CN1370182A

CN1370182A - 用于治疗和诊断肺癌的化合物和方法

Info

Publication number: CN1370182A
Application number: CN00807012A
Authority: CN
Inventors: 王彤彤; 范力群
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1999-04-02
Filing date: 2000-04-03
Publication date: 2002-09-18
Also published as: CA2369578A1; IL145731A0; WO2000061612A2; EP2028190A1; DE60039353D1; HK1049848A1; JP2002543769A; CZ20013527A3; EP1169347B1; AU4069200A; WO2000061612A3; NZ514818A; EA200101037A1; YU72901A; ATE399793T1; EA005140B1; MXPA01009962A; BR0009505A; HUP0200760A2; PL354348A1

Abstract

本发明提供用于治疗和诊断肺癌的化合物和方法。本发明化合物包括含有肺肿瘤蛋白质的至少一个部分的多肽。本发明还提供含有该多肽、或编码该多肽的DNA分子,用于免疫治疗肺癌的疫苗和药物组合物,以及用于制备本发明多肽的DNA分子。

Description

用于治疗和诊断肺癌的化合物和方法

技术背景

一般地，本发明涉及癌症，例如肺癌的治疗和诊断。更具体地，本发明涉及含有肺肿瘤蛋白质的至少一个部分的多肽，和编码这些多肽的多核苷酸。这些多肽和多核苷酸可以用于疫苗和药物组合物中以防止和治疗肺癌，以及诊断和监测这些癌症。

发明背景

在美国，肺癌是男性和女性癌症死亡的主要原因，据报道1994年就估计有172,000个新病例。无论诊断时疾病的阶段如何，在所有的肺癌患者中，5年的存活率仅为13％。这与当该疾病还处于局部时检测到的病例中46％的5年存活率形成对照。然而，仅有16％的肺癌在该疾病扩散之前被发现。

由于通常一直要到该痰病达到晚期时才可观察到临床症状，故早期检测是困难的。目前，该疾病的诊断借助于胸部X射线、对痰中所含的细胞类型的分析、和支气管通道的光纤检查。治疗方案取决于该癌症的类型和阶段，包括手术、放疗和/或化疗。尽管对于肺癌的治疗已有了相当多的研究，但该疾病仍难于医治。

因此，本领域对用于肺癌的改良疫苗、治疗方法和诊断技术仍存在需要。

发明概述

简而言之，本发明提供用于诊断和治疗癌症，例如肺癌的组合物和方法。一方面，本发明提供含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少一个部分的多肽。某些部分和其它变体具有免疫原性，以致该变体与抗原特异性抗血清的反应能力在相当大程度得到保持。在某些实施方案中，该多肽含有由选自下组的多核苷酸序列编码的序列：(a)SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、5-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、8、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253-337、345、347和349之任一个中所示的序列；(b)SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253-337、345、347和349之任一个中所示序列的变体；和(c)(a)或(b)序列的互补序列、在具体的实施方案中，本发明的多肽含有包括选自下组的氨基酸序列的肿瘤蛋白质的至少一个部分：SEQ ID NO：152、155、156、165、166、169、170、172、174、176、226-252、338-334和346之任意一个中的所示序列和其变体。

本发明还提供编码上述多肽的多核苷酸或其部分(例如编码肺肿瘤蛋白质的至少15个氨基酸残基的部分)，含有这些多核苷酸的表达载体和用这些表达载体转化或转染的宿主细胞。

在其它方面，本发明提供含有上述多肽或多核苷酸和生理学上可接受载体的药物组合物。

在本发明的一个相关方面，提供用于预防或治疗用途的疫苗。这些疫苗含有上述多肽或多核苷酸和免疫刺激剂。

本发明还提供药物组合物，其含有：(a)特异地与肺肿瘤蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段；和(b)生理学上可接受的载体。

在其它方面，本发明提供药物组合物，其含有：(a)表达上述多肽的抗原呈递细胞和(b)可药用载体或赋形剂。抗原呈递细胞包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和B细胞。

在相关方面中，本发明提供疫苗，其含有(a)表达上述多肽的抗原呈递细胞，和(b)免疫刺激剂。

在其它方面，本发明还提供含有至少一种上述多肽的融合蛋白，以及编码这些融合蛋白的多核苷酸。

在相关方面中，本发明提供含有融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸，及生理学上可接受载体的药物组合物。

在其它方面，本发明还提供含有融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸，及免疫刺激剂的疫苗。

在其它方面，本发明提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用上述药物组合物或疫苗。

在其它方面中，本发明还提供用于从生物样品中除去肿瘤细胞的方法，包括用特异地与肺肿瘤蛋白质反应的T细胞接触生物样品，其中该接触步骤在足以允许从该样品中除去表达该蛋白质的细胞的条件和时间下进行。

在相关方面，本发明提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用按上述方法处理过的生物样品。

在其它方面，本发明还提供用于刺激和/或扩增肺肿瘤蛋白质特异性T细胞的方法，包括在足以刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下，用以下一或多种物质接触T细胞：(i)上述多肽；(ii)编码该多肽的多核苷酸；和/或(iii)表达该多肽的抗原呈递细胞。本发明还提供含有按上述方法制备的T细胞的确定T细胞群。

在其它方面，本发明提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用有效量的上述T细胞群。

本发明还提供用于抑制患者体内癌症发展的方法，包括步骤：(a)用以下一或多种物质与来自患者的确定CD4+和/或CD8+T细胞一起孵育：(i)含有肺肿瘤蛋白质的至少免疫原性部分的多肽；(ii)编码该多肽的多核苷酸；和(iii)表达该多肽的抗原呈递细胞；和(b)给患者施用有效量的该增殖T细胞，并籍此抑制患者体内的癌症发展。在给患者施用之前，可以，但并不必须，对增殖细胞进行克隆。

在其它方面，本发明提供用于确定患者体内是否存在癌症的方法，包括：(a)用与上述多肽结合的结合剂接触获自患者的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；和(c)将该多肽量和预先确定的截断值(cut-off value)进行比较，由此确定患者体内是否存在癌症。在优选的实施方案中，该结合剂是抗体，更优选的是单克隆抗体。该癌症可以是肺癌。

在其它方面，本发明还提供用监测患者体内癌症进展趋势的方法。该方法包括步骤：(a)用与上述多肽结合的结合剂接触在第一时间点上从患者获得的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；(c)采用在随后的时间点上从该患者获得的生物样品，重复步骤(a)和(b)；和(d)将步骤(c)中检测到的多肽量和步骤(b)中检测到的量进行比较，并由此监测患者体内癌症的进展趋势。

在其它方面，本发明还提供用于确定患者体内是否存在癌症的方法，包括步骤：(a)用与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品；(b)检测该样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸，优选mRNA，的水平；和(c)将与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的水平与预确定的截断值进行比较，由此确定该患者体内是否存在癌症。在某些实施方案中，采用例如至少一个与编码上述多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应，检测该mRNA的量。在其它实施方案中，利用与编码上述多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸探针，采用杂交技术，检测该mRNA的量。

在相关方面，本发明提供用于监测患者体内癌症进展趋势的方法，包括步骤：(a)用与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品；(b)检测该样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；(c)采用在随后时间点上从该患者获得的生物样品，重复步骤(a)和(b)；和(d)将步骤(c)中检测到的多核苷酸量与步骤(b)中检测到的量进行比较，由此监测该患者体内癌症的进展趋势。

在其它方面，本发明提供与上述多肽结合的抗体，例如单克隆抗体，以及含有这些抗体的诊断试剂盒。还提供含有上述一或多个寡核苷酸探针或引物的诊断试剂盒。

参考以下详述和附图，本发明的这些和其它方面将是明了的。本文公开的所有文献特此以参考文献的形式完整地并入，如同每篇文献单独并入一样序列名称SEQ ID NO：1是LST-S2-2的测定的cDNA序列SEQ ID NO：2是LST-S2-28的测定的cDNA序列SEQ ID NO：3是LST-S2-90的测定的cDNA序列SEQ ID NO：4是LST-S2-144的测定的cDNA序列SEQ ID NO：5是LST-S2-133的测定的cDNA序列SEQ ID NO：6是LST-S2-169的测定的cDNA序列SEQ ID NO：7是LST-S2-6的测定的cDNA序列SEQ ID NO：8是LST-S2-11的测定的cDNA序列SEQ ID NO：9是LST-S2-17的测定的cDNA序列SEQ ID NO：10是LST-S2-25的测定的cDNA序列SEQ ID NO：11是LST-S2-39的测定的cDNA序列SEQ ID NO：12是LST-S2-43的第一种测定的cDNA序列SEQ ID NO：13是LST-S2-43的第二种测定的cDNA序列SEQ ID NO：14是LST-S2-65的测定的cDNA序列SEQ ID NO：15是LST-S2-68的测定的cDNA序列SEQ ID NO：16是LST-S2-72的测定的cDNA序列SEQ ID NO：17是LST-S2-74的测定的cDNA序列SEQ ID NO：18是LST-S2-103的测定的cDNA序列SEQ ID NO：19是LST-S2-N1-1F的测定的cDNA序列SEQ ID NO：20是LST-S2-N1-2A的测定的cDNA序列SEQ ID NO：21是LST-S2-N1-4H的测定的cDNA序列SEQ ID NO：22是LST-S2-N1-5A的测定的cDNA序列SEQ ID NO：23是LST-S2-N1-6B的测定的cDNA序列SEQ ID NO：24是LST-S2-N1-7B的测定的cDNA序列SEQ ID NO：25是LST-S2-N1-7H的测定的cDNA序列SEQ ID NO：26是LST-S2-N1-8A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：27是LST-S2-N1-8D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：28是LST-S2-N1-9A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：29是LST-S2-N1-9E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：30是LST-S2-N1-10A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：31是LST-S2-NI-10G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：32是LST-S2-N1-11A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：33是LST-S2-N1-12C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：34是LST-S2-N1-12E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：35是LST-S2-B1-3D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：36是LST-S2-B1-6C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：37是LST-S2-B1-5D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：38是LST-S2-B1-5F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：39是LST-S2-B1-6G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：40是LST-S2-B1-8A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：41是LST-S2-B1-8D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：42是LST-S2-B1-10A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：43是LST-S2-B1-9B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：44是LST-S2-B1-9F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：45是LST-S2-B1-12D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：46是LST-S2-I2-2B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：47是LST-S2-I2-5F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：48是LST-S2-I2-6B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：49是LST-S2-I2-7F的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：50是LST-S2-I2-8G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：51是LST-S2-I2-9E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：52是LST-S2-I2-12B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：53是LST-S2-H2-2C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：54是LST-S2-H2-1G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：55是LST-S2-H2-4G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：56是LST-S2-H2-3H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：57是LST-S2-H2-5G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：58是LST-S2-H2-9B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：59是LST-S2-H2-10H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：60是LST-S2-H2-12D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：61是LST-S3-2的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：62是LST-S3-4的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：63是LST-S3-7的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：64是LST-S3-8的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：65是LST-S3-12的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：66是LST-S3-13的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：67是LST-S3-14的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：68是LST-S3-16的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：69是LST-S3-21的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：70是LST-S3-22的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：71是LST-S1-7的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：72是LST-S1-A-1E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：73是LST-S1-A-1G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：74是LST-S1-A-3E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：75是LST-S1-A-4E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：76是LST-S1-A-6D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：77是LST-S1-A-8D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：78是LST-S1-A-10A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：79是LST-S1-A-10C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：80是LST-S1-A-9D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：81是LST-S1-A-10D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：82是LST-S1-A-9H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：83是LST-S1-A-11D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：84是LST-S1-A-12D的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：85是LST-S1-A-11E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：86是LST-S1-A-12E的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：87是L513S(T3)的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：88是L513S重叠群1的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：89是L514S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：90是L514S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：91是L516S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：92是L516S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：93是L517S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：94是LST-S1-169(又称L519S)的扩延cDNA序列。SEQ ID NO：95是L520S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：96是L520S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：97是L521S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：98是L521S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：99是L522S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：100是L523S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：101是L524S的测定的cDNA序列。SEQ ID N0：102是L525S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：103是L526S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：104是L527S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：105是L528S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：106是L529S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：107是L530S的第一种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：108是L530S的第二种测定的cDNA序列。SEQ ID NO：109是L531S短形式的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO：110是推测的SEQ ID NO：109编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：111是L531S长形式的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO：112是推测的SEQ ID NO：111编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：113是L520S的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO：114是推测的SEQ ID NO：113编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：115是重叠群1的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：116是重叠群3的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：117是重叠群4的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：118是重叠群5的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：119是重叠群7的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：120是重叠群8的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：121是重叠群9的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：122是重叠群10的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：123是重叠群12的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：124是重叠群11的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：125是重叠群13的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：126是重叠群15的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：127是重叠群16的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：128是重叠群17的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：129是重叠群19的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：130是重叠群20的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：131是重叠群22的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：132是重叠群24的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：133是重叠群29的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：134是重叠群31的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：135是重叠群33的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：136是重叠群38的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：137是重叠群39的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：138是重叠群41的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：139是重叠群43的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：140是重叠群44的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：141是重叠群45的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：142是重叠群47的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：143是重叠群48的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：144是重叠群49的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：145是重叠群50的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：146是重叠群53的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：147是重叠群54的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：148是重叠群56的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：149是重叠群57的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：150是重叠群58的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：151是L530S的全长cDNA序列。SEQ ID NO：152是SEQ ID NO：151编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：153是L514S第一个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO：154是L514S第二个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO：155是SEQ ID NO：153编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：156是SEQ ID NO：154编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：157是重叠群59的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：158是L763P(又称作重叠群22)的全长cDNA序列。SEQ ID NO：159是SEQ ID NO：158编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：160是L762P(又称作重叠群17)的全长cDNA序列。SEQ ID NO：161是SEQ ID NO：160编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：162是L515S的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：163是L524S第一个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO：164是L524S第二个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO：165是SEQ ID NO：163编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：166是SEQ ID NO：164编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：167是L762P第一个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO：168是L762P第二个变体的全长cDNA序列。SEQ ID NO：169是SEQ ID NO：167编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：170是SEQ ID NO：168编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：171是L773P(又称作重叠群56)的全长cDNA序列。SEQ ID NO：172是SEQ ID NO：171编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：173是L519S的扩延cDNA序列。SEQ ID NO：174是推测的SEQ ID NO：174编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：175是L523S的全长cDNA序列。SEQ ID NO：176是推测的SEQ ID NO：175编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：177是LST-sub5-7A的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：178是LST-sub5-8G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：179是LST-sub5-8H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：180是LST-sub5-10B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：181是LST-sub5-10H的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：182是LST-sub5-12B的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：183是LST-sub5-11C的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：184是LST-sub6-1c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：185是LST-sub6-2f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：186是LST-sub6-2G的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：187是LST-sub6-4d的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：188是LST-sub6-4e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：189是LST-sub6-4f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：190是LST-sub6-3h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：191是LST-sub6-5d的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：192是LST-sub6-5h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：193是LST-sub6-6h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：194是LST-sub6-7a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：195是LST-sub6-8a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：196是LST-sub6-7d的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：197是LST-sub6-7e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：198是LST-sub6-8e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：199是LST-sub6-7g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：200是LST-sub6-9f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：201是LST-sub6-9h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：202是LST-sub6-11b的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：203是LST-sub6-11c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：204是LST-sub6-12c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：205是LST-sub6-12e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：206是LST-sub6-12f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：207是LST-sub6-11g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：208是LST-sub6-12g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：209是LST-sub6-12h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：210是LST-sub6-II-1a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：211是LST-sub6-II-2b的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：212是LST-sub6-II-2g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：213是LST-sub6-II-1h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：214是LST-sub6-II-4a的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：215是LST-sub6-II-4b的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：216是LST-sub6-II-3e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：217是LST-sub6-II-4f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：218是LST-sub6-II-4g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：219是LST-sub6-II-4h的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：220是LST-sub6-II-5c的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：221是LST-sub6-II-5e的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：222是LST-sub6-II-6f的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：223是LST-sub6-II-5g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：224是LST-sub6-II-6g的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：225是L528S的氨基酸序列。SEQ ID NO：226-251是来源于L762P的合成肽。SEQ ID NO：252是L514S的表达氨基酸序列。SEQ ID NO：253是相应于SEQ ID NO：252的DNA序列。SEQ ID NO：254是L762P表达结构的DNA序列。SEQ ID NO：255是克隆23785的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：256是克隆23786的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：257是克隆23788的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：258是克隆23790的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：259是克隆23793的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：260是克隆23794的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：261是克隆23795的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：262是克隆23796的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：263是克隆23797的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：264是克隆23798的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：265是克隆23799的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：266是克隆23800的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：267是克隆23802的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：268是克隆23803的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：269是克隆23804的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：270是克隆23805的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：271是克隆23806的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：272是克隆23807的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：273是克隆23808的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：274是克隆23809的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：275是克隆23810的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：276是克隆23811的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：277是克隆23812的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：278是克隆23813的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：279是克隆23815的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：280是克隆25298的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：281是克隆25299的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：281是克隆25299的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：282是克隆25300的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：283是克隆25301的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：284是克隆25304的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：285是克隆25309的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：286是克隆25312的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：287是克隆25317的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：288是克隆25321的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：289是克隆25323的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：290是克隆25327的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：291是克隆25328的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：292是克隆25332的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：293是克隆25333的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：294是克隆25336的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：295是克隆25340的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：296是克隆25342的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：297是克隆25356的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：298是克隆25357的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：299是克隆25361的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：300是克隆25363的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：301是克隆25397的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：302是克隆25402的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：303是克隆25403的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：304是克隆25405的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：305是克隆25407的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：306是克隆25409的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：307是克隆25396的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：308是克隆25414的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：309是克隆25410的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：310是克隆25406的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：311是克隆25306的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：312是克隆25362的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：313是克隆25360的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：314是克隆25398的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：315是克隆25355的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：316是克隆25351的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：317是克隆25331的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：318是克隆25338的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：319是克隆25335的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：320是克隆25329的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：321是克隆25324的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：322是克隆25322的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：323是克隆25319的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：324是克隆25316的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：325是克隆25311的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：326是克隆25310的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：327是克隆25302的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：328是克隆25315的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：329是克隆25308的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：330是克隆25303的测定的cDNA序列。SEQ ID NO：331-337是p53肿瘤抑制基因的同系物p63的同种型的cDNA序列(又称L530S)。SEQ ID NO：338-344分别是SEQ ID NO：331-337编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：345是抗原L763P的第二种cDNA序列。SEQ ID NO：346是SEQ ID NO：345序列编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：347是L523S的测定的全长cDNA序列。SEQ ID NO：348是推测的SEQ ID NO：347编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：349是编码L773PN端部分的cDNA序列。SEQ ID NO：350是L773P N端部分的氨基酸序列。发明详述

正如以上指出的，本发明一般指向用于治疗和诊断癌症例如肺癌的组合物和方法。本文所述组合物可以包括肺肿瘤多肽、编码这些多肽的多核苷酸、抗体等结合剂、抗原呈递细胞(APC)和/或免疫系统细胞(例如T细胞)。本发明多肽一般含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少一个部分(例如免疫原性部分)。“肺肿瘤蛋白质”是当采用本文提供的代表性分析方法测定时，以高于正常组织中的表达水平至少2倍、优选至少5倍的水平在肺肿瘤细胞中表达的蛋白质。某些肺肿瘤蛋白质是(在免疫测定法中，例如ELISA或Western印迹)可检测地与肺癌患者抗血清反应的肿瘤蛋白质。本发明的多核苷酸一般含有编码该多肽的全部或部分的DNA或RNA序列、或与该序列互补的序列。抗体一般是指能与上述多肽结合的免疫系统蛋白质、或其抗原结合片段。抗原呈递细胞包括表达上述多肽的树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和B细胞。可以用于这些组合物的T细胞一般是对上述多肽具有特异性的T细胞。本发明以发现的人肺肿瘤蛋白质为基础。编码具体肿瘤蛋白质的多核苷酸序列见SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349。肺肿瘤蛋白质的多核苷酸

编码本文所述肺肿瘤蛋白质、或其部分或其它变体的任何多核苷酸均包括在本发明内。优选的多核苷酸含有编码肺肿瘤蛋白质一部分的至少15个连续核苷酸、优选至少30个连续核苷酸、更优选至少45个连续核苷酸。更优选地，多核苷酸编码肺肿瘤蛋白质的免疫原性部分。与任何这些序列互补的多核苷酸也包括在本发明之内。多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并以一对一形式与DNA分子对应的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。本发明多核苷酸中可以，但不必须，存在其它编码或非编码序列，而且可以，但不必须，将多核苷酸与其它分子和/或支持材料连接在一起。

多核苷酸可以含有天然序列(即编码肺肿瘤蛋白质或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体。多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，以致所编码的多肽的免疫原性相对于天然肿瘤蛋白质得到保持。一般可以按本文所述方法评价对该编码多肽的免疫原性的影响。变体优选表现出与编码天然肺肿瘤蛋白质或其部分的多核苷酸序列有至少约70％的一致性、更优选至少约80％的一致性、最优选至少约90％的一致性。术语“变体”也包括异种来源的同源基因。

如果在按下述方法进行最大匹配比对后，两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则认为这两个序列是“一致的”。典型地，两个序列之间的比较通过在比较窗中对序列进行比较以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。本文所用“比较窗”是指具有至少约20个连续位置，通常30-约75个，40-约50个连续位置的区段，在该区段中可以在两个序列最佳对齐后比较该序列与具有相同连续位置数目的参考序列。

为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。该程序体现了以下文献中所述的几个比对策略：Dayhoff，M.O.(1978)蛋白质的进化改变模型-检测远缘关系的矩阵，见Dayhoff，M.O.(编)《蛋白质序列和结构图集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，国立生物化学研究基金会，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.(1990)比对和系统发生的统一方法，第626-645页，《酶学方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，SanDiego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P，M.(1989)CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《数值分类学-数值分类学的原理和实践》(Numerical Taxonomy-the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：726-730。

优选地，“序列一致性百分数”通过在至少有20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了获得两个序列的最佳比对，与参考序列(不含有插入或缺失)相比，该比较窗中的该多核苷酸或多肽序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即间隔区)。该百分数的计算方法是：确定这两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以获得匹配位置数，用该匹配位置数除以该参考序的总位置数(即该窗的大小)，然后将所获结果乘以100以产生该序列一致性百分数。

变体还可以，或者是作为替代方案可以，和天然基因，或其部分或互补序列在相当大程度上同源。这些多核苷酸变体能够在中等严紧条件下与编码天然肺肿瘤蛋白质的天然存在DNA序列(或互补序列)杂交。适合的中等严紧条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在5×SSC中50℃-65℃杂交过夜；之后用含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC于65℃ 20分钟各进行2次洗涤。

本领域的普通技术人员将明了，由于遗传密码的简并性，有许多编码本文所述多肽的多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与所有天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸是本发明所具体考虑的。而且，含有本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也属于本发明的范围。等位基因是由于一或多个突变，例如核苷酸的缺失、添加和/或替代，而造成改变的内源性基因。所导致的mRNA和蛋白质可以，但不必，具有改变的结构或功能。可以采用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。

多核苷酸可以采用多种技术中的任一种来制备。例如，可以按以下详细描述的方法，通过筛选微阵列cDNA寻找肿瘤相关表达(即，按本文提供的代表性分析方法测定的、在肿瘤细胞中比在正常组织中高出至少2倍的表达)，鉴定多核苷酸。可以采用Synteni微阵列(Palo Alto，CA)，根据厂家说明书(以及基本上按Schena等，美国国家科学院院刊93：10614-10619，1996和Heller等，美国国家科学院院刊94：2150-2155，1997中所描述的方法)，进行这些筛选。或者，可以从表达本文所述蛋白质的细胞(例如肺肿瘤细胞)中制备cDNA，然后从该cDNA扩增多肽。这些多核苷酸可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。对于该方法，序列特异性引物可以基于本文所提供的序列进行设计，并可以通过购买或合成获得。

根据熟知技术，可以采用扩增的部分从适合的文库(例如肺肿瘤cDNA文库)中分离全长基因。在这些技术中，可采用一或多个多核苷酸探针或适于扩增的引物筛选文库(cDNA或基因组文库)。优选地，对文库进行大小筛选以包括较大分子。还可以优选随机引物产生的文库(randomprimed libraries)以鉴定基因的5’和上游区域。优选基因组文库以获得内含子和延伸的5’序列。

对于杂交技术，可以采用熟知技术(例如用32P通过切口平移或末端标记)标记部分序列。然后通过用该标记探针杂交含有变性的细菌菌落(或含有噬菌斑的菌苔)的滤膜，筛选细菌或噬菌体文库(见Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989)。筛选和扩增杂交的菌落或噬菌斑，并分离该DNA用于进一步分析。可以通过例如PCR，采用来自该部分序列的引物和来自载体的引物，分析cDNA克隆以确定额外序列的量。可以制备限制性图谱和部分序列，以鉴定一个或多个重叠克隆。然后采用标准技术确定该完整序列，这些技术可能涉及产生一系列缺失克隆。然后将该所获重叠序列组装成一个连续序列。可以采用熟知技术，通过将适合的片段连接在一起，产生全长cDNA分子。

作为可选择的方案，有许多扩增技术可以用于从部分cDNA序列获得全长编码序列。在这些技术中，一般通过PCR进行扩增。可以采用多种可从商业途径获得的试剂盒中的任一种，实施扩增步骤。引物可以采用例如本领域熟知的软件来设计。引物优选长22-30个核苷酸，具有至少50％的GC含量，并可以在约68℃-72℃的温度下与靶序列退火。可以按以上所述方法对扩增区域进行测序，然后将重叠的序列组装成一个连续序列。

一个这样的扩增技术是反向PCR(见Triglia等，核酸研究(Nucl.Acids Res。)16：8186，1988)，该技术采用限制性酶在基因的已知区域中产生片段。然后，通过分子内连接使该片段环化，并作为模板与来源于该已知区域的背驰引物(divergent primers)一起用于PCR。在另一个方法中，与部分序列相邻的序列可以通过采用针对接头序列的引物和已知区域所特异的引物进行扩增来获得。典型地，该扩增序列采用相同的接头引物和该已知区域所特异的第二个引物进行第二轮扩增。该方法的一个变体采用了从该已知区域以相反方向起始延伸的两个引物，其描述于WO 96/38591中。另一种此类技术称作“cDNA末端的快速扩增”或RACE。该技术涉及到应用一个内部引物和一个与polyA区域或载体序列杂交的外部引物来鉴定已知序列的5’和3’序列。其它技术包括捕获PCR(capturePCR)(Lagerstrom等，PCR方法应用(PCR Methods Applic.)1：111-19，1991)和步行PCR(walking PCR)(Parker等，核酸研究19：3055-60，1991)。还可以采用其它利用扩增的方法以获得全长cDNA序列。

在某些情况下，可以通过分析已表达序列标志(EST)数据库，例如可从GenBank获得的EST数据库中提供的序列，获得全长cDNA序列。一般可以采用熟知程序(例如NCBI BLAST搜索程序)搜索重叠的EST，并可以采用这些EST产生连续的全长序列。还可以通过分析基因组片段获得全长DNA序列。

编码肺肿瘤蛋白质的部分的一些cDNA分子核酸序列见SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349。

多核苷酸变体一般可以通过本领域已知的任何方法来制备，包括通过例如固相亚磷酰胺化学合成法进行化学合成。还可以采用标准诱变技术，例如寡核苷酸指导的位点特异性诱变(见Adelman等，DNA 2：183，1983)，在多核苷酸序列中引入修饰。或者，可以通过体外或体内转录编码肺肿瘤蛋白质或其部分的DNA序列，产生RNA分子，前提是将该DNA序列插入带有适合RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6)的载体中。按本文所述，某些部分可以用于制备编码的多肽。此外，或作为可供选择的方案，可以给患者施用部分序列，以便体内产生该编码多肽(例如通过用编码肺肿瘤多肽的cDNA结构转染抗原呈递细胞，例如树突细胞，然后给该患者施用此转染的细胞)。

还可以将与编码序列互补的部分序列(即反义多核苷酸)用作探针，或用以调节基因表达。还可以将能够转录出反义RNA的cDNA结构引入组织的细胞中，以便于反义RNA的产生。按本文所述，可以利用反义多核苷酸抑制肿瘤蛋白质的表达。反义技术通过形成三股螺旋妨碍双螺旋充分展开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力，可以用于控制基因表达(见Gee等，Huber和Carr，《分子和免疫学方法(Molecular andImmunologic Approaches)》，Futura Pulishing Co.(Mt.Kisco，NY；1994))。或者，可以设计反义分子与基因控制区域(例如启动子、增强子或转录起始位点)杂交并阻断该基因的转录；或通过抑制转录本与核糖体的结合阻断翻译。

还可以将部分编码序列或互补序列设计成探针或引物以检测基因表达。探针可以用多种报道基团(例如放射性核素和酶)标记，并优选长至少10个核苷酸，更优选长至少20个核苷酸，甚至更优选长至少30个核苷酸。正如以上指出的，引物优选长22-30个核苷酸。

可以对任何多核苷酸作进一步修饰，以增加其在体内的稳定性。可能的修饰包括，但不限于，在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在骨架中采用硫代硫酸酯或2’O-甲基而非磷酸二酯酶键；和/或在其中包含非常规碱基，例如次黄苷、queosine、wybutosine，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基、甲基、硫代、及其它修饰形式。

可以采用成熟的重组DNA技术将本文所描述的核苷酸序列与各种其它核苷酸序列连接起来。例如，可以将多核苷酸克隆在多种克隆载体的任意一种中，这些载体包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒。尤其有意义的载体包括表达载体、复制载体、探针制备用载体和测序载体。一般地，载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记。其它元件将由期望的用途决定，并且将是本领域普通技术人员所明了的。

在某些实施方案中，可以对多核苷酸进行配制，以便使其能进入哺乳动物细胞中，并在其中表达。这些制剂对于治疗目的是尤其有用的，见下述。本领域普通技术人员将明了，实现多核苷酸在靶细胞中的表达有多种途径，而且可以采用任何适合的方法来进行。例如，可以将多核苷酸导入病毒载体中，这些载体例如，但不限于，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、或痘苗病毒或其它痘病毒(例如禽类痘病毒)。还可以将多核苷酸作为裸质粒载体进行施用。用于将DNA插入这些载体中的技术是本领域普通技术人员所熟知的。此外，逆转录病毒载体还可以转移或掺入基因作为选择标记(以帮助鉴定或筛选转导的细胞)和/或导向部分，例如针对特异靶细胞上受体的配体的编码基因，以使该载体具有靶标特异性。也可以采用抗体，通过本领域配体技术人员已知的方法，实现导向。

用于治疗目的的其它制剂包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米囊剂(nanocapsules)、微球体、小珠，和基于脂质的系统，包括水包油型乳剂、微胶粒、混合微胶粒、和脂质体。用作体外和体内递送载体的优选胶体系统是脂质体(即人造膜载体)。这些系统的制备和应用是本领域所熟知的。肺肿瘤多肽

在本发明的上下文中，本文所述多肽可以含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分。正如以上所指出的，“肺肿瘤蛋白质”是肺肿瘤细胞表达的蛋白质。作为肺肿瘤蛋白质的蛋白质与肺癌患者的抗血清之间的反应可在免疫测定(例如ELISA)中检测到。本文所述多肽可以是任何长度。还可以存在来源于该天然蛋白质和/或异源序列的其它序列，而且这些序列可以(但不必须)也具有免疫原或抗原性质。

“免疫原性部分”在本文中用于指被B细胞和/T细胞表面抗原受体识别(即特异结合)的蛋白质部分。这些免疫原性部分一般含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少5个氨基酸残基、更优选至少10个、甚至更优选至少20个氨基酸残基。某些优选的免疫原性部分包括N端前导序列和/或跨膜域已经缺失的肽。其它优选的免疫原性部分可以相对于成熟蛋白质含有小的N-和/或C-端缺失(例如1-30个氨基酸，优选5-15个氨基酸)。

一般可以采用熟知的技术，例如Paul，基础免疫学(FundamentalImmunology)，第3版，第243-247页(Raven Press，1993)及其中所引用的文献中总结的那些技术，鉴定免疫原性部分。这些技术包括筛选能够与抗原特异性抗体、抗血清和/或T细胞系或克隆反应的多肽。本文中，如果抗血清和抗体特异地与抗原结合(即在ELISA或其它免疫测定中它们与该蛋白质反应，而且检测不到它们与无关蛋白质的反应)，则它们是“抗原特异性的”。这些抗血清和抗体可以按本文所述并采用熟知技术制备。天然肺肿瘤蛋白质的免疫原性部分是(例如在ELISA和/或T细胞反应性测定中)以基本上不低于该全长多肽的反应性的水平与这些抗血清和/或T细胞反应的部分。这些免疫原性部分可以在这些测定试验中以类似于或高于该全长多肽的反应性的水平反应。一般可以采用本领域普通技术人员熟知的方法，例如描述于Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中的那些技术，进行此筛选。例如，可以将多肽固定在固相支持物上，并用患者血清与之接触以允许该血清中的抗体与该固定化多肽结合。然后除去未结合的血清，并采用例如125I标记的A蛋白检测结合的抗体。

正如以上指出的，组合物可以含有天然肺肿瘤蛋白质的变体。本文所述多肽“变体”是指与天然肺肿瘤蛋白质相差一或多个替代、缺失、添加和/或插入以致基本上保持了多肽的免疫原性的多肽。换言之，相对于天然蛋白质，变体与抗原特异性抗血清的反应能力可以有所增强或不发生改变，或可以相对于该天然蛋白质有不足50％、优选不足20％的降低。一般可以通过对一种上述多肽序列进行修饰，然后评价该修饰多肽与本文所述抗原特异性抗体或抗血清的反应性，从而鉴定这些变体。优选的变体包括其中一或多个部分，例如N端前导序列或跨膜域已经被除去的那些变体。其它优选的变体包括已从成熟蛋白质的N和/或C端除去了一个小部分(例如1-30个氨基酸，优选5-15个氨基酸)的变体。

多肽变体优选表现出(按上述方法测定)与所指定的多肽有至少约70％、更优选至少约90％、最优选至少约95％的一致性。

优选地，变体含有保守替代。“保守替代”是指一个氨基酸替代具有相似性质的另一个氨基酸，以致肽化学领域的技术人员将预期该多肽的二级结构和亲水性质基本上不发生改变。一般可以基于氨基酸残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或双亲性质，进行氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有非荷电极性头部基团、具有相似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其它氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体可以还，或作为可替代方案，含有非保守改变。在一个优选实施方案中，变体多肽与天然多肽相差5个或更少个氨基酸的替代、缺失或添加。还(或者作为可选择方案)可以通过例如缺失或添加对该多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质产生最小影响的氨基酸，修饰变体。

正如以上指出的，多肽可以在该蛋白质的N末端含有在翻译的同时或在翻译后指导该蛋白质转移的信号(或前导)序列。该多肽还可以和接头或其它序列偶联，以利于该多肽的合成、纯化或鉴定(例如poly-His)，或增强该多肽与固相支持物的结合。例如，可以将多肽与免疫球蛋白的Fc区偶联。

多肽的制备可以采用多种熟知技术中的任意一种。采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任何一种，可以容易地从本文所述的DNA序列制备这些序列编码的重组多肽。可以在任何一种用含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的适合宿主细胞中实现表达。适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母、高等真核细胞和植物细胞。优选地，该宿主细胞采用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系例如COS或CHO。首先可以采用可商业购买获得的滤器，浓缩来自将重组蛋白或多肽分泌至培养基中的适合宿主/载体系统的上清液。浓缩后，可以将该浓缩物应用到适合的纯化基质例如亲和基质或离子交换树脂上。最后，可以采用一或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组多肽。

还可以通过合成手段，采用本领域普通技术人员熟知的技术，制备具有少于约100个氨基酸、一般少于约50个氨基酸的多肽部分和其它变体。例如，可以采用任何一种商业可获得的固相技术，例如Merrifield固相合成法，通过将氨基酸顺序地添加到生长的氨基酸链上，合成这些多肽。见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。用于自动合成多肽的仪器可从供应商例如Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision(Foster City，CA)处购买获得，并可以按厂家说明书进行操作。

在某些具体的实施方案中，多肽可以是含有多个上述多肽的融合蛋白，或含有至少一个上述多肽及无关序列(例如已知的肿瘤蛋白质)的融合蛋白。融合伴侣(fusion partner)可以例如协助提供T辅助细胞表位(免疫学融合伴侣)，优选人类所识别的T辅助细胞表位，或可以协助使该蛋白质比该原来的重组蛋白以更高的产量表达(表达增强子)。某些优选的融合伴侣既是免疫学融合伴侣又是表达增强融合伴侣。可以选择其它融合伴侣，以便增加该蛋白质的可溶性或使该蛋白质能被导向期望的细胞内区室。再其它融合伴侣包括利于该蛋白质纯化的亲和标记物。

融合蛋白一般可以采用包括化学偶联在内的标准技术制备。优选地，将融合蛋白表达为重组蛋白质，以便使其相对于非融合蛋白在表达系统中的产生水平提高。简而言之，可以单独地将编码这些多肽成分的DNA序列组装起来，然后连接至适合的表达载体中。将编码一个多肽成分的DNA序列的3’末端与编码第二多肽成分的DNA序列的5’末端，在有或无肽接头时相连，以便这些序列的阅读框同相。这就使得可以翻译成保留了这两个多肽成分的生物学活性的单个融合蛋白质。

可以采用肽接头序列将该第一和第二多肽成分分开一段足够长的距离，以保证每一个多肽都折叠成其二级和三级结构。该多肽接头序列可以采用本领域熟知的标准技术并入融合蛋白中。可以基于以下因素选择适合的肽接头序列：(1)其能够采取柔性伸展构象；(2)不能采取能与该第一和第二多肽的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可以和该多肽的功能性表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于该接头序列中。可以用作接头的有用氨基酸序列包括那些公开于如下文献中的序列：Maratea等，基因(Gene)40：39-46，1985；Murphy等，美国国家科学院院刊83：8258-8262，1986；美国专利4,935,233和美国专利4,751,180。接头序列一般可以长1-约50个氨基酸。当该第一个和第二个多肽具有能够用以分开这些功能域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，则无需接头序列。

将这些相连的DNA序列可操作地与适当的转录或翻译调节元件连接在一起。负责DNA表达的调节元件仅置于编码该第一多肽的DNA序列的5’端。同样，终止翻译所必需的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码该第二多肽的DNA序列的3’端。

本发明还提供含有本发明多肽及无关免疫原性蛋白质的融合蛋白。优选地该免疫原性蛋白质能够引起回忆应答。这些蛋白质的实例包括破伤风、结核和肝炎蛋白(见例如Stoute等，New Engl.J.Med.，336：86-91(1997))。

在优选的实施方案中，免疫学融合伴侣来源于D蛋白，即革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的一种表面蛋白质(WO 91/18926)。优选地，D蛋白的衍生物含有该蛋白质的大约三分之一(first third)(例如N端的头100-110个氨基酸)，而且可以对D蛋白衍生物进行脂化。在某些优选实施方案中，N端包括了D脂蛋白融合伴侣的头109个残基，以提供具有额外外源性T细胞表位的多肽并增强其在大肠杆菌中的表达水平(由此起到表达增强子的作用)。该脂类尾部保证了该抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。其它融合伴侣包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。尽管可以采用包括T辅助细胞表位在内的不同片段，但典型地采用此N端81个氨基酸。

在另一个实施方案中，该免疫学融合伴侣是称作LYTA的蛋白质，或其部分(优选C端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该细菌合成一种称作酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；基因(Gene)43：265-292，1986)。LYTA是一种特异降解该肽聚糖骨架中某些键的自溶素。该LYTA蛋白的C端区域负责与胆碱或某些胆碱类似物例如DEAE的亲和。该性质已被利用来开发表达融合蛋白的大肠杆菌表达C-LYTA的质粒。对在氨基端含有该C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化已有描述(见生物技术(Biotechnology)10：795-798，1992)。在一个优选的实施方案中，可以将LYTA的重复部分掺入融合蛋白中。重复部分存在于从第178个残基起始的C端区域中。尤其优选的重复部分包括第188-305位残基。

一般地，本文所述多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其最初环境中被分离出来的多肽或多核苷酸。例如，如果将天然存在的蛋白质和其自然系统中的一些或全部共存物质分开，则该蛋白质是“分离的”。优选地，这些多肽有至少约90％的纯度、更优选至少约95％的纯度，最优选至少约99％的纯度。例如，如果将多核苷酸克隆在非其自然环境一部分的载体中，则该多核苷酸被认为是分离的。结合剂

本发明还提供特异地与肺肿瘤蛋白质结合的药剂，例如抗体和其抗原结合片段。在本文中，如果抗体或其抗原结合片段(在例如ELISA中)以可检测得到的水平与肺肿瘤蛋白质反应，而在相似条件下不能检测到其与无关蛋白质的反应时，则被认为与肺肿瘤蛋白质“特异结合”。本文所用“结合”是指两个独立分子之间的非共价联接以致形成复合物。结合能力可以通过例如测定形成该复合物的结合常数来评价。结合常数是当用各成分的浓度乘积除该复合物的浓度时获得的值。一般地，在本文的上下文中，当形成复合物的结合常数大于约103L/mol时，两个化合物被认为是“相结合的”。该结合常数可以采用本领域熟知的方法测定。

采用本文提供的代表性测定方法，结合剂还能够区分患者是否患有癌症，例如肺癌。换言之，与肺肿瘤蛋白质结合的抗体或其它结合剂将在至少约20％患有该病的患者中产生指示癌症存在的信号，而将在至少约90％未患该病的个体中产生指示癌症不存在的信号。为了确定结合剂是否满足此要求，可以按本文所述方法测定在来自(用标准临床检验确定的)患有和未患癌症的患者的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检组织)中是否存在与该结合剂结合的多肽。很明显，分析的患病和未患病样品的数量应当具有统计学显著性。每个结合剂都应满足以上标准；然而，本领域普通技术人员将知道，可以联合使用多个结合剂以提高灵敏度。

满足以上要求的任何药剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含有或不含有肽成分的核糖体、RNA分子或多肽。在一个优选实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。抗体的制备可以采用本领域普通技术人员已知的多种技术中的任意一种。见例如Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，可以通过细胞培养技术制备抗体，包括按本文所述制备单克隆抗体，或通过用抗体基因转染适合的细菌或哺乳动物细胞宿主，以便使得可以产生重组抗体。在一项技术中，首先给多种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊)中的任一种注射含有本发明多肽的免疫原。在该步骤中，可以将本发明的多肽不经修饰用作免疫原。或者，尤其是对于相对短的多肽，如果将该多肽与载体蛋白质，例如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白，连接在一起，则可以引起极佳的免疫应答。给该动物宿主注射该免疫原，并优选地根据预先确定的时间表掺入一或多次加强免疫，然后定期采取该动物的血液。然后可以从抗血清中，通过例如采用与适合固相支持物偶联的该多肽进行亲和层析，纯化对该多肽具有特异性的多克隆抗体。

对目的抗原多肽具有特异性的单克隆抗体可以采用例如Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)，及其改良方法来制备。简而言之，这些方法涉及制备能够产生具有期望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的永生化细胞系。可以从例如获自按上述方法免疫的动物的脾细胞制备这些细胞系。然后通过例如和骨髓瘤细胞融合伴侣，优选与该免疫动物同基因的骨髓瘤细胞，融合，使该脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将该脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度铺在支持杂种细胞而不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选的筛选技术采用了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)筛选。在足够长的时间之后，通常为约1-2周，可观察到杂种集落。选择单集落，并测试其培养物上清液与本发明多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。

可以从培养的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，还可以采用各种技术增加产量，例如将该杂交瘤细胞系注射入适合脊椎动物宿主例如小鼠的腹腔内。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术例如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提从这些抗体中除去杂质。本发明多肽可以用于纯化方法的例如亲和层析步骤中。

在某些实施方案中，可能优选采用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段，它们可以采用标准技术制备。简而言之，可以通过在A蛋白珠柱上通过亲和层析从兔血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通过木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段。该Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通过亲和层析分离。

可以将本发明的单克隆抗体与一或多种治疗剂偶联在一起。在此方面适合的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和它们的衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单孢菌外毒素、志贺氏菌毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。

治疗剂可以与适合的单克隆抗体直接或间接地(即通过接头基团)偶联(例如共价键合)。当药剂和抗体均具有能够与另一个反应的取代基时，它们之间的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团，例如氨基或巯基，可以和另一个上的含有羰基的基团例如酐或酰基卤，或含有容易离去的基团(例如卤素)的烷基反应。

或者，可能期望将治疗剂和抗体通过接头基团偶联。接头基团能够作为间隔起作用使抗体和药剂分隔开，以便避免对结合性能的干扰。接头基团还可以用于增强药剂或抗体上取代基的化学反应性，由此增加偶联效率。化学反应性的增强还可以促进药剂、或药剂上功能基团的应用，否则将不可能实现这种应用。

本领域技术人员将明了，有多种功能相同和相异的双功能或多功能试剂(例如描述于Pierce化学制品公司(Rockford，IL)的产品目录中的那些)可以用作该接头基团。可以通过例如氨基、羧基、巯基或氧化糖残基实现偶联。有许多文献描述过该方法学，例如Rodwell等的美国专利4,671,958。

当治疗剂游离于本发明治疗偶联物的抗体部分而更为有效时，可能期望采用在内化进行细胞过程中或之后可切割的接头基团。已有过许多不同的可切割接头基团的描述。在细胞内从这些接头基团处释放出药剂的机制包括由二硫键还原(例如Spitler的美国专利4,489,710)、光不稳定键的辐射(例如Senter等的美国专利4,625,014)、衍生的氨基酸侧链的水解(例如Kohn等的美国专利4,638,045)、血清补体介导的水解(例如Rodwell等的美国专利4,671,958)、和酸催化的水解(例如Blattler等的美国专利4,569,789)引起的断裂。

可能期望将一个以上的药剂与抗体偶联。在一个实施方案中，一个药剂的多个分子与一个抗体分子偶联。在另一个实施方案中，一种以上类型的药剂可以和一个抗体偶联。无论具体的实施方案如何，可以有多种途径制备带有一个以上药剂的免疫偶联物。例如，可以将一个以上的药剂直接与一个抗体分子偶联，或可以采用提供多个连接位点的接头。或者，可以采用载体。载体可以以多种方式携带这些药剂，包括直接或通过接头基团的共价键合。适合的载体包括蛋白质例如白蛋白(例如Kato等的美国专利4,507,234)、肽和多糖例如氨基葡聚糖(例如Shih等的美国专利4,699,784)。载体还可以通过非共价结合或通过包入例如脂质体囊中(例如美国专利4,429,008和4,873,088)携带药剂。特异用于放射性核素药剂的载体包括放射性卤化小分子和螯合化合物。例如美国专利4,735,792公开了代表性的放射性卤化小分子和它们的合成。可以从螯合化合物形成放射性核素螯合物，这些螯合化合物包括那些含有氮和硫原子作为结合金属、或金属氧、放射性核素的供体原子的螯合化合物。例如，Davison等的美国专利4,673,562公开了代表性的螯合化合物和它们的合成。

可以采用多种途径施用这些抗体和免疫偶联物。典型地，可以静脉内、肌内、皮下或在切除肿瘤床(bed of a resected tumor)中给药。很明显，该抗体/免疫偶联物的精确剂量将随所用的抗体、肿瘤上的抗原密度、和抗体的清除率而改变。T细胞

免疫治疗组合物可以还，或者作为替代方案可以，含有肺肿瘤蛋白质特异性T细胞。这些细胞一般可以在体外或离体采用标准程序制备。例如，可以采用商业上可获得的细胞分离系统，例如可从NexellTherapeutics公司(Irvine，CA)获得的IsolexTM系统，从患者的骨髓、外周血、或骨髓或外周血组分分离T细胞(也参见美国专利5,240,856；美国专利5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)。或者，可以从相关或无关的人、非人哺乳动物、细胞系或培养物获得T细胞。

可以用肺肿瘤多肽、编码肺肿瘤多肽的多核苷酸和/或表达该多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。该刺激在足以产生对该多肽特异的T细胞的条件和时间下进行。优选地，将肺肿瘤多肽或多核苷酸置于递送载体中，例如微球体中，以利于特异性T细胞的产生。

如果T细胞特异增殖、分泌细胞因子或杀伤被覆肺肿瘤多肽或表达编码该多肽的基因的靶细胞，则该T细胞被认为是肺肿瘤多肽特异的。T细胞的特异性可以采用多种标准技术中的任一种进行评价。例如，在铬释放测定或增殖测定中，相对于阴性对照，在裂解和/或增殖方面超过2倍的刺激指数增加指示T细胞的特异性。这些测定可以按例如Chen等，癌症研究(Cancer Res.)54：1065-1070，1994中的描述进行。或者，可以通过各种已知技术检测T细胞的增殖。例如，可以通过测量DNA合成速率的增加(例如通过用含氚胸苷脉冲标记T细胞培养物并测量掺入DNA中的含氚胸苷的量)，检测T细胞的增殖。和肺肿瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应导致T细胞增殖的至少2倍增加。正如采用标准细胞因子测定方法所测量的，在该测定方法中细胞因子(例如TNF或IFN-γ)释放水平增加2倍指示T细胞的激活(见Coligan等，当代免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)，第1卷，Wiley Interscience(Greene 1998))，按以上所述接触2-3小时应导致T细胞的激活。响应肺肿瘤多肽、多核苷酸或表达该多肽的APC而激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+的。可以采用标准技术扩增肺肿瘤蛋白质特异性T细胞。在优选的实施方案中，这些T细胞来源于患者、或相关或无关的供体，并在刺激和扩增后被用于该患者。

对于治疗目的，可以在体外或体内扩增响应肺肿瘤多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T细胞的数量。可以有多种途径来实现这些T细胞的体外增殖。例如，可以在添加了或未添加T细胞生长因子(例如白介素2)和/或合成肺肿瘤多肽的刺激细胞的情况下，将这些T细胞重新暴露于肺肿瘤多肽或相应于该多肽免疫原性部分的短肽中。或者，可以通过克隆大量扩增在存在肺肿瘤蛋白质时增殖的一或多种T细胞的数量。克隆细胞的方法是本领域所熟知的，包括有限稀释。药物组合物和疫苗

在某些方面，可以将本文所公开的多肽、多核苷酸、T细胞和/或结合剂掺入药物组合物或免疫原性组合物(即疫苗)中。药物组合物含有一或多种这些化合物及生理学上可接受载体。疫苗可以含有一或多种这些化合物和免疫刺激剂。免疫刺激剂可以是增强或加强针对外源性抗原的免疫应答的任何物质。免疫刺激剂的例子包括佐剂、生物可降解微球体(例如polylactic galactide)和脂质体(所述化合物被掺入其中；见例如Fullerton，美国专利4,235,877)。疫苗的制备一般描述于例如M.F.Powell和M.J.Newman编，“疫苗的设计(亚单位和佐剂方法)(Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)”，Plenum Press(NY，1995)。属于本发明范围的药物组合物和疫苗还可以含有其它化合物，这些化合物可以具有或没有生物学活性。例如，可以将其它肿瘤抗原的一或多个免疫原性部分并入融合多肽中或作为独立的成分存在于该组合物或疫苗中。

药物组合物或疫苗可以含有编码一或多种上述多肽的DNA，以便原位产生该多肽。正如以上所指出的，该DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统的任一种中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术是本领域所熟知的，例如描述于Rolland，Crit.Rev.Therop.Drug Carrier Systems 15：143-198，1998，和其中的引用文献中的那些技术。适合的核酸表达系统含有在患者中进行表达所必需的DNA序列(例如适合的启动子和终止信号)。细菌递送系统涉及到施用在其细胞表面表达该多肽免疫原性部分或分泌该表位的细菌(例如卡介菌(Bacillus-Calmette-Guerrin))。在一个优选的实施方案中，可以采用病毒表达系统(例如痘苗病毒或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)引入该DNA，这可能涉及到非致病性(缺陷性)可复制病毒的使用。适合的系统公开于例如Fisher-Hoch等，美国国家科学院院刊86：317-321，1989；Flexner等，Ann，N.Y.Acad.Sci.569：86-103，1989；Flexner等，疫苗(Vaccine)8：17-21，1990；美国专利4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO89/01973；美国专利4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner，生物技术(Biotechniques)6：616-627，1988；Rosenfeld等，科学(Sciene)252：431-434，1991；Kolls等，美国国家科学院院刊91：215-219，1994；Kass-Eisler等，美国国家科学院院刊90：11498-11502，1993；Guzman等，血液循环(Circulation)88：2838-2848，1993；和Guzman等，Cir.Res.73：1202-1207，1993。用于将DNA引入这些表达系统的技术是本领域普通技术人员熟知的。这些DNA也可以是“裸露的”，参见例如Ulmer等，科学259：1745-1749，1993，综述参见Cohen，科学259：1691-1692，1993。可以通过将裸露的DNA包被在可以有效地运送入细胞的生物可降解小珠上，增加该DNA的摄取。

尽管在本发明的药物组合物中可采用本领域普通技术人员已知的任何适合载体，但载体的类型将随给药模式的改变而改变。可以对本发明的组合物进行配制以用于适当的给药方式，包括例如局部、口服、鼻腔、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对于非胃肠道给药，例如皮下注射，该载体优选含有水、盐水、乙醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服用药，可以采用以上任一种载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸镁。还可采用生物可降解微球体(例如polylactate polyglycolate)作为载体用于本发明的药物组合物。适合的生物可降解微球体公开于例如美国专利4,897,268和5,075,109。

这些组合物还可以含有缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、糖类(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、螯合剂例如EDTA或谷胱苷肽、佐剂(例如氢氧化铝)和/或防腐剂。或者，可以将本发明的组合物制成冻干物。还可以采用熟知的技术将化合物装入脂质体中。

在本发明的疫苗中可以采用多种免疫刺激剂中之任一种。例如，可以将佐剂包括在内。大多数佐剂含有设计用以防止抗原快速代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答的刺激剂，例如脂质A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)来源的蛋白质。可从商业途径获得适合的佐剂，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKlineBeecham，Philadalphia，PA)；铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐类；酰化酪氨酸的不溶性悬浮物；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂A(monophosphoryllipid A)和quil A。细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12，也可以用作佐剂。

在本文提供的疫苗中，优选对佐剂组合物进行设计以诱导主要是Th1型免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导针对所施用抗原的细胞介导免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进诱导体液免疫应答。在施用本文所提供的疫苗后，患者将支持包括Th-1和Th-2型应答在内的免疫应答。在应答主要是Th-1型的优选实施方案中，Th-1型细胞因子的水平将比Th2-型细胞因子的水平有更高程度的增加。这些细胞因子的水平可以采用标准测定方法容易地评价。对于细胞因子家族的综述，参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。

用于引起主要是Th-1型应答的优选佐剂包括，例如单磷酰脂A，优选3-脱氧酰化单磷酰脂A(3D-MPL)，与铝盐的组合。MPL佐剂可从RibiImmunoChem Research公司(Hamilton，MT)获得(见美国专利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中该CpG二核苷酸未被甲基化)也诱导主要是Th1应答。这些寡核苷酸是熟知的，并描述于例如WO96/02555和WO 99/33488。免疫刺激性DNA序列还描述于，例如Sato等，科学273：352，1996。另一优选的佐剂是皂苷，优选QS21(Aquila Biopharmaceuticals公司，Framingham，MA)，其可以单独或联合其它佐剂一起使用。例如，一个增强系统包括单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合，例如WO94/00153中所述的QS21和3D-MPL的组合，或WO96/33739中所述的用胆固醇淬灭了QS21并具有较小反应原性的组合物。其它优选制剂包含水包油型乳剂和生育酚。WO95/17210描述了一种尤其有效的在水包油型乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的佐剂制剂。

其它优选的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，法国)，SAF(Chiron，California，美国)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS系列佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，可从SmithKline Beecham，Rixensart，比利时获得)，Detox(Ribi ImmunoChem Research公司，Hamilton，MT)，RC-529(Ribi ImmunoChem Research公司，Hamilton，MT)和氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGPs)。

本文提供的所有疫苗均可以采用将抗原、免疫应答增强剂和适合的载体或赋形剂组合在一起的熟知方法制备。本文所述组合物可以作为持续释放制剂(即，施用后实现化合物的缓慢释放的胶囊、海绵或凝胶(例如由多糖组成的)等制剂)的部分施用。这些制剂一般可以采用熟知技术(见例如Coombes等，疫苗(Vaccine)14：1429-1438，1996)制备，并通过例如口服、直肠或皮下植入，或通过在期望靶位置的植入进行施用。持续释放制剂可以含有多肽、多核苷酸或抗体，它们可以被分散在载体基质中和/或包含在控速膜包围形成的贮存池中。

用于这些制剂的载体具有生物适合性，并还可以是可生物降解的；优选地，该制剂提供相对恒定水平的活性成分释放。这些载体包括poly(latide-co-glycolide)微粒，以及聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素和葡聚糖。其它延迟释放载体包括超分子生物载体，它们含有一个非液体亲水核心(例如交联的多糖或寡糖)和任选的含有双亲化合物例如磷酸脂的外层(见例如美国专利5,151,254和PCT申请WO94/20078、WO94/23701和WO96/06638)。包含在持续释放制剂中的活性化合物的量取决于植入位置、释放速率和预期的持续时间，以及待治疗或预防的疾病性质。

在药物组合物和疫苗中可以采用多种递送载体中的任一种，以促进产生靶向肿瘤细胞的抗原特异性免疫应答。递送载体包括抗原呈递细胞(APC)、例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可以经改造成为有效APC的其它细胞。这些细胞可以，但不必须，经遗传修饰，以增强呈递抗原的能力、改善对T细胞应答的激活和/或维持、本身具有抗肿瘤作用和/或与受体在免疫学上相容(即，匹配的HLA单倍型)。一般可以从多种生物学液体或器官(包括肿瘤和肿瘤周围组织)中的任一种分离APC，而且APC可以是自体的、同种异体、同系的、或异种的细胞。

本发明的某些优选实施方案采用树突细胞或其祖先细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是极为有效的APC(Banchereau和Steinman，自然(Nature)392：245-251，1998)，而且已经显示其与生理学佐剂在引起预防性或治疗性抗肿瘤免疫方面同样有效(见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529，1999)。一般地，树突细胞可以基于其典型型状(在原位是星形，而体外可见到有明显的细胞质突起(树突))、其高效摄取、加工和呈递抗原的能力、和其激活幼稚T细胞应答的能力来鉴定。当然，可以对树突细胞进行改造以表达通常在体内或离体时树突细胞上并不存在的特定细胞表面受体或配体，而且这些修饰的树突细胞是本发明所考虑到的。作为树突细胞的替代物，可以在疫苗中采用携带抗原的分泌小泡的树突细胞(称作外来体)(见Zitvogel等，Nature Med.4：594-600，1998)。

树突细胞和其祖先细胞可以从外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周围组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或任何其它适合的组织或体液中获得。例如，可以通过将细胞因子的组合例如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα加入从外周血收获的单核细胞的培养物中，离体分化树突细胞。或者，可以通过将GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或诱导树突细胞分化、成熟和增殖的其它化合物的组合加入培养基中，使收获自外周血、脐带血或骨髓的CD34阳性细胞分化成树突细胞。

方便地，树突细胞被分为“未成熟”和“成熟”细胞，这样就允许通过一种简单的方式区分两种已良好表征的表型。然而，不应将此种命名理解为排除了所有可能的分化中间阶段。未成熟树突细胞被表征是具有强抗原摄取和加工能力的APC，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关联。成熟表型的典型特征是这些标记的较低表达，但负责T细胞激活的细胞表面分子例如I型和II型MHC、粘着分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)有高表达。

一般可以用编码肺肿瘤蛋白质(或其部分或其它变体)的多核苷酸转染APC，以便在该细胞表面表达该肺肿瘤多肽、或其免疫原性部分。按本文所述，该转染可以离体进行，然后可以将含有该转染细胞的组合物或疫苗用于治疗目的。或者，可以给患者施用靶向树突细胞或其它抗原呈递细胞的基因递送载体，以导致在体内发生转染。例如，树突细胞的体内和离体转染一般可以采用本领域已知的任何方法进行，例如WO97/2447中描述的那些方法，或者Mahvi等(免疫学和细胞生物学(Immunology and Cell Biology))75：456-460，1997)所述的基因枪法。可以通过树突细胞或其祖先细胞与该肺肿瘤多肽、DNA(裸露的或位于质粒载体中)或RNA；或与表达抗原的重组细菌或病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒载体)一起孵育，使树突细胞携载抗原。在携载之前，可以将该多肽与提供T细胞辅助的免疫学伴侣(例如载体分子)偶联。或者，可以用非偶联的免疫学伴侣单独地或在该多肽存在的同时脉冲树突细胞。

可以将疫苗和药物组合物置于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶中。优选将这些容器密封以保持直到使用前该制剂无菌。一般地，可以将制剂以悬浮液、溶液或乳剂的形式在油性或水性赋形剂中贮存。或者，可以将疫苗或药物组合物在冻干情况下贮存，临使用前只需加入无菌液相载体即可。癌症治疗

在本发明的其它方面，可以将本文所述组合物用于免疫治疗癌症、例如肺癌。在这些方法中，典型地给患者使用药物组合物和疫苗。本文所用“患者”是指任何恒温动物，优选人类。患者可以患有或可以未患有癌症。因此，以上药物组合物和疫苗可以用于预防癌症的出现或治疗癌症患者。可以采用本领域普遍接受的标准(包括恶性肿瘤存在的)，诊断癌症。可以在手术除去原发性肿瘤和/或实施例如施用放疗或常规化疗药物等治疗之前或之后，施用药物组合物和疫苗。

在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依靠施用免疫应答调节剂(例如本文公开的多肽和多核苷酸)体内刺激内源性宿主免疫系统产生抗肿瘤反应。

在其它实施方案中，免疫治疗可以是被动免疫治疗，其中治疗涉及到递送具有确定肿瘤免疫反应性、能够直接或间接地介导抗肿瘤效果的药剂(例如效应细胞或抗体)，而无需依赖完整的宿主免疫系统。效应细胞的例子包括以上讨论的T细胞、T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒T淋巴细胞和CD4+T辅助肿瘤浸润淋巴细胞)、杀伤细胞(例如自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞)、B细胞和表达本文提供的多肽的抗原呈递细胞(例如树突细胞和巨噬细胞)。可以对本文所述多肽的特异性T细胞受体和抗体受体进行克隆、表达、和转移至其它载体或效应细胞中用于过继免疫治疗。还可以采用本文提供的多肽制备抗体或抗独特型抗体(按以上所述和美国专利4,918,164中的方法)用于被动免疫治疗。

一般可以按本文所述方法，通过体外培养获得用于过继免疫治疗的足量效应细胞。用于将单抗原特异性效应细胞扩增至几十亿个并保留其体内抗原识别性质的培养条件是本领域熟知的。典型地，这些体外培养条件是通常在细胞因子(例如IL-2)和非分裂饲喂细胞存在时，利用抗原进行间歇性刺激。正如以上指出的，可以采用本文提供的免疫反应性多肽快速扩增抗原特异性T细胞培养物，以产生足够用于免疫治疗的细胞数目。具体地，采用本领域熟知的标准技术，可以用免疫反应性多肽脉冲(pulse)抗原呈递细胞例如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞或B细胞，或可以用一或多种多核苷酸转染抗原呈递细胞。例如，可以用含有适于在重组病毒或其它表达系统中增强表达的启动子的多核苷酸转染抗原呈递细胞。培养的效应细胞必需能够在体内生长和广泛分布，并且能够长期存活。研究表明，通过用补加IL-2的抗原进行反复刺激能够诱导相当大数量的培养效应细胞在体内生长并长期存活(见例如Cheever等，免疫学综述(Immunological Reviews)，157：177，1997)。

或者，可以将表达本文所述多肽的载体引入取自患者的抗原呈递细胞中，然后通过克隆和离体增殖后再移植回同一患者体内。可以采用本领域已知的任何手段，优选以无菌形式通过静脉内、腔内、腹膜内或肿瘤内施用，将转染的细胞重新导入该患者体内。

本文公开的治疗组合物的施用途径和频率及剂量将因人而异，而且可以采用标准技术容易地确定。一般地，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻腔途径(例如通过吸入)或口服，施用这些药物组合物和疫苗。优选地，可以在52周的一个期间中施用1-10个剂量。优选地，以间隔1个月的形式施用6个剂量，此后可以定期给予加强接种。替代接种方案可能对个别患者是适合的。适合的剂量为当按以上所述方法施用时，能够促进抗肿瘤免疫应答使其至少高于基础(即未处理的)水平10-50％的化合物的量。可以通过测量患者体内的抗肿瘤抗体，或通过能够体外杀伤该患者肿瘤细胞的细胞裂解性效应细胞的疫苗依赖性产生，监测该应答。这些疫苗还应该能够引起免疫应答，以导致与未接种的患者相比在接种的患者中出现改善的临床结果(例如，更频繁的症状缓解、完全或部分的或较长的无病存活)。一般地，对于含有一或多种多肽的药物组合物和疫苗，一个剂量中存在的每种多肽的量为每kg宿主约25μg-5mg。适合的剂量大小将随患者的体积而改变，但典型地在约0.1ml-约5ml之间。

一般地，适当的剂量和治疗方案提供足以获得治疗和/或预防益处的量的活性成分。可以通过确定与未治疗患者相比经治疗的患者出现改善的临床效果(例如更频繁的症状缓解、完全或部分的或较长的无病存活)，监测该应答。预先存在的抗肺肿瘤蛋白质的免疫应答的增加一般与改善的临床效果相关联。一般可以采用标准增殖、细胞毒或细胞因子测定，评价这些免疫应答，这些测定可以采用在治疗前和后从患者获得的样品进行。癌症检测方法

一般地，可以基于从患者获得生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检组织)中一或多种肺肿瘤蛋白质和/或编码这些蛋白质的多核苷酸的存在，检测该患者是否患有癌症。换言之，可以采用这些蛋白质作为标志指示是否存在癌症例如肺癌。此外，还可以采用这些蛋白质检测其它癌症。一般本文提供的结合剂可以检测生物样品中与该药剂结合的抗原的水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白质的mRNA的水平，该水平也指示了癌症的存在与否。一般地，肺肿瘤序列在肿瘤组织中应比在正常组织中高至少3倍的水平存在。

对于采用结合剂检测样品中的多肽标志而言，有多种本领域普通技术人员已知的测定形式可以使用。见例如Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，患者体内是否存在癌症可以通过以下步骤确定：(a)用结合剂接触从患者获得的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的水平；和(c)将该多肽水平与预先确定的截断值进行比较。

在一个优选的实施方案中，该测定涉及采用固定在固相支持物上的结合剂结合并从样品剩余物中分离该多肽。然后采用含有报道基团并特异与该结合剂/多肽复合物结合的检测试剂检测该结合的多肽。这些检测试剂可以含有例如，与该多肽特异结合的结合剂、或与该结合剂特异结合的抗体或其它药剂，例如抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可以利用竞争测定法，在该方法中用报道基团标记多肽，并在固定化结合剂与样品一起孵育后，允许该多肽和该结合剂结合。该样品中的成分对该标记多肽与该结合剂结合的抑制程度指示了该样品与该固定化结合剂的反应性。适合用于这些测定方法的多肽包括以上所述的全长肺肿瘤蛋白质和其与该结合剂结合的部分。

所述固相支持物可以是本领域普通技术人员已知的可以附着该肿瘤蛋白的任何材料。例如，该固相支持物可以是微量滴定板中的测试孔或硝酸纤维素或其它适合的膜。或者，该支持物可以是小珠或园盘，例如玻璃、玻璃纤维、胶乳、或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。该支持物还可以是磁性颗粒或光导纤维传感器，例如公开于美国专利5,359,681中的那些。可以采用本领域技术人员已知的各种技术将结合剂固定在固相支持物上，这些技术在此类专利和科学文献中有详细的描述。在本发明的上下文中，术语“固定”既指非共价连接例如吸附，又指共价结合(其可以是抗原和该支持物上的官能团之间的直接连接，或可以是通过交联剂形成的连接)。优选通过吸附固定在微量滴定板孔中或膜上。在这些情况下，可以通过在适合缓冲液中使结合剂与固相支持物接触适当长的时间来实现吸附。该接触时间随温度而改变，但典型的在约1小时至约1天之间。一般地，用约10ng-约10μg量、优选约100ng-约1μg量的结合剂接触一个塑料微量滴定板孔(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)，就足以固定足量的结合剂。

一般地，可以首先通过用既可以和支持物又可以和结合剂上的官能团，如羟基或氨基，反应的双功能剂与该支持物反应，实现结合剂与固体支持物的共价结合。例如，可以采用苯醌或通过支持物上的醛基和结合伴侣上胺及活性氢的缩合，使该结合剂与具有适当聚合物包衣的支持物共价结合(见例如Pierce免疫技术产品目录和手册(PierceImmunotechnology Catalog and Handbook)，1991，A12-A13)。

在某些实施方案中，该测定方法是双抗体三明治测定。该测定的操作方式可以是首先使固定在固相支持物上(通常是微量滴定板的孔中)的抗体与样品接触，以便该样品中的多肽可以与该固定的抗体结合。然后，从该固定的多肽-抗体复合物中除去未结合的样品，并加入含有报道基团的检测试剂(优选能够与该多肽上的不同部位结合的二抗)。然后采用适于该特定报道基团的方法，确定与该固相支持物保持结合的检测试剂的量。

更具体地，一旦该抗体按以上所述被固定在该支持物上后，典型地封闭该支持物上的剩余蛋白质结合位点。可以采用本领域普通技术人员已知的任何适合的封闭剂，例如牛血清白蛋白或Tween 20TM(SigmaChemical公司，St.Louis，MO)。然后将该固定化抗体与样品一起孵育，并使多肽可以和该抗体结合。在孵育前可用适合的稀释剂例如磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释该样品。一般地，适合的接触时间(即孵育时间)为足以在获自患有肺癌的个体的样品中检测到多肽存在的时间段。优选地，该接触时间足以使结合水平到达结合和未结合多肽之间达到平衡时结合水平的至少大约95％。本领域的普通技术人员将明了，通过测定一段时间内出现的结合水平，可以容易地确定达到平衡所必需的时间。在室温，约30分钟的孵育时间一般是足够的。

然后，通过用适当缓冲液，例如含有0.1％Tween 20TM的PBS，洗涤该固相支持物，除去未结合的样品。随后可以向该固相支持物加入含有报道基团的二抗。优选的报道基团包括以上所述的那些基团。

然后使检测试剂与该固定的抗体-多肽复合物一起孵育足够长时间以能检测到该结合多肽。适合的时间长度一般可以通过测定一段时间内出现的结合水平来确定。然后除去未结合的检测试剂，并利用该报道基团检测结合的检测试剂。用于检测该报道基团的方法取决于该报道基团的性质。对于放射性基团，一般液闪计数或放射自显影法是适合的。可以采用分光光度法检测染料、发光基团和荧光基团。可以采用偶联了一个不同的报道基团(通常是放射性基团或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白检测生物素。酶报道基团一般可以通过加入底物(一般持续一定时间段)，随后采用分光光度法或其它分析方法分析反应产物，以进行检测。

为了确定癌症(例如肺癌)是否存在，一般将所检测到的来自与该固相支持物保持结合的该报道基团的信号和相应于预确定截断值的信号进行比较。在一个优选实施方案中，用于癌症检测的截断值为当用该固定化抗体与从未患该癌症的患者获得的样品一起孵育时，所获得的信号的平均值。一般地，将所产生的信号高于该预确定截断值3个标准差的样品认定为癌症阳性。在另一个优选实施方案中，该截断值采用ReceiverOperator Curve，根据Sackett等(临床流行病学：临床医学的基础科学(Clinical Epidemiology：A Basic Science for Clinical Medicine)，Little Brown and Co.，1985，第106-7页)的方法确定。简而言之，在该实施方案中，将该诊断测试结果的每一个可能截断值所对应的成对真阳性率(即灵敏度)和假阳性率(100％特异性)作图，然后可以从该图确定该截断值。图上最接近左上角的截断值(即包括了最大面积的值)是最准确的截断值，而产生的信号高于该方法所确定的截断值的样品可以被认为是阳性的。或者，可以沿着该图向左移动该截断值，以最小化假阳性率，或向右移动以最小化假阴性率。一般地，产生的信号高于该方法所确定的截断值的样品被认为是癌症阳性。

在一个相关的实施方案中，该测定在流过或长条测试形式上进行，其中结合剂被固定在硝酸纤维素等膜上。在该流过测试中，当样品经过该膜时，样品中的多肽与固定化结合剂结合。然后当含有标记的第二结合剂的溶液流经该膜时，该第二结合剂将与该结合剂-多肽复合物结合。接着可以按以上所述方法检测结合的第二结合剂。在长条测试形式中，将结合了结合剂的膜的一端浸入含有样品的溶液中。该样品沿该膜迁移通过含有第二结合剂的区域并到达含有固定化结合剂的区域。在含有固定化结合剂的区域中第二结合剂的浓缩指示了癌症的存在。典型地，在该位置第二结合剂的浓缩产生能够通过肉眼观察的图形，例如线。无该图形，则指示阴性结果。一般地，对固定在该膜上的结合剂的量进行选择，以便当生物样品含有的多肽水平足以在该以上讨论形式的双抗体三明治测定中产生阳性信号时，可以产生肉眼可识别的图形。用于这些测定的优选结合剂是抗体和其抗原结合片段。优选地，固定在该膜上的抗体量在约25ng-约1μg之间，更优选在约50ng-约500ng之间。典型地用极少量的生物样品即能够进行这些测试。

当然，存在着适用于本发明肿瘤蛋白质或结合剂的许多其它测试方法。以上的描述仅旨在作为范例。例如，本领域的普通技术人员将明了，可以容易地对以上操作步骤进行修改，以采用肺肿瘤多肽检测生物样品中与这些多肽结合的抗体。这些抗体特异性肺肿瘤蛋白质的检测结果可以和癌症的存在相关联。

还可以，或者作为替代方案可以，基于生物样品中特异地与肺肿瘤蛋白质反应的T细胞的存在，检测癌症。在某些方法中，将分离自患者的含有CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与肺肿瘤多肽、编码该多肽的多核苷酸和/或表达该多肽的至少免疫原性部分的APC一起孵育，然后检测该T细胞是否被特异激活。适合的生物样品包括，但不限于，分离的T细胞。例如，可以根据常规技术(例如通过Ficoll/Hypaque密度梯度离心外周血淋巴细胞)，从患者分离T细胞。可以将T细胞和多肽(例如5-25μg/ml)在体外于37℃一起孵育2-9天(典型的是4天)。可能期望在无肺肿瘤多肽的情况下孵育另一份T细胞样品以用作对照。对于CD4+T细胞，优选通过评价该T细胞的增殖来检测激活。对于CD8+T细胞，优选通过评价细胞裂解活性来检测激活。与未患病患者相比，高至少2倍的增殖水平和/或高至少20％的细胞裂解活性指示患者患有癌症。

正如以上指出的，还可以，或者作为替代方案可以，基于生物样品中编码肺肿瘤蛋白质的mRNA的水平检测癌症。例如，可以在基于聚合酶链式反应的测定中采用至少两个寡核苷酸引物扩增来源于生物样品的肺肿瘤cDNA的部分，其中该寡核苷酸引物中的至少一个对编码该肺肿瘤蛋白质的多核苷酸是特异的(即可以与之杂交)。然后采用本领域熟知的技术，例如凝胶电泳，分离并检测该扩增的cDNA。相似地，可以在杂交测定中采用特异与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针，检测生物样品中是否存在编码该肿瘤蛋白质的多核苷酸。

为了保证在测定条件下发生杂交，寡核苷酸引物和探针应含有与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸的一部分有至少约60％、优选至少约75％、最优选至少90％一致性的寡核苷酸序列，其中该多核苷酸部分长至少10个核苷酸、优选至少20个核苷酸。优选地，寡核苷酸引物和/或探针将在本文所定义的中等严紧条件下与编码本文所公开多肽的多核苷酸杂交。可以用于本文所述诊断方法中的寡核苷酸引物和/或探针优选长至少10-40个核苷酸。在一个优选的实施方案中，该寡核苷酸引物含有如下DNA分子中的至少10个连续核苷酸、更优选至少15个核苷酸，该DNA分子具有SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349中所示序列。用于基于PCR的测定方法和杂交分析的技术是本领域熟知的(见例如Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263，1987；Erlich编，PCR技术(PCRTechnology)，Stockton Press，NY，1989)。

一个优选的测定法采用了RT-PCR，其中PCR联合逆转录一起使用。典型地，从生物样品，例如活检组织中提取RNA，然后将之逆转录以制备cDNA分子。采用至少一个特异引物进行PCR扩增以产生cDNA分子，该cDNA分子可以通过例如凝胶电泳进行分离和观察。可以对取自测试患者的样品和取自未患癌症的个体的样品进行扩增。该扩增反应可以在横跨两个数量级的几种cDNA稀释液中进行。典型地，该测试患者样品的几种稀释液与具有同样稀释度的非癌性样品相比在表达上的两倍或更高倍的增加被认为是阳性。

在另一个实施方案中，本公开的组合物可以用作癌症进展趋势的标志。在该实施方案中，可以在不同时间进行以上所述的用于癌症诊断的测定，并评价反应性多肽或多核苷酸水平的改变。例如，可以在6个月-1年的期间内每隔24-72小时进行一次该测定，之后按需要进行。一般地，如果患者体内所检测到的多肽或多核苷酸水平随时间的过去而增加，则该患者体内的癌症处于发展状态。相反，如果反应性多肽或多核苷酸的水平保持不变或随时间的过去而减少，则该癌症并非处于发展状态。

某些体内诊断分析方法可以直接在肿瘤上进行。一个这样的分析方法涉及用结合剂接触肿瘤细胞。然后通过报道基团直接或间接地检测该结合的结合剂。这些结合剂也可以用于组织学用途中。或者，可以在这些应用中采用多核苷酸探针。

正如以上指出的，为了提高灵敏度，可以在一个指定的样品中测定多个肺肿瘤蛋白质标志。应明了，对本文所提供的不同蛋白质具有特异性的结合剂可以联合用于一个测定试验中。而且，可以同时使用多个引物或探针。肿瘤蛋白质标志可以基于常规实验来选择，以确定导致最佳灵敏度的组合。此外，或者作为可替代方案，可以将用于测定本文所提供的肿瘤蛋白质的方法和用于测定其它已知肿瘤抗原的方法结合起来。诊断试剂盒

本发明还提供用于任一种以上诊断方法的试剂盒。这些试剂盒典型地含有进行诊断测定所必需的两种或多种成分。这些成分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒中的一个容器可含有特异与肺肿瘤蛋白质结合的单克隆抗体或其片段。可以将这些抗体或片段附着在以上所述的固体材料上一起提供。其它的一个或多个容器可以包括用于该测定的成分，例如试剂或缓冲液。这些试剂盒可以还，或者作为替代方案可以，包括上述含有适于直接或间接检测抗体结合的报道基团的检测试剂。

或者，可以将试剂盒设计为用于检测生物样品中编码肺肿瘤蛋白质的mRNA的量。这些试剂盒一般含有至少一个上述与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针或引物。例如，可以将该寡核苷酸用于PCR或杂交分析。该试剂盒中可以存在的其它成分包括便于检测编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸的第二寡核苷酸和/或诊断试剂或容器。

提供以下实施例作为举例说明，而非进行限制。

实施例1

分离和表征编码肺肿瘤多肽的cDNA序列

本实施例描述了从肺肿瘤cDNA文库中分离鳊码肺肿瘤特异性多肽的cDNA分子。A.从肺鳞状细胞癌文库分离cDNA序列

采用Superscript用于cDNA合成的质粒系统和质粒克隆试剂盒(BRLLife Technologies，Gaithersburg，MD 20897)，根据厂家说明书，从来自两名患者组织库的poly A+RNA构建人肺鳞状细胞癌eDNA表达文库。具体地，用polytron(Kinematica，瑞士)匀浆肺癌组织，然后采用Trizol试剂(BRL Life Technologies)按厂家指导提取总RNA。然后采用寡脱氧胸苷酸纤维素，按Sambrook等(分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989)所述的方法，纯化该poly A+RNA。采用NotI/Oligo-dT18引物合成第一链cDNA。合成双链cDNA，将其与BstXI/EcoRI连接子(Invitrogen，Carlsbad，CA)连接，然后用NotI消化。在用cDNA大小分级分离柱(BRL Life Technologies)进行大小分级分离后，将该cDNA连接到pCDNA3.1(Invitrogen)的BstXI/NotI位点中，并通过电穿孔转化ElectroMax大肠杆菌DH10B细胞(BRL LifeTechnologies)。

采用同样的程序，从含有4个组织标本的库中制备正常的人肺cDNA表达文库。通过确定独立菌落的数量、带有插入片段的克隆的百分数、插入片段的平均大小，并通过序列分析，对这些cDNA文库进行表征。该肺鳞状细胞癌文库含有2.7×106个独立菌落、100％的克隆含有插入片段而且插入片段的平均大小为2100个碱基对。该正常肺cDNA文库含有1.4×106个独立菌落、90％的克隆含有插入片段而且插入片段的平均大小为1800个碱基对。对于这两个文库，序列分析显示，大多数克隆含有从mRNA合成的全长cDNA序列。

采用以上肺鳞状细胞癌和正常肺cDNA文库，按稍作修饰的Hara等所述的方法(血液(Blood)，84：189-199，1994)，进行cDNA文库扣除。具体地，按下述制备肺鳞状细胞癌特异性扣除cDNA文库。用BamHI和XhoI消化正常组织cDNA文库(80μg)，之后用DNA聚合酶Klenow片段进行补平反应。酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，将该DNA溶解在133μl H2O中，热变性后与133μl(133μg)光探测生物素(Photoprobe biotin)(VectorLaboratories，Burlingame，CA)混合。按厂家推荐方法，用270W的太阳灯照射置于冰上的所获混合物20分钟。再加入67μl光探测生物素，并重复该生物素化反应。用丁醇抽提5次后，乙醇沉淀该DNA，并将其溶解在23μl H2O中形成驱动DNA(driver DNA)。

为了形成示踪DNA(tracer DNA)，用NotI和SpeI消化10μg肺鳞状细胞癌cDNA文库，酚氯仿抽提后通过Chroma spin-400柱(Clontech，Palo Acto，CA)。典型地，在经过大小选择柱后回收5μg cDNA。乙醇沉淀后，将该示踪DNA溶解在5μl H2O中。将示踪DNA与15μl驱动DNA和20μl 2×杂交缓冲液(1.5M NaCl/10mM EDTA/50mM HEPES pH7.5/0.2％十二烷基硫酸钠)混合，用矿物油覆盖，然后进行完全热变性。将该样品立即转移到68℃的水浴中，并孵育20个小时(长杂交[LH])。然后用链霉亲和素处理该反应混合物，之后进行酚/氯仿抽提。再重复该过程3次。沉淀扣除DNA、将其溶解在12μl H2O中，与8μl驱动DNA和20μl 2×杂交缓冲液混合，然后68℃杂交2小时(短杂交[SH])。除去生物素化的双链DNA后，将扣除DNA连接至氯霉素抗性pBCSK+(Stratagene，LaJolla，CA)的NotI/SpeI位点中，然后通过电穿孔转化ElecroMax大肠杆菌DH1OB细胞，产生肺鳞状细胞癌特异性扣除cDNA文库(文后称作“肺扣除文库I”)。

除了将来自于肺扣除文库I的8个频繁多次回收的基因包括在该驱动DNA中外，以类似于该肺扣除文库I的方式，构建第二个肺鳞状细胞癌特异性扣除cDNA文库(称作“肺扣除文库II”)，并回收了24,000个独立的克隆。

为了分析这些扣除cDNA文库，从这些扣除肺鳞状细胞癌特异性文库中随机挑取320个独立克隆，制备质粒DNA。在Perkin Elmer/AppliedBiosystems Division 373A型和/或377型自动测序仪(Foster City，CA)上，通过DNA测序对代表性cDNA克隆进行分析。在SEQ ID NO：1-60中提供了分离的60个克隆的cDNA序列。采用EMBL和GenBank数据库(Release 96)将这些cDNA序列与基因库中的已知序列进行比较。对于SEQID NO：2、3、19、38和46中所提供的序列，没有发现显著同源性。发现SEQ ID NO：1、6-8、10-13、15、17、18、20-27、29、30、32、4-37、39-45、47-49、51、52、54、55和57-59的序列表现出与以前鉴定的已表达序列标志(EST)有某种同源性。发现SEQ ID NO：9、28、31和33的序列表现出与以前鉴定的非人类基因序列有某种同源性，而发现SEQ ID NO：4、5、14、50、53、56和60的序列表现出与以前在人类中鉴定的基因序列有某种同源性。

采用以上肺鳞状细胞癌cDNA文库作为该示踪DNA，而以上正常肺组织cDNA文库和来自正常肝和心脏的cDNA文库(从由以上所述每种组织的一个样品组成的库进行构建的)，加上在肺扣除文库I和II中频繁多次回收的20个其它cDNA克隆，作为该驱动DNA，重复上述扣除步骤(肺扣除文库III)。该正常肝和心脏cDNA文库含有1.76×106个独立菌落，100％的克隆含有插入片段而且插入片段的平均大小为1600个碱基对。又分离了10个克隆(SEQ ID NO：61-70)。按以上所述，将这些cDNA序列与基因库中的序列进行比较，显示SEQ ID NO：62和67中提供的序列没有显著同源性。发现SEQ ID NO：61、63-66、68和69的序列表现出与以前分离的EST有某种同源性，而发现SEQ ID NO：70中提供的序列表现出与一个以前鉴定的大鼠基因有某种同源性。

在进一步的研究中，采用以上肺鳞状细胞癌cDNA文库作为该示踪DNA，而来自正常肺、肾、结肠、胰脏、脑、静息PBMC、心脏、皮肤和食道组成的库的cDNA文库作为该驱动DNA，其中食道cDNA占该驱动材料的三分之一，重复上述扣除步骤。由于食道富含正常上皮细胞，包括分化的鳞状细胞，该方法很可能富集肿瘤特异性而非组织特异性基因。在该扣除方法中确定的48个克隆的cDNA序列见SEQ ID NO：177-224。SEQ IDNO：177、178、180、181、183、187、192、195-197、208、211、212、215、216、218和219的序列表现出与以前鉴定的基因有某种同源性。SEQID NO：179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220和224的序列表现出与以前确定的EST有某种同源性。SEQ ID NO：221-223的序列表现出与任何以前确定的序列均无同源性。B.从肺腺癌文库分离cDNA序列

按以上所述方法构建人肺腺癌cDNA表达文库。该文库含有3.2×106个独立菌落，100％的克隆含有插入片段而且插入片段的平均大小为1500个碱基对。采用上述正常肺和正常肝和心脏cDNA表达文库作为驱动DNA，按上述方法进行文库扣除杂交。回收2600个独立克隆。

最初对100个独立克隆的cDNA序列分析显示有许多核糖体蛋白质基因。在此扣除杂交中分离的15个克隆的cDNA序列见SEQ ID NO：71-86。按上述进行这些序列与基因库中序列的比较，显示与SEQ ID NO：84中提供的序列没有显著同源性。发现SEQ ID NO：71、73、74、77、78和80-82的序列表现出与以前分离的EST有某种同源性，而发现SEQ ID NO：72、75、76、79、83和85的序列表现出与以前鉴定的人类基因有某种同源性。

在进一步的研究中，从转移性肺腺癌构建cDNA文库(称作mets3616A)。随机选自该文库的25个克隆的确定cDNA序列见SEQ IDNO：255-279。从该mets3616 cDNA文库中扣除制备自正常肺、肝、胰脏、皮肤、肾、脑和静息PBMC的库的cDNA文库。为了增加该扣除法的特异性，在该驱动物中掺入已被确定在该mets3616A cDNA文库中最丰富的基因例如EF1-α、整联蛋白β和抗凝蛋白PP4，以及以前发现的在扣除肺腺癌cDNA文库中差异表达的cDNA。从该扣除文库(称作mets3616A-S1)分离的51个克隆的测定cDNA序列见SEQ ID NO：280-330。

在SEQ ID NO：255-330的序列与公共数据库中的序列之间进行比较，显示与SEQ ID NO：255-258、260、262-264、270、272、275、276、279、281、287、291、296、300和310的序列没有显著同源性。SEQ ID NO：259、261、265-269、271、273、274、277、278、282-285、288-290、292、294、297-299、301、303-309、313、314、316、320-324和326-330的序列表现出与以前鉴定的基因序列有某种同源性，而SEQ ID NO：280、286、293、302、310、312、315、317-319和325的序列表现出与以前分离的已表达序列标志(ETS)有某种同源性。

实施例2

确定肺肿瘤多肽的组织特异性

采用基因特异性引物，通过RT-PCR测定实施例1所述的7种代表性肺肿瘤多肽在多种正常和肿瘤组织中的mRNA表达水平。

简而言之，采用Trizol试剂按以上所述从多种正常和肿瘤组织中提取总RNA。采用2μg总RNA和SuperScript II逆转录酶(BRL LifeTeehologies)于42℃孵育1个小时，合成第一链cDNA。然后采用基因特异性引物通过PCR扩增该cDNA。为了确保该RT-PCR的半定量性质，采用β-肌动蛋白作为每一个检测组织的内对照。采用1μl 1∶30的cDNA稀释液以使该β-肌动蛋白模板在线性范围内扩增，而且此cDNA量也具有足够的灵敏度以反映在该最初拷贝数中存在的差异。在这些条件下，测定来自每个组织的逆转录反应中该β肌动蛋白的水平。通过DNase处理，并通过保证在采用制备的第一链cDNA而不加入逆转录酶时为阴性PCR结果，最小化DNA污染。

在5种不同类型的肿瘤组织(来自3名患者的肺鳞状细胞癌、肺腺癌、来自2名患者的结肠癌、乳腺肿瘤和前列腺肿瘤)，和13种不同的正常组织(来自4名供体的肺、前列腺、脑、肾、肝、卵巢、骨骼肌、皮肤、小肠、胃、心肌、视网膜和睾丸)中，检测mRNA的表达水平。采用10倍量的cDNA，发现抗原LST-S1-90(SEQ ID NO：3)在肺鳞状细胞癌和乳腺肿瘤中以高水平表达，而在检测的其它组织中表达水平低或检测不到。

抗原LST-S2-68(SEQ ID NO：15)似乎是肺和乳腺肿瘤特异的，然而，在正常肾中也检测到其表达。抗原LST-S1-169(SEQ ID NO：6)和LST-S1-133(SEQ ID NO：5)似乎在肺组织(正常和肿瘤组织)中极为丰富，在大多数检测的正常组织中这两个基因的表达降低。LST-S1-169和LST-S1-133也在乳腺和结肠肿瘤中表达。抗原LST-S1-6(SEQ ID NO：7)和LST-S2-I2-5F(SEQ ID NO：47)没有表现出肿瘤或组织特异性表达，LST-S1-28的表达稀少仅可在少数几种组织中检测到。抗原LST-S3-7(SEQID NO：63)表现出肺和乳腺肿瘤特异性表达，当PCR进行30个循环后仅在正常睾丸中检测到其信息。当将该循环数增至35时在一些正常组织中检测到较低水平的表达。发现抗原LST-S3-13(SEQ ID NO：66)在4个肺肿瘤中的3个、一个乳腺肿瘤和两个结肠肿瘤样品中表达。与在肿瘤中相比，其在正常组织中的表达较低，仅在4个正常肺组织的一个中和肾、卵巢和视网膜的正常组织中检测到。抗原LST-S3-4(SEQ ID NO：62)和LST-S3-14(SEQ ID NO：67)的表达稀少而且未显示出任何组织或肿瘤特异性。与Northern印迹分析相一致，抗原LAT-S1-A-10A(SEQ ID NO：78)的RT-PCR结果提示，其在包括肺和结肠肿瘤在内的肺、结肠、胃和小肠组织中高表达，而在其它组织中其表达量低或无法检测到。

对上述在肺扣除文库I、II和III中分离的总共2002个cDNA片段进行菌落PCR扩增，并采用微阵列技术(Synteni，Palo Alto，CA)在肺肿瘤、正常肺、和各种其它正常和肿瘤组织中检测了它们的mRNA表达水平。简而言之，将这些PCR扩增产物以阵列格式点在载玻片上，在该阵列中每个产物占据独一个位置。从待测试的组织样品中提取mRNA，逆转录、然后制备荧光标记的cDNA探针。用这些标记的cDNA探针探测这些微阵列，扫描载玻片并测量荧光强度。该强度与杂交强度相关。17个非冗余cDNA克隆在肺鳞状细胞癌中表现出超量表达，在测试的正常组织(肺、皮肤、淋巴结、结肠、肝、胰脏、乳腺、心脏、骨髓、大肠、肾、胃、脑、小肠、膀胱和唾液腺)中的表达或检测不到，或低于肺鳞状肿瘤10倍。克隆L513S的部分测定cDNA序列见SEQ ID NO：87和88；L514S的见SEQ ID NO：89和90；L516S的见SEQ ID NO：91和92；L517S的见SEQ ID NO：93；L519S的见SEQ ID NO：94；L520S的见SEQ ID NO：95和96；L521S的见SEQ ID NO：97和98；L522S的见SEQ ID NO：99；L523S的见SEQ ID NO：100；L524S的见SEQ ID NO：101；L525S的见SEQ ID NO：102；L526S的见SEQ ID NO：103；L527S的见SEQ ID NO：104；L528S的见SEQ ID NO：105；L529S的见SEQ ID NO：106；和L530S的见SEQ IDNO：107和108。此外，SEQ ID NO：151中提供了L530S的全长cDNA序列，SEQ ID NO：152中提供了相应的推测氨基酸序列。L530S表现出与p53肿瘤抑制基因的拼接变体p63同源。SEQ ID NO：331-337中提供了7种已知的p63同种型的cDNA序列，而SEQ ID NO：338-344中分别提供了相应的推测氨基酸序列。

由于多态性，克隆L531S表现出有两种形式。测定的L531S的第一种全长cDNA序列见SEQ ID NO：109，其相应的推测氨基酸序列见SEQ IDNO：110。测定的L531S的第二种全长cDNA序列见SEQ ID NO：111，其相应的推测氨基酸序列见SEQ ID NO：112。除了SEQ ID NO：111的序列含有一个27bp的插入片段外，其与SEQ ID NO：109的序列一致。类似地，L514S也有两种不同的拼接形式；第一种变体cDNA见SEQ ID NO：153，其相应的氨基酸序列见SEQ ID NO：155。L514S第二种变体形式的全长cDNA见SEQ ID NO：154，其相应的氨基酸序列见SEQ ID NO：156。L524S(SEQ ID NO：101)的全长克隆产生两种变体(SEQ ID NO：163和164)，它们的相应推测氨基酸序列分别是SEQ ID NO：165和166。两种变体均表现出编码甲状旁腺激素相关肽。

分离L519S的全长cDNA的尝试导致分离获得SEQ ID NO：173中提供的扩延cDNA序列，其含有一个潜在的开放阅读框。SEQ ID NO：174中提供了SEQ ID NO：173的推测的编码氨基酸序列。此外，SEQ ID NO：100的克隆(称作L523S)的全长cDNA序列是一个已知的基因，见SEQ ID NO：175，而其相应的推测氨基酸见SEQ ID NO：176。在进一步的研究中，通过PCR扩增，采用从SEQ ID NO：175的序列设计的基因特异性引物，从L523S阳性肿瘤cDNA文库中分离了L523S的全长cDNA序列。该测定的cDNA序列见SEQ ID NO：**。该序列编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：**。该蛋白质与以前公开的蛋白质序列在两个氨基酸位置上，即第158和410位，不同。

按以上所述，将L514S和L531S的序列(分别是SEQ ID NO：87和88、89和90、及109)与基因库中的序列进行比较，显示其与已知序列没有显著同源性。发现L531S、L516S、L517S、L519S、L520S和L530S的序列(分别是SEQ ID NO：87和88、91和92、93、94、95和96、107和108)表现出与以前鉴定的EST有某种同源性。发现L521S、L522S、L523S、L524S、L525S、L526S、L527S、L528S和L529S(分别是SEQ ID NO：97和98、99、99、101、102、103、104、105、和106)是已知基因。测定的L520S的全长cDNA序列见SEQ ID NO：113，其相应的推测氨基酸序列见SEQ ID NO：114。随后的微阵列分析显示，L520除了在肺鳞状肿瘤中外还在乳腺肿瘤中超量表达。

进一步的分析说明，L529S(SEQ ID NO：106和115)、L525S(SEQ IDNO：102和120)和L527S(SEQ ID NO：104)是细胞骨架成分，并且潜在地是鳞状细胞特异性蛋白质，L529S是连接蛋白26，一种间隙连接蛋白质。其在肺鳞状肿瘤9688T中高表达，在其它两个鳞状肿瘤中适当地过量表达。然而，在正常皮肤、结肠、肝和胃中也可检测到连接蛋白26的较低水平表达。连接蛋白26在某些乳腺肿瘤中的过量表达已有报道，而且L529S的突变形式可以导致其在肺肿瘤中的过量表达。L525S是plakophilin 1，一种在皮肤的带斑粘着连接中发现的细胞桥粒蛋白质。L525S mRNA的表达水平在测试的4个肺鳞状肿瘤中的3个和正常皮肤中有很大的提高。L527S已被鉴定为角蛋白6的同种型，II型58Kd角蛋白，和细胞角蛋白13，并显示出在鳞状肿瘤中超量表达，而在正常皮肤、乳腺和结肠组织中低表达。值得注意的是，已有大量文献证明角蛋白和角蛋白相关基因是肺癌包括CYFRA2.1的潜在标志(Pastor，A.等，Eur.Respir.J.，10：603-609，1997)。L513S(SEQ ID NO：87和88)在测试的几种肿瘤组织中表现出中等程度的超量表达，其编码一个最初作为寻常性天疱疮抗原分离的蛋白质。

L520S(SEQ ID NO：95和96)和L521S(SEQ ID NO：97和98)在肺鳞状肿瘤中高表达，而且L520S在正常唾液腺中上调，而L521S在正常皮肤中超量表达。两者均属于富含脯氨酸的小蛋白质家族，并是完全分化的鳞状细胞的标志。L521S被描述为肺鳞状肿瘤的特异标志(Hu，R.等，肺癌(Lung Cancr)，20：25-30，1998)。L515S(SEQ ID NO：162)编码IGF-β2，而L516S是醛糖还原酶的同系物，两者均在肺鳞状肿瘤和正常结肠中以中等水平表达。值得注意的是，L516S(SEQ ID NO：91和92)在转移的肿瘤中而非原发性肺腺癌中表达上调，这说明其在癌转移中的潜在作用，是一个潜在的预示标志。L522S(SEQ ID NO：99)在肺鳞状肿瘤中以中等水平表达，而在正常组织中表达最少。L522S表现出属于IV型醇脱氢酶，即ADH7，而且其表达分布情况提示其是一个鳞状细胞特异性抗原。L523S(SEQ ID NO：100)在肺鳞状肿瘤、人胰腺癌细胞系和胰腺癌组织中以中等程度超量表达，这提示该基因可能是胰腺和肺鳞状细胞癌所共有的抗原。

L524S(SEQ ID NO：101)在测试的大多数鳞状肿瘤中超量表达，并与甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)同源，已十分清楚地知道其引起与恶性肿瘤例如白血病、前列腺和乳腺癌相关的体液高血钙。据信PTHrP还与肺鳞状癌极为相关，而与肺腺癌极少相关(Davidson，L.A.等，J.Pathol.，178：398-401，1996)。L528S(SEQ ID NO：105)在两个肺鳞状肿瘤中高度超量表达，而在另两个鳞状肿瘤、一个肺腺癌和一些正常组织，包括皮肤、淋巴结、心脏、胃和肺中适度表达。它编码与黑素细胞特异性基因Pmel17的前体相似的NMB基因，据报道该基因优选在潜在的低转移性黑素瘤细胞系中表达。这提示，L528S可能是黑素瘤和肺鳞状细胞癌中共有的抗原。L526S(SEQ ID NO：103)在测试的所有鳞状细胞肿瘤组织中均超量表达，而且表现出与基因(ATM)有同源性，该基因中的一个突变导致共济失调毛细血管扩张该疾病是一种人类遗传疾病，除了其它症状外还导致易于引发癌症的倾向。ATM编码的蛋白质通过对p53分子的直接结合和磷酸化，激活p53介导的细胞周期关卡。大约40％的肺癌与p53突变有关，而且推测ATM的超量表达是补偿p53功能丧失造成的结果，但不知道该超量表达是肺鳞状细胞癌的原因还是结果。此外，在转移性而非肺腺癌中也检测到L525S(ATM)的表达，这提示其在癌转移中起作用。

按以上所述通过实时RT-PCR还检测了L523S(SEQ ID NO：175)的表达。在采用一系列肺鳞状肿瘤进行的第一项研究中，发现L523S在4/7肺鳞状肿瘤、2/3头部和颈部鳞状肿瘤，及2/2肺腺癌中表达，而在骨骼肌、软腭和扁桃体中低水平表达。在采用肺腺癌系列进行的第二项研究中，在4/9原发性腺癌、2/2肺胸腔积液、1/1转移性肺腺癌和2/2肺鳞状肿瘤中观察到L523S的表达，而在正常组织中几乎没有观察到其表达。

L523S在肺肿瘤和各种正常组织中的表达还采用标准技术通过Northern印迹分析进行了检查。在第一项研究中，发现L523S在许多肺腺癌和鳞状细胞癌，以及正常扁桃体中表达。在正常肺中没有观察到表达。在采用来自Clontech的正常组织印迹进行的第二项研究中，发现尽管L523S在胎盘中有强表达，但在脑、骨骼肌、结肠、胸腺、脾脏、肾、肝、小肠、肺或PBMC中没有观察到表达。

实施例3

通过基于PCR的扣除方法分离和表征肺肿瘤多肽

从如下cDNA扣除文库中获得857个克隆，该扣除文库(Clontech，Palo Alto，CA)含有已扣除了来自包括肺、PBMC、脑、心脏、肾、肝、胰脏和皮肤在内的8种正常人组织cDNA的两个人肺鳞状肿瘤库的cDNA，将这些克隆用于第一轮PCR扩增。按照该厂家说明书，将该文库进行第二轮PCR扩增。将所获cDNA片段亚克隆至载体P7-Adv载体(Clontech，Palo Alto，CA)中，并转化大肠杆菌DH5α(Gibco，BRL)。从独立的克隆中分离DNA，并采用Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 373型自动测序仪进行测序。

对162个阳性克隆进行了测序。按上述方法，将这些克隆的DNA序列与EMBL和GenBank数据库中的序列进行比较，显示其中的13个克隆，下文称作重叠群13、16、17、19、22、24、29、47、49、56-59，没有显著同源序列。测定的这些克隆的cDNA序列分别提供在SEQ ID NO：125、127-129、131-133、142、144、148-150、和157中。发现重叠群1、3-5、7-10、12、11、15、20、31、33、38、39、41、43、44、45、48、50、53、54(分别是SEQ ID NO：115-124、126、130、134-141、143、145-147)表现出与以前鉴定的DNA序列有某种程度的同源性。发现重叠群57(SEQ ID NO：149)是1998年7月27日提交的美国专利申请09/123,912中所公开的克隆L519S(SEQ ID NO：94)。就本发明者所知，以前从未报道过这些序列在肺肿瘤中有差异超量表达。

按上述方法通过RT-PCR确定在肺肿瘤组织、正常肺组织(n＝4)、静息PBMC、唾液腺、心脏、胃、淋巴结、骨骼肌、软腭、小肠、大肠、支气管、膀胱、扁桃体、肾、食道、骨髓、结肠、肾上腺、胰脏和皮肤(所有组织均来自人类)中代表性克隆的mRNA表达水平。除非另行指出否则在每一类组织的一个样品中，按以上所述，采用微阵列技术检查表达水平。

发现重叠群3(SEQ ID NO：116)在测试的所有头部和颈部鳞状细胞肿瘤(17/17)中均以高水平表达，在大多数(8/12)肺鳞状肿瘤中有表达，(7/12高表达，2/12中等水平表达，2/12低表达)，而在2/4正常肺组织中表现出表达阴性，且在剩余的两个样品中表现出低表达。重叠群3在皮肤和软腭中表现出以中等水平表达，而在静息PBMC、大肠、唾液腺、扁桃体、胰脏、食道和结肠中表达水平较低。发现重叠群11(SEQ ID NO：124)在测试所有头部和颈部鳞状细胞肿瘤(17/17)中均有表达：14/17高表达、3/17中等水平表达。此外，肺鳞状肿瘤中也表现出有3/12高水平表达，4/12中等水平表达。对于3/4的正常肺样品，重叠群11是阴性的，而剩余样品仅有低表达。重叠群11对唾液腺、软腭、膀胱、扁桃体、皮肤、食道和大肠表现出低至中等的反应性。在测试的所有头部和颈部鳞状细胞肿瘤(17/17)中发现重叠群13(SEQ ID NO：125)的表达：12/17高表达，5/17中等水平表达。重叠群13在7/12的肺鳞状肿瘤中表达，其中4/12高表达而3个样品中有中等水平的表达。对正常肺样品的分析显示2/4的为表达阴性，而剩余的两个样品中有低至中等水平的表达。重叠群13确实表现出对静息PBMC、唾液腺、膀胱、胰腺、扁桃体、皮肤、食道和大肠有低至中等的反应性，而且在软腭中有高表达。发现重叠群16(SEQ ID NO：127)在一些头部和颈部鳞状细胞肿瘤(6/17)和一个肺鳞状肿瘤中有中等水平的表达；而在测试的所有正常肺样品中均未表现出有任何表达。重叠群16确实表现出对静息PBMC、大肠、皮肤、唾液腺和软腭有低的反应性。重叠群17(SEQ ID NO：128)表现出在测试的所有头部和颈部鳞状细胞肿瘤(17/17)中均表达：5/17的为高表达，12/17的为中等水平表达。在肺鳞状肿瘤中的表达水平显示，一个肿瘤样品有高水平表达，而3/12的为中等水平表达。重叠群17对于2/4正常肺样品是阴性的，在剩余的样品中仅有低水平表达。此外，还在食道和软腭中发现低水平的表达。发现重叠群19(SEQ ID NO：129)在测试的大多数头部和颈部鳞状细胞肿瘤(11/17)中都有表达：其中两个样品有高水平的表达，6/17的表现出中等水平的表达，而在3/17的样品中发现低水平的表达。在肺鳞状肿瘤中的测试仅显示出在3/12的样品中有中等水平的表达。在2/4正常肺样品中表达水平为阴性，其它两个样品仅有低表达。重叠群19在食道、静息PBMC、唾液腺、膀胱、软腭和胰腺中表现出低的表达水平。

重叠群22(SEQ ID NO：131)表现出在测试的大多数头部和颈部鳞状细胞肿瘤(13/17)中存在表达，这些样品中的4个有高水平的表达，6/17的有中等水平的表达，而在3/17的样品中有低水平表达。在测试的3/12肺鳞状肿瘤组织中发现有中等至高的表达水平，在两个正常肺样品中为表达阴性而在其它两个样品中有低水平表达(n＝4)。重叠群22在皮肤、唾液腺和软腭中表现出低水平的表达。相似地，在测试的大多数头部和颈部鳞状细胞肿瘤(13/17)中发现有重叠群24(SEQ ID NO：132)的表达，其中3个样品为高表达，在6/17的样品中为中等水平表达，而在4/17的样品中为低水平表达。在测试的3/12肺鳞状肿瘤组织中发现有中等至高的表达水平，在3个正常肺样品中表达为阴性而在一个样品中有低水平的表达(n＝4)。重叠群24在皮肤、唾液腺和软腭中表现出低水平的表达。重叠群29(SEQ ID NO：133)在测试的几乎所有头部和颈部鳞状细胞肿瘤(16/17)中都有表达：4/17的为高表达水平，11/17的为中等表达水平，而在一个样品中为低表达水平。而且，在3/12的肺鳞状肿瘤中也有适度表达，尽管2/4的正常肺样品中表达为阴性。重叠群29在大肠、皮肤、唾液腺、胰腺、扁桃体、心脏和软腭中表现出低至中等的表达水平。重叠群47(SEQ ID NOl：142)在测试的大多数头部和颈部鳞状细胞肿瘤(12/17)中都有表达：10/17的为中等水平表达，而在两个样品中为低水平的表达。在肺鳞状肿瘤中，一个样品中有高水平表达，而在另两个样品中为中等表达水平(n＝13)。重叠群47在2/4的正常肺样品中为阴性，而在剩余的两个样品中有中等水平的表达。而且，重叠群47在大肠和胰腺中表现出中等表达水平，而在皮肤、唾液腺、软腭、胃、膀胱、静息PBMC和扁桃体中表现出低表达水平。

重叠群48(SEQ ID NO：143)在测试的所有头部和颈部鳞状细胞肿瘤(17/17)中均有表达：8/17的有高水平的表达而7/17的有中等水平的表达，而在两个样品中为低水平的表达。在3个肺鳞状肿瘤样品(n＝13)中表达水平从高至中等。重叠群48在4个正常肺样品的其中1个中为阴性，而剩余样品表现出有低或中等水平的表达。重叠群48在软腭、大肠、胰腺和膀胱中表现出中等表达水平，而在食道、唾液腺、静息PBMC和心脏中表现出低表达水平。重叠群49(SEQ ID NO：144)在测试的6/17头部和颈部鳞状细胞肿瘤中以低至中等的水平表达。在3个肺鳞状肿瘤样品(n＝13)中表达水平中等。重叠群49在2/4的正常肺样品中为阴性，而剩余样品表现出低的表达水平。皮肤、唾液腺、大肠、胰腺、膀胱和静息PBMC中表现出中等的表达水平，软腭、淋巴结和扁桃体中表现出低表达水平。重叠群56(SEQ ID NO：148)在测试的3/17头部和颈部鳞状细胞肿瘤中以低至中等的水平表达，而13个肺鳞状肿瘤样品中的3个表现出低至中等的表达水平。值得注意的是，在1个腺癌肺肿瘤样品(n＝2)中检测到低的表达水平。重叠群56在3/4的正常肺样品中为阴性，而且仅在大肠中表现出中等表达水平，在唾液腺、软腭、胰腺、膀胱和静息PBMC中表现出低的表达水平。重叠群58，又称L769P，(SEQ ID NO：150)在测试的11/17头部和颈部鳞状细胞肿瘤中以中等水平表达，而在另外的1个样品中以低水平表达。13个肺鳞状肿瘤样品中的3个表现出低至中等的表达水平。重叠群58在3/4的正常肺样品中为阴性，而在1个样品中有低水平的表达。在皮肤、大肠和静息PBMC中表现出中等表达水平，在唾液腺、软腭、胰腺和膀胱中表现出低的表达水平。重叠群59(SEQ ID NO：157)在某些头、颈、和肺鳞状肿瘤中表达。在唾液腺和大肠中也检测到重叠群59的低表达水平。

重叠群22(又称L763P)的全长cDNA序列见SEQ ID NO：158，其相应的推测氨基酸序列见SEQ ID NO：159。对L763P的实时RT-PCR分析揭示，其在3/4的肺鳞状肿瘤和4/4的头部和颈部鳞状肿瘤中有高水平表达，而在正常的脑、皮肤、软腭和气管中观察到低的表达水平。随后的数据库搜索显示，SEQ ID NO：158的序列含有一个导致在其相应的蛋白质序列出现移码的突变。SEQ ID NO：345中提供了L763P的第二种cDNA序列，而在SEQ ID NO：346中提供了相应的氨基酸序列。除了SEQ IDNO：159的C端33个氨基酸之外，SEQ ID NO：159和346的序列是一致的。

合并了重叠群17、19和24的全长cDNA序列，称作L762P，序列见SEQ ID NO：160，其预测的相应氨基酸序列见SEQ ID NO：161。对L762P进行的进一步分析确定其是I型膜蛋白，并对另两个变体进行了测序。变体1(SEQ ID NO：167，其相应氨基酸序列见SEQ ID NO：169)是SEQ IDNO：160的另一种拼接形式，导致503个核苷酸的缺失和该表达蛋白质中一个短片段的缺失。变体2(SEQ ID NO：168，其相应氨基酸序列见SEQ IDNO：170)与SEQ ID NO：160相比在3’编码区缺失了两个核苷酸，结果产生该表达蛋白质的分泌形式。L762P的实时RT-PCR分析揭示，在3/4的肺鳞状肿瘤和4/4的头部和颈部肿瘤中有超量表达，而在正常皮肤、软腭和气管中观察到有低水平的表达。

重叠群56(SEQ ID NO：148)的全长cDNA序列，又称L773P，见SEQID NO：171，其推测的氨基酸序列见SEQID NO：172。发现L733P与二羟基脱氢酶在该基因的3’部分一致，而具有不同的5’序列。因此，其N端的69个氨基酸是独一无二的。编码该69个N端氨基酸的cDNA序列提供在SEQ ID NO：349中，而该N端氨基酸序列提供在SEQ ID NO：350中。实时PCR显示，L773P在肺鳞状肿瘤和肺腺癌中以高水平表达，而在正常组织中却检测不到其表达。L773P的随后Northern印迹分析说明，该转录本在鳞状肿瘤中有差异超量表达，而且在原发性肿瘤组织中检测到约1.6Kb的片段，在原发性头和颈部肿瘤组织中检测到约1.3Kb的片段。

随后的微阵列分析显示，重叠群58，又称L769S(SEQ ID NO：150)，除了在肺鳞状肿瘤中还在乳腺肿瘤中超量表达。

实施例4

多肽合成

可以在Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A肽合成仪上，采用FMOC化学和HPTU(O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)活化，合成多肽。可以在该肽的氨基端连接一个Gly-Cys-Gly序列，以提供进行偶联、与固定化表面结合、或标记该肽的方法。从固相支持物上将该肽切割下来可以采用如下切割混合物来实现：三氟乙酸∶乙二硫醇：苯甲硫醚∶水∶酚(40∶1∶2∶2∶3)。切割2小时后，可以在冷甲基叔丁基醚中沉淀该多肽。然后可以将该肽沉淀溶解在含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水中，并冻干，再用C18反相HPLC纯化。可以采用0％-60％梯度的乙腈(含0.1％TEA)水溶液洗脱该肽。将该纯化组分冻干后，可以采用电喷射或其它类型的质谱测定以及通过氨基酸分析，对该肽进行特性分析。

实施例5

制备抗肺癌抗原的抗体

按以下制备抗肺癌抗原L514S、L528S和L531S(分别是SEQ ID NO：155、225和112)的抗体。

用按以上所述在大肠杆菌中表达并纯化的重组蛋白质免疫兔。对于最初的免疫，皮下(S.C.)注射400μg抗原和胞壁酰二肽(MDP)。4周之后用混合了弗氏不完全佐剂(IFA)的200μg抗原经皮下对动物进行加强免疫。作为诱导高抗体滴度应答所必需的，随后S.C.注射混有IFA的100μg抗原进行加强。采用纯化的蛋白质进行ELISA测定，以测定取自免疫兔的血清的抗原特异性反应活性。采用与固相支持物连接的纯化蛋白质，从高滴度多克隆血清中亲和纯化抗L514S、L528S和L531S的多克隆抗体。

在5个肺肿瘤样品、5个正常肺组织样品、和正常结肠、肾、肝、脑和骨髓上，采用抗L514S多克隆抗体进行免疫组织化学分析。具体地，将组织样品在甲醛溶液中固定24小时，然后包埋在石蜡中，并切成10微米厚的切片。对组织切片进行透化处理并与抗体孵育1小时。与HRP标记的抗小鼠孵育后，通过与DAB色素原的孵育观察L514S的免疫反应性。发现L514S在肺肿瘤组织中以高水平表达，而在正常肺、脑或骨髓中几乎没有或没有观察到表达。在结肠和肾中观察到轻微的染色。在正常肝中观察到染色，但在该组织中没有检测到mRNA，这使该结果值得怀疑。

实施例6

用肽抗原免疫小鼠和CTL细胞系的增殖

按下述鉴定来自肺癌抗原L762P(SEQ ID NO：161)针对HLA-A2/Kb限制性CD8+T细胞的免疫原性肽。

采用通过与HLA-A*0201的已知肽结合基序进行匹配检验以预测可能与HLA-A*0201结合的肽序列的计算机程序(Ruper等(1993)，细胞(Cell)74：929；Rammensee等(1995)免疫遗传学(Immunogenetics)41：178-228)，预测该肺癌抗原L762P(SEQ ID NO：161)中HLA-A2结合肽的位置。按上述方法制备相应于该预测的HLA-A*0201结合肽选定子集的一系列19个合成肽。

按进行了如下修改的Thebald等(美国国家科学院院刊92：11993-11997，1995)的所述方法，用这些合成肽免疫表达人HLA-A2/Kb转基因的小鼠(由L Sherman博士，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA提供)。用在弗氏不完全佐剂中乳化的50μg L726P肽和120μg来源于乙型肝炎病毒的I-Ab结合肽免疫小鼠。3周后处死这些动物，并制备单细胞悬浮液。然后将这些细胞以7×106个细胞/ml的密度重悬在含有10％FCS、2mM谷氨酰胺(Gibco BRL)、丙酮酸钠(Gibco BRL)、非必需氨基酸(Gibco BRL)、2×10^-5M 2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和链霉素的完全培养基(RPMI-1640；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中，并在存在辐射(3000 rads)过的L726P肽-(5μg/ml)和10mg/ml B2-微球蛋白-(3μg/ml)LPS母细胞(在存在7μg/ml硫酸葡聚糖和25μg/ml LPS时培养3天的A2转基因脾细胞)的情况下进行培养。6天后，用2.5×106/ml经肽脉冲的辐射(20,000rads)过的EL4A2Kb细胞(Sherman等，科学(Science)，258：815-818，992)，和5×106/ml辐射(3000rads)过的A2/Kb转基因脾饲喂细胞，对细胞(5×105个/ml)进行再次刺激。将细胞在10U/ml IL-2存在的情况下培养。一周一次按所述方法反复刺激细胞，为克隆该细胞系作准备。

用辐射(20,000rads)过的经L762P肽脉冲的EL4 A2Kb肿瘤细胞(1×104个细胞/孔)作为刺激物，而辐射(3000rads)过的A2/Kb转基因脾细胞作为饲喂物(5×105个细胞/孔)，通过极限稀释分析克隆肽特异性细胞系，将之培养在存在10U/ml IL-2存在的情况下。第7天，按前述对细胞进行再次刺激。在第14天，分离生长的克隆并维持培养。

对L762P-87(SEQ ID NO：226；相应于SEQ ID NO：161的第87-95位氨基酸)、L726P-145(SEQ ID NO：227；相应于SEQ ID NO：161的第145-153位氨基酸)、L762P-585(SEQ ID NO：228；相应于SEQ ID NO：161的第585-593位氨基酸)、L762P-425(SEQ ID NO：229；相应于SEQ ID NO：161的第425-433位氨基酸)、L762P(10)-424(SEQ ID NO：230；相应于SEQ ID NO：161的第424-433位氨基酸)、和L762P(10)-458(SEQ IDNO：231；相应于SEQ ID NO：161的第458-467位氨基酸)具有特异性的细胞系，表现出其对抗L762P肽脉冲的EL4-A2/K^b肿瘤靶细胞的反应性明显高于其对抗对照肽脉冲的EL4-A2/K^b肿瘤靶细胞的反应性(按特异裂解百分数测定的)。

实施例7

鉴定来源于肺癌抗原L762P的CD4免疫原性T细胞表位

按下述方法制备抗原L762P(SEQ ID NO：161)特异性CD4 T细胞系。

合成横跨约50％的该L762P序列的一系列28个重叠肽。为了进行抗原接触，将4-5个肽组合成一个库，以20μg/ml的浓度对树突细胞脉冲24小时。然后洗涤该树突细胞，并在96孔U型底板中将其与阳性筛选的CD4+T细胞混合。每个肽库产生40个培养物。每周一次用携带这些肽库的新鲜树突细胞反复刺激这些培养物。总共3个刺激周期后，另外停止处理细胞1周，并采用γ-干扰素ELISA和增殖测定试验测试细胞对肽库脉冲的抗原呈递细胞(APC)的特异性。对于这些测定试验，采用携带有该相关肽库或无关肽的贴壁单核细胞作为APC。就每一个库，鉴定通过细胞因子释放和增殖表现出特异识别L762肽库的T细胞系。重点放在鉴定具有增殖应答的T细胞上。对表现出L762P特异性细胞因子分泌和增殖，或仅表现出强增殖的T细胞系进行再扩增，以检测其对来自这些库的各个肽的识别，以及其对重组L762P的识别。重组L762P来源于大肠杆菌，该物质经过部分纯化并表现出内毒素阳性。这些研究采用了10μg每种肽、10或2μg无关肽，以及2或0.5μg L762P蛋白质或无关的纯度相同的大肠杆菌产生的重组蛋白。每个库中的许多L76P来源肽都诱导显著的γ干扰素产生和CD4 T细胞的增殖。这些肽的氨基酸序列见SEQID NO：232-251。这些肽分别相应于SEQ ID NO：161的第661-680、676-696、526-545、874-893、811-830、871-891、856-875、826-845、795-815、736-755、706-725、706-725、691-710、601-620、571-590、556-575、616-635、646-665、631-650、541-560和586-605位氨基酸。

用10μg/ml相关肽进行刺激，进一步扩增对各个L762P来源肽表现出特异性的CD4 T细胞系。刺激后2周，采用增殖和IFN-γ ELISA测定检测识别此特定肽的T细胞系。许多之前鉴定的T细胞继续表现出L726P肽特异性活性。在该相关肽上进一步对这些细胞系的每一个进行扩增，并在扩增两周后在滴定试验中测试每个细胞系对该L762P肽的特异识别，以及对重组大肠杆菌来源L762P蛋白的识别。对于这些实验，用该相关L762P来源肽、或无关mammaglobin来源肽、重组大肠杆菌来源的L762P(大约50％的纯度)、或无关大肠杆菌来源的蛋白质，脉冲自体贴壁单核细胞。发现大多数T细胞系表现出对该相关肽的低亲和性，原因是当L762P肽被稀释后特异增殖和IFN-γ比值极大地降低。然而，鉴定了4个甚至在0.1μg/ml肽时仍表现出显著活性的细胞系。这些细胞系(称作A/D5、D/F5、E/A7和E/B6)的每一个均还表现出响应该大肠杆菌来源的L762P蛋白制备物，而不响应该无关蛋白制备物的特异增殖。SEQ ID NO：234、249、236和245中分别提供了这些细胞系所识别的L762P来源肽的氨基酸序列。在所有这些细胞系中均没有检测到蛋白质特异性IFN-γ。在经0.1(A/D5和E/A7)或1(D/F5)μg/ml该相关肽脉冲的自体贴壁单核细胞上，克隆A/D5、E/A7和E/B6细胞系。在细胞生长后，测试其对该相关肽的特异性。对于A/D5和E/A7，鉴定了许多对该相关肽具有特异性的克隆。

实施例8

肺肿瘤特异性抗原的蛋白质表达a)在大肠杆菌中表达L514S

将肺肿瘤抗原L514(SEQ ID NO：89)亚克隆在表达载体pE32b的NcoI和NotI位点中，并采用标准技术转化大肠杆菌。从SEQ ID NO：89的第3-153位表达出该蛋白质。表达的氨基酸序列和其相应DNA序列分别见SEQ ID NO：252和253。b)L762P的表达

采用卡那霉素抗性，将带有6×His尾的肺肿瘤抗原L762P(SEQ ID NO：161)第32-944位氨基酸亚克隆在修饰的pET28表达载体中，并采用标准技术用其转化BL21 CodonPlus。观察到低至中等水平的表达。该L762P表达结构的测定DNA序列见SEQ ID NO：254。

从以上所述，应明了，尽管为了举例说明的目的本文中描述了本发明的具体实施方案，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。

序列表

<110>Corixa公司等。

<120>用于治疗和诊断肺癌的化合物和方法

<130>210121.45501PC

<140>PCT

<141>2000-04-03

<160>350

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>315

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(315)

<223>n＝A，T，C or G

<400>1gcagagacag actggtggtt gaacctggag gtgccaaaaa agccagctgc gggcccagga 60cagctgccgt gagactcccg atgtcacagg cagtctgtgt ggttacagcg cccctcagtg 120ttcatctcca gcagagacaa cggaggaggc tcccaccagg acggttctca ttatttatat 180gttaatatgt ttgtaaactc atgtacagtt ttttttgggg gggaagcaat gggaanggta 240naaattacaa atagaatcat ttgctgtaat ccttaaatgg caaacggtca ggccacgtga 300aaaaaaaaaa aaaaa 315

<210>2

<211>380

<212>DNA

<213>人

<400>2atttaggctt aagattttgt ttacccttgt tactaaggag caaattagta ttaaagtata 60atatatataa acaaatacaa aaagttttga gtggttcagc ttttttattt tttttaatgg 120cataactttt aacaacactg ctctgtaatg ggttgaactg tggtactcag actgagataa 180ctgaaatgag tggatgtata gtgttattgc ataattatcc cactatgaag caaagggact 240ggataaattc ccagtctaga ttattagcct ttgttaacca tcaagcacct agaagaagaa 300ttattggaaa ttttgtcctc tgtaactggc actttggggt gtgacttatc ttttgccttt 360gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 380

<210>3

<211>346

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(346)

<223>n＝A，T，C or G

<400>3ttgtaagtat acaattttag aaaggattaa atgttattga tcattttact gaatactgca 60catcctcacc atacaccatc cactttccaa taacatttaa tcctttctaa aattgtaagt 120atacaattgt actttctttg gattttcata acaaatatac catagactgt taattttatt 180gaagtttcct taatggaatg agtcattttt gtcttgtgct tttgaggtta cctttgcttt 240gacttccaac aatttgatca tatagtgttg agctgtggaa atctttaagt ttattctata 300gcaataattt ctattnnnag annccnggnn naaaannann annaaa 346

<210>4

<211>372

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(372)

<223>n＝A，T，C or G

<400>4actagtctca ttactccaga attatgctct tgtacctgtg tggctgggtt tcttagtcgt 60tggtttggtt tggttttttg aactggtatg tagggtggtt cacagttcta atgtaagcac 120tctcttctcc aagttgtgct ttgtggggac aatcattctt tgaacattag agaggaaggc 180agttcaagct gttgaaaaga ctattgctta tttttgtttt taaagaccta cttgacgtca 240tgtggacagt gcacgtgcct tacgctacat cttgttttct aggaagaagg ggatgcnggg 300aaggantggg tgctttgtga tggataaaac gnctaaataa cacaccttta cattttgaaa 360aaaacaaaac aa 372

<210>5

<211>698

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc_feature

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acccggtcac gttcttggat cctcagaact ctttgctctt gtcggggtgg 360gggtgggaac tcacgtgggg agcggtggct gagaaaatgt aaggattctg gaatacatat 420tccatgggac tttccttccc tctcctgctt cctcttttcc tgctccctaa c 471<210>213<211>511<212>DNA<213>人<220><221>不确定<222>(27)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(63)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(337)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(442)<223>n＝A，T，C or G<400>213ctaattagaa acttgctgta ctttttnttt tcttttaggg gtcaaggacc ctctttatag 60ctnccatttg cctacaataa attattgcag cagtttgcaa tactaaaata ttttttatag 120actttatatt tttccttttg ataaagggat gctgcatagt agagttggtg taattaaact 180atctcagccg tttccctgct ttcccttctg ctccatatgc ctcattgtcc ttccagggag 240ctcttttaat cttaaagttc tacatttcat gctcttagtc aaattctgtt acctttttaa 300taactcttcc cactgcatat ttccatcttg aattggnggt tctaaattct gaaactgtag 360ttgagataca gctatttaat atttctggga gatgtgcatc cctcttcttt gtggttgccc 420aaggttgttt tgcgtaactg anactccttg atatgcttca gagaatttag gcaaacactg 480gccatggccg tgggagtact gggagtaaaa t 511<210>214<211>521<212>DNA<213>人<400>214agcattgcca aataatccct aattttccac taaaaatata atgaaatgat gttaagcttt 60ttgaaaagtt taggttaaac ctactgttgt tagattaatg tatttgttgc ttccctttat 120ctggaatgtg gcattagctt ttttatttta accctcttta attcttattc aattccatga 180cttaaggttg gagagctaaa cactgggatt tttggataac agactgacag ttttgcataa 240ttataatcgg cattgtacat agaaaggata tggctacctt ttgttaaatc tgcactttct 300aaatatcaaa aaagggaaat gaagtataaa tcaatttttg tataatctgt ttgaaacatg 360agttttattt gcttaatatt agggctttgc cccttttctg taagtctctt gggatcctgt 420gtagaagctg ttctcattaa acaccaaaca gttaagtcca ttctctggta ctagctacaa 480attcggtttc atattctact taacaattta aataaactga a 521<210>215<211>381<212>DNA<213>人<220><221>不确定<222>(17)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(20)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(60)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(61)<223>n＝A，T，C or G<221>不确定<222>(365)<223>n＝A，T，C or G<400>215gagcggagag cggaccngtn agagccctga gcagccccac cgccgccgcc ggcctagttn 60ncatcacacc ccgggaggag ccgcagctgc cgcagccggc cccagtcacc atcaccgcaa 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ccctggtgga cccccagaaa ggactgttac tccagcccta 240tcatcaaatg tgttaccaag acatcttgga tcccctgcta cttcagtgcc tggaatgggt 300aaacagagca cttaatgtta tttacagttt atattgtttt ctctggttac caataaaacg 360ggccattttc aggtggtaaa aaaaa 385

<210>225

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<212>PRT

<213>人

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20 25 30Arg Pro Ser Ala Tyr Met Arg Glu His Asn Gln Leu Asn Gly Trp Ser

35 40 45Ser Asp Glu Asn Asp Trp Asn Glu Lys Leu Tyr Pro Val Trp Lys Arg

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130 135 140Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ser His His Asn Val Phe Pro Asp Gly Lys145 150 155 160Pro Phe Pro His His Pro Gly Trp Arg Arg Trp Asn Phe Ile Tyr Val

165 170 175Phe His Thr Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Val

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325 330 335Pro Ser Leu Gly Pro Ala Gly Asp Asn Pro Leu Glu Leu Ser Arg Ile

340 345 350Pro Asp Glu Asn Cys Gln Ile Asn Arg Tyr Gly His Phe Gln Ala Thr

355 360 365Ile Thr Ile Val Glu Gly Ile Leu Glu Val Ash Ile Ile Gln Met Thr

370 375 380Asp Val Leu Met Pro Val Pro Trp Pro Glu Ser Ser Leu Ile Asp Phe385 390 395 400Val Val Thr Cys Gln Gly Ser Ile Pro Thr Glu Val Cys Thr Ile Ile

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<212>PRT

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<212>PRT

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5 10 15Asn His Ser Pro Ser

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5 10 15Asn Pro Gln Gln

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260 265 270Ala Gln Tyr Val Glu Asp Pro Ile Thr Gly Arg Gln Ser Val Leu Val

275 280 285Pro Tyr Glu Pro Pro Gln Val Gly Thr Glu Phe Thr Thr Val Leu Tyr

290 295 300Asn Phe Met Cys Asn Ser Ser Cys Val Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro305 310 315 320Ile Leu Ile Ile Val Thr Leu Glu Thr Arg Asp Gly Gln Val Leu Gly

325 330 335Arg Arg Cys Phe Glu Ala Arg Ile Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg

340 345 350Lys Ala Asp Glu Asp Ser Ile Arg Lys Gln Gln Val Ser Asp Ser Thr

355 360 365Lys Asn Gly Asp Gly Thr Lys Arg Pro Phe Arg Gln Asn Thr His Gly

370 375 380Ile Gln Met Thr Ser Ile Lys Lys Arg Arg Ser Pro Asp Asp Glu Leu385 390 395 400Leu Tyr Leu Pro Val Arg Gly Arg Glu Thr Tyr Glu Met Leu Leu Lys

405 410 415Ile Lys Glu Ser Leu Glu Leu Met Gln Tyr Leu Pro Gln His Thr Ile

420 425 430Glu Thr Tyr Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Gln His Leu Leu Gln

435 440 445Lys Gln Thr Ser Ile Gln Ser Pro Ser Ser Tyr Gly Asn Ser Ser Pro

450 455 460Pro Leu Asn Lys Met Asn Ser Met Asn Lys Leu Pro Ser Val Ser Gln465 470 475 480Leu Ile Asn Pro Gln Gln Arg Asn Ala Leu Thr Pro Thr Thr Ile Pro

485 490 495Asp Gly Met Gly Ala Asn Ile Pro Met Met Gly Thr His Met Pro Met

500 505 510Ala Gly Asp Met Asn Gly Leu Ser Pro Thr Gln Ala Leu Pro Pro Pro

515 520 525Leu Ser Met Pro Ser Thr Ser Gln Cys Thr Pro Pro Pro Pro Tyr Pro530 535 540Thr Asp Cys Ser Ile Val Ser Phe Leu Ala Arg Leu Gly Cys Ser Ser545 550 555 560Cys Leu Asp Tyr Phe Thr Thr Gln Gly Leu Thr Thr Ile Tyr Gln Ile

565 570 575Glu His Tyr Ser Met Asp Asp Leu Ala Ser Leu Lys Ile Pro Glu Gln

580 585 590Phe Arg His Ala Ile Trp Lys Gly Ile Leu Asp His Arg Gln Leu His

595 600 605Glu Phe Ser Ser Pro Ser His Leu Leu Arg Thr Pro Ser Ser Ala Ser

610 615 620Thr Val Ser Val Gly Ser Ser Glu Thr Arg Gly Glu Arg Val Ile Asp625 630 635 640Ala Val Arg Phe Thr Leu Arg Gln Thr Ile Ser Phe Pro Pro Arg Asp

645 650 655Glu Trp Asn Asp Phe Asn Phe Asp Met Asp Ala Arg Arg Asn Lys Gln

660 665 670Gln Arg Ile Lys Glu Glu Gly Glu

675 680<210>343<211>461<212>PRT<213>人<400>343Met Leu Tyr Leu Glu Asn Asn Ala Gln Thr Gln Phe Ser Glu Pro Gln

5 10 15Tyr Thr Asn Leu Gly Leu Leu Asn Ser Met Asp Gln Gln Ile Gln Asn

20 25 30Gly Ser Ser Ser Thr Ser Pro Tyr Asn Thr Asp His Ala Gln Asn Ser

35 40 45Val Thr Ala Pro Ser Pro Tyr Ala Gln Pro Ser Ser Thr Phe Asp Ala

85 90 95Thr Trp Thr Tyr Ser Thr Glu Leu Lys Lys Leu Tyr Cys Gln Ile Ala

100 105 110Lys Thr Cys Pro Ile Gln Ile Lys Val Met Thr Pro Pro Pro Gln Gly

115 120 125Ala Val Ile Arg Ala Met Pro Val Tyr Lys Lys Ala Glu His Val Thr

165 170 175Ser His Ala Gln Tyr Val Glu Asp Pro Ile Thr Gly Arg Gln Ser Val

180 185 190Leu Val Pro Tyr Glu Pro Pro Gln Val Gly Thr Glu Phe Thr Thr Val

195 200 205Leu Tyr Asn Phe Met Cys Asn Ser Ser Cys Val Gly Gly Met Asn Arg

245 250 255Asp Arg Lys Ala Asp Glu Asp Ser Ile Arg Lys Gln Gln Val Ser Asp

260 265 270Ser Thr Lys Asn Gly Asp Gly Thr Lys Arg Pro Phe Arg Gln Asn Thr

275 280 285His Gly Ile Gln Met Thr Ser Ile Lys Lys Arg Arg Ser Pro Asp Asp

325 330 335Thr Ile Glu Thr Tyr Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Gln His Leu

340 345 350Leu Gln Lys Gln Thr Ser Ile Gln Ser Pro Ser Ser Tyr Gly Asn Ser

355 360 365Ser Pro Pro Leu Asn Lys Met Asn Ser Met Asn Lys Leu Pro Ser Val

405 410 415Pro Met Ala Gly Asp Met Asn Gly Leu Ser Pro Thr Gln Ala Leu Pro

420 425 430Pro Pro Leu Ser Met Pro Ser Thr Ser His Cys Thr Pro Pro Pro Pro

435 440 445Tyr Pro Thr Asp Cys Ser Ile Val Arg Ile Trp Gln Val

450 455 460<210>344<211>516<212>PRT<213>人<400>344Met Ser Gln Ser Thr Gln Thr Asn Glu Phe Leu Ser Pro Glu Val Phe

5 10 15Gln His Ile Trp Asp Phe Leu Glu Gln Pro Ile Cys Ser Val Gln Pro

20 25 30Ile Asp Leu Asn Phe Val Asp Glu Pro Ser Glu Asp Gly Ala Thr Asn

35 40 45Lys Ile Glu Ile Ser Met Asp Cys Ile Arg Met Gln Asp Ser Asp Leu

85 90 95Thr Asp His Ala Gln Asn Ser Val Thr Ala Pro Ser Pro Tyr Ala Gln

100 105 110Pro Ser Ser Thr Phe Asp Ala Leu Ser Pro Ser Pro Ala Ile Pro Ser

115 120 125Asn Thr Asp Tyr Pro Gly Pro His Ser Phe Asp Val Ser Phe Gln Gln

165 170 175Met Thr Pro Pro Pro Gln Gly Ala Val Ile Arg Ala Met Pro Val Tyr

180 185 190Lys Lys Ala Glu His Val Thr Glu Val Val Lys Arg Cys Pro Asn His

195 200 205Glu Leu Ser Arg Glu Phe Asn Glu Gly Gln Ile Ala Pro Pro Ser His

245 250 255Gly Thr Glu Phe Thr Thr Val Leu Tyr Asn Phe Met Cys Asn Ser Ser

260 265 270Cys Val Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Ile Ile Val Thr Leu

275 280 285Glu Thr Arg Asp Gly Gln Val Leu Gly Arg Arg Cys Phe Glu Ala Arg

325 330 335Arg Pro Phe Arg Gln Asn Thr His Gly Ile Gln Met Thr Ser Ile Lys

340 345 350Lys Arg Arg Ser Pro Asp Asp Glu Leu Leu Tyr Leu Pro Val Arg Gly

355 360 365Arg Glu Thr Tyr Glu Met Leu Leu Lys Ile Lys Glu Ser Leu Glu Leu

405 410 415Pro Ser Ser Tyr Gly Asn Ser Ser Pro Pro Leu Asn Lys Met Asn Ser

420 425 430Met Asn Lys Leu Pro Ser Val Ser Gln Leu Ile Asn Pro Gln Gln Arg

435 440 445Asn Ala Leu Thr Pro Thr Thr Ile Pro Asp Gly Met Gly Ala Asn Ile

485 490 495His Cys Thr Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Thr Asp Cys Ser Ile Val Arg

500 505 510Ile Trp Gln Val

515<210>345<211>1800<212>DNA<213>人<400>345gcgcctcatt gccactgcag tgactaaagc tgggaagacg ctggtcagtt cacctgcccc 60actggttgtt ttttaaacaa attctgatac aggcgacatc ctcactgacc gagcaaagat 120tgacattcgt atcatcactg tgcaccattg gcttctaggc actccagtgg ggtaggagaa 180ggaggtctga aaccctcgca gagggatctt gccctcattc tttgggtctg aaacactggc 240agtcgttgga aacaggactc agggataaac cagcgcaatg gattggggga cgctgcacac 300tttcatcggg ggtgtcaaca aacactccac cagcatcggg aaggtgtgga tcacagtcat 360ctttattttc cgagtcatga tcctagtggt ggctgcccag gaagtgtggg gtgacgagca 420agaggacttc gtctgcaaca cactgcaacc gggatgcaaa aatgtgtgct atgaccactt 480tttcccggtg tcccacatcc ggctgtgggc cctccagctg atcttcgtct ccaccccagc 540gctgctggtg gccatgcatg tggcctacta caggcacgaa accactcgca agttcaggcg 600aggagagaag aggaatgatt tcaaagacat agaggacatt aaaaagcaca aggttcggat 660agaggggtcg ctgtggtgga cgtacaccag cagcatcttt ttccgaatca tctttgaagc 720agcctttatg tatgtgtttt acttccttta caatgggtac cacctgccct gggtgttgaa 780atgtgggatt gacccctgcc ccaaccttgt tgactgcttt atttctaggc caacagagaa 840gaccgtgttt accattttta tgatttctgc gtctgtgatt tgcatgctgc ttaacgtggc 900agagttgtgc tacctgctgc tgaaagtgtg ttttaggaga tcaaagagag cacagacgca 960aaaaaatcac cccaatcatg ccctaaagga gagtaagcag aatgaaatga atgagctgat 1020ttcagatagt ggtcaaaatg caatcacagg tttcccaagc taaacatttc aaggtaaaat 1080gtagctgcgt cataaggaga cttctgtctt ctccagaagg caataccaac ctgaaagttc 1140cttctgtagc ctgaagagtt tgtaaatgac tttcataata aatagacact tgagttaact 1200ttttgtagga tacttgctcc attcatacac aacgtaatca aatatgtggt ccatctctga 1260aaacaagaga ctgcttgaca aaggagcatt gcagtcactt tgacaggttc cttttaagtg 1320gactctctga caaagtgggt actttctgaa aatttatata actgttgttg ataaggaaca 1380tttatccagg aattgatacg tttattagga aaagatattt ttataggctt ggatgttttt 1440agttccgact ttgaatttat ataaagtatt tttataatga ctggtcttcc ttacctggaa 1500aaacatgcga tgttagtttt agaattacac cacaagtatc taaatttcca acttacaaag 1560ggtcctatct tgtaaatatt gttttgcatt gtctgttggc aaatttgtga actgtcatga 1620tacgcttaag gtgggaaagt gttcattgca caatatattt ttactgcttt ctgaatgtag 1680acggaacagt gtggaagcag aaggcttttt taactcatcc gtttggccga tcgttgcaga 1740ccactgggag atgtggatgt ggttgcctcc ttttgctcgt ccccgtggct taacccttct 1800<210>346<211>261<212>PRT<213>人<400>346Met Asp Trp Gly Thr Leu His Thr Phe Ile Gly Gly Val Asn Lys His

5 10 15Ser Thr Ser Ile Gly Lys Val Trp Ile Thr Val Ile Phe Ile Phe Arg

20 25 30Val Met Ile Leu Val Val Ala Ala Gln Glu Val Trp Gly Asp Glu Gln

35 40 45Glu Asp Phe Val Cys Asn Thr Leu Gln Pro Gly Cys Lys Asn Val Cys

85 90 95Tyr Tyr Arg His Glu Thr Thr Arg Lys Phe Arg Arg Gly Glu Lys Arg

100 105 110Asn Asp Phe Lys Asp Ile Glu Asp Ile Lys Lys His Lys Val Arg Ile

115 120 125Glu Gly Ser Leu Trp Trp Thr Tyr Thr Ser Ser Ile Phe Phe Arg Ile

165 170 175Leu Val Asp Cys Phe Ile Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Val Phe Thr

180 185 190Ile Phe Met Ile Ser Ala Ser Val Ile Cys Met Leu Leu Asn Val Ala

195 200 205Glu Leu Cys Tyr Leu Leu Leu Lys Val Cys Phe Arg Arg Ser Lys Arg

245 250 255Thr Gly Phe Pro Ser

260<210>347<211>1740<212>DNA<213>人<400>347atgaacaaac tgtatatcgg aaacctcagc gagaacgccg ccccctcgga cctagaaagt 60atcttcaagg acgccaagat cccggtgtcg ggacccttcc tggtgaagac tggctacgcg 120ttcgtggact gcccggacga gagctgggcc ctcaaggcca tcgaggcgct ttcaggtaaa 180atagaactgc acgggaaacc catagaagtt gagcactcgg tcccaaaaag gcaaaggatt 240cggaaacttc agatacgaaa tatcccgcct catttacagt gggaggtgct ggatagttta 300ctagtccagt atggagtggt ggagagctgt gagcaagtga acactgactc ggaaactgca 360gttgtaaatg taacctattc cagtaaggac caagctagac aagcactaga caaactgaat 420ggatttcagt tagagaattt caccttgaaa gtagcctata tccctgatga aacggccgcc 480cagcaaaacc ccttgcagca gccccgaggt cgccgggggc ttgggcagag gggctcctca 540aggcaggggt ctccaggatc cgtatccaag cagaaaccat gtgatttgcc tctgcgcctg 600ctggttccca cccaatttgt tggagccatc ataggaaaag aaggtgccac cattcggaac 660atcaccaaac agacccagtc taaaatcgat gtccaccgta aagaaaatgc gggggctgct 720gagaagtcga ttactatcct ctctactcct gaaggcacct ctgcggcttg taagtctatt 780ctggagatta tgcataagga agctcaagat ataaaattca cagaagagat ccccttgaag 840attttagctc ataataactt tgttggacgt cttattggta aagaaggaag aaatcttaaa 900aaaattgagc aagacacaga cactaaaatc acgatatctc cattgcagga attgacgctg 960tataatccag aacgcactat tacagttaaa ggcaatgttg agacatgtgc caaagctgag 1020gaggagatca tgaagaaaat cagggagtct tatgaaaatg atattgcttc tatgaatctt 1080caagcacatt taattcctgg attaaatctg aacgccttgg gtctgttccc acccacttca 1140gggatgccac ctcccacctc agggccccct tcagccatga ctcctcccta cccgcagttt 1200gagcaatcag aaacggagac tgttcatctg tttatcccag ctctatcagt cggtgccatc 1260atcggcaagc agggccagca catcaagcag ctttctcgct ttgctggagc ttcaattaag 1320attgctccag cggaagcacc agatgctaaa gtgaggatgg tgattatcac tggaccacca 1380gaggctcagt tcaaggctca gggaagaatt tatggaaaaa ttaaagaaga aaactttgtt 1440agtcctaaag aagaggtgaa acttgaagct catatcagag tgccatcctt tgctgctggc 1500agagttattg gaaaaggagg caaaacggtg aatgaacttc agaatttgtc aagtgcagaa 1560gttgttgtcc ctcgtgacca gacacctgat gagaatgacc aagtggttgt caaaataact 1620ggtcacttct atgcttgcca ggttgcccag agaaaaattc aggaaattct gactcaggta 1680aagcagcacc aacaacagaa ggctctgcaa agtggaccac ctcagtcaag acggaagtaa 1740<210>348<211>579<212>PRT<213>人<400>348Met Asn Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser

5 10 15Asp Leu Glu Ser Ile Phe Lys Asp Ala Lys Ile Pro Val Ser Gly Pro

20 25 30Phe Leu Val Lys Thr Gly Tyr Ala Phe Val Asp Cys Pro Asp Glu Ser

35 40 45Trp Ala Leu Lys Ala Ile Glu Ala Leu Ser Gly Lys Ile Glu Leu His

85 90 95Leu Asp Ser Leu Leu Val Gln Tyr Gly Val Val Glu Ser Cys Glu Gln

100 105 110Val Asn Thr Asp Ser Glu Thr Ala Val Val Asn Val Thr Tyr Ser Ser

115 120 125Lys Asp Gln Ala Arg Gln Ala Leu Asp Lys Leu Asn Gly Phe Gln Leu

130 135 140Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val Ala Tyr Ile Pro Asp Glu Thr Ala Ala145 150 155 160Gln Gln Asn Pro Leu Gln Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gly Leu Gly Gln

165 170 175Arg Gly Ser Ser Arg Gln Gly Ser Pro Gly Ser Val Ser Lys Gln Lys

180 185 190Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu Leu Val Pro Thr Gln Phe Val Gly

195 200 205Ala Ile Ile Gly Lys Glu Gly Ala Thr Ile Arg Asn Ile Thr Lys Gln

245 250 255Cys Lys Ser Ile Leu Glu Ile Met His Lys Glu A la Gln Asp Ile Lys

260 265 270Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile Leu Ala His Asn Asn Phe Val

275 280 285Gly Arg Leu Ile Gly Lys Glu Gly Arg Asn Leu Lys Lys Ile Glu Gln

325 330 335Ala Lys Ala Glu Glu Glu Ile Met Lys Lys Ile Arg Glu Ser Tyr Glu

340 345 350Asn Asp Ile Ala Ser Met Asn Leu Gln Ala His Leu Ile Pro Gly Leu

355 360 365Asn Leu Asn Ala Leu Gly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Met Pro Pro

370 375 380Pro Thr Ser Gly Pro Pro Ser Ala Met Thr Pro Pro Tyr Pro Gln Phe385 390 395 400Glu Gln Ser Glu Thr Glu Thr Val His Leu Phe Ile Pro Ala Leu Ser

405 410 415Val Gly Ala Ile Ile Gly Lys Gln Gly Gln His Ile Lys Gln Leu Ser

420 425 430Arg Phe Ala Gly Ala Ser Ile Lys Ile Ala Pro Ala Glu Ala Pro Asp

435 440 445Ala Lys Val Arg Met Val Ile Ile Thr Gly Pro Pro Glu Ala Gln Phe

450 455 460Lys Ala Gln Gly Arg Ile Tyr Gly Lys Ile Lys Glu Glu Asn Phe Val465 470 475 480Ser Pro Lys Glu Glu Val Lys Leu Glu Ala His Ile Arg Val Pro Ser

485 490 495Phe Ala Ala Gly Arg Val Ile Gly Lys Gly Gly Lys Thr Val Asn Glu

500 505 510Leu Gln Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val Val Val Pro Arg Asp Gln Thr

515 520 525Pro Asp Glu Asn Asp Gln Val Val Val Lys Ile Thr Gly His Phe Tyr

565 570 575Arg Arg Lys<210>349<211>207<212>DNA<213>人<400>349atgtggcagc ccctcttctt caagtggctc ttgtcctgtt gccctgggag ttctcaaatt 60gctgcagcag cctccaccca gcctgaggat gacatcaata cacagaggaa gaagagtcag 120gaaaagatga gagaagttac agactctcct gggcgacccc gagagcttac cattcctcag 180acttcttcac atggtgctaa cagattt 207<210>350<211>69<212>PRT<213>人<400>350Met Trp Gln Pro Leu Phe Phe Lys Trp Leu Leu Ser Cys Cys Pro Gly

5 10 15Ser Ser Gln Ile Ala Ala Ala Ala Ser Thr Gln Pro Glu Asp Asp Ile

20 25 30Asn Thr Gln Arg Lys Lys Ser Gln Glu Lys Met Arg Glu Val Thr Asp

35 40 45Ser Pro Gly Arg Pro Arg Glu Leu Thr Ile Pro Gln Thr Ser Ser His

50 55 60Gly Ala Asn Arg Phe65

Claims

1.分离的多肽，其含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分，其中该肿瘤蛋白质含有由选自下组的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349中所示序列；

(b)与SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示序列在中等严紧条件下杂交的序列；和

(c)(a)或(b)的互补序列。

2.根据权利要求1的分离多肽，其中该多肽含有由SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示多核苷酸序列、或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列。

3.含有SEQ ID NO：110、112、114、152、155、156、159、161、165、166、169、170、172、174、176、226-252、346、348和350之任一个中所示序列的分离的多肽。

4.编码肺肿瘤蛋白质或其变体中的至少15个氨基酸残基的分离的多核苷酸，该变体与所述肺肿瘤蛋白质相差一或多个替代、缺失、添加和/或插入以致该变体与抗原特异性抗血清的反应能力在相当大程度得到保持，其中该肺肿瘤蛋白质含有由包含SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示的序列、或任一个前述序列的互补序列的多核苷酸编码的氨基酸序列。

5.编码肺肿瘤蛋白质或其变体的分离的多核苷酸，其中该肺肿瘤蛋白质含有由包含SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示的序列、或任一个前述序列的互补序列的多核苷酸编码的氨基酸序列。

6.分离的多核苷酸，其含有SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示的序列。

7.分离的多核苷酸，其含有与SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中的所示序列在中等严紧条件下杂交的序列。

8.与根据权利要求4-7之任一项的多核苷酸互补的分离多核苷酸。

9.含有根据权利要求4-8之任一项的多核苷酸的表达载体。

10.用根据权利要求9的表达载体转化或转染的宿主细胞。

11.特异地与肺肿瘤蛋白质结合的分离的抗体或其抗原结合片段、其中该肺肿瘤蛋白质含有由SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示的多核苷酸序列、或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列。

12.含有至少一个根据权利要求1的多肽的融合蛋白。

13.根据权利要求12的融合蛋白，其中该融合蛋白含有在转染了编码该融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞中增强该融合蛋白表达的表达增强子。

14.根据权利要求12的融合蛋白，其中该融合蛋白含有在权利要求1的多肽中不存在的T辅助细胞表位。

15.根据权利要求12的融合蛋白，其中该融合蛋白含有亲和标记物。

16.编码根据权利要求12的融合蛋白的分离的多核苷酸。

17.药物组合物，其含有生理学上可接受的载体和至少一个选自下组的成分：

(a)根据权利要求1的多肽；

(b)根据权利要求4的多核苷酸；

(c)根据权利要求11的抗体；

(d)根据权利要求12的融合蛋白；和

(e)根据权利要求16的多核苷酸。

18.含有免疫刺激剂和至少一个选自下组的成分的疫苗：

(a)根据权利要求1的多肽；

(b)根据权利要求4的多核苷酸；

(c)根据权利要求11的抗体；

(d)根据权利要求12的融合蛋白；和

(e)根据权利要求16的多核苷酸。

19.根据权利要求18的疫苗，其中该免疫刺激剂是佐剂。

20.根据权利要求18的疫苗，其中该免疫刺激剂诱导主要是I型应答。

21.抑制患者体内癌症发展的方法，其包括给患者施用有效量的根据权利要求17的药物组合物。

22.抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用有效量的根据权利要求18的疫苗。

23.药物组合物，其含有表达根据权利要求1的多肽的抗原呈递细胞，及可药用载体或赋形剂。

24.根据权利要求23的药物组合物，其中该抗原呈递细胞是树突细胞或巨噬细胞。

25.含有表达如下多肽的抗原呈递细胞和免疫刺激剂的疫苗，该多肽含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分，其中该肿瘤蛋白质含有由选自下组的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349中所示序列；

(b)与SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示序列在中等严紧条件下杂交的序列；和

(c)(i)或(ii)的序列的互补序列。

26.根据权利要求25的疫苗，其中该免疫刺激剂是佐剂。

27.根据权利要求25的疫苗，其中该免疫刺激剂诱导主要是I型应答。

28.根据权利要求25的疫苗，其中该抗原呈递细胞是树突细胞。

29.抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用有效量的表达如下多肽的抗原呈递细胞，该多肽含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分，其中该肿瘤蛋白质含有由选自下组的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

(c)由SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示多核苷酸编码的(i)或(ii)的序列的互补序列；

并籍此抑制该患者体内的癌症展。

30.根据权利要求29的方法，其中该抗原呈递细胞是树突细胞。

31.根据权利要求21、22和29之任一项的方法，其中所述癌症是肺癌。

32.从生物样品中清除肿瘤细胞的方法，包括用特异地与肺肿瘤蛋白质反应的T细胞接触生物样品，其中该肿瘤蛋白质含有由选自下组的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示的多核苷酸；和

(ii)前述多核苷酸的互补序列；其中该接触步骤在足以允许从该样品中清除表达该抗原的细胞的条件和时间下进行。

33.根据权利要求32的方法，其中该生物样品是血液或其组分。

34.抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用经权利要求32的方法处理过的生物样品。

35.刺激和/或扩增肺肿瘤蛋白质特异性T细胞的方法，包括在足以允许刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下，用至少一个选自下组的成分接触T细胞：

(a)含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分的多肽，其中该肺肿瘤蛋白质含有由选自下组的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349中所示序列；

(ii)与SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示序列在中等严紧条件下杂交的序列；和

(iii)(i)或(ii)的序列的互补序列；

(b)编码(a)的多肽的多核苷酸；和

(c)表达(a)的多肽的抗原呈递细胞。

36.分离的T细胞群，其含有根据权利要求35的方法制备的T细胞。

37.抑制患者体内癌症发展的方法，包括给患者施用有效量的根据权利要求36的T细胞群。

38.抑制患者体内癌症发展的方法，包括步骤：

(a)将自患者分离的CD4⁺和/或CD8+T细胞与至少一个选自下组的成分一起孵育：

(i)含有肺肿瘤蛋白质或其变体的至少免疫原性部分的多肽，其中该肺肿瘤蛋白质含有由选自下组的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349中所示序列；

(2)与SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示序列在中等严紧条件下杂交的序列；和

(3)(1)或(2)的序列的互补序列；

(ii)编码(i)的多肽的多核苷酸；和

(iii)表达(i)的多肽的抗原呈递细胞：

以便T细胞获得增殖；和

(b)给该患者施用有效量的该增殖T细胞，籍此抑制该患者体内的癌症发展。

39.抑制患者体内癌症发展的方法，包括步骤：

(3)(1)或(2)的序列的互补序列；

(ii)编码(i)的多肽的多核苷酸；和

(iii)表达(i)的多肽的抗原呈递细胞；

以便T细胞获得增殖；

(b)克隆至少一个增殖细胞以提供克隆的T细胞；和

(c)给该患者施用有效量的该克隆T细胞，籍此抑制该患者体内的癌症发展。

40.确定患者体内是否存在癌症的方法，包括步骤：

(a)用与肺肿瘤蛋白质结合的结合剂接触获自患者的生物样品，其中该肿瘤蛋白质含有由SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示多核苷酸序列或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列；

(b)检测生物样品中与该结合剂结合的多肽的量；和

(c)将该多肽量与预确定的截断值进行比较，由此确定该患者体内是否存在癌症。

41.根据权利要求40的方法，其中该结合剂是抗体。

42.根据权利要求43的方法，其中该抗体是单克隆抗体。

43.根据权利要求40的方法，其中所述癌症是肺癌。

44.监测患者体内癌症进展趋势的方法，包括步骤：

(a)用与肺肿瘤蛋白质结合的结合剂接触在第一时间点上从患者获得的生物样品，其中该肿瘤蛋白质含有由SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示多核苷酸序列或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列；

(b)检测生物样品中与该结合剂结合的多肽的量；

(c)采用在随后的时间点上从该患者获得的生物样品重复步骤(a)和(b)；和

(d)将步骤(c)中检测到的多肽量与步骤(b)中检测到的量进行比较，由此检测该患者体内癌症的进展趋势。

45.根据权利要求44的方法，其中该结合剂是抗体。

46.根据权利要求45的方法，其中该抗体是单克隆抗体。

47.根据权利要求44的方法，其中所述癌症是肺癌。

48.确定患者体内是否存在癌症的方法，包括步骤：

(a)用与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品，其中该肿瘤蛋白质含有由SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示多核苷酸序列或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列；

(b)检测生物样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；

(c)将与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量和预确定的截断值进行比较，由此确定该患者体内是否存在癌症、

49.根据权利要求48的方法，其中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量是采用聚合酶链式反应确定的。

50.根据权利要求48的方法，其中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量是采用杂交测定方法确定的。

51.监测患者体内癌症进展趋势的方法，包括步骤：

(a)用与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触从患者获得的生物样品，其中该肿瘤蛋白质含有由SEQ ID NO：1-109、111、113、115-151、153、154、157、158、160、162-164、167、168、171、173、175、177-224、255-337、345、347和349之任一个中所示多核苷酸序列或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列；

(b)检测生物样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；

(d)将步骤(c)中检测到的多核苷酸量与步骤(b)中检测到的量进行比较，由此检测该患者体内癌症的进展趋势。

52.根据权利要求51的方法，其中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量是采用聚合酶链式反应确定的。

53.根据权利要求51的方法，其中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量是采用杂交测定方法确定的。

54.诊断试剂盒，其含有：

(a)根据权利要求11的一种或多种抗体；和

(b)含有报道基团的检测试剂。

55.根据权利要求54的试剂盒，其中该抗体被固定在固相支持物上。

56.根据权利要求54的试剂盒，其中该检测试剂含有抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白或凝集素。

57.根据权利要求54的试剂盒，其中该报道基团选自：放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。

58.寡核苷酸，其含有在中等严紧条件下与编码肺肿瘤蛋白质的多核苷酸杂交的10-40个连续核苷酸，其中该肿瘤蛋白质含有由SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示多核苷酸序列或任一个前述多核苷酸序列的互补序列编码的氨基酸序列。

59.根据权利要求58的寡核苷酸，其中该寡核苷酸含有SEQ ID NO：1-3、6-8、10-13、15-27、29、30、32、34-49、51、52、54、55、57-59、61-69、71、73、74、77、78、80-82、84、86-96、107-109、111、113、125、127、128、129、131-133、142、144、148-151、153、154、157、158、160、167、168、171、173、175、179、182、184-186、188-191、193、194、198-207、209、210、213、214、217、220-224、253、254-258、260、262-264、270、272、275、276、279-281、286、287、291、293、295、296、300、302、308-310、313、315-317、323、345、347和349之任一个中所示的10-40个连续核苷酸。

60.诊断试剂盒，其含有：

(a)根据权利要求59的寡核苷酸；和

(b)用于聚合酶链式反应或杂交测定的诊断试剂。