KR101360112B1 - 공기전파가 가능한 신규한 ｈ９ｎ２형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 균주 및 그로부터 유래된 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공기전파가 가능한 신규한 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 A/Korean native chicken/Korea/K040110/2010 (H9N2)주, 및 이의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물에 관한 것이다.

Description

공기전파가 가능한 신규한 Ｈ９Ｎ２형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 균주 및 그로부터 유래된 백신{A novel airborn transmissible low pathogenic avian Influenza virus (H9N2) K040110/2010 and vaccine for low pathogenic avian Influenza comprising the same}

본 발명은 공기전파가 가능한 신규한 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 A/Korean native chicken/Korea/K040110/2010 (H9N2)주, 및 이의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물에 관한 것이다.

A형 인플루엔자 바이러스는 오쏘믹소바이러스 속, 오쏘믹소비리대 과의 멤버이며, 네거티브 센스 단일 가닥 RNA를 포함하며(Lamb, R.A. and Krug, R. 1996. In Field Virology. 3^rd Edn. Eds B.N. Field, D.M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia, Lippincott-Raven. p.1353-1395), 항원으로 및 유전적으로 구분될 수 있는 16가지 상이한 서브타입의 적혈구응집소 (HA) 및 9가지 상이한 서브타입의 뉴라미니다제(NA)가 존재한다(Choi et al., 2004. Vet. Rec. 154, 274-275; Fouchier et al., 2005. J. Virol. 79, 2814-2822).

이들 상이한 서브타입 간에는 항원성이 달라 상호 교차 반응이나 교차 면역이 잘 되지 않고 동일한 서브타입 간에도 대변이 및 소변이에 따른 빈번한 항원성의 변이가 나타나므로 인플루엔자바이러스에 대한 예방에는 많은 어려움이 따르게 된다.

또한 이러한 변이는 예방과 관계되는 항원성의 변이뿐 아니라 기존의 인플루엔자 바이러스의 숙주 범위 확대, 숙주 간 전파력 및 병원성 변화를 유발하므로 인플루엔자바이러스에 대한 통제를 더욱 어렵게 한다. 특히 변이로 인해 생성된 신규한 인플루엔자바이러스가 사람에서 감염시, 2년간 5000만 명의 사망자를 발생시켜 인류 최대의 재앙으로 기록된 스페인 독감과 같은 대유행인플루엔자로 발전할 가능성이 있다.

상기의 중요성으로 인해 이러한 인플루엔자 바이러스의 변이원리를 주제로 다양한 연구가 전 세계적으로 활발히 이뤄지고 있으며 다양한 특성을 가지는 다양한 종류의 인플루엔자 바이러스 균주가 연구의 수단으로써 활용되고 있다.

특히 변이를 통해 생성되어 기존의 통상적인 인플루엔자 바이러스균주와 전파력, 병원성의 차이를 나타내는 신규한 특성을 가지는 인플루엔자바이러스 균주는 연구용 균주 및 이와 같은 특성을 가지는 인플루엔자 질병에 유효한 면역원성 조성물의 생산에 이용되는 항원제조용 균주로써 가치가 높다.

인플루엔자바이러스에 대한 연구용 및 면역원성조성물의 생산에 이용되는 항원제조용 균주는 사람 및 가축을 대상으로 다양한 종류가 분리 및 개발되어 있다.

가금을 대상으로 한 H9형 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 균주의 경우, 불활성화된 면역원성 제제 및 백신의 형태로 단일 및 다른 감염성 질병에 대한 면역원성 조성물과 복합된 형태로 가공되어 시판되고 있다.

그러나 인플루엔자바이러스는 상기된 바와 같이 항원성의 변이가 빈번해 과거에 분리 또는 개발된 백신 균주는 최근의 인플루엔자 유행주에 대해 충분한 방어효과를 제공하지 못한다(Palese P. Making better influenza virus vaccines? Emerg Infect Dis 2006;12(January(1)):61-5) .

따라서 최근 국내에서 유행하고 있는 신규 인플루엔자바이러스 균주에 유효한 방어능을 제공하는 면역원성 제제 및 백신의 개발이 요구된다. 인플루엔자 바이러스의 경우, 바이러스균주를 이용하여 기존의 통상적인 방법으로 불활성화할 경우, 효과적으로 면역원성 제제 및 백신을 생산할 수 있다.

따라서 위와 같은 형태의 면역원성 제제 및 백신의 개발에는 신규한 인플루엔자균주의 분리 및 확보가 핵심단계가 된다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020070060049호, '인플루엔자 백신의 제조방법'은 예방, 진단, 면역치료 또는 치료 목적을 위한 인플루엔자 바이러스 또는 항원의 산업적-규모의 제조방법에 관한 것으로, 특히, 인플루엔자 백신, 보다 특히 인플루엔자 A형 및 B형을 포함하는 사람 백신의 매딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK) 유래의 세포주 및 세포 배양물에 기반한 제조방법에 관한 것이 기재되어 있으며,

다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020070092474호, 'Ｈ3 말 인플루엔자 Ａ 바이러스'는 78번 위치의 발린 또는 159번 위치의 아르기닌을 가지지 않는, 서열 1을 갖는 HA(헤마글루티닌) 또는 서열 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 HA를 포함하는 단리된 H3 말 (equine) 인플루엔자 바이러스가 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 저병원성 조류인플루엔자 질병에 유효한 면역원성 조성물의 생산에 이용되는 항원제조용 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기존의 저병원성 인플루엔자와 전파력 및 병원성이 다른 신규한 저병원성 조류인플루엔자의 특성을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 기존의 저병원성 인플루엔자와 전파력 및 병원성이 다른 신규한 저병원성 조류인플루엔자의 균주를 연구용 및 상품제조를 목적으로 제조하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가금에서 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염으로부터 유발된 질병 상태를 제어하는 방법을 제공한다

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기탁번호 KCTC 11938BP로 기탁된 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.

본 발명의 바이러스는 대한민국 대전시 유성구 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11938BP로 2011년 5월 23일에 기탁하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스는 국내 가금류로부터 분리한 조류인플루엔자 A 바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스의 분리 방법에 대한 자세한 설명이 실시예1에 개시되어 있다.

본 발명의 바이러스의 분리 방법에서 바람직한 출발 물질로서 병에 걸린 조류, 특히 가금류의 호흡기관 또는 이러한 조류에 의해 배설되는 배설물로부터 분리될 수 있다. 기타 기관이 본 발명의 바이러스의 분리를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다는 점이 제외되어서는 안된다.

또 다른 측면에서 본 발명은 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염에서 야기되는 임상증상에 대한 가금의 보호용 백신을 제공하는데, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 및 약학적 허용 담체나 희석제를 포함한다.

본 발명의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스는 불활성화된 형태로서 백신 중에 포함될 수 있다. 만일 저병원성 조류인플루엔자 바이러스가 불활성화된 형태라면, 상기에 전술한 질병을 유도하는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 성질은 완전히 없어진다.

본 발명의 백신은 예를 들면 시판용 불활성화된 조류인플루엔자 바이러스 백신에 흔히 사용되는 통상적인 방법에 따라 준비될 수 있다. 수의학적 백신 조성물의 제조는 특히 "Handbunch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin"(편집: Mays,A.등, Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Germany, 1984) 및 "Vaccines or Veterinary Applications"(편집: Peters,A.R.등, Butterworth-Heinemann Ltd,1993)에 설명되어 있다.

간단하게 설명하면, 감염되기 쉬운 기질에는 본 발명의 H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 살아있는 형태로 접종하고, 바이러스가 소정의 감염 적정농도 또는 항원 함량(질량)으로 복제될 때까지 증식시킨다. 그 후에 물질을 보유한 조류인플루엔자 바이러스를 수거하고 예방적 활성을 갖는 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.

상기에서 정의된 조류 인플루엔자 바이러스의 복제에 사용할 수 있는 모든 기질은, 조류인플루엔자 바이러스가 기질에 적응한 후 필요하다면, 본 발명에 따른 백신을 생성하는데 사용될 수 있다.

적당한 기질은 1차(조류) 세포 배양물[예를 들면, 닭의 계태아 섬유아세포(chicken embryo fibroblast, CEF), 또는 닭의 신장세포(chicken kidney cell, CK)], 포유동물 세포주를[예를 들어, Madin·Darby canine kidney, MDCK 세포주] 포함한다. 대개, 세포의 접종 후에 트립신효소가 포함된 배지에서 바이러스를 3-10일 동안 증식시키고, 그 후 세포 배양 상층액을 수거하고, 필요한 경우 세포 잔해를 제거하기 위해 여과하거나 원심분리한다.

또는 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스를 배(胚)화된 달걀에서 증식시킨 후, 통상적인 방법으로 조류인플루엔자 바이러스 물질을 수거할 수 있다.

또한 본 발명은 조류인플루엔자감염에 대하여 불활성화된 형태의 조류인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다. 불활성화된 백신의 주된 장점은 높은 레벨의 보호 항체가 장기간 지속된다는 것이다. 이러한 성질로 인해, 불활성화된 백신이 종축 백신접종에 특히 적합하게 된다.

증식 단계 후 수거된 바이러스를 불활성화하는 목적은 바이러스의 재생성을 방지하는 것이다. 일반적으로, 이것은 화학적 또는 물리적 수단으로 수행될 수 있다. 화학적 불화성화는 예를 들어 효소, 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 에틸렌-이민 또는 그것의 유도체로 바이러스를 처리함으로써 수행될 수 있다. 필요한 경우, 불활성화 된 화합물은 나중에 중화된다. 포름알데히드로 불활성화된 물질은 예를 들어 티오설페이트로 중화될 수 있다. 물리적 불활성화는 에너지가 충분한 방사능, 예를 들면 UV 광을 바이러스에 조사함으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 필요한 경우, 처치 후 pH 가 약 7의 값으로 조정될 수 있다.

불활성화된 조류인플루엔자 바이러스를 함유하는 백신은 예를 들면 이 목적에 적당한 전술한 약학적 허용 담체 또는 희석제를 하나 이상 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 불활성화된 백신은 보조적 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 이 목적에 적당한 화합물이나 조성물은 알루미늄 히드록시드, -포스페이트, -옥시드, 광유, 비타민 E 아세테이트와 같은 식물유 및 사포닌을 주성분으로 하는 수중유형 또는 유중수형 유제를 포함한다.

불활성화된 백신은 대개 비경구적으로, 즉 근육내 또는 피하내로 투여된다.

본 발명의 백신은 활성 성분으로서 조류인플루엔자 바이러스를 유효량, 즉 독성 바이러스에 의한 공격(항원 투여)에 대항하여 백신 접종된 조류 또는 그들의 자손에서 면역을 유도할 조류인플루엔자 바이러스 물질을 면역화시키는 양으로 포함한다. 본원에서 면역은 백신접종되지 않은 군에 비해 백신접종 후 조류 집단에서 상당히 높은 레벨의 보호를 유도하는 것으로 정의된다.

통상적으로, 본 발명의 불활성화된 백신은 조류 1 마리당 10⁷-10⁹EID₅₀의 용량과 등가의 항원을 포함하여 투여될 수 있다.

본 발명의 저병원성인플루엔자 바이러스 백신은 닭에 효과적으로 사용될 수 있으나, 칠면조, 기니아 파울(guinea fowl) 및 메추라기와 같은 기타의 가금도 효과적으로 백신으로 접종될 수 있다. 닭은 식용 닭, 복제 가축, 및 알을 낳는 가축을 포함한다.

본 발명에 따른 살아있는 또는 불활성화된 백신을 투여받은 동물의 나이는 현재 시판되는 불활성화된 조류인플루엔자 바이러스 백신을 투여받은 동물의 나이와 동일하다. 식용 닭의 종축과 같은 부모 가축의 백신접종은 본 발명의 살아있는 약화된 또는 불활성화된 백신, 또는 양자의 혼합으로 수행될 수 있다. 이런 유형의 면역주사 프로그램의 장점은 수직적으로 새끼에게 전달되는 모계 유래의 항체에 의해 제공된 생후 1일된 자손의 직접적인 보호를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 외에 가금에 감염되는 기타 병원균의 하나 이상의 백신 성분을 포함하는 백신 조합을 포함한다.

바람직하게는 백신 조합에서 백신 성분은 가금에 감염되는 병원균의 살아있는 약화된 또는 불활성화된 형태이다.

특히, 본 발명은 백신 조합을 제공하며 이 백신 조합의 모든 백신 성분은 불활성화된 형태이다.

백신 조합은 전염성 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus, IBV), 조류 레오바이러스 (avian reovirus), 전염성 F낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus, IBDV), 가금 아데노바이러스 (fowl adenovirus, FAdV), 산란저하증 바이러스 (egg drop syndrome 76' virus, EDS 76' virus) 및 칠면조 비기관지 염 바이러스 (turkey rhinotracheitis virus, TRTV)의 하나 이상의 (불활성화된) 백신 균주를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 새로운 H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스, 이를 포함하는 백신 및 이들의 제조 방법을 제공함으로써 최근의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염증으로부터 유효하게 가금을 보호할 수 있다.

도 1은 토종닭으로부터 채취한 검채를 유제하여 접종한 계태아난으로부터 인플루엔자 바이러스의 유무를 확인하기 위해 인플루엔자 바이러스의 M단백질에 대한 연쇄중합효소반응을 실시한 후 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 토종닭으로부터 채취한 검채를 유제하여 접종한 계태아난으로부터 닭 전염성 기관지염 바이러스(IBV)와 뉴캣슬 바이러스(NDV)의 유무를 확인하기 위해 닭 전염성기관지염 바이러스의 S1 단백질과 뉴캣슬 바이러스의 M 단백질과 F 단백질에 대한 연쇄중합효소반응을 실시한 후 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 조류인플루엔자 바이러스 K040110/2010 분리주의 증식성을 동물실험을 통해 분석한 결과를 나타낸 표이다.
도 4는 기존에 상용화 되어 조류인플루엔자 바이러스의 항원으로 사용되고 있는 K01310/2001 분리주의 전파력을 동물실험을 통해 분석한 결과를 나타낸 표이다.
도 5는 조류인플루엔자 바이러스 K040110/2010 분리주의 전파력을 동물실험을 통해 분석한 결과를 나타낸 표이다.
도 6은 조류인플루엔자 바이러스 K040110/2010를 사용하여 제작한 시험용 사독백신의 K040110/2010에 대한 방어능을 동물실험을 통해 분석한 결과를 나타낸 표이다.
도 7은 6주령 닭에 조류인플루엔자 바이러스 K040110/2010를 사용하여 제작한 시험용 사독백신을 접종 한 후 2주 및 3주 후에 채혈한 혈청의 인플루엔자 바이러스에 대한 항체가를 HI test를 이용하여 측정한 결과이다.
도 8은 조류인플루엔자 바이러스 K040110/2010 및 K01310/2001에 대한 방어능을 동물실험을 통해 분석한 결과를 나타낸 표이다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 예시된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 닭으로부터 바이러스의 분리 및 동정

2010년 저병원성 조류인플루엔자 감염이 의심되는 토종닭 농장으로부터 폐사계를 수거한 후 기관과 맹장편도를 검체로서 채취하였다.

채취한 검체를 유제한 후 PBS에 10% weight/volume(w/v)으로 희석하고 원심분리한 후 상층액을 0.45 pore size로 여과하여 세균오염을 배제한 후 10일령 특정병원성부재 (Specific pathogen free, SPF) 계태아란에 접종한 후 37℃ 항온기에서 배양하였다.

3일간 배양 후, 계태아란에서 요막강액 (Allantoic fluid)를 채취하여 10% SPF 닭 적혈구와 1:1 비율로 반응하여 요막강 내 바이러스의 혈구 응집능 (Hemmagglutination activity, HA) 보유여부를 판단하였다.

혈구 응집능을 가지는 요막강내 바이러스에 대해 인루엔자바이러스의 특이적 단백질인 Matrix (M) 단백질 유전자에 대한 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR)을 실시한 후 (정방향 프라이머 염기서열 AGCAAAAGCAGGTAG, 역방향 프라이머 염기서열 AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT) 전기영동을 실시한 결과 해당 유전자크기의 유전체를 확인하여 채취한 검체 내에 조류인플루엔자 바이러스가 존재함을 확인하였다. (도 1)

실시예 2: 신규한 조류인플루엔자 바이러스 야외분리주 내 기타병원체 부정시험

계태아란의 장요막강액에서 증식이 가능한 기타 병원체의 존재 유무를 확인하기 위하여 닭 전염성기관지염 바이러스의 (Infectious bronchitis virus IBV)의 S1 단백질 유전자 (정방향 프라이며 염기서열 TAGTGACCCTTTTGTGTGCACTAT , 역방향 프라이며 염기서열GTTTGTATGTACTCATCTGTAAC), 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease, NDV)의 F (Fusion) 단백질 유전자 (정방향 프라이며 염기서열 GCTGATCATGAGGTTACCTC, 역방향 프라이며 염기서열 AGTCGGAGGATGTTGGCAGC) 등에 대한 역전사 중합효소연쇄반응을(RT-PCR) 실시한 후 전기영동을 실시한 결과 해당 유전자 크기의 유전체를 확인하지 못하였다. 따라서 토종닭의 기관과 맹장편도 내에 조류인플루엔자 바이러스 외에는 기타 병원체가 없음을 확인하였다. (도 2)

실시예 3: 동물실험을 통한 병원성 분석

토종닭에서 분리한 조류인플루엔자 바이러스의 생체 내 병원성을 조사하기 위하여 OIE 규정에 따라 PBS로 10배 희석한 바이러스를 4주령의 SPF 닭 10마리에 수당 10⁶ EID₅₀씩 0.2ml의 용량으로 정맥 접종하였다. 공격접종 후 10일간 임상증상 및 폐사율을 관찰한 결과 접종 후 4일과 9일 사이에 3마리의 닭이 폐사하여 폐사율은 30%로 확인되었고, OIE 규정에 따라 IVPI지수를 산출하였을 때 1.15로 확인되어 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 속하는 것을 확인하였다.

실시예 4: 동물실험을 통한 증식성 분석

토종닭에서 분리한 조류인플루엔자 바이러스의 병원성과 증식성을 확인하기 위하여 백신이 이뤄지지 않은 3주령 병아리와 9주령 병아리로 각각 실험군을 구성하였고 기존에 상용화되어 이용되는 조류인플루엔자 백신을 접종한 (A/Chicken/Korea/01310/01 백신주를 항원으로 사용하여 제작된 상용화 백신, 대성미생물, 대한민국) 9주령 닭으로 실험군을 구성하여 총 3개의 실험군을 구성하였다. 모든 실험군에 속한 실험계에 수당 10^6.0 EID₅₀씩 0.1ml의 용량으로 비강접종하였다. 접종 3, 5 그리고 7일 후 구강과 총배설강을 면봉채취(Swab)하였고 채취에 사용한 면봉을 겐타마이신 항생제가 1% 함유되어 있는 PBS에 보관하였다. PBS와 면봉이 잘 섞이도록 한 후 PBS에 함유된 바이러스의 역가를 측정하는 방법으로 구강과 총배설강에서 배출되는 바이러스의 양을 확인하였다. (도 4)

실험결과, 상용화된 백신을 접종한 실험군에서 80%의 바이러스 배출율을 나타내 기존에 상용화된 백신으로는 토종닭에서 분리한 바이러스를 효과적으로 방어하지 못하는 것이 확인되었다.

실시예 5: 동물실험을 통한 기존 조류인플루엔자 바이러스 백신주의 공기전파력 분석

기존에 상용화되어 조류인플루엔자 사독백신의 항원으로 사용되고 있는 A/Chicken/Korea/01310/01 주의 전파력을 확인하기 위하여 바이러스 접종군, 바이러스 접종군과 직접적인 접촉은 불가능 하지만 공기는 서로 통하는 사육장에서 사육되는 공기전파군으로 실험군을 구성하였다. 바이러스 접종군에 수당 10^6.0 EID50씩 0.1ml의 용량으로 비강접종하였다. 접종 1, 2, 3, 4, 5, 그리고 6일 후 구강과 총배설강을 면봉채취(Swab)하였고 채취에 사용한 면봉을 겐타마이신 항생제가 1% 함유되어 있는 PBS에 보관하였다. PBS와 면봉이 잘 섞이도록 한 후 PBS에 함유된 바이러스의 유전자를 검출하는 방법으로 구강과 총배설강에서 배출되는 바이러스의 유무를 확인하였다. (도 5)

실험결과 공기전파군에 속하는 실험계에서 바이러스 배출이 확인되지 않아 기존에 분리되어 백신주로 사용되고 있는 인플루엔자 바이러스 균주는 공기전파가 불가능 하다는 것이 확인되었다.

실시예 6: 동물실험을 통한 신규한 조류인플루엔자 바이러스 균주의 공기전파력 분석

토종닭에서 분리한 조류인플루엔자 바이러스의 전파력을 확인하기 위하여 바이러스 접종군, 바이러스 접종군과 동거사육 되는 직접접촉군, 바이러스 접종군과 직접적인 접촉은 불가능 하지만 공기는 서로 통하는 사육장에서 사육되는 공기전파군으로 실험군을 구성하였다. 바이러스 접종군에 수당 10^6.0 EID₅₀씩 0.1ml의 용량으로 비강접종하였다. 접종 3, 5, 7 그리고 9일 후 구강과 총배설강을 면봉채취(Swab)하였고 채취에 사용한 면봉을 겐타마이신 항생제가 1% 함유되어 있는 PBS에 보관하였다. PBS와 면봉이 잘 섞이도록 한 후 PBS에 함유된 바이러스의 유전자를 검출하는 방법으로 구강과 총배설강에서 배출되는 바이러스의 유무를 확인하였다.(도 5)

실험결과 직접접촉군은 3일 이내에 모두 직접전파되어 모두 감염되는 것이 확인되었고, 공기전파군은 3일 이내에 전파가 시작되어 9일째에 모든 개체가 감염된 것이 확인되어 실험에 사용된 바이러스가 공기전파가 가능하다는 것이 확인되었다.

실시예 7: 신규한 조류인플루엔자 바이러스 균주의 Seed virus stock 의 제작

토종닭의 기관 또는 맹장편도 유제액을 접종한 계태아란에서 채취한 요막강액을 Master seed로 사용하여 계태아란에 2회 계대한 Seed virus stock을 제작하였다. Seed virus stock의 바이러스량을 확인하기 위해 종란에 접종하여 역가를 산출한 결과 Seed virus stock의 바이러스 함량은 10^9.0EID₅₀/로 확인되었다.

실시예 8: 신규한 조류인플루엔자 바이러스 야외분리주를 이용한 사독백신 제작

K040110/2010 분리주 배양액에 0.2% 포르말린을 첨가한 후 37℃에서 15시간 처리한 후 4℃에서 1주일간 불활화 처리를 하거나, 장요막강액에 0.01M BEI(Binary ethylenimine)를 처리하여 37℃에서 3시간 또는 장요막강액에 0.2% B-PL을 처리하여 25℃에서 3시간 불활화하여 사독백신용 항원을 제작하였다.

실시예 9: 신규분리주를 불활화하여 제작한 백신의 안전성시험

K040110/2010 분리주를 불활화하여 제작한 시험용 사독백신의 안전성을 확인하기 위하여 15수의 3~4주령 SPF 닭 대퇴부 근육내에 1 (2dose)씩 접종하였다. 접종 후 3주간 임상증상, 증체율 그리고 폐사율을 조사하고 3주, 4주, 5주에 그룹별 5수씩 부검하여 접종부위의 육안적 병변의 형성여부를 조사한다. 시험결과 임상증상, 증체율, 폐사율 그리고 접종부위의 육안적 병변의 형성이 무접종 대조군과 비교하여 차이가 나타나지 않아 시험제작된 백신의 안전성을 입증하였다.

실시예 10: 신규분리주를 불활화하여 제작한 백신의 효능시험

K040110/2010 분리주를 불활화하여 제작한 시험용 사독백신의 효능을 확인하기 위하여 6주령 SPF 닭을 대상으로 동물실험을 실시하였다. 백신군과 대조군으로 나누었으며 백신군에는 제작한 시험백신을 1수분 접종하였다. 백신접종 2주와 3주 후 채혈을 통하여 H9 인플루엔자 특이 항체역가를 혈구응집 억제시험을 통하여 확인하였다. 2에 대한 로그값으로 항체역가를 표시하였을 때 측정한 백신 2주 후의 항체역가는 6이상이었으며 3주 후의 항체역가는 7이상으로 나타나 충분한 정도의 항체반전이 나타난 것을 확인하였다. (도 7)

백신 3주 후, 시험제작한 백신의 방어능을 확인하기 위하여 인플루엔자 바이러스 K040110/2010 및 K01310/2001를 마리당 10^6.0 EID₅₀씩 0.1ml의 용량으로 비강접종하였다. 공격접종 5일 후 실험계를 부검하였고 기관과 맹장편도를 채취하여 유제한 후 겐타마이신 항생제가 1% 함유되어 있는 PBS에 희석하였다. 희석한 유제액을 종란에 접종하여 바이러스의 유무를 확인하는 방법으로 기관과 맹장편도내 바이러스의 유무를 확인하였다. (도 8)

시험결과 백신을 접종하지 않은 실험군의 경우 인플루엔자바이러스 K040110/2010을 공격접종하였을 때 모든 기관과 맹장편도에서 바이러스가 발견되었지만 백신을 접종한 실험군의 경우 K040110/2010을 공격접종한 후에도 모든 검체에서 바이러스가 검출되지 않아 100%에 해당하는 방어능을 보인 것을 확인하였다.

또한 백신을 접종하지 않은 실험군의 경우 기존의 백신균주로 사용된 인플루엔자바이러스 K01310/2001을 공격접종하였을 때 80%에 해당하는 기관과 맹장편도에서 바이러스가 검출되었지만 백신을 접종한 실험군의 경우 K01310/2001을 공격접종한 후에도 모든 검체에서 바이러스가 검출되지 않았다. 따라서 인플루엔자바이러스 야외분리주 K040110/2010을 사용하여 제작한 백신은 동일바이러스 외에도 기존에 백신제조용으로 사용되었던 균주에 대해서도 100%의 방어효과를 가지는 것이 확인되었다.

한국생명공학연구원 KCTC11938BP 20110530

Claims (11)

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3. 기탁번호 KCTC 11938BP로 기탁된 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 A 바이러스 K040110/2010 주 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하고,
   상기 조류인플루엔자 A 바이러스는 불활성화된 형태인 것을 특징으로 하는 조류인플루엔자 A 바이러스 감염으로부터 유발된 질병에 대한 가금 보호용 백신.
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6. 제3항에 있어서, 상기 백신이 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
7. 제3항에 있어서, 상기 백신이 가금에 감염성이 있는 다른 병원균의 백신성분을 하나 이상 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
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