CN1679926A - 人溶菌酶在制备抗流行性感冒病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因生物制药领域，人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用，包括甲(A)、乙(B)、丙(C)三种流行性感冒病毒。重组人溶菌酶它是一种有效的抗菌剂，重组人溶菌酶除可以直接裂解细菌外，经试验还有抗流行性感冒病毒作用。本产品安全无毒副作用，有很好的药用前景；制备工艺简单，使用更方便。
Description
技术领域：
本发明涉及基因生物制药领域，尤其是含有人溶菌酶抗流行性感冒病毒的药物中的新用途。
背景技术：
流行性感冒病毒(influenza uirus)简称流感病毒，分类上属正粘病毒科，包括甲(A)、乙(B)、丙(C)三个型。可引起人和动物(猪、马、海洋哺乳动物和禽类等)流行性感冒(简称流感)。1934年分离出的甲型流感病毒在引起人类流感流行上最重要，是流行最为频繁和播及全球的重要病原体。其中最著名的是发生于1918～1919年的流感世界大流行，世界人口(当时20亿)的50％被感染，死亡人数至少有2000万，平均死亡率3％，高于第一次世界大战死亡总人数。乙型流感病毒对人类致病性较低，常局部爆发；丙型流感病毒主要侵犯婴儿或只引起人类轻微的上呼吸道感染，很少流行。
流行性感冒尚无特效药可治，现在国内已引进了流行性感冒疫苗，不过，打了疫苗只能预防当年度可能流行的A型或B型流行性感冒，至于其它病毒感染引起的感冒，仍然无法幸免。而且A型流行性感冒病毒千变万化，每年流行的病毒株皆可能不同，所以，需要研究新的抗流行感冒病毒新药，保护人民身体健康。
发明内容：
本发明的目的是针对流行性感冒病毒，提供一种人溶菌酶在制备抗流行性感冒病毒药物中的应用，其药物使用方便快捷，释药速度快，作用迅速，疗效显著。
本发明实质上是人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用。
所述人溶菌酶在预防和治疗由甲(A)、乙(B)、丙(C)三种流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用。
所述人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
所述药物含有重组人溶菌酶1500U～80000U/ml。剂型为滴鼻剂、喷雾剂等。
所述药物的具体制法按下述方法制备：
将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得1500U～80000U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)75～85％、5～25％丙二醇、1～5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成滴鼻剂或喷雾剂。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用重组人溶菌酶滴鼻剂、喷雾剂的药效试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶的制备：1、摇瓶种子制备：以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸镁)1-5克，K2SO4(硫酸钾)2-6克，KOH(氢氧化钾)1-3克，CaSO42H2O(硫酸钙)1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。2、种子罐培养：以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)25-19毫升，MgSO4(硫酸镁)13-17克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.4-0.8克，K2SO4(硫酸钾)16-20克，KOH(氢氧化钾)2.12-6.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0-8.0；溶解氧浓度为10-60％，当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。3、生产罐培养：以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)93-97毫升，MgSO4(硫酸镁)51-55克，CaSO42H2O(硫酸钙)19-23克，K2SO4(硫酸钾)61-65克，KOH(氢氧化钾)13-17克加蒸馏水至7升，高压灭菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。
纯化工艺：将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50万截流分子量膜超滤，收集滤液；用3000-8000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过G-50柱除盐，测定蛋白量、纯度、和溶菌酶活性。
将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得1500U～80000U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、1～5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成滴鼻剂、喷雾剂。
模型试验：
一、重组人溶菌酶药物体外预防、抑制人冠状病毒OC43株\229E株的药效试验：
试验材料：
1.验证药物：重组人溶菌酶 蛋白含量5mg(30000U/mg)由大连奇龙生物技术研究所提供
2.细胞：人宫颈癌传代细胞(HELA)由军事医学科学院提供。
3.病毒：人冠状病毒OC43株\229E株由国家疾病控制中心病毒所提供。
4.CO2培养箱由本室提供
5.(XSZ-D2)由重庆光学仪器厂生产
6.其它试剂、器材等均由本室提供。
试验分为预备试验和正式试验：
预备试验：
1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性测定
HELA细胞以40万/ml浓度分别接种两块96孔培养板，37℃、5％CO2培养2小时，分别加入试验药物，重组人溶菌酶倍比稀释6000ug/ml～11.7ug/ml，同时设正常细胞对照，37℃5％CO2孵箱培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。
试验结果为三次试验的平均值：验证药物重组人溶菌酶的最大无毒浓度(TD0)为750±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为1500±0μg/ml。
2.在HELA细胞培养内对人冠状病毒OC43株\229E株的毒力的测定
病毒CPE法：HELA细胞以每毫升40万浓度分别接种两块96孔培养板，37℃5％CO2培养24小时，分别加入人冠状病毒OC43株\229E株病毒液，病毒稀释10-1～10-5，5个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，设正常细胞对照，37℃5％CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下变化为“+”，26％～50％变化为“++”，51％～75％为“+++”，76％～100％变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID50。
试验结果：采用细胞形态变化(CPE)法。计算药物最大无毒浓度(TD0)和半数中毒浓度(TD50)，以下试验结果为三次试验结果的均值。测定结果(TCID50)人冠状病毒OC43株\229E株的半数感染量(TCID50)为10-3。
正式试验：
1、重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对人冠状病毒OC43株\229E株的抑制作用
试验采用病毒细胞(CPE)法：HELA细胞以40万/ml浓度分别接种两块96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，分别加入100TCID50的人冠状病毒OC43株\229E株病毒液，置37℃5％CO2吸附2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即1500μg/ml～3.9μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
实验结果：以下试验数据为三次试验结果的均值，验证药物重组人溶菌酶的药物半数有效浓度(IC50)为23.4±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8±0μg/ml，治疗指数(TI)为16。
2、重组人溶菌酶对人冠状病毒OC43株\229E株的预防作用
试验采用病毒细胞(CPE)法：HELA细胞以40万/ml浓度分别接种两块96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，分别加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即1500μg/ml～3.9μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小时后，分别加入100TCID50的人冠状病毒OC43株\229E株病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
实验结果：以下试验数据为三次试验结果的均值，验证药物重组人溶菌酶的药物半数有效浓度(IC50)为5.9±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7±0μg/ml，治疗指数(TI)为64。
以上结果表明重组人溶菌酶药物有预防和抑制人冠状病毒OC43株\229E株的作用，预防人冠状病毒OC43株\229E株的效果优于抑制结果。
二、重组人溶菌酶药物体外预防、抑制流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株、的药效试验：
试验材料：
1.药物：重组人溶菌酶 蛋白含量5mg(30000U/mg)由大连奇龙生物技术研究所提供
2.细胞：人胚肺二倍体细胞(HEF)由本室提供
3.病毒：流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株由国家疾病控制中心病毒所提供
4.CO2培养箱 由本室提供
5.(XSZ-D2)由重庆光学仪器厂生产
6.其它试剂、器材等均由本室提供
试验分为预备试验和正式试验：
预备试验：
1.重组人溶菌酶对人胚肺二倍体细胞(HEF)的毒性测定
HEF细胞以40万/ml浓度分别接种四块96孔培养板，37℃、5％CO2培养2小时，分别加入验证药物，重组人溶菌酶倍比稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，37℃5％CO2孵箱培养3天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。
试验结果：验证药物重组人溶菌酶的最大无毒浓度(TD0)为750±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为1500±0μg/ml。
2.在HEF细胞培养内对流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株的毒力的测定
病毒CPE法：HEF细胞以每毫升40万浓度分别接种四块96孔培养板，37℃5％CO2培养24小时，分别加入流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株病毒液，病毒稀释10-1～10-3，5个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，设正常细胞对照，37℃5％CO2培养3天，每24小时在倒置显微镜下察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下变化为“+”，26％～50％变化为“++”，51％～75％为“+++”，76％～100％变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID50。
实验结果：以下试验结果为三次试验结果的均值。流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株：半数感染量(TCID50)为10-3。
正式试验：
1、重组人溶菌酶在HEF细胞培养内对流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株的抑制作用
试验采用病毒细胞(CPE)法：HEF细胞以40万/ml浓度分别接种四块96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，分别加入100TCID50的流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株病毒液，置37℃5％CO2吸附1.5小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即1500μg/ml～3.9μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养3天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
试验结果：以下试验数据为三次试验结果的均值，验证药物重组人溶菌酶：药物半数有效浓度(IC50)为23.4±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8±0μg/ml，治疗指数(TI)为16。
2、重组人溶菌酶对流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株、的预防作用
试验采用病毒细胞(CPE)法：HEF细胞以40万/ml浓度分别接种四块96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，分别加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即1500μg/ml～3.9μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小时后，分别加入100TCID50的流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养3天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
试验结果：以下试验数据为三次试验结果的均值，验证药物重组人溶菌酶的药物半数有效浓度(IC50)为5.9±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7±0μg/ml，治疗指数(TI)为64。
实验结果证明重组人溶菌酶药物在病毒感染细胞前和病毒感染细胞后给药均有抑制流感病毒A型H1N1株\H3N2株、流感病毒B型B/京科/6/54株、B/沪防/1/67株的作用，结果表明重组人溶菌酶药物对流感病毒有治疗和预防作用。
本发明发掘了重组人溶菌酶在抗流感病毒领域的新用途，重组人溶菌酶它是一种有效的抗菌剂，全称为：1，4-β-N-溶菌酶或者称：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。重组人溶菌酶除可以直接裂解细菌外，经试验有抗流行性感冒病毒作用。本产品安全无毒副作用，有很好的药用前景；制备工艺简单，使用更方便。
使用方法：直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1
基因重组人溶菌酶菌种发酵液以配制220毫升培养基为准，用磷酸8毫升、硫酸镁4克，硫酸钾5克，氢氧化钾1.5克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养30-45小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液，测蛋白纯度、测活性保存。
将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得1500U/mL，磷酸盐缓冲液20mM(pH6.5～7.5)80％、18％丙二醇、2％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成喷雾剂。采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵，使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。主要用于抗流感病毒
实施例2
按照实施例1所述方法制备人溶菌酶，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得80000U/mL，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。主要用于抗流感病毒。
实施例2
按照实施例1所述方法制备人溶菌酶，将纯度97％的基因重组人溶菌酶制得10000U/mL，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.5～7.5)80％、17％丙二醇、3％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。
实施例3
按照实施例1所述方法制备人溶菌酶，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得15000U/mL，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。
实施例4
按照实施例1所述方法制备人溶菌酶，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得30000U/mL，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。
实施例5
按照实施例1所述方法制备人溶菌酶，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得50000U/mL，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。
实施例6
按照实施例1所述方法制备人溶菌酶，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得65000U/mL，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，采用德国菲弗公司出品的每次100ul泵在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。使用时直接鼻腔给药，每日1～6次，每次750U～80000U。
Claims (6)
1、人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用。
2、根据权利要求1所述人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用，其特征是：流行性感冒病毒为甲(A)、乙(B)或丙(C)型病毒。
3、根据权利要求1或2所述的人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用，其特征是：人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
4、根据权利要求1或2所述的人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用，其特征是：药物含有人溶菌酶1500U～80000U/ml。
5、根据权利要求4所述的人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用，其特征是：药物剂型为滴鼻剂或喷雾剂。
6、根据权利要求5所述的人溶菌酶在制备预防和治疗由流行性感冒病毒引起的感冒的药物中的应用，其特征是：所述药物的制法为：取重组人溶菌酶纯度95％以上、活性1500u～80000U/ml重组人溶菌酶溶液，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、万分之五吐温80，1～5％水溶性氮酮、在常温下混合均质，制成滴鼻剂或喷雾剂成品。
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2005
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