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CN108251338B - 猪鼻支原体强毒株及其应用 - Google Patents

猪鼻支原体强毒株及其应用 Download PDF

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CN108251338B CN201810198100.8A CN201810198100A CN108251338B CN 108251338 B CN108251338 B CN 108251338B CN 201810198100 A CN201810198100 A CN 201810198100A CN 108251338 B CN108251338 B CN 108251338B
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mycoplasma
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mycoplasma hyorhinis
hyorhinis
virulent strain
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刘蓓蓓
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Abstract

本发明提供猪鼻支原体强毒株及其应用，涉及微生物技术领域。本发明猪鼻支原体强毒株，是猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）HEF16株，保藏号为CCTCC NO:M2017462。本发明还提供所述猪鼻支原体在建立猪鼻支原体攻毒发病模型中的应用，采用该强毒株的纯培养物攻毒，能够诱导包括多发性浆膜炎和关节炎在内的多种猪鼻支原体感染典型病症，毒力强，发病快，7天内即可出现典型临床表现，发病情况严重，且在不同背景猪上均可发病，可用于建立具有典型病症的猪鼻支原体发病模型，具有代表性。本发明还提供猪鼻支原体在制备灭活疫苗中的应用，该菌株免疫原性好，制备的灭活疫苗具有良好的攻毒保护效力。

Description

猪鼻支原体强毒株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及猪鼻支原体强毒株及其应用。
背景技术
猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)，属于支原体科（Mycoplasmataceae）支原体属（Mycoplasma）成员，最早由Carler和Mckay于1953年从传染性萎缩性鼻炎猪的鼻腔内分离获得，故定名为猪鼻支原体。猪鼻支原体是临床猪场中常见病原菌，通常由母猪或大猪传染给小猪，一般可通过飞沫或直接接触由上呼吸道感染传播。猪只一旦感染，该支原体在上呼吸道迅速传播并且能从感染猪的肺脏和鼻咽管中分离到，而后可经呼吸道移行至全身。猪鼻支原体能够引起猪多发性浆膜炎、关节炎、耳炎、肺炎等病症，其中以多发性浆膜炎和关节炎最为常见。其临床感染率在不同国家地区普遍可达60-70%以上。同时猪鼻支原体亦可与其他病原菌形成混合感染，加重疾病的发生率和严重程度。近年来的研究发现猪鼻支原体属于人兽共患性疾病病原，其感染与多种人类癌症有明显的相关性。此外猪鼻支原体也是细胞培养中引起培养污染的最常见支原体之一。
目前，对于猪鼻支原体的控制仅依赖抗生素，尚无市场化应用的疫苗。分离强毒和建立发病模型是疫苗研发的前提，建立症状典型且稳定的发病模型成为迫切需要。但是已公开的猪鼻支原体分离株要么以肺部病变为主，不符合猪场临床典型发病特征，不具有代表性；要么毒力不强，必须采用较高滴度的培养物或细胞组织毒攻毒，发病较轻，发病时间较晚，或者需使用不吃初乳猪才可发病。
发明内容
本发明的目的是提供猪鼻支原体强毒株，该毒株能够诱导包括多发性浆膜炎和关节炎在内的多种猪鼻支原体感染典型病症，毒力强，发病快，7天内即可出现典型临床表现，发病情况严重，且在不同背景猪上均可发病，可用于建立具有典型病症的猪鼻支原体发病模型，符合猪场临床发病特征，具有代表性。
本发明的另一目的是提供所述猪鼻支原体强毒株在建立猪鼻支原体攻毒发病模型中的应用，采用该强毒株的纯培养物攻毒，发病快，7天内即可出现典型临床表现，发病情况严重，且在不同背景猪上均可发病，能够诱导包括多发性浆膜炎和关节炎在内的多种猪鼻支原体感染典型病症。
本发明的再一目的是提供猪鼻支原体灭活疫苗，可提供良好的免疫刺激能力和攻毒保护效力。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
猪鼻支原体强毒株，分类命名为猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）HEF16株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2017462。
该菌株的具体来源为：安徽合肥某猪场猪群发现关节肿胀、跛行、精神沉郁、食欲不振等疑似猪鼻支原体感染症状，采集关节腔液体，接种KM2培养基，从中分离得到，经16SrDNAPCR测序鉴定为猪鼻支原体。将该菌株纯培养物直接接种健康阴性猪，攻毒后一周内猪出现典型临床症状，剖检可观察到多发性浆膜炎、关节炎等相关病理变化，并从中再次分离到猪鼻支原体，将攻毒再分离毒株命名名为猪鼻支原体HEF16株。
本发明中的强毒株具有两个优势特征，第一，可诱发包括多发性浆膜炎和关节炎在内的多种典型猪鼻支原体临床症状，与其他报道的一些诱发肺炎、耳炎的猪鼻支原体菌株相比更加符合猪场临床发病特征，所建立的发病模型更具有代表性；第二，其毒力强，发病严重，发病时间早，且在不同背景猪上均可发病，普通生长猪上也可诱导病变，比一些报道使用CDCD（剖腹产不吃初乳）猪攻毒更接近临床。同时其攻毒每头猪只需使用108CCU纯培养物即可发病，比一些报道使用感染细胞培养物更加纯净，所需滴度更低。这些特点均有利于人工发病模型的建立和广泛应用。
在本发明中，所述猪鼻支原体强毒株培养采用的培养基为KM2培养基，培养滴度可达每毫升菌液108-1011CCU。
本发明提供所述猪鼻支原体强毒株在建立猪鼻支原体攻毒发病模型中的应用。所述猪鼻支原体攻毒发病模型用于疫苗效力检验中。优选的技术方案中，采用所述猪鼻支原体强毒株纯培养物进行攻毒。所述猪鼻支原体强毒株纯培养物的浓度至少为107CCU/ml。
在本发明中，所述猪鼻支原体强毒株攻毒直接使用菌株培养物接种，可通过多种途径实现，包括滴鼻、腹腔、肺内、气管内注射。接种后3-7天可出现被毛粗糙、发热、精神沉郁、食欲不振、关节肿胀、跛行或行走困难、呼吸困难、腹部触痛等急性症状，甚至出现濒死或死亡现象，14天后，急性症状一般有所减轻，但仍有一些猪可能继续恶化或死亡。
本发明还要求保护所述猪鼻支原体强毒株在制备猪鼻支原体灭活疫苗中的应用以及以灭活的所述猪鼻支原体强毒株为活性成分的灭活疫苗。所述灭活疫苗还包括佐剂。佐剂为油乳剂佐剂或水性佐剂。优选的技术方案中，所述佐剂为白油。
在本发明中，所述猪鼻支原体强毒株用于制备灭活疫苗时，直接使用灭活的培养物，无需浓缩，工艺简单，成本低廉。免疫时，接种剂量为108-109CCU每头，根据所用佐剂及动物品种不同，可进行一次或两次免疫，两次免疫间隔期一般为2-3周。
本发明猪鼻支原体强毒株，能够诱导包括多发性浆膜炎和关节炎在内的多种猪鼻支原体感染典型病症，毒力强，发病快，7天内即可出现典型临床表现，发病情况严重，且在不同背景猪上均可发病，可用于建立具有典型病症的猪鼻支原体发病模型，符合猪场临床发病特征，具有代表性。采用所述猪鼻支原体强毒株制备的灭活疫苗，可提供良好的免疫刺激能力和攻毒保护效力。
附图说明
图 1显示了猪鼻支原体HEF16株在固体平板上的菌落形态。
图 2是猪鼻支原体HEF16株的扫描电镜照片。
图3显示了猪鼻支原体HEF16株攻毒后发病猪的状态。
图 4显示了猪鼻支原体HEF16株攻毒后关节炎症状。(A)关节肿胀；（B）关节腔积液。
图 5显示了猪鼻支原体HEF16株攻毒后多发性浆膜炎症状。 (A)胸膜炎；（B）心包炎；（C）腹膜炎。
具体实施方式
KM2培养基配制方法如下：取5000mlEagle’s液（含有MEM48.47g，L-谷氨酰胺1.5g）、24.00gNaCl、6.00gKCl、8.695gNa2HPO4、0.60gKH2PO4、0.30gCaCl2、0.30gMgCl2、50.00g水解乳蛋白、50.00gYeast Extract、2000ml健康猪血清、100-200万IU青霉素钾盐、125ml1%醋酸铊溶液和16.67ml0.4%酚红水溶液，混合均匀，然后用1N NaOH溶液校正pH到7.4-7.6，重蒸水定容至10000ml。
实施例1：猪鼻支原体HEF16株的分离、培养及鉴定
安徽合肥某猪场猪群发现关节肿胀、跛行、精神沉郁、食欲不振等疑似猪鼻支原体感染症状，采集关节腔液体，接种KM2培养基，从中分离得到一株支原体，经16SrDNAPCR测序。序列如SEQ ID NO:1所示，经同源性比对，发现与猪鼻支原体序列的同源性达到99%，鉴定其为猪鼻支原体。
上述分离到的支原体经滴鼻、腹腔或气管途径接种健康阴性猪，攻毒后一周内猪出现典型临床症状，剖检可观察到多发性浆膜炎、关节炎相关病理变化，并从中再次分离到猪鼻支原体，16SrDNA PCR测序结果与SEQ ID NO:1相同。对再分离株进行6个基因的MLST分型（Trüeb B等，Veterinary Microbiology, 2016, 191:9-14），分离株与攻毒株ST型相同。该结果证明该毒株为猪鼻支原体强毒株。将攻毒再分离毒株命名为猪鼻支原体HEF16株，并作为种毒。
猪鼻支原体HEF16株在固体培养基上培养可形成典型的“油煎蛋”型菌落（图1），液体培养基中生长滴度为108-1011CCU/ml。扫描电镜显示其为球型，大小为300-500nm。菌体周围偶见直径约50nm的疑似分泌囊泡结构（图2）。
猪鼻支原体HEF16株培养采用的培养基为KM2培养基，37℃培养1-3天，培养滴度可达每毫升菌液108-1011CCU。
将猪鼻支原体HEF16株进行菌种保藏，保藏信息如下：
分类命名：猪鼻支原体HEF16株
Mycoplasma hyorhinisHEF16株；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
地址：中国.武汉.武汉大学； 保藏日期：2017年8月31日；
保藏编号：CCTCC NO: M 2017462。
实施例2：猪鼻支原体HEF16株的攻毒发病试验1
动物：无菌接产、不吃初乳的三元杂交猪，饲养至3月龄，经检测全部健康，作为攻毒动物。攻毒组5头，对照组5头。
攻毒材料：猪鼻支原体HEF16株，种毒用KM2培养基37℃培养1-3天复苏，传2-3代后使用。
攻毒：取猪鼻支原体HEF16株新鲜培养物，滴度调整为107 CCU/mL,经滴鼻和肺内注射途径接种各5ml，共108 CCU每头。
发病判定标准：攻毒后观察临床症状，21-28天后剖检观察病理变化情况，符合下列二项中任何一项即可判为发病：（1）猪鼻支原体感染发病死亡。（2）具有明显的猪鼻支原体发病临床症状和剖检病变，即感染后出现被毛粗糙、轻度发热、精神沉郁、食欲不振和关节临床症状，症状持续至少3日，此处关节临床症状是指跛行或关节肿胀；剖检可见多发性浆膜炎（心包炎、胸膜炎、腹膜炎）或关节炎病变。
临床及剖检观察结果：HEF16株攻毒组全部发病，对照组无异常临床表现，剖检无病变。HEF16株攻毒组发病情况（见图3-5），具体如下：攻毒试验猪在感染后2-3天，出现被毛粗糙、轻度发热、精神沉郁、食欲不振、行走困难及关节肿胀，并且上述临床症状超过3天。感染14天后可见试验猪明显消瘦，2头猪出现濒死状态提前剖杀，余下猪14天后症状有所稳定，病程未见明显加重，21天剖检。剖检结果显示，主要可见关节肿胀，关节液增多，部分猪伴有黄色化脓灶；心包增厚黏连，胸腔粘连伴有纤维素性渗出，部分猪腹腔黏连，肝脏、脾脏及肠道表面有乳白色纤维素性渗出，即同时出现多发性浆膜炎和关节炎病变。
从上述结果可见，HEF16株攻毒后可出现明显临床及剖检变化，猪只发病快，7天内即可出现临床表现，剖检病变典型，发病情况严重。上述实验结果显示HEF16株为强毒株。
实施例3：猪鼻支原体HEF16株的攻毒发病试验2
动物：无菌接产、不吃初乳的二元杂交猪，饲养至2月龄，经检测全部健康，作为攻毒动物。攻毒组5头，对照组5头。
攻毒：取猪鼻支原体HEF16株新鲜培养物（培养方法同实施例2），滴度调整为107CCU/mL,经气管内和腹腔途径各接种5ml，共108CCU每头。
发病判定标准：同上。
临床及剖检观察结果：攻毒后3天体温开始升高，第4天开始出现食欲差、关节肿胀、跛行、关节触诊疼痛、被毛粗糙、精神沉郁，临床症状持续3天以上。攻毒后第二周，攻毒组试验猪行动困难，消瘦，并出现死亡3头；攻毒后第三周攻毒组食欲适度恢复，急性症状有所缓解。攻毒后21天剖检，出现多发性浆膜炎和关节炎典型病变，具体如下：胸腔严重粘连并含有少量胸腔积液，心包增厚，有心包积液，心脏表面大量纤维素性渗出，关节腔内有大量的积液并有化脓灶。病灶积液或组织中猪鼻支原体PCR阳性，再分离菌株成功。因此，攻毒组全部发病。对照组无异常临床表现，剖检无病变。从上述结果可见，HEF16株攻毒后，猪只发病快，7天内即可出现典型临床表现，发病情况严重。上述实验结果显示HEF16株为强毒株。
实施例4：猪鼻支原体HEF16株的攻毒发病试验3
动物：4月龄、健康巴马猪10头，随机分组，攻毒组5头，对照组5头。
攻毒：取猪鼻支原体HEF16株新鲜培养物（培养方法同实施例2），滴度107CCU/mL,经滴鼻和腹腔途径接种各5ml，共108CCU每头。
发病判定标准：同上。
临床及剖检观察结果：攻毒后3天攻毒组猪开始出现被毛粗糙、轻度发热、精神沉郁、食欲下降、轻度跛行、不愿走动、关节肿胀、精神状态差等临床表现，并持续3天以上。攻毒后28天剖检可见肺脏与胸腔明显粘连，肺叶之间粘连，心包略微增厚，关节腔内有大量的积液并有化脓灶，即同时出现多发性浆膜炎（心包炎、胸膜炎、腹膜炎）和关节炎病变；关节拭子和鼻拭子检测猪鼻支原体阳性，再分离菌株成功，血清抗体转阳。因此，攻毒组全部发病。对照组无异常临床表现，剖检无病变。
从上述结果可见， HEF16株攻毒后，猪只发病快，7天内即可出现典型临床表现，发病情况严重。从实施例2-4的攻毒试验可以发现，HEF16株攻毒后，在不同背景猪上均可发病，且HEF16株为强毒株。
实施例5：猪鼻支原体HEF16株灭活疫苗的免疫保护试验
疫苗制备：取猪鼻支原体HEF16株新鲜培养物，调整菌体浓度为109CCU/ml，加入甲醛进行灭活处理，得到灭活抗原液。采用常规方法将灭活抗原液和白油按体积比1：3混合、乳化，得到猪鼻支原体HEF16株灭活疫苗。
动物：7-21日龄、健康三元杂交猪30头，随机分成3组：G1组为健康对照组，不免疫；G2组为疫苗免疫组，每头肌肉注射免疫猪鼻支原体HEF16株灭活疫苗2 mL，2周后加强免疫一次，免疫剂量方法同第一次； G3组为攻毒对照组，不免疫。G1组动物不攻毒，G2组动物于首次免疫后一个半月攻毒，经滴鼻和腹腔注射途径接种各5ml猪鼻支原体新鲜培养物（108CCU每头），G3组攻毒时间、方法和剂量同G2组。
疫苗保护力评价：按发病标准统计攻毒后的发病动物数量，按以下公式计算攻毒保护率：攻毒保护率=（攻毒动物数﹣发病动物数）/攻毒动物数×100%。
结果：攻毒后攻毒对照组动物出现急性临床症状，所有猪只均发病，且所有猪剖检均出现多发性浆膜炎和关节炎的典型病变，其中3头死亡；而免疫组动物中只有2头出现发病症状，无动物死亡，保护率达到80%。具体见下表。
组别 总动物数 发病头数 死亡头数 存活率（%） 保护率（%）
G1 10 0 0 100 -
G2 10 2 0 100% 80%
G3 10 10 3 70% -
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 猪鼻支原体强毒株及其应用
<130> 20180309
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA
<213> 猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）HEF16株
<400> 1
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gagaagcaat atggtgacat ggagcaaatc tcaaaaaacc gatctcagtt cggattgaag 1260
tctgcaactc gacttcatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcagc tacgctacgg 1320
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aaagtcggtg agttaacttc ggagaccatg cctaagcaga ctattttgtc 1430

Claims (10)

1.猪鼻支原体强毒株，分类命名为猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）HEF16株，保藏号为CCTCC NO:M2017462。
2.权利要求1所述猪鼻支原体强毒株在建立猪鼻支原体攻毒发病模型中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述猪鼻支原体攻毒发病模型用于疫苗效力检验中。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于：采用权利要求1所述猪鼻支原体强毒株纯培养物进行攻毒。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述猪鼻支原体强毒株纯培养物的浓度至少为107CCU/ml。
6.权利要求1所述猪鼻支原体强毒株在制备猪鼻支原体灭活疫苗中的应用。
7.猪鼻支原体灭活疫苗，活性成分为灭活的权利要求1所述猪鼻支原体强毒株。
8.根据权利要求7所述猪鼻支原体灭活疫苗，其特征在于所述还包括佐剂。
9.根据权利要求8所述猪鼻支原体灭活疫苗，其特征在于所述佐剂为油乳剂佐剂或水性佐剂。
10.根据权利要求9所述猪鼻支原体灭活疫苗，其特征在于所述佐剂为白油。
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