KR101209964B1

KR101209964B1 - 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101209964B1
Application number: KR1020100100632A
Authority: KR
Inventors: 이지훈; 강익재; 류덕영; 채찬희
Original assignee: 주식회사 동방; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2012-12-07
Anticipated expiration: 2030-10-15
Also published as: KR20120039113A

Abstract

본 발명의 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 안전성, 보존성 및 백신효과가 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 돼지 다발성 장막염의 위험에 노출된 돼지에 직접 투여되어 다발성 장막염으로부터 돼지들을 예방할 수 있고, 모체 이행항체가 가능하여 임신한 모돈에 투여하는 것으로 포유자돈에서 발생하는 다발성 장막염을 예방할 수 있다.

Description

돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법{Vaccine composition for swine polyserositis and manufacturing method thereof}

돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 연쇄상구균에 의해 유발되는 다발성 장막염을 효과적으로 예방할 수 있는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

국내 양돈장에서 가장 많이 발생되고 있는 질병 중 하나인 다발성 장막염은 관절, 늑막, 심낭, 복막 등 여러 부위에 이 생기는 질병으로 장액성 삼출을 동반하고, 장막에 전신성 염증을 일으키는 질병이다.

다발성 장막염을 일으키는 원인균은 대부분의 양돈장에 상재하고 있으며, 감염 발병에 의해, 육계돈의 성장지연, 폐사, 출하일령 지연, 및 사료 효율 저하 등을 일으킴과 더불어, 치료를 위한 약품투여 등으로 인해 농가에 큰 경제적 손실을 주고 있다.

한편, 다발성 장막염을 일으키는 대표적인 원인균으로는 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis ) 및 연쇄상구균(Streptococcus suis)이 있다. 이 중 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis)에 감염되어 발병하는 글래써씨 병의 경우, 지역 구분 없이 전국적으로 발생되고 있으며, 그 발병 양상은 주로 섬유소성 복막염과 흉막염, 심외막염 및 뇌막염 등의 다발성 장막염 증상을 보이는데, 이 질병을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 다수의 치료제나 예방 백신이 개발되어 판매되고 있다.

한편, 다수의 육계돈을 밀집시켜 사육하는 국내양돈업계의 상황에서 많은 양돈장에 연쇄상구균(Streptococcus suis)이 분포되었을 것으로 추정된다. 연쇄상구균의 혈청형은 각각 독립된 특정 항체를 형성하는 균주들의 그룹이며, 현재까지 대략 30 여종 이상의 다양한 연쇄상구균 혈청형(serotype 1, 2, 3, 4, ~34형, 1/2형)과 그 외 혈청형으로 분리하지 못한 다양한 연쇄상구균 균주가 발견되었지만, 연쇄상구균에 의해 유발되는 돼지의 다발성 장막염에 대한 연구는 아직까지 미비한 실정이다.

따라서, 다발성 장막염을 유발하는 연쇄상구균에 대한 연구와 이를 통해 국내 양돈 농가에서 매년 발생하는 다발성 장막염에 의한 피해를 해결하고자 하는 노력이 시급하다.

또한, 국내에서 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균과 외국에서 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균은 혈청타입이 서로 달라 수입 백신의 적용으로는 효과적인 방역이 이루어지지 못하므로, 국내에서 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균을 새로이 동정하고, 연쇄상구균에 의해 발생하는 다발성 장막염을 예방할 수 있는 백신을 새롭게 개발할 필요가 있다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 국내 양돈농장에서 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균을 동정하고, 이 원인균을 이용하여 다발성 장막염을 예방할 수 있는 백신을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 제조된 돼지 다발성 장막염 예방 백신을 이용하여 다발성 장막염으로부터 돼지를 보호하는데 있다.

본 발명의 첫번째 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지의 다발성 장막염을 유발하는 연쇄상구균(Streptococcus suis serotype 2) 혈청형 타입 2를 약독화 또는 불활화시켜 이를 유효성분으로 함유하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2는 고항원성 Mrp 유전자 및 고병원성 유전자인 Epf 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2는 서열번호 7의 16S rRNA 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2는 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 11111P로 기탁된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 불활화는 포르말린 처리에 의해 불활화된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 백신 조성물은 알루미늄 젤(aluminium hydroxide gel)을 부형제(adjuvant)로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물을 돼지에 투여하여 다발성 장막염 질환을 예방하는 방법을 제공하며, 보다 바람직하게는 상기 백신 조성물은 경구, 비강, 항문, 근육내, 경피내, 정맥내 또는 피하 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 돼지의 다발성 장막염을 유발하는 수탁번호 KCCM 11111P의 연쇄상구균 및 이를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, (1) 다발성 장막염에 감염된 돼지로부터 시료를 채취하고 이를 배양하여 콜로니를 제작하는 단계; 및 (2) 상기 배양된 콜로니에 서열번호 1로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 서열번호 7의 16S rRNA 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2 균주를 동정하는 단계;를 포함하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에 배양된 콜로니에서 연쇄상구균의 형태학적 특성을 갖는 콜로니를 선발하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, (3) 상기 동정된 균주에서 Mrp 유전자를 포함하는 균주를 선발하는 단계; (4) Mrp 유전자를 포함하는 균주에서 Epf 유전자를 포함하는 균주를 선발하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (3) 단계는 서열번호 3으로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (4) 단계는 서열번호 5로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행할 수 있다.

본 발명의 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 안전성, 보존성 및 백신효과가 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 돼지 다발성 장막염의 위험에 노출된 돼지에 직접 투여되어 연쇄상구균 혈청형 2 균주가 유발하는 다발성 장막염으로부터 돼지들을 예방할 수 있고, 모체 이행항체가 가능하여 임신한 모돈에 투여하는 것으로 포유자돈에서 발생하는 연쇄상구균 혈청형 2 균주에 의해 발생하는 다발성 장막염을 예방할 수 있다.

도 1은 고항원성 유전자인 Mrp 유전자를 갖는 연쇄상구균으로 PCR 반응을 수행한 후, 전기영동하여 촬영한 겔 사진이다(M; marker, 1; mrp 양성균주, 2; mrp 음성균주).
도 2는 병원성과 항원성을 동시에 갖는 유전자인 Epf 유전자를 가지는 연쇄상구균으로 PCR 반응을 수행한 후, 전기영동하여 촬영한 겔 사진이다.다(M; marker, 1; mrp 양성균주, 2; mrp 음성균주).

상술한 바와 같이, 연쇄상구균에 의해 유발되는 돼지의 다발성 장막염에 대한 연구가 제대로 이루어지지 않을 뿐 아니라, 국내에서 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균과 외국에서 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균은 혈청타입이 서로 달라 수입 백신의 적용으로는 효과적인 방역이 이루어지지 못하는 문제가 있었다.

이에 본 발명에서는 돼지의 다발성 장막염을 유발하는 연쇄상구균(Streptococcus suis serotype 2) 혈청형 타입 2를 약독화 또는 불활화시켜 이를 유효성분으로 함유하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

여기서, 상기 다발성 장막염은 늑막, 심낭, 복막 등 여러 부위에 염증이 생기는 질병으로 장액성 삼출을 동반하며, 심장의 심외막(pericardium)에서 섬유소(fibrin)가 침착하는 섬유소성 심외막염(fibrinous pericarditis)을 유발하고, 복막에서는 복막을 구성하는 장막에서 섬유소가 침착하는 섬유소성 복막염(fibrinous peritonitis)을 유발하여 전신성 염증을 일으키는 질병이다. 그러나, 본 발명에서 상기 다발성 장막염은 연쇄상구균(Streptococcus suis)에 의해 돼지에게 발병되는 다발성 장막염에 한정되어 사용된다.

상기 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2 병원균은 통상의 연쇄상구균의 혈청형의 구분에 따라, 혈청형 타입 2에 해당하는 연쇄상구균을 약독화 또는 불활화시켜 돼지의 다발성 장막염 예방용 백신 조성물의 유효성분으로 사용한 것으로서, 이를 통해 제조된 백신 조성물은 돼지 다발성 장막염의 위험에 노출된 돼지에 직접 투여되어 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2로부터 감염되어 발생한 다발성 장막염으로부터 돼지들을 예방할 수 있고, 모체 이행항체가 가능하여 임신한 모돈에 투여하는 것으로 포유자돈에서 발생하는 다발성 장막염을 예방할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물은 바람직하게는 (1) 다발성 장막염에 감염된 돼지로부터 시료를 채취하고 이를 배양하여 콜로니를 제작하는 단계; 및 (2) 상기 배양된 콜로니에 서열번호 1로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 서열번호 7의 16S rRNA 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2 균주를 동정하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.

먼저, (1) 단계로서 다발성 장막염에 감염된 돼지로부터 시료를 채취하고 이를 배양하여 콜로니를 제작한다. 그 뒤 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에 배양된 콜로니에서 연쇄상구균의 형태학적 특성을 갖는 콜로니를 선발하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 경우 콜로니에서 연쇄상구균의 형태학적 특성은 통상적으로 널리 알려진 연쇄상구균의 형태학적 특성을 의미하는 것으로서 바람직하게는 콜로니의 형태가 48시간이 지났을 경우 1mm정도로 작고 가장자리가 원형이며 색은 우윳빛, 그리고 콜로니 주변에 녹색을 띄거나 투명한 용혈부위를 만드는 것을 선별할 수 있다.

그 뒤 (2) 상기 배양된 콜로니에 서열번호 1로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 연쇄상구균(Streptococcus suis)을 동정할 수 있다.

(3) 단계로서 상기 동정된 균주에서 Mrp 유전자(Genbank No. AM493987.1)를 포함하는 균주를 선발하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 고항원성 Mrp유전자를 보유한 연쇄상구균은 배양할 때 백신의 면역반응에 필요한 항원을 더 많이 발현할 수 있다. 한편 상기 (3) 단계는 서열번호 3으로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행할 수 있다.

그 뒤 (4) 단계로서 Mrp 유전자를 포함하는 균주에서 Epf 유전자(Genbank No. X64450)를 포함하는 균주를 선발하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 Epf 유전자는 여 연쇄상구균(Streptococcus suis) 타입 2만이 보유하는 병원성과 항원성에 모두 관련된 유전자로서 이를 통해 항체생성에 더욱 유리한 균주를 선별할 수 있게 된다. 상기 (4) 단계는 서열번호 5로 표시되는 전방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행할 수 있다.

이렇게 분리된 연쇄상구균 중에서 백신 제조에 적합한 균주를 찾기 위하여, 본 발명자들은 고항원성 유전자인 Mrp 유전자 및 고병원성 유전자인 Epf 유전자를 모두 포함하는 균주를 최종 분리하여, 국내에서 다발성 장막염에 의해 폐사한 돼지에서 새롭게 분리된 연쇄상구균(Streptococcus suis) 균주의 아형(subtype)을 동정하였으며, 항혈청 응집 반응을 통하여 혈청형 타입 2에 속하는 균주임을 확인하였다.

이렇게, 분리 동정된 연쇄상구균은 서열번호 7의 16S rRNA 염기서열과 95%이상, 바람직하게는 동일한 상동성 가지며, 한국 미생물 보존 센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM 11111P로 기탁되었다.

본 발명의 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 상기 연쇄상구균 혈청형 타입 2를 통상의 약독화 또는 불활화(inactvation)시켜 제조된 것을 특징으로 한다.

질병 원인균의 약독화 또는 불활화는 통상적인 방법으로 시행될 수 있다. 즉, 항원을 포름알데히드, 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤, 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시키거나 열, 방사선 조사 등의 방법으로 불활화할 수 있다. 약독화는 질병 원인균의 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 균주의 염기서열의 특정 결실 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에서는, 상기 연쇄상구균 혈청형 타입 2의 불활화는 포르말린을 이용한 방법이 바람직하게 사용될 수 있다. 포르말린(포름알데히드)을 이용한 불활화는 다른 화학물질을 이용한 불활화 법에 비하여 불활화 달성의 신뢰성과 확실성 및 안정성이 이미 증명되어 있어 안정한 제품을 제공할 수 있다. 이 불활화 방법은 대량 생산에 적합하여 인력 및 생산경비가 절약되고, 수십 년간 사용되어 온 일본뇌염 바이러스 백신에서 안정성이 세계적으로 인정된 바 있다.

상기 백신에는 불활화한 연쇄상구균 혈청형 타입 2 항원 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 여기서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이며, 투여되는 피험체에게 독성이 아닌 담체 매질을 의미한다. 각종 담체들이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 증류수, 염수 또는 미네랄수가 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물에는 약제학적 또는 수의학적으로 허용될 수 있는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어 EDTA염, 메티올레이트 등을 포함할 수 있다.

불활화한 연쇄상구균 혈청형 타입 2을 포함하는 백신에 당업자에게 공지된 기술에 따라 아쥬번트를 첨가할 수 있다. 아쥬번트의 예로는 수산화알루미늄과 같은 광물겔, 리조레시틴과 같은 계면활성제, 사포닌이나 사포닌 유도체와 같은 글리코시드, 란티딘, Avridine, 카보폴(carbopol), 폴리포스파젠, DDA(dimethyldioctadecylammonium bromide), 퀼 에이(quil A), 암피겐, 광물유 등을 들 수 있다.

상기 불활화한 연쇄상구균 혈청형 타입 2를 포함하는 백신은 제약기술 분야 및 수의학 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 표준기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 백신의 함량은 의학기술분야 및 수의학 기술분야의 당업자들이 투여 대상 개체의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 다른 면역학적 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속투여를 할 수 있다.

본 발명의 백신이 사용될 수 있는 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위 내 투여용의 현탁액, 시럽 등과 같은 액상 제제 및 피하, 내피, 근육 내, 또는 정맥 내 투여용의 멸균 현탁 또는 에멀션제제를 포함할 수 있다. 또한 사용 전에 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 재현탁되는 가용성 성분 또는 미립자의 고체 제제일 수 있다. 가용성 성분 또는 미립자는 코아세르베이션, 바이아세르베이션, 응고, 분무건조, 기포건조, 침전, 동결건조 등 약제학 분야 및 수의학 분야의 당업자에게 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 연쇄상구균 혈청형 2 균주가 유발하는 다발성 장막염의 발병 위험에 노출된 돼지에 상기 백신을 투여하여 다발성 장막염을 예방하는 방법을 제공한다. 한편, 본 백신 조성물은 교차예방이 적용되기 어려우므로 연쇄상구균 혈청형 3, 4형에 감염되어 유발된 돼지의 다발성 장막염을 예방하는데 사용하기는 어렵다.

상기 백신은 수의학적으로 허용되는 다양한 경로를 통해 돼지에 투여될 수 있다. 예를 들어, 사료나 음수에 첨가하는 경구투여, 안점막에 점적투여, 근육주사, 정맥주사, 피내주사 등으로 투여될 수 있다. 투여경로에 따라 수의학 분야의 당업자들이 투여량을 결정할 수 있다. 예컨대 체중 1kg 당 0.1 ~ 1㎖를 접종할 수 있으며 1차 접종 후 일정시간(예컨대 1 ~ 2달)이 경과하고 2차 접종을 실시할 수 있다.

이때, 양돈 농장에서 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염이 7일령에서 18일령의 어린 포유자돈 시기에 유발되는 경우, 어린 포유자돈에 백신을 직접 접종할 시간적 여유가 없으므로, 임신한 모돈에게 상기 백신을 접종하여 모돈에서 형성된 항체가 초유를 통하여 포유자돈에게 이행되게 하여, 연쇄상구균 혈청형 타입 2에 의한 다발성 장막염을 예방할 수 있다.

그리고, 4주령 이상의 이유자돈이나 육성돈에서 다발성 장막염이 유발되는 경우에는 포유자돈, 이유자돈, 또는 육성돈에 직접 백신을 접종하여 연쇄상구균 혈청형 타입 2에 의한 다발성 장막염을 예방할 수 있다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예 및 실험예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

단계 1: 콜로니 형태학적 특징을 이용한 1차 분리

국내 양돈 농장에서 다발성 장막염에 감염되어 서울대학교 병리학실에 의뢰된 돼지들 중에서 섬유소성 심외막염, 흉막염, 및 복막염이 관찰되는 케이스를 부검하였다.

부검 시 장기가 오염되지 않도록 소독한 부검용 매스로 조심스럽게 흉강과 복강을 개방하고, 멸균 면봉으로 섬유소성 병변이 관찰되는 장막 부위에서 시료를 채취하였다. 채취된 시료를 5% 면양 혈액이 포함된 아가 배지에 도포한 후, 백금이를 사용하여 고르게 도포하였다.

배지를 37℃의 배양기에 넣고, 24시간 동안 호기성 배양을 하여 증균한 후, 현미경으로 관찰하여 연쇄상구균의 형태학적 특징(48시간 경과 후 1mm정도로 작고 가장자리가 원형이며 색은 우윳빛, 그리고 콜로니 주변에 녹색을 띄거나 투명한 용혈부위를 만드는 것)을 갖는 50 여종의 독립된 콜로니를 골라 TSA(Trypticase soy agarose) 배지에 백금이를 이용하여 2차 배양하였다.

단계 2: 16S rRNA 서열을 이용한 2차 분리

상기 단계 1에서 2차 배양된 50 여종의 균주 중에서 연쇄상 구균들만을 분리하기 위해, 공지된 연쇄상구균 16S rRNA 서열에서 디자인한 프라이머 서열을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

PCR 반응에 필요한 균주 DNA를 추출하기 위하여, 상기 2차 배양된 균주를 멸균된 PBS 버퍼 1ml에 용해시키고, 부유시켜 끓는 물에서 10분 동안 가열하였다. 그리고 3000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, DNA가 추출된 상층액을 분리하여, 각각의 균주에 대한 DNA를 추출하였다.

그리고, 연쇄상 구균 16s rRNA에 특이적인 프라이머를 제작하기 위해, 공지 연쇄상구균 16s rRNA 서열을 이용하여, 전방향 프라이머 서열로는 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 서열(서열번호 1)을 제작하여 사용하였고, 역방향 프라이머 서열로는 5'-CGGGATCCCAGGCCCGGGAACGTATTCAC-3' 서열(서열번호 2)을 제작하여 사용하였다.

상기 균주에서 추출된 DNA 5㎕, 전방향 프라이머 10nM, 역방향 프라이머 10nM, TLA 중합효소(Bioneer, Daejeon, Korea) 1U, KCl 50mM, MgCl₂ 1mM, 및 Tris-HCl(pH8.3) 10mM을 혼합한 후, 증류수를 첨가하여 제조된 50㎕의 반응 용액으로 PCR 반응(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 수행하였다.

PCR 반응은 섭씨 95℃에서 5분 동안 가열 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분을 반응시키는 과정을 40번 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응하는 조건에서 수행되었다.

상기와 같은 PCR 반응을 통하여 16S rRNA PCR 산물을 갖는 28 종의 균주를 확인하고, 이들이 유전적으로 연쇄상구균임을 확인하였다.

단계 3: 연쇄상 구균의 분리 및 동정

상기 분리된 28 종의 연쇄상구균 중에서 백신 제조에 적합한 연쇄상 구균을 분리, 동정하였다.

이러한 백신 제조에 적합한 균주로는 고항원성 유전자인 Mrp 유전자 및 갖고, 병원성과 항원성에 모두 관려된 유전자인 Epf 유전자를 가지는 균주를 분리 동정하였다.

먼저, Mrp 유전자를 갖는 균주를 선발하기 위하여, 상기 실시예 2의 DNA 추출 방법과 같은 방법으로 각각의 균주에서 추출된 DNA 5㎕, 전방향 프라이머(5‘-ATTGCTCCACAAGAGGATGG-3’)(서열번호 3) 10nM, 역방향 프라이머(5‘-TGAGCTTTACCTGAAGCGGT-3’)(서열번호 4) 10nM, TLA 중합효소(Bioneer, Daejeon, Korea) 1U, KCl 50mM, MgCl2 1mM, 및 Tris-HCl(pH8.3) 10mM을 혼합한 후, 증류수를 첨가하여 제조된 50㎕의 반응 용액으로 PCR 반응(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 수행하여 Mrp 유전자를 갖는 균주들을 선발하였다.

이때, PCR 반응은 섭씨 95℃에서 2 분 동안 가열 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 반응시키는 과정을 40번 반복하고, 마지막으로 72℃에서 2분 동안 반응하는 조건에서 수행되었다.

도 1에 도시된 바와 같이, PCR 반응이 끝난 후, 10㎕를 0.02% ET-Br을 첨가한 2% 아가로오스 겔에 40분 동안 전기영동 하여 188 bp의 Mrp 유전자를 갖는 균주를 1차 선발하였다.

그리고, 1차 선발된 균주들 중에서 Epf 유전자를 가지는 균주를 선발하기 위하여, 상기 실시예 2의 DNA 추출 방법과 같은 방법으로 각각의 균주에서 추출된 DNA 5㎕, 전방향 프라이머(5‘-GCTACGACGGCCTCAGAAATC-3’)(서열번호 5) 10nM, 역방향 프라이머(5‘-TGGATCAACCACTGGTGTTAC-3’)(서열번호 6) 10nM, TLA 중합효소(Bioneer, Daejeon, Korea) 1U, KCl 50mM, MgCl2 1mM, 및 Tris-HCl(pH8.3) 10mM을 혼합한 후, 증류수를 첨가하여 제조된 50㎕의 반응 용액으로 PCR 반응(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 수행하여 Epf 유전자를 포함하는 균주를 선발하였다.

이때, PCR 반응은 섭씨 95℃에서 10 분 동안 가열 후, 94℃에서 1 분, 60℃에서 55초, 72℃에서 2분을 반응시키는 과정을 40번 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 반응하는 조건에서 수행되었다.

도 2에 도시된 바와 같이, PCR 반응이 끝난 후, 10㎕를 0.02% ET-Br을 첨가한 2% 아가로오스 겔에 40분 동안 전기영동 하여 626 bp의 Epf 유전자를 포함하는 균주를 최종 분리 동정하였다.

상기와 같은 방식에 의해 최종적으로 분리 동정된 균주는 국내에서 다발성 장막염에 의해 폐사한 돼지에서 새롭게 분리된 연쇄상구균(Streptococcus suis) 균주의 아형(subtype)이며, 본 발명자들은 최종 분리된 연쇄상 구균의 혈청형을 검증하기 위해 캐나다의 몬트리올 대학((Groupe de Recherche sur les Maladies Infectieuses du Porc, Faculte de medecine veterinaire, Universite de Montreal)에 항혈청 응집 반응을 의뢰한 결과, 혈청형 타입 2임을 확인하고 이를 한국미생물보존센터에 KCCM 11111P로 기탁하였다.

상기 기탁된 KCCM 11111P는 서열번호 7로 표시되는 16s rRNA 서열을 갖는 것을 확인하였다.

단계4 : 연쇄상구균 혈청형 타입 2을 이용한 백신의 제조

상기 단계 3에서 동정한 1 X 10⁵CFU(colony forming unit)의 연쇄상구균 혈청형 타입 2 균주(기탁번호 KCCM 11111P)를 1% 말 혈장(horse serum) 및 1% 효모 추출물(yeast extract)이 포함된 뇌심장육수(brain heart infusion, BHI) 배양액 100ml에 접종한 후, 12 시간 동안 37℃의 배양기에서 교반하면서 배양시켰다.

상기 연쇄상구균 혈청형 타입 2 균주가 1 X 10⁸CFU로 증식될 때까지 배양한 후, 증식된 배양액 100ml에 포르말린 0.8ml를 첨가하고, 24시간 이상 교반시켜 연쇄상구균 2형을 불활화시켰다.

상기 불활화된 배양액 100ml에 알루미늄 겔을 8ml를 첨가하고, 24시간 이상 교반하여 백신을 제조하였다. 백신 제조 후에 멸균 유무를 확인하여 곰팡이와 세균의 증식이 없는 것을 확인하였다.

실험예 1. 백신의 일반 기준 시험

1-1. 특성 시험

동물용 생물학적 제제 일반 검정기준에 따라 시험한 결과 상기 제조예의 백신은 유백색의 현탁액으로 이물 및 이취가 없고 소분된 내용물의 성상이 균일하였다.

1-2. 무균 시험

상기 제조예의 백신에 대한 무균시험 결과는 영양아가(Nutrient agar), 영양브로스(Nutrient broth), 티오글리콜레이트(Thioglycollate) 배지에 이식하여 22 ℃ 및 37℃에서 7일간 배양하였을 때, 어떠한 세균 및 곰팡이의 발육도 인정되지 않았다.

실험예 2. 모체 이행 항체를 이용한 다발성 장막염 예방 시험

양돈 농장에서 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염이 최근 분만한 7 일령에서 18 일령 사이의 포유자돈 시기에 유발되는 경우, 너무 어리기 때문에 백신을 직접 접종할 시간적 여유가 없으므로, 임신한 모돈에 백신을 접종하여 모돈에서 형성된 면역력이 초유를 통하여 이행되어 분만된 포유자돈에서 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염에 대한 예방 효과가 있는지 실험하였다.

구체적으로, 상기 제조예의 백신 2cc를 분만 5주전과 3주전에 2회 임신한 모돈에게 근육 주사하여 백신을 접종한 후, 분만된 3주령의 포유자돈에 상기 실시예 3에서 분리 동정된 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2(기탁번호 KCCM 11111P)를 1x 10⁷ CFU 용량으로 주사기를 이용하여 공격 접종한 후, 5주간 관찰하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

그룹	실험 모돈 두수	모돈 백신접종	포유자돈 공격접종 일령	포유자돈 공격접종 두수	다발성 장막염 발병 두수	다발성 장막염 발병율(%)
백신접종군	5	분만 5주전 분만 3주전 (2회 접종)	3주령	30	4	13.3
양성대조군	5	백신 미접종	3주령	30	26	86.6
음성대조군	5	백신 미접종	미접종	30	0	0

상기 표 1에서 양성대조군은 백신접종을 하지 않고 공격접종만을 한 그룹을 의미하고 음성대조군은 백신접종과 공격접종 모두 하지 않은 그룹을 의미하며, 백신접종군은 백신접종과 공격접종을 모두 시행한 그룹을 의미한다.

그 결과, 백신을 접종한 모돈에서 분만된 자돈(백신접종군)은 모돈의 초유로부터 충분한 항체를 전달받아 3주령에 공격접종을 한 후에도 뚜렷한 임상증상이 관찰되지 않았고, 실험이 종결될 때까지 한마리도 폐사하지 않았다. 다만, 4두에서 공격 접종 후 3주가 경과된 6주령에서 다소 위축된 증상이 관찰되었고, 공격접종 실험이 종료되는 8주령에서 부검을 하였을 때에는 경미한 장막염만이 관찰되었다.

이에 반하여, 백신을 접종하지 않은 모돈에서 분만된 자돈(양성대조군)의 경우 초유를 통한 항체가 없기 때문에 공격 접종을 한 후에 뚜렷한 임상증상이 관찰되었다. 양성대조군에서는 공격접종 1 주 후부터 식욕부진 등의 상태가 관찰되었으며, 공격 접종 후 3 주가 경과된 6 주령에서는 매우 위축된 자돈들이 관찰되었다. 또한 공격접종 실험이 종료되는 8주령에서 부검을 하였을 때 심한 섬유소성 장막염이 30두 중에서 26두에서 관찰되었다.

그리고, 백신도 접종하지 않고, 공격접종도 실시하지 않은 음성대조군에서는 시험이 종료되는 8주령까지 전혀 어떠한 증상과 병변이 관찰되지 않았다.

상기와 같은 결과를 통하여 본 발명의 불활화된 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2를 유효성분으로 함유하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 연쇄상구균에 의한 피해를 최소화하여 다발성 장막의 예방에 효과적임을 알 수 있었고, 임신한 모돈에 직접 투여하여 모체 이행항체를 이용하여 포유자돈에서 다발성 장막염을 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. 포유자돈에 백신 접종을 통한 다발성 장막염 예방

농장에서 4주령 이상의 이유자돈에서 다발성 장막염이 유발되는 경우에는 포유자돈에게 백신을 접종하여 예방하는 것이 효과적이다. 포유자돈에 백신을 접종하여 이유자돈에서 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염에 대한 예방 효과가 있는지 실험하였다.

구체적으로, 포유자돈에 상기 제조예의 백신을 1cc 용량으로 1 주령에 1차로 근육주사하여 접종하고, 3 주령에 2차로 근육 주사하여 접종하였다.

그리고, 2차 백신 접종한지 2주 후인 5 주령에 상기 실시예 3에서 분리 동정된 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2을 1x 10⁷ CFU 용량으로 주사기를 이용하여 공격 접종한 후, 5주간 관찰하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

그룹	실험두수	백신접종 연령	공격접종 일령	다발성 장막염 발병 두수	다발성 장막염 발병율
백신접종군	30	1차1주령 2차 3주령 (2회접종)	5주령	2	6.7
양성대조군	30	백신 미접종	5주령	29	96.6
음성대조군	30	백신 미접종	미접종	0	0

상기 표 2에서 양성대조군은 백신접종을 하지 않고 공격접종만을 한 그룹을 의미하고 음성대조군은 백신접종과 공격접종 모두 하지 않은 그룹을 의미하며, 백신접종군은 백신접종과 공격접종을 모두 시행한 그룹을 의미한다.

그 결과, 백신을 2차로 나누어 접종하고, 2차 백신 접종 후 2주 경과 후에 공격 접종한 군(백신접종군)에서는 실험이 종결될 때까지 다발성 장막염과 관련된 뚜렷한 임상증상이 관찰되지 않았고, 실험이 종결될 때까지 한마리도 폐사하지 않았다. 다만, 2두에서 공격 접종 후 3주가 경과된 8주령에서 다소 위축된 증상이 관찰되었으며 공격접종 실험이 종료되는 10주령에서 부검을 하였을 때 경미한 장막염이 관찰되었다.

이에 반하여, 백신을 접종하지 않고 5주령 시점에서 연쇄상구균을 공격 접종한 그룹(양성대조군)에서는 공격 접종 후에 다발성 장막염과 관련된 뚜렷한 임상증상이 관찰되었다.

우선, 이들 양성대조군에서는 공격접종 1주일 후부터 뚜렷한 식욕부진 등의 상태가 관찰되었으며, 공격 접종 후 3주가 경과된 8주령에서는 매우 위축된 자돈들이 관찰되었다. 또한 공격접종 실험이 종료되는 10주령에서 부검을 하였을 때 매우 심한 섬유소성 장막염이 30두 중에서 29두에서 관찰되었다.

상기와 같은 결과를 통하여 본 발명의 불활화된 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2을 유효성분으로 함유하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신은 돼지에 투여되어 다발성 장막염을 일으키는 연쇄상구균에 대한 면역력을 증가시킴으로써, 연쇄상구균에 의해 발생하는 다발성 장막염을 효과적으로 예방할 수 있고, 다발성 장막염의 발병 위험에 취약한 국내 양돈 농가에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11111P

20101011

서열목록 전자파일 첨부

Claims

약독화 또는 불활화시킨, 서열번호 7의 16S rRNA 서열을 갖는 돼지의 다발성 장막염을 유발하는 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2를 유효성분으로 함유하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 연쇄상구균(Streptococcus suis) 혈청형 타입 2는 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 11111P로 기탁된 것을 특징으로 하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 불활화는 포르말린 처리에 의해 불활화된 것을 특징으로 하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
알루미늄 젤(aluminium hydroxide gel)을 부형제(adjuvant)로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물.
제1항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 돼지에 투여하여 다발성 장막염 질환을 예방하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구, 비강, 항문, 근육내, 경피내, 정맥내 또는 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 다발성 장막염 질환을 예방하는 방법.
돼지의 다발성 장막염을 유발하는 수탁번호 KCCM11111P의 연쇄상구균(Streptococcus suis).
약독화 또는 불활화시킨 돼지의 다발성 장막염을 유발하는 수탁번호 KCCM11111P의 연쇄상구균(Streptococcus suis)을 유효성분으로 함유하는 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물.
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