ｏ８Ｅタンパク質のペプチドスパニングアミノ酸領域３１〜６５、７６〜１１０、１３６〜２００、および２２６〜２４５を、アフィニティー精製された抗Ｏ８Ｅ血清からの酸溶出ピークおよび／または塩溶出ピークによって認識した。従って、上記のペプチドの対応するアミノ酸配列は、アフィニティー精製された抗Ｏ８Ｅ抗体によって認識される抗体エピトープを構成する。
【０１４６】
抗Ｏ８Ｅウサギ血清のＥＬＩＳＡ分析を、図２３に示し、そしてアフィニティー精製されたウサギ抗Ｏ８Ｅポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡ分析を、図２４に示す。
【０１４７】
エピトープトマッピングについて、Ｏ８Ｅタンパク質に対応する２０マーまたは２１マーのペプチドを合成した。抗体アフィニティー精製について、ウサギ抗Ｏ８Ｅ血清を、Ｏ８Ｅ−セファロースカラムに流し、次いで、抗体を、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＰＯ４を含む塩緩衝液で溶出し、その後、０．２Ｍ グリシン、ｐＨ２．３を用いて、酸溶出工程を行った。精製された抗体を、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８の添加によって中和し、そして緩衝液を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）分析について、Ｏ８ＥペプチドおよびＯ８Ｅ組換えタンパク質を、１ｍｌ当たり２μｇで、２時間室温（ＲＴ）で、９６ウェル平底プレート上にコーティングした。次いで、プレートを、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５回洗浄し、そしてＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて１時間ブロックした。次いで、アフィニティー精製された抗Ｏ８Ｅ抗体（酸溶出画分または塩溶出画分のいずれか）を、１ｍｌ当たり１μｇでウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを、再び洗浄し、その後、ロバ抗ウサギＩｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を、室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、次いで、発色性（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ）基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｂｏｓら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ２：１８７〜２０４（１９８１）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能）の添加によって現像した。この反応物を、室温で１５分間インキュベートし、次いで、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止した。プレートを、自動プレートリーダーにおいて、４５０の光学濃度（ＯＤ４５０）で読みとった。ＯＥ８抗体エピトープに対応するペプチド配列を、本明細書中で、配列番号３９４から配列番号４１５として開示する。Ｏ８Ｅポリクローナル抗血清によって認識される抗体エピトープを、本明細書中で、図１７に開示する。
【０１４８】
（実施例４）
本実施例は、卵巣癌組織サンプルにおけるＯ８Ｅ発現のＩＨＣ分析を開示する。
【０１４９】
免疫組織化学研究について、パラフィン包理されたホルマリンで固定された卵巣癌組織を、８ミクロンの切片に薄く切った。０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）における蒸気熱誘導性のエピトープ回収（ＳＨＩＥＲ）を、最適染色条件について使用した。切片を、１０％ 血清／ＰＢＳとともに５分間インキュベートした。一次抗体（抗Ｏ８Ｅウサギのアフィニティー精製されたポリクローナル抗体）を、各々の切片に２５分間添加し、その後、抗ウサギビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗体とともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３回の１．５分間の過酸化水素とのインキュベーションによってブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ系を、ＤＡＢクロモゲンとともに使用して、抗原発現を視覚化した。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色した。６つの卵巣癌組織切片のうちの１つ（漿液性嚢腺腫（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））が、Ｏ８Ｅ免疫反応性を示した。染色条件の最適化の下で、５つの卵巣癌サンプルのうちの４つを、Ｏ８Ｅポリクローナル抗体を用いてポジティブに染色した。Ｏ８Ｅ発現は、細胞膜に局在した。
【０１５０】
６つの卵巣癌組織を、抗Ｏ８Ｅウサギポリクローナル抗体を用いて分析した。６つの卵巣癌組織サンプルのうちの１つ（漿液性嚢腺腫）を、Ｏ８Ｅ発現についてポジティブに染色した。Ｏ８Ｅ発現は、表面の膜に局在した。
【０１５１】
（実施例５）
本実施例は、ＨＬＡ−Ａ２を結合し、そしてヒトにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答について免疫原性であると予測されるＯ８Ｅペプチドを開示する。
【０１５２】
Ｏ８Ｅの潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを、Ｏ８Ｅ由来の全長のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて、そして「Ｅｐｉｓｅｅｋ」（ＭＨＣ結合ペプチドの予測に用いられるプログラム）に通すことによって予測した。使用されるプログラムは、Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１）：１６３〜１７５（１９９４）（本明細書中でその全体において参考として援用される）によって公開されるアルゴリズムに基づく。ＨＬＡ−０２０１を結合すると予測される１０マーおよび９マーのペプチドを、本明細書中において、それぞれ配列番号４１６〜４３５および配列番号４３６〜４５５として開示する。
【０１５３】
（実施例６）
本実施例は、蛍光活性化セルソーティングによって測定されるＯ８Ｅ細胞表面発現を開示する。
【０１５４】
ＦＡＣＳ分析について、細胞を、氷冷染色緩衝液（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／アジ化物）で洗浄した。次に、この細胞を、３０分間氷上で、１ｍｌ当たり１０マイクログラムのアフィニティー精製されたウサギ抗Ｂ３０５Ｄポリクローナル抗体とインキュベートした。この細胞を、染色緩衝液で３回洗浄し、次いで、１：１００希釈のヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と３０分間氷上でインキュベートした。３回の洗浄後、この細胞を、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｄｉｕｍ）（透過性細胞の同定を可能にする生体染色）を含む染色緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳによって分析した。Ｏ８Ｅ表面発現を、ＳＫＢＲ３乳癌細胞およびＯ８ＥについてのｃＤＮＡを安定に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対して確認した。ＭＢ４１５細胞もＨＥＫ２９３細胞もまた、Ｏ８Ｅの表面発現を示すコントロールの無関係のプラスミドＤＮＡで安定にトランスフェクトされなかった（図１８および図１９）。
【０１５５】
（実施例７）
本実施例は、Ｏ８Ｅの発現および表面局在をさらに評価する。
【０１５６】
免疫化について使用される抗原の発現および精製について、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現されるＯ８Ｅを、振盪インキュベータにおいて３７℃で、適切な抗生物質を含むＬＢ Ｂｒｏｔｈにおいて一晩増殖させた。翌朝、１０ｍｌの一晩の培養物を、２ＬのバッフルＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて、適切な抗生物質を含む５００ｍｌの２×ＹＴに添加した。培養物の光学濃度が、（５６０ナノメートルで）０．４〜０．６に達したときに、細胞を、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。ＩＰＴＧでの誘導から４時間後、細胞を、遠心分離によって回収した。次いで、この細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして再び遠心分離した。この上清を捨て、そして細胞を、今後の使用について凍結するか、または直ちに処理するかのいずれかにした。２０ミリリットルの溶解緩衝液を、細胞ペレットに添加し、そしてボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を破壊して開くために、次いでこの混合物を、１６，０００ｐｓｉの圧力で、フレンチプレスを通した。次いで、この細胞を、再び遠心分離し、そして上清およびペレットを、組換えタンパク質の分割について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細胞ペレットに局在したタンパク質について、このペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１％ ＣＨＡＰＳ中に再懸濁し、そして封入体ペレットを洗浄し、そして再び遠心分離した。この手順を、２回以上繰り返した。洗浄した封入体ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０および１０ｍＭ イミダゾールを含む８Ｍ 尿素または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０および１０ｍＭ イミダゾールを含む６Ｍ グアニジンＨＣｌのいずれかで可溶化した。可溶化したタンパク質を、５ｍｌのニッケルキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に添加し、そして継続的に撹拌しながら、室温で４５分〜１時間インキュベートした。インキュベーション後、この樹脂およびタンパク質の混合物を、使い捨てカラムに注ぎ、そしてフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収した。次いで、このカラムを、１０〜２０カラム容量の可溶化緩衝液で洗浄した。次いで、抗原を、８Ｍ 尿素、１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ８．０および３００ｍＭ イミダゾールを用いてカラムから溶出し、そして３ｍｌ画分で回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走らせて、どの画分をさらなる精製についてプールするかを決定した。最終精製工程として、強力な陰イオン交換樹脂（例えば、Ｈｉ−Ｐｒｅｐ Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ））を、適切な緩衝液で平衡化し、そして上記からのプールされた画分を、このカラムにロードした。各々の抗原を、漸増塩勾配を用いてカラムから溶出した。カラムを走らせながら画分を回収し、そして別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走らせて、カラム由来のどの画分をプールするかを決定した。このプールされた画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に対して透析した。次いで、この物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣによって決定されるような許容純度、Ｌｏｗｒｙアッセイまたはアミノ酸分析によって決定されるような濃度、アミノ末端タンパク質配列によって決定されるような同一性およびＬｉｍｕｌｕｓ（ＬＡＬ）アッセイによって決定されるようなエンドトキシンレベルについて評価した。次いで、このタンパク質を、０．２２ミクロンのフィルターを通じた濾過後にバイアルに入れ、そして抗原を、免疫化について必要とされるまで凍結した。
【０１５７】
ポリクローナル抗血清の作製について、４００マイクログラムの各々の前立腺抗原を、１００マイクログラムのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と組み合わせた。等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を添加し、次いで混合した。４週間毎に、動物を、抗原と等量のＩＦＡと混合した１００マイクログラムの抗原でブーストした。各ブーストから７日後に、この動物の血液を抜き取った。血液を、４℃で１２〜２４時間インキュベートし、その後遠心分離によって、血清を作製した。
【０１５８】
ポリクローナル抗血清の特徴付けについて、４℃で２０時間、５０マイクロリットル（代表的には、１マイクログラム）とインキュベートすることによって、９６ウェルプレートを、抗原でコーティングした。２５０マイクロリットルのＢＳＡブロッキング緩衝液を、ウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０１％ ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。抗Ｏ８Ｅウサギ血清またはアフィニティー精製された抗Ｏ８Ｅ抗体を、ＰＢＳで希釈した。５０マイクロリットルの希釈抗体を、各々のウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。１：１００００希釈での５０マイクロリットルのヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加し、そして室温で３０分間インキュベートする前に、プレートを、上記のように洗浄した。プレートを、上記のように洗浄し、そして１００マイクロリットルのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質、各々のウェルに添加した。暗所で室温での１５分間のインキュベーション後、比色反応を、１００マイクロリットルの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止し、そして直ちに４５０ｎｍで読みとった。すべてのポリクローナル抗体は、Ｏ８Ｅ抗原に対して免疫反応性を示した。
【０１５９】
哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における組換え発現について、全長のＯ８Ｅ ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、これらは、改変されて、それぞれＨｉｓエピトープタグおよびＦＬＡＧエピトープタグを含んだ。これらの構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。手短に言えば、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において、１ｍｌ当たり１００，０００の細胞の密度でプレーティングし、そして一晩増殖させた。翌日、２μｌのＦｕｇｅｎｅ６を、ＦＢＳを含まない１００μｌのＤＭＥＭに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。次いで、Ｆｕｇｅｎｅ６／ＤＭＥＭ混合物を、１μｇのＯ８Ｅ／ｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡまたは１μｇのＯ８Ｅ／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドＤＮＡに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。次いで、このＦｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物を、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、そして３７℃で７％ ＣＯ２とともに、４８〜７２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳですすぎ、次いで収集し、そして遠心分離によってペレット化した。ウェスタンブロット分析について、全細胞溶解物を、溶解緩衝液を含むＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００において、細胞を３０分間氷上でインキュベートすることによって作製した。次いで、溶解物を、４℃で５分間、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって浄化した。サンプルを、βメルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で希釈し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのローディングの前に１０分間沸騰させた。タンパク質を、ニトロセルロースに移し、そして１：７５０の希釈で、抗Ｏ８Ｅウサギポリクローナル血清番号２３３３Ｌを用いてプローブ化した。ブロットを、ＨＲＰに結合したヤギ抗ウサギＩｇを用いて明らかにし、その後、ＥＣＬ基質中でインキュベートした。
【０１６０】
ＦＡＣＳ分析について、細胞を、氷冷染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋アジ化物）でさらに洗浄した。次に、この細胞を、１０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製抗Ｏ８Ｅポリクローナル血清とともに、氷上で３０分間インキュベートした。この細胞を、染色緩衝液で３回洗浄し、次いで、１：１００希釈のヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、氷上で３０分間インキュベートした。３回の洗浄後、この細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（透過性細胞の同定を可能にする生体染色）を含む染色緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳによって分析した。
【０１６１】
これらの実験から、この結果を、図２０〜２１に例示する。Ｏ８Ｅ発現を、ウサギ抗Ｏ８Ｅ血清を用いたＦＡＣＳ分析によって、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞およびＳＫＢＲ３細胞の表面上を検出した。発現をまた、ウェスタンブロット分析によって、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞溶解物において検出した（図２２）。
【０１６２】
（実施例８）
（抗Ｏ８ＥｍＡｂの作製および特徴付け）
マウスモノクローナル抗体を、以下の通りに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯ８Ｅタンパク質に対して惹起した。Ａ／Ｊマウスを、５０μｇの組換えＯ８Ｅを含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いて腹腔内（ＩＰ）免疫し、その後、１０μｇの組換えＯ８Ｅタンパク質を含む不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて、引き続きＩＰブーストした。脾臓を取り出す３日前、このマウスを、およそ５０μｇの可溶性Ｏ８Ｅ組換えタンパク質を用いて、静脈内免疫した。Ｏ８Ｅに対して正の力価を有するマウスの脾臓を取り出し、そして単細胞懸濁を行い、そしてＳＰ２／０骨髄腫細胞への融合について使用して、Ｂ細胞ハイブリドーマを作製した。このハイブリッドクローン由来の上清を、組換えＯ８Ｅに対する特異性について、ＥＬＩＳＡによって試験し、そしてエピトープを、Ｏ８Ｅ配列全体に及ぶペプチドを用いてマッピングした。このｍＡｂをまた、Ｏ８Ｅを用いて安定にトランスフェクトされた細胞表面上および乳房腫瘍細胞系統の表面上においてＯ８Ｅを検出する能力について、フローサイトメトリーによって試験した。
【０１６３】
ＥＬＩＳＡ分析について、９６ウェルプレートを、組換えＯ８Ｅタンパク質、またはＯ８Ｅ分子全体に及ぶ重複２０マーペプチドのいずれかを、それぞれ１〜２μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの濃度でコーティングした。コーティング後、このプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄し、そして０．５％ ＢＳＡ、０．４％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いてブロックした。次いで、ハイブリッド上清または精製ｍＡｂを添加し、そしてこのプレートを、室温で６０分間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液で５回洗浄し、そして二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結したロバ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、６０分間添加した。このプレートを、洗浄緩衝液において再び５回洗浄し、その後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。作製されたハイブリドーマクローンのうち、１５のクローンが、Ｏ８Ｅタンパク質全体を認識したｍＡｂを分泌した。エピトープマッピングは、これらの１５のクローンのうち、１４のクローンが、Ｏ８Ｅアミノ酸残基６１〜８０を認識したｍＡｂを分泌し、そして１つのクローンが、アミノ酸残基１５１〜１７０を認識したｍＡｂを分泌したことを明らかにした。
【０１６４】
フローサイトメトリー分析について、Ｏ８Ｅ細胞、およびＯ８ＥｍＲＮＡを発現するＳＫＢＲ３細胞を用いて安定にトランスフェクトされていたＨＥＫ２９３細胞を回収し、そしてフロー染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋アジ化物）で洗浄した。この細胞を、ｍＡｂハイブリッド由来の上清とともに、氷上で３０分間インキュベートし、その後、染色緩衝液で３回洗浄した。この細胞を、ヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣとともに、氷上で３０分間インキュベートし、その後、ヨウ化プロピジウムを含む洗浄緩衝液中に再懸濁する前に、染色緩衝液で３回洗浄した。フローサイトメトリー分析は、１５のｍＡｂのうちの１５が、Ｏ８ＥでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の表面上で発現されたＯ８Ｅタンパク質を検出し得たことを明らかにした。ＳＫＢＲ３細胞に対して試験された６のｍＡｂのうちの６つが、表面発現したＯ８Ｅを認識し得た。
【０１６５】
（実施例９）
（配列Ｏ７７２Ｐの延長ＤＮＡ配列分析および延長タンパクの質配列分析）
クローン３ｆ、６ｂ、８ｅおよび１２を包含する全長配列を、実施例２において詳細に記載される卵巣腫瘍（ＳＣＩＤ−由来）ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングによって獲得した。この２９９６塩基対の配列（Ｏ７７２Ｐと呼ばれる）を、配列番号３１１に示し、そしてこのコードされる９１４アミノ酸のタンパク質配列を、配列番号３１２に示す。このＤＮＡ配列Ｏ７７２Ｐを、Ｇｅｎｂａｎｋを含む公のデータベースに対して検索し、そしてＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＫ０２４３６５（配列番号４５７）に対して有意なヒットを示した。このＧｅｎｂａｎｋ配列は、３５５７塩基対長であり、そして１１５６アミノ酸長のタンパク質（配列番号４５９）をコードすることが見出された。この配列の短縮型バージョン（残基２５〜３４７１）（ここで、残基２５が、Ｇｅｎｂａｎｋ配列（配列番号４５６）における最初のＡＴＧ開始コドンに対応する）が、１１４８アミノ酸長のタンパク質（配列番号４５８）をコードする。この公開されたＤＮＡ配列（配列番号４５７）は、配列番号４５７の塩基９５８〜９６２に対応する５塩基対挿入を有する点において、Ｏ７７２Ｐと異なる。この挿入は、フレームシフトをもたらし、その結果、配列番号４５７は、Ｏ７７２Ｐ（配列番号３１２）に関して、さらなるＮ末端タンパク質配列をコードする。さらに、Ｏ７７２Ｐは、残基１〜７９（配列番号４６０）に含まれる独特のＮ末端部分をコードする。この配列番号４５６のＮ末端部分（残基１〜３１３）はまた、独特の配列を含み、そして配列番号４６１として列挙される。
【０１６６】
（実施例１０）
（分子Ｏ７７２Ｐの細胞関連発現パターンの免疫組織化学およびフローサイトメトリー分析についてのポリクローナル抗体の作製）
Ｏ７７２Ｐ分子を、本出願の実施例２および実施例９において同定した。種々の組織における抗原発現の細胞下の局在および特異性を評価するために、ポリクローナル抗体を、Ｏ７７２Ｐに対して作製した。これらの抗体を産生するために、Ｏ７７２Ｐ−１（配列番号３１２のアミノ酸４４〜７７２）およびＯ７７２Ｐ−２（配列番号３１２の４７７〜９１４）を、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現させ、そしてＬＢ Ｂｒｏｔｈにおいて３７℃で一晩増殖させた。翌日、１０ｍｌの一晩培養物を、適切な抗生物質を含む５００ｍｌの２×ＹＴに添加した。培養物の吸光度（５６０ナノメートル）が、０．４〜０．６に達したときに、細胞を、ＩＰＴＧで誘導した。誘導後、細胞を回収し、洗浄し、溶解し、そして１６０００ｐｓｉの圧力で、フレンチプレスを通した。次いで、この細胞を、遠心分離し、そしてペレットを、組換えタンパク質の区画化について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細胞ペレットに局在したタンパク質について、このペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１％ ＣＨＡＰＳ中に再懸濁し、そして封入体ペレットを洗浄し、そして遠心分離した。洗浄した封入体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０および１０ｍＭ イミダゾールを含む８Ｍ 尿素または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０および１０ｍＭ イミダゾールを含む６Ｍ グアニジンＨＣＬのいずれかで可溶化した。次いで、可溶化したタンパク質を、５ｍｌのニッケルキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に添加し、そして室温で４５分間インキュベートした。
【０１６７】
インキュベーション後、この樹脂およびタンパク質の混合物を、カラムに注ぎ、そしてフロースルーを回収した。このカラムを、１０〜２０カラム容量の緩衝液で洗浄し、そして抗原を、８Ｍ 尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０および３００ｍＭ イミダゾールを用いて溶出し、そして３ｍｌ画分で回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを泳動して、どの画分をさらなる精製のためプールするかを決定した。最終精製工程として、強力な陰イオン交換樹脂を、適切な緩衝液で平衡化し、そしてプールされた画分を、このカラムにロードした。各々の抗原を、漸増塩勾配を用いてカラムから溶出した。画分を回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、カラム由来のどの画分をプールするかを決定した。このプールされた画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析し、そして得られたタンパク質を、最終放出についての品質コントロールとして提出した。この放出基準は、以下の通りであった：（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣによって決定されるような純度、（ｂ）Ｌｏｗｒｙアッセイまたはアミノ酸分析によって決定されるような濃度、（ｃ）アミノ末端タンパク質によって決定されるような同一性、および（ｄ）Ｌｉｍｕｌｕｓ（ＬＡＬ）アッセイによって決定されるような内毒素レベル。次いで、このタンパク質を、０．２２μＭフィルターを通じて濾過し、そして、免疫のために必要とされるまで凍結した。
【０１６８】
ポリクローナル抗血清を作製するために、４００μｇのＯ７７２Ｐ−１またはＯ７７２Ｐ−２を、１００μｇのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と組み合わせた。ウサギを、抗原と等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合した１００μｇの抗原で、４週間毎に免疫した。各ブーストから７日後、この動物から血液を抜き取り、そして、血液を４℃で１２〜２４時間インキュベートし、その後、遠心分離することによって、血清を作製した。
【０１６９】
抗血清の特徴付けのために、９６ウェルプレートを、抗原でコーティングし、その後ＢＳＡでブロッキングした。ウサギ血清を、ＰＢＳで希釈し、そして各々のウェルに添加した。次いで、プレートを洗浄し、そしてヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加した。プレートを、再び洗浄し、そしてＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質を添加した。このインキュベーション後、比色反応を停止し、そしてプレートを、直ちに４５０ｎｍで読みとった。すべてのポリクローナル抗体は、適切な抗原に対して免疫反応性を示した。
【０１７０】
Ｏ７７２Ｐ発現の免疫組織化学分析を、パラフィン包理されたホルマリンで固定された組織に対して行った。Ｏ７７２Ｐは、正常卵巣および卵巣腫瘍において発現することが見出されたが、正常心臓、正常腎臓、正常結腸、正常肺または正常肝臓における発現は見出されなかった。さらに、免疫組織化学およびフローサイトメトリー分析は、Ｏ７７２Ｐが、原形質膜結合分子であることを示す。Ｏ７７２Ｐは、アミノ酸８５９〜８８０によってコードされると予測される１つの原形質膜貫通ドメインを含む。Ｏ７７２ＰのＮ末端は、細胞外であり、そしてアミノ酸１〜８５９によってコードされるが、一方、Ｃ末端は、細胞内である。配列分析は、１７個の潜在的なＮ結合グリコシル化部位が存在することを示す。
【０１７１】
（実施例１１）
（Ｏ７７２Ｐは、初代卵巣腫瘍細胞の表面上に発現する）
哺乳動物細胞における組換え発現について、Ｏ７７２Ｐ−２１００８（配列番号３８７）およびＯ７７２Ｐ全長ｃＤＮＡ（配列番号３１２のタンパク質をコードする配列番号３１１）を、それぞれ哺乳動物発現ベクターｐＢＩＢまたはｐＣＥＰ４にサブクローニングした。これらの構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。次いで、このＨＥＫ細胞を、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭにおいて、１ｍｌ当たり１００，０００の細胞の密度でプレーティングし、そして一晩増殖させた。翌日、２μｌのＦｕｇｅｎｅ６を、ＦＢＳを含まない１００μｌのＤＭＥＭに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。次いで、Ｆｕｇｅｎｅ６／ＤＭＥＭ混合物を、１μｇのＯ７７２Ｐ／ｐＢＩＢプラスミドＤＮＡまたは１μｇのＯ７７２Ｐ／ｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡに添加し、そしてさらに室温で１５分間インキュベートした。次いで、このＦｕｇｅｎｅ６／ＤＮＡ混合物を、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、そして３７℃で７％ ＣＯ２とともに、４８〜７２時間インキュベートした。この細胞をすすぎ、そして遠心分離によってペレット化した。
【０１７２】
ウェスタンブロット分析について、全細胞溶解物を、溶解緩衝液中で細胞をインキュベートすることによって作製し、その後、遠心分離によって浄化した。サンプルを希釈し、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。次いで、ゲルを、ニトロセルロースに移し、そして、精製抗Ｏ７７２Ｐ−２ウサギポリクローナル抗体を用いてプローブした。ブロットを、ＨＲＰに結合したヤギ抗ウサギＩｇを用い、その後、ＥＣＬ基質中でインキュベートして明らかにした。ウェスタンブロット分析は、Ｏ７７２Ｐ−２１００８が、Ｏ７７２ＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において検出され得ることを明らかにした。
【０１７３】
細胞におけるＯ７７２Ｐの細胞発現プロフィールを決定するために、初代卵巣腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウス中で増殖させた。この細胞を、マウスから回収し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。手短に言えば、細胞を、ＰＢＳ、１％ ＢＳＡおよびＮａアジドを含む冷染色緩衝液において洗浄した。この細胞を、１０μｇ／ｍｌの精製抗Ｏ７７２Ｐ−１ポリクローナル血清および精製抗Ｏ７７２Ｐ−２ポリクローナル血清とともに、３０分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を、染色緩衝液において３回洗浄し、そしてＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に結合体化したヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）とともにインキュベートした。この細胞を洗浄し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（生存能力のない細胞を同定する生体染色）を含む染色緩衝液中に再懸濁した。次いで、この細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて分析した。ＦＡＣＳ分析は、Ｏ７７２Ｐが、細胞表面上に存在したことを明らかにした。腫瘍細胞上のＯ７７２Ｐの表面発現は、治療抗体による免疫標的化を可能にする。
【０１７４】
（実施例１２）
（抗Ｏ８Ｅモノクローナル抗体の機能的特徴付け）
実施例８に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯ８Ｅに対して惹起されたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｏ８Ｅ抗原インターナリゼーションを促進する能力について試験した。抗体のインターナリゼーションを、インビトロ細胞傷害性アッセイを用いて決定した。手短に言えば、ＨＥＫ２９３細胞およびＯ８Ｅ／ＨＥＫトランスフェクト細胞を、１ウェル当たり５０ｎｇの精製抗Ｏ８Ｅ抗体またはコントロール抗体の存在下において、ＤＭＥおよび１０％ 熱不活化ＦＢＳを含む９６ウェルプレートにプレーティングした。抗Ｏ８Ｅ ｍＡｂのアイソタイプは、以下の通りである：１１Ａ６−ＩｇＧ１／κ、１５Ｃ６−ＩｇＧ２ｂ／κ、１８Ａ８−ＩｇＧ２ｂ／κおよび１４Ｆ１−ＩｇＧ２ａ／κ。Ｗ６／３２は、ポジティブコントロールとして役立つ汎（ｐａｎ）抗ヒトＭＨＣクラスＩマウスモノクローナル抗体であり、そして２つの無関係のｍＡｂ、Ｉｒ−ＰｈａｒｍおよびＩｒ−Ｃｒｘａを、ネガティブコントロールとして含めた。Ｏ８Ｅ特異的抗体または関連するコントロール抗体とのインキュベーション後、ｍＡｂ−ｚａｐ（ヤギ抗マウスＩｇ−サポリン結合体化二次抗体）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ウェルの半分に、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、そしてこのプレートを、３７℃で７％ ＣＯ２インキュベータにおいて、４８〜７２時間インキュベートした。このアッセイは、サポリン（リボザイム不活化タンパク質）の毒性性質を利用し、これは、インターナリゼーションされる場合に、細胞傷害性効果を有する。ｍＡｂ−ｚａｐとのインキュベーション後、インターナリゼーションを、ＭＴＳ試薬の添加によって定量し、その後、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーで、プレートのＯＤ４９０を読みとった。図２５は、これらのアッセイからの結果を示す。上パネルは、Ｏ８ＥでトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞を示し、従って、Ｏ８Ｅ抗体は、結合およびインターナリゼーションされないはずである。増殖レベルは、ポジティブコントロールＡｂであるＷ６／３２を除いて、ｍＡｂ−ｚａｐとのインキュベーションの有無にかかわらず、すべてのサンプルにおいて同じであった。下パネルは、Ｏ８Ｅでトランスフェクトされている細胞を示し、従って、Ｏ８Ｅ特異的抗体を結合するはずである。Ｏ８Ｅのアミノ酸６１〜８０を認識するハイブリドーマ、１１Ｈ６、１４Ｆ１および１５Ｃ６由来の抗体は、ｍＡｂ−ｚａｐの毒性性質に起因して、増殖レベルの減少によって測定されるように、Ｏ８Ｅ表面タンパク質のインターナリゼーションを促進し得た（図２５を参照のこと）。ハイブリドーマ１８Ａ８によって作製される抗体（これは、Ｏ８Ｅのアミノ酸１５１〜１７０を認識する）は、ｍＡｂ−ｚａｐの非存在下または存在下のいずれかにおいて、増殖の正常レベルによって決定されるように、インターナリゼーションを促進できなかった。
【０１７５】
（実施例１３）
（卵巣腫瘍抗原Ｏ７７２Ｐの特徴付け）
複数の形態の卵巣腫瘍抗原Ｏ７７２ＰについてのｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、上記（例えば、実施例２および実施例９）に記載されている。Ｇｅｎｂａｎｋ検索は、Ｏ７７２Ｐが、ＦＬＪ１４３０３（登録番号ＡＫ０２４３６５；配列番号４５７および配列番号４６３）と高度の類似性を有することを示した。Ｏ７７２ＰおよびＦＬＪ１４３０３に対応するタンパク質配列を、それぞれ配列番号４７８および配列番号４７９に開示する。ＦＬＪ１４３０３は、Ｏ７７２Ｐの大部分と同一であり、多くの３’末端は、１００％の相同性を示した。しかし、ＦＬＪ１４３０３の５’末端は、Ｏ７７２Ｐよりも５’をさらに延長することが見出された。さらに、ＦＬＪ１４３０３は、５ｂｐ挿入（配列番号４５７）を含み、アミノ末端タンパク質配列のフレームシフトをもたらし、その結果、ＦＬＪ１４３０３は、Ｏ７７２Ｐとは異なる開始メチオニンを利用し、従って、異なるタンパク質をコードする。この挿入は、ゲノム配列中に存在し、そしてこの領域との同一性を示したすべてのＥＳＴクローンに見られ、このことは、ＦＬＪ１４３０３（配列番号４５７）が、Ｏ７７２Ｐのスプライス改変体（延長されかつ異なるアミノ末端を含むＯＲＦを有する）を示すことを示唆する。さらなる５’ヌクレオチド配列は、反復配列を含み、これは、Ｏ７７２Ｐのゲノムマッピングの間に同定された。Ｏ７７２Ｐの５’末端およびＦＬＪ１４３０３の対応する領域は、９０〜１００％の間の相同性を示した。総合すれば、これは、Ｏ７７２ＰおよびＦＬＪ１４３０３が、同じ遺伝子の異なるスプライス改変体であり、異なる独特の反復配列は、この遺伝子の５’末端にスプライシングされることを示唆する。
【０１７６】
第１９染色体の同じ領域内のさらなる１０以上の反復配列の同定は、異なる反復配列の示差的スプライシングに起因して、各々異なる５’末端を有する多くの形態のＯ７７２Ｐが存在し得ることを示す。Ｏ７７２Ｐのノーザンブロット分析は、Ｏ７７２Ｐとハイブリダイズする、異なる大きさ（いくつかは、１０ｋｂを超える）の複数の転写物を実証した。
【０１７７】
さらなる分析で、１３個のさらなるＯ７７２Ｐ関連配列を同定し、このｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、表２に記載する。
【０１７８】
【表２】
Figure 0004942906
最初は、これらの配列が、Ｏ７７２Ｐスプライス形態の重複配列および／または別個の配列を示し、これは、Ｏ７７２Ｐの特定のスプライス形態に独特なポリペプチドをコードし得るようであった。しかし、これらの配列のヌクレオチド整列は、反復エレメント内部のいずれの同一の領域をも同定できなかった。これは、この配列が、１つのＯ７７２Ｐ遺伝子の異なる特定の領域（１６以上の反復ドメインを含み、これらのすべては、１つの直鎖状転写物を形成する）を示し得ることを示す。配列ＬＳ番号１０４３４００．１０（表２；配列番号４６５）の５’末端は、Ｏ７７２ＰおよびＦＬＪ１４３０３の両方に独特であり、そして反復エレメントを含まず、これは、この配列が、Ｏ７７２Ｐの５’末端を示し得ることを表す。
【０１７９】
以前に、膜貫通予測分析は、Ｏ７７２Ｐが、１と３との間の膜貫通ドメインを含んだことを示した。これは、免疫組織化学およびフローサイトメトリーの使用によって確認され、これは、Ｏ７７２Ｐを示す原形質膜結合分子の存在を実証した。しかし、免疫組織化学はまた、Ｏ７７２Ｐの分泌形態の存在を示し、これはおそらく、Ｏ７７２Ｐの選択的スプライス形態または翻訳後開裂事象から生じる。表２に示される配列のいくつかの分析は、配列１０４３４００Ｂ．１２、１０４３４００．８Ｂおよび１０４３４００．１１Ｂのすべてが、膜貫通領域を含んだが、一方、１０４３４００．８Ａ、１０４３４００．１０、１０４３４００．１、１０４３４００．１１Ａおよび１０４３４００．９が、すべて膜貫通配列を欠如したことを示し、これは、これらのタンパク質が、分泌され得ることを示唆する。
【０１８０】
分析は、Ｏ７７２Ｐの一部が、原形質膜上に発現および／または保持されることを示し、Ｏ７７２Ｐを、指向性特異的免疫療法（例えば、このタンパク質に対する治療抗体）についての魅力的な標的とする。Ｏ７７２Ｐの推定細胞外ドメインを、配列番号４８９に開示し、そしてＯ７７２Ｐの分泌は、配列内部の開裂事象の結果として生じるようである：
【０１８１】
【化１】
Figure 0004942906
タンパク質分解開裂は、配列番号４８９の１０位のリジン（Ｋ）で最も生じるようである。Ｏ７７２Ｐの細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域をすべて、配列番号４８８に開示する：
細胞外：
【０１８２】
【化２】
Figure 0004942906
膜貫通：
【０１８３】
【化３】
Figure 0004942906
細胞質：
【０１８４】
【化４】
Figure 0004942906
（実施例１４）
（卵巣癌組織および正常組織におけるＯ８Ｅ発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析）
どの組織が、卵巣癌抗原Ｏ８Ｅを発現するかを決定するために、ＩＨＣ分析を、Ｏ８Ｅに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を用いて、種々の範囲の組織切片に対して行った。Ｏ８Ｅ特異的ポリクローナル抗体の作製は、実施例８において詳細に記載される。染色について使用されるモノクローナル抗体は、１１Ａ６および１４Ｆ１であり、これらの両方が、Ｏ８Ｅのアミノ酸６１〜８０および１８Ａ８（これは、Ｏ８Ｅのアミノ酸１５１〜１７０を認識する）に特異的である（作製に対する詳細については、実施例１２を参照のこと）。
【０１８５】
染色を行うために、組織サンプルを、１２〜２４時間ホルマリン溶液中で固定し、そして８ミクロンの切片に薄く切る前に、パラフィンに包理した。０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）における蒸気熱誘導性のエピトープ回収（ＳＨＥＩＲ）を、最適染色条件について使用した。切片を、１０％ 血清／ＰＢＳとともに５分間インキュベートした。次いで、一次抗体を、各々の切片に２５分間添加し、その後、抗ウサギビオチン化抗体または抗マウスビオチン化抗体のいずれかとともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３回の過酸化水素との１．５分間のインキュベーションによってブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢ色素原とともに使用して、抗原発現を視覚化した。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色して、細胞核を視覚化した。
【０１８６】
Ｏ８Ｅ（ａ．ａ．２９〜２８３）に対するウサギのアフィニティー精製されたポリクローナル抗体（このＡｂの作製に対する詳細については、実施例３を参照のこと）を用いた結果を、表３に示す。３つのモノクローナル抗体を用いた結果を、表４に示す。
【０１８７】
【表３】
Figure 0004942906
【０１８８】
【表４】
Figure 0004942906
（実施例１５）
（Ｏ７７２Ｐポリクローナル抗体のエピトープマッピング）
Ｏ７７２Ｐのエピトープマッピングを行うために、ペプチドを作製し、この配列は、Ｏ７７２Ｐの配列に由来した。これらのペプチドは、５アミノ酸が重複した１５マーであり、そして膜支持体上での化学合成を介して作製された。このペプチドは、そのＣ末端によって、Ｗｈａｔｍａｎ ５０セルロース支持体に共有結合し、Ｎ末端は結合しなかった。エピトープ特異性を決定するために、この膜を、１００％ エタノールで１分間濡らし、次いで、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．５）中で、１６時間ブロックした。次いで、このペプチドを、２つのＯ７７２Ｐ特異的抗体であるＯ７７２Ｐ−１（配列番号３１２のアミノ酸４４〜７７２）およびＯ７７２Ｐ−２（配列番号３１２の４７７〜９１４；抗体作製の詳細については、実施例１０を参照のこと）ならびにコントロールとして、無関係のウサギ抗体を用いてプローブした。この抗体を、１μｇ／ｍｌに希釈し、そして室温で２時間、膜と共にインキュベートした。次いで、この膜を、１：１０，０００希釈のＨＲＰ結合体化抗ウサギ二次抗体との２時間のインキュベーションの前に、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液において、３０分間洗浄した。この膜を、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／Ｔｒｉｔｏｎにおいて３０分間再び洗浄し、そして抗ペプチド反応性を、ＥＣＬを用いて視覚化した。Ｏ７７２Ｐ−ポリクローナル抗体の各々についての特定のエピトープ結合特異性を、表５に記載する。
【０１８９】
【表５】
Figure 0004942906
（実施例１６）
（Ｏ７７２Ｐと結合する新規のＮ末端反復構造の同定）
種々のＯ７７２Ｐ ｃＤＮＡ形態およびタンパク質形態が、上記のように（例えば、実施例１、２、９および１４）、同定および特徴付けされている。重要なことには、Ｏ７７２ＰのＲＮＡおよびタンパク質は、正常組織に対して、卵巣癌組織において過剰発現されることが実証されており、従って、卵巣癌の診断適用および治療適用についての魅力的な標的を示す。
【０１９０】
Ｏ７７２Ｐと相同性を有すると以前に同定されたゲノムヌクレオチド配列由来のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の生物情報科学分析を用いて、複数のヌクレオチド反復配列を、Ｏ７７２Ｐタンパク質をコードする遺伝子の５’領域において同定した。多くのこれらの反復配列を、個々の反復に特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。複数の反復を含んだフラグメントを、ｃＤＮＡから増幅し、このように、特定の反復の存在を確認し、そしてこれらの反復の順序の確立を可能にした。
【０１９１】
思いがけないことに、異なるデータベースおよび実験室供給源由来の種々のセットのＯ７７２Ｐ配列を分析した場合、少なくとも２０の異なる反復構造（互いに十分なレベルの同一性を各々有する（表６を参照のこと））を、Ｏ７７２Ｐ遺伝子の５’領域およびＯ７７２Ｐタンパク質の対応するＮ末端領域において同定した。各々の反復は、ポリペプチド単位をコードする連続オープンリーディングフレーム（これは、１つ以上の他の反復とスプライシングされ得る）を含み、その結果、この反復のコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｏｍｅｒ）が、異なる数および異なる順序で形成される。興味深いことに、Ｏ７７２Ｐについて本明細書中で記載されるドメインと類似の反復構造ドメインを有する他の分子が、科学文献に記載されている。例えば、ムチンファミリーのタンパク質（これは、気道、消化管および尿管の内側を覆う細胞の表面をコーティングする粘膜（ｍｕｃｏｕｓ）の主要な糖タンパク質成分である）が、縦列反復配列から構成されることが示され、この配列は、ムチンごとに数、長さおよびアミノ酸配列が変化する（Ｐｅｒｅｚ−ＶｉｌａｒおよびＨｉｌｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４５）：３１７５１〜３１７５４、１９９９）。
【０１９２】
本明細書中で示される種々の同定された反復構造は、Ｏ７７２Ｐの複数の形態を生じさせることが期待され、これは、おそらく選択的スプライシングによる。この同定された反復のｃＤＮＡ配列を、配列番号５１３〜５４０、配列番号５４２〜５４６および配列番号５４８〜５６７に示す。この反復のコードされたアミノ酸配列を、配列番号５７４〜５９３に示す。多くの場合において、これらのアミノ酸配列は、１を超える実験由来の配列の整列から誘導されたコンセンサス配列を示す。
【０１９３】
これらのスプライス形態の各々は、独特のＯ７７２Ｐタンパク質をコードし得、複数の反復ドメインが、膜貫通領域を含むＯ７７２Ｐの定常カルボキシ末端タンパク質部分に付着した。Ｏ７７２Ｐ定常領域のｃＤＮＡ配列を、配列番号５６８に示し、そしてコードされたアミノ酸配列を、配列番号５９４に示す。
【０１９４】
得られたすべての入手可能なＯ７７２Ｐ配列を、その同定可能な反復に分解し、そしてこれらの配列を、重みつき残基重量表を用いたＣｌｕｓｔａｌ法（ＤＮＡＳＴＡＲ配列分析パッケージの中のＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア）を使用して比較して、反復配列間の関係を同定した。この情報、ＲＴ−ＰＣＲによって提供される順序データおよびＳｅｑＭａｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いた配列整列（自動および手動）を用いて、２０の別個の反復単位を含む１つの例示的なコンセンサス全長Ｏ７７２Ｐコンティグを同定した。このＯ７７２Ｐ ｃＤＮＡコンティグについてのｃＤＮＡを、配列番号５６９に示し、そしてこのコードされたアミノ酸配列を、配列番号５９５に示す。Ｏ７７２Ｐタンパク質のこの形態は、以下の順序で、以下のコンセンサス反復構造を含む：
配列番号５７２−配列番号５７４−配列番号５７５−配列番号５７６−配列番号５７７−配列番号５７８−配列番号５７９−配列番号５８０−配列番号５８１−配列番号５８２−配列番号５８３−配列番号５８４−配列番号５８５−配列番号５８６−配列番号５８７−配列番号５８８−配列番号５８９−配列番号５９０−配列番号５９１−配列番号５９２−配列番号５９３。
【０１９５】
従って、配列番号５９５は、Ｏ７７２Ｐタンパク質についての１つの例示的な全長のコンセンサス配列を示す。しかし、上記で議論されるように、このタンパク質の現在の知識に基づいて、そして類似の反復構造を含むタンパク質を記載する科学文献に基づいて、多くの他の形態のＯ７７２Ｐが、より多くの反復またはより少ない反復のいずれかを有して存在することが期待される。さらに、多くの形態のＯ７７２Ｐが、これらのＮ末端反復構造の異なる配置（例えば、異なる順序）を有することが期待される。異なる数の反復を有する複数の形態のＯ７７２Ｐの存在は、Ｏ７７２Ｐのノーザン分析によって支持される。この研究において、Ｏ７７２Ｐ特異的プローブのノーザンハイブリダイゼーションは、いくつかは１０ｋｂを超える、Ｏ７７２Ｐとハイブリダイズする複数の転写物のスメアをもたらした。
【０１９６】
従って、Ｏ７７２タンパク質の可変反復領域は、構造Ｘｎ−Ｙによって例示的に示され得、ここで、Ｘは、配列番号５９６に示されるコンセンサス反復配列と少なくとも５０％の同一性を有する反復構造を含み；ｎは、タンパク質に存在する反復の数であり、そして代表的には、１〜およそ３５の整数であることが期待され；Ｙは、配列番号５９４に示されるＯ７７２Ｐ定常領域配列、または配列番号５９４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。Ｏ７７２Ｐ分子のＸｎ反復領域に存在する各々のＸは異なる。
【０１９７】
２０の反復領域の各々のコンセンサス配列を決定するために、別個の反復領域について実験的に決定された配列を整列し、そしてコンセンサス配列を決定した。個々の反復領域についてのコンセンサス配列の決定に加えて、コンセンサス反復配列もまた決定した。この配列を、２０の個々のコンセンサス配列の整列によって得た。個々の反復領域の各々由来のコンセンサスアミノ酸配列を、全体の反復コンセンサス配列と整列させることによって、反復の可変性を決定した。同一性データを、表６に示す。
【０１９８】
【表６】
Figure 0004942906
上述から、本発明の特定の実施形態が、本明細書中において、例示の目的で記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による限定を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｓ（配列番号１〜７１）は、代表的な分泌卵巣癌抗原をコードするポリヌクレオチドの部分配列を示す。
【図２】 図２Ａ〜２Ｃは、図１のクローンの３つについての全挿入配列を示す。図２Ａは、Ｏ７Ｅ（１１７３１；配列番号７２）と命名された配列を示す。図２Ｂは、Ｏ９Ｅ（１１７８５；配列番号７３）と命名された配列を示す。図２Ｃは、Ｏ８Ｅ（１３６９５；配列番号７４）と命名された配列を示す。
【図３】 図３は、Ｏ８Ｅと命名された卵巣癌配列のマイクロアレイ発現分析の結果を示す。
【図４】 図４は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型腫瘍性タンパク質ＴＡＸとオステオネクチンとの間のスプライス融合物である卵巣癌配列をコードするポリヌクレオチド（３ｇと命名された；配列番号７５）の部分配列を示す。
【図５】 図５は、３ｆ（配列番号７６）と命名された卵巣癌ポリヌクレオチドを示す。
【図６】 図６は、６ｂ（配列番号７７）と命名された卵巣癌ポリヌクレオチドを示す。
【図７】 図７Ａおよび７Ｂは、８ｅ（配列番号７８）および８ｈ（配列番号７９）と命名された卵巣癌ポリヌクレオチドを示す。
【図８】 図８は、１２ｃ（配列番号８０）と命名された卵巣癌ポリヌクレオチドを示す。
【図９】 図９は、１２ｈ（配列番号８１）と命名された卵巣癌ポリヌクレオチドを示す。
【図１０】 図１０は、３ｆと命名された卵巣癌配列のマイクロアレイ発現分析の結果を示す。
【図１１】 図１１は、６ｂと命名された卵巣癌配列のマイクロアレイ発現分析の結果を示す。
【図１２】 図１２は、８ｅと命名された卵巣癌配列のマイクロアレイ発現分析の結果を示す。
【図１３】 図１３は、１２ｃと命名された卵巣癌配列のマイクロアレイ発現分析の結果を示す。
【図１４】 図１４は、１２ｈと命名された卵巣癌配列のマイクロアレイ発現分析の結果を示す。
【図１５】 図１５Ａ−１５ＥＥＥは、代表的な分泌卵巣癌抗原をコードするさらなるポリヌクレオチド（配列番号８２〜３１０）の部分配列を示す。
【図１６】 図１６は、全長配列内の種々の部分的Ｏ８Ｅ配列の位置を示す図である。
【図１７】 図１７は、Ｏ８Ｅタンパク質上のエピトープマッピング研究の結果を示すグラフである。
【図１８】 図１８は、Ｏ８Ｅ細胞表面発現の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析のグラフである。
【図１９】 図１９は、Ｏ８Ｅ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析のグラフである。
【図２０】 図２０は、Ｏ８Ｅの細胞表面発現を実証する、Ｏ８ＥでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図２１】 図２１は、Ｏ８Ｅの細胞表面発現を実証する、ＳＫＢＲ３胸部腫瘍細胞についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図２２】 図２２は、ＨＥＫ ２９３細胞におけるＯ８Ｅの発現を示す。この細胞を、抗Ｏ８Ｅウサギポリクローナル抗血清＃２３３３Ｌでプローブした。
【図２３】 図２３は、抗Ｏ８Ｅウサギ血清のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図２４】 図２４は、親和性精製したウサギ抗Ｏ８Ｅポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図２５】 図２５は、抗Ｏ８Ｅ ｍＡｂの抗体内部移行を決定するグラフであり、アミノ酸６１〜８０に対するｍＡＢが、リガンドの内部移行を誘導することを示す。
【配列表】
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Claims (13)

  1. 配列番号３９８で示されるアミノ酸配列においてＯ８Ｅポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. その抗体または抗原結合フラグメントが毒素と結合されている、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  3. 毒素が、リシン毒素、アブリン毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質からなる群より選択される、請求項２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  4. その抗体または抗原結合フラグメントが放射性核種と結合されている、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  5. 放射性核種が、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉからなる群より選択される、請求項４に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  6. その抗体または抗原結合フラグメントが、配列番号３９１の配列によってコードされるポリペプチドに結合し、かつ該ポリペプチドが卵巣腫瘍細胞の細胞表面上に発現するものである、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  7. その抗体または抗原結合フラグメントが、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて、配列番号３９１の配列によってコードされる細胞表面上で発現されたポリペプチドに結合する際にインターナリゼーションを引き起こす、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメント、および生理学的に受容可能なキャリアを含む、卵巣癌の治療に使用するための薬学的組成物。
  9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメント、および検出試薬を含む、卵巣癌の診断に使用するための診断キット。
  10. 検出試薬がレポーター基を含む、請求項９に記載の診断キット。
  11. 配列番号３９８で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを用いてマウスを免疫することを含む、単離された抗体を製造する方法。
  12. 配列番号３９８で示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
  13. 請求項１２に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
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