JPH06503708A - 不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・バクテリンおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不活性化マイコプラズマ・バイオニューモニエ・である。これはブタの気道に感 染し、気管、気管支、および細気管支にコロニーを形成する。このマイコプラズ マは、呼吸路を裏打ちする綿毛の運動停止を引き起こす毛様体静止因子［ｃｉｌ ｉｏｓｆａｊｉｃ　ｆａｃｔｏｒｌを生成する。最終的に、毛様体の劣化は、ブ タをより重篤な二次病原体に感染しやすい状態におく。マイコプラズマ◆バイオ ニューモニエによって引き起こされる疾患、風土性肺炎［ｅｎｚｏｏｒｒｃ　ｐ ｎｅｕｔｎｏｎ１ａ３は、全ての年齢のブタに感染する死に至ることのない慢性 疾患である（Ａ、Ｄ、Ｌｘｍａｎ、ｔｆ　ａｌ、、（ｅｄｓ、）、　Ｄｉｓｅａ ｓｅｓ　ｏｌ　ＳｗＩｎｅ、ＩｏｗａＨａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｆ７　Ｐｔｅ ｓｓ、１９８６に掲載のＲ，Ｆ、Ｒｏｓｓ、　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ！　ｄｉｓ ｅａｓｅｓ、ｐｐ、４３６−４４４）　ｏ感染したブタは、咳および熱の穏やか な症状を示すのみである。しかしながら、疾患の経済的な衝撃は無視できない。

この疾患は、ブタの疾患関連損失の最も重要な原因の１つであると信じられてい る（Ｔｕｌｌｙ　ａｎｄ　Ｗｈｉｆｃｏｍｂ　（ｅｄｓ、）、Ｔｈｅ　Ｍｙｃｏ ｐｌａｓｍａ　Ｖｏｌ　２：　Ｈｕｍａｎ　ａｎｄＡｎｉｍａｌ　Ｍｙｃｏｐｌ ａｓｍａｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、（１９７ ９）に掲載されるＷｈｉｔＮｅｓｌｏｎｅ、ｐｐ、１３３−１７６　）　、この 疾病の行き着くところは、一般に、十分体重が増加せず、かつ発育不全で不健康 な動物である。また、冒されたブタはしばしば日和見生物によって二次感染に罹 りやすい。

マイコプラズマ性肺炎からブタを保護するためのワクチンを提供する多くの試み がなされている。しかしなから、そのようなワクチンか成功したことはなく、こ の疾患は広く残存している。

何人かの探索者が、組換えにより生成した、ヱ乙３プラズマ・バイオニューモニ エの表面抗原を含むワクチンを開示している、５ｃｈａｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、 　、米国特許４．８９４．３３２号（１９９０年１月１６日発行）；欧州特許公 開２８３．８４０号（１９８８年９月２８日公開）。

ＰＣＴ公開Ｗ０８６１０００１９号（１９８６年１月３日公開）には、マイコプ ラズマ・バイオニューモニエ原形質膜のみを含み、他の細胞成分は含まないマイ コプラズマ・ノ１イオニューモニエ・ワクチンが開示されている。

Ｅｔｈｅｒｉｄｇｅ　ｅｊ　ａｔ、　（Ｒｅｓ、　Ｙｅｔ、Ｓｃｉ、３３：　１ ８８　（１９８２）　）は、生ワクチンを静脈内、皮下もしくは腹腔内投与した 際に、マイコプラズマ・バイオニューモニエによる肺コロニー形成に対する不完 全な防御を見出した。

Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（＾ｍ、ｌ、　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ　４２： 　７８４　（１９８１）　）は、熱不活性化マイコプラズマ・／ＸＸイエューモ ニエの注射後には、ブタがマイコプラズマ性肺炎に対して防御されていないこと を見出した。

Ｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、（Ａｍ、Ｊ、Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ　４５：　１８９９　（ １９８４））は、凍結−解凍手段で調製したマイコプラズマ・ノ＼イオニューモ 防御のみか得られ、ある場合には、免疫されたブタに増強された病変生成か認ら れることを見出した。これらの探索者は、ホルマリン不活性化により調製した全 細胞ワクチンについても研究した。ホルマリン不活性化はマイコプラズマ・バイ オニューモニエの防御免疫原性を有意に隠匿してしまい、このワクチンは有効で はない。

Ｙｏｓｈｉｏｋａ　ｅｌ　ａｌ、、米国特許３．９１７．８１９号（１９７５年 １１月４日発行）は、マイコプラズマ・バイオニューモニエに対する不活性化ワ クチンを含む、ホルマリンで不活性化したマイコプラズマを含有する数種の殺マ イコプラズマワクチンを開示している。しかしながら、このワクチンはホルマリ ン不活性化により調製されている。

このように、不活性化マイコプラズマ−バイオニューモニエを用いる従来の研究 は、恐らく用いる条件、すなわち熱処理、ホルマリン処理、もしくは凍結−解凍 が生物の防御免疫原性能力を破壊したために、不成功に終わっている。

したがって、これまでに、不活性化した病原性の高いマイコプラズマ・バイオニ ューモニエを含む、マイコプラズマ性肺炎に対してブタを防御するための全細胞 ワクチンは開発されていない。

この発明は、全細胞マイコプラズマ・バイオニューモニエ・ワクチンまたはバイ ナリ−・エチレンイミン［ｂｉｎａｒ７　ｅｔｈ７１ｅｎｅｉｍｉｎｅ］を用い る処理によって不活性化されたマイコブ法は生物の防御免疫原性に悪影響を及ぼ さず、有効なバクテリンとして処方することができる。

発明の要約 この発明は、マイコプラズマ・バイオニューモニエによる感染に対してブタを免 疫するに有効な童の、バイナリ−・エチレンイミンで不活性化された、病原性の 高いマイコプラズマ・バイオニューモニエ分離株、および生理学的に許容し得る 適切な担体を含有するバクテリンを提供する。

この発明は、培養液中のマイコプラズマ・バイオニューモニエの病原性の高い分 離株を適切な培地で成長させ；成長した病原性の高いマイコプラズマ・バイオニ ューモニエをバイナリ−・エチレンイミンで処理してマイコプラズマ・バイオさ れた濃縮、不活性化マイコプラズマ・バイオニューモニエを生理学的に許容し得 る適切な担体と混合してバクテリンを処方することを含むバクテリンの製造方法 をも提供する。

この発明は、マイコプラズマ・バイオニューモニエの病原性の高い株の不活性化 方法であって、マイコプラズマ・バイオニューモニエの培養液を約４ｍＭの濃度 のバイナリ−φエチレンイミンと接触させ；この培養液をマイコプラズマ・バイ オニューモニエの不活性化に有効な条件下でインキュヘートシ；および中和有効 濃度のチオ硫酸ナトリウムを添加することにより培養液中のバイナリ−・エチレ ンイミンを中和することを含む不活性化方法をも提供する。

この発明は、マイコプラズマ・バイオニューモニエによる感染に対してブタを免 疫する方法であって、この発明によるｔ＜）７テリンの１回用量をブタに投与し てマイコプラズマ・バイオニューモニエ感染に対してブタを免疫することを含む 免疫方法をも提供する。

図面の簡単な説明 第１図、ホルマリンを用いる不活性化により調製されたバクテリンとの比較にお ける、バイナリ−・エテリンによってブタに誘導された相対抗体力価を比較する ＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果。

第２図、　バイナリ−・エチレンイミン不活性化バクテリンの最小防御用量の研 究結果。血清試料は１（ＰＶ）、３（Ｖｌ）、４　（Ｖ２　＞、５　（ＰＣＨＩ 　）および７　（ＰＣＨ３）週齢での試験における各ブタから得、かつ抗体力価 はＥＬＩＳＡにより検定した。

感染に対してブタを免疫するに有効な量の、バイナリ−・よる適切な担体を含有 するバクテリンを提供する。この発明の現時点の好ましい態様においては、バク テリンのマイコプラズマ株（ＡＴＣＣ受付番号５５０８８）が含まれる。

発明を記述するが、バイナリ−・エチレンイミンで不活性化されたいかなる病原 性の高いマイコプラズマ・バイオニューモニエ分離株であっても有効なバクテリ ンに処方し得ることカン・タイプ・カルチャー・コレクションを含む種々の源が ら利用可能である。最後に、１００２分離株の寄託は、特許手続上の微生物の寄 託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、かつこれを履行して、アメリカ ン・タイプφカルチャー・コレクション、１２３０１　パークローン・ドライブ 、ロックビル、メリーランド２０８５２に対してなされた。

このバクテリンは、生理学的に許容し得る適切な担体をさらに含む。そのような 担体の多くの種類が当該分野において公知であり、特定の担体の選定は当業者の 技量の範囲内にある。単に一例として、生理学的に許容し得る適切な担体には蒸 留水もしくは脱イオン水、生理食塩水、または鉱浦が含まれる。

現時点で好ましい態様において、バクテリンは有効量のアジュバントをさらに含 有する。ここで用いる「アジュバント」とは、免疫応答の強化剤である。アジュ バントには、毒、刺激物、および注射された動物の免疫応答を高める一般的な物 質を含めることかできる。この発明の現時点で好ましい態様において、アジュバ ントはアクリル酸のポリマー、例えばホモポリマーを含む。そのようなアクリル 酸のホモポリマーの市販例としては、カルボポール［Ｃａｒｂｏｐｏｌｌ　９４ １　（Ｂ、Ｆ、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、、　ＣＩｅｖｅｌａｎ＋Ｉ、　０ｈｉ ｏ　）を挙げることができる。カルボポールの化学構造式は（ＣＨ２ＣＨＯＯＯ Ｈ）　ｒＩである。

特定のアジュバントの有効量は、バクテリンを接種した動物の免疫応答に対する アジュバントの増強効果を最適化するために、容易に決定することができる。一 般に、アジュバントとして有用なアクリル酸ポリマーの有効量は、バクテリンの 約０２％（ｗ／ｖ）である。

この発明のバクテリンは、ブタの免疫に有効な量の、パイ的に免疫する」という ことは、このバクテリンがマイコプラズマ性肺炎の重篤性を阻止もしくは軽減す ることを意味する。

いずれにせよ、当業者は、アジュバントの存在下および非存在下における特定の 分離株と担体との組み合わせに対して、ブタの免疫に有効な、バイナリ−・エチ レンイミンで不活性化されたマイコプラズマ・バイオニューモニエの量を容易に 決定することができる。この発明の現時点における好ましい態様において、有効 量はバクテリン１ｍｌ当り少なくとも約ある（１’−ＤＮＡ細胞等量」の論考に ついては、後述の方法および材料を参照）。

を生理学的に許容し得る適切な担体と混合してバクテリンを処方することを含む バクテリンの製造方法をも提供する。この発明の好ましい態様においては、１０ ０２　（Ａ　Ｔ　ＣＣ受付番号器エキス、グルコース、Ｌ−システィン、アンピ シリン、酢酸第一タリウム、ブタ血清および脱イオン水を含有する適切な培地に おいて培養により成長させる。現時点で好ましいそのような培地の一つが、これ 以降に詳細に記述されている。

分離株が成長する厳密な条件は、培地の厳密な組成および成長する特定の分離株 によって変化し得る。しかしながら、典型的には、分離株はインキュベーション 時から回収時までの１１定で約４８時間ないし約１４４時間成長させる。

このように成長させた病原性の高いマイコプラズマ・ハイ処理する。このため、 分離株の培養液を約１ないし約１０ｍＭ、例えば約４ｍＭの濃度のバイナリ−・ エチレンイミンと接触させることができる。次に、この培養液をマイコプラズマ ・バイオニューモニエを不活性化するのに有効な条件の下で、例えば約３７°Ｃ で少なくとも１２時間インキュベートする。その後、有効中和濃度、例えば、約 １６ｍＭのように約１０ｍＭないし約２０ｍＭの濃度のチオ硫酸ナトリウムを添 加することにより、培養液中のバイナリ−・エチレンイミンを中和する。

この発明の態様の１つにおいては、マイコプラズマ−バイオニューモニエと接触 させ、かつ不活性化するために用いられるバイナリ−・エチレンイミンは、培養 液中にＬ−ブロモエチルアミン・ハイドロブロマイドを、バイナリ−・エチレン イミンに変換される際に所望の不活性化濃度、例えば約４ｍＭを形作る結果とな る量添加することにより、その場で形成される。

次いで、得られた不活性化マイコプラズマ・バイオニューモニエを濃縮する。そ のような生物の濃縮には、当該分野において様々な方法が知られている。例えば 、生物を、超遠心のような遠心または限外濾過のような濾過により濃縮すること ができる。

次に、得られた、濃縮不活性化マイコプラズマ・ハイオニ最後に、このように回 収された濃縮不活性化マイコプラズマ・バイオニューモニエを、バクテリンを処 方するために、生理学的に許容し得る適切な担体と混合する。最適には、この混 合物は、有効量、例えばバクテリンの約０．０５％ないし約０．２０％、特には 少な（とも約０．０７％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ。

または有効量、例えばパクテリンの約０．００５％ないし約０．０５％、特には 約０．０１％（ｗ／ｖ）のチメロソール［ｊｈｉｍｅｒｏｓｏｌ］をさらに含有 することができる。

バクテリンは、また、前記方法のいくつかの変形のいずれによっても製造するこ とができる。例えば、マイコプラズマ・バイオニューモニエは、不活性化の後よ りも、その前に濃縮することができる。また、バクテリンの調製は、濃縮工程の 前および後の両方で不活性化工程を繰り返すことにより行なうこともできる。

濃縮された、バイナリ−・エチレンイミン不活性化マイコプラズマ−バイオニュ ーモニエは、このように適切な担体を添加することによりバクテリンとして処方 される。希釈剤、染料もしくは防腐剤を添加することもできる。ＥＤＴＡのよう なキレート剤も、好ましくは少なくとも約０．０７％（ｗ／ｖ）の最終濃度で添 加することができる。生理食塩水のような希釈剤、もしくは当該分野で公知の他 の担体も、バクテリンの処方において、不活性化マイコプラズマ−バイオニュー モニエの希釈に用いることができる。防腐剤も添加することができる。この発明 の態様の１つにおいては、防腐剤としてチメロサールを少なくとも約０．０１％ （ｗ　／　ｖ　）の最終濃度で添加される。

の病原性の高い株の不活性化方法であって、マイコプラズマ度、例えば約３７℃ で、有効時間、例えば約１２時間等の）下でインキュベートし；および培養液中 のバイナリ−・エチレンイミンを、中和有効濃度、例えばバイナリ−・エチレン イミン濃度の約４倍、すなわちバイナリ−・エチレンイミンの濃度が約４ｍＭで ある場合に約１６ｍＭのチオ硫酸ナトリウムを添加することにより中和すること を含む不活性化方法をも提供する。また、上述のように、バイナリ−・エチレン イミンは培養液にＬ−ブロモエチルアミン・ハイドロブロマイドを添加すること によりその場で形成することもできる。

また、この発明は、マイコプラズマ・バイオニューモニエによる感染に対してブ タを免疫する方法であって、マイコプラズマ・バイオニューモニエ感染に対して ブタを免疫するために、バクテリンの少なくとも１回用量をブタに投与すること を含む免疫方法をも提供する。バクテリンは、原理的には、様々な経路により投 与することができる。しかしながら、この発明の現時点で好ましい態様において は、バクテリンは筋肉内に投与される。さらに、現時点では、バクテリン１回容 量はバクテリン２ｍｌを含み、その各々１ｍｌには約１０９マていることが好ま しい。このハクテリンは、好ましくは２回ブタに投与される。その１回はブタの 誕生後約１週間、もう１回は約３週間である。

この発明によるバクテリンは、注射による投与を意図するものであり、不活性な 生理学的に許容し得る希釈液に懸濁された、不活性化された、砂原性の高いマイ コプラズマ・バイオニューモニエを含む。

適当な希釈剤は、水、生理食塩水、または当該分野において公知の他のいかなる 希釈剤をも含む。マイコプラズマ・バイオニューモニエは、無菌条件下の無菌希 釈剤中に懸濁させることが有利である。

注射用のバクテリンは、通常の技術によって、例えば、ブタの血液と等張の塩溶 液に対して透析することによって等張にすることができる。注射媒体としての使 用に適したいかなる塩溶液も、バクテリンを等張にするために用いることができ る。

さらに、バクテリンは、使用前に希釈する濃縮組成物、または使用可能な状態に ある組成物のいずれとしても調製することができる。後者の場合には、不活性化 された、病原性の高いマイコプラズマ・バイオニューモニエの濃度は、１ｍ１当 り少なくとも約１０９ＤＮＡ細胞等量である。

この発明のバイナリ−・エチレンイミン不活性化マイコプラズマ・バイオニュー モニエはまた、１種以上の活性成分、すなわち、マイコプラズマ・バイオニュー モニエもしくは他の疾患原因要因に対する防御免疫応答を誘発することが可能な 抗原性物質を含有するワクチンの成分として使用することバクテリンの調製に用 いられる微生物は、１００２と名付けられ、ＡＴＣＣ受付番号５５０８８として 寄託された病原性の高いマイコプラズマ・バイオニューモニエ分離株である。こ の株は、元来、肺ホモジネートの１Ｏ−２希釈液をマイコプラズマ・ブロスにお いて培養することにより感染した肺から単離したものであり、ブロスにおいて７ 回継代してマスターシード［Ｍａｓｌｅｒ　５ｅｅｄコ　（“Ｘ”）を確立した 。

証した。ＮＶＳＬから入手したマイコプラズマ・バイオニューモニエ株Ｊを比較 の基準として用いた。マスターシード（“Ｘ”）の同一性は、基準であるマイコ プラズマ・バイオニューモニエ株Ｊおよび他の関連マイコプラズマ種との５ＤＳ −ＰＡＧＥおよびイムノプロット比較によりさらに立証した。

マスターシード（“Ｘ”）は、１００２と名付けられた分離株の７伏縫代である 。生成シード［ｐｒｏｄｕｃｌｉｏｎ　５ｅｅｄコは“Ｘ＋２＃継代である。シ ード培養液［ｓｅ！ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ］はＸ＋３″ないし“Ｘ＋６”の範囲に ある。生成培養液［ｐｒｏｄｕｃｔｉＯｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅコは“Ｘ＋６＃ない し“Ｘ＋７”の範囲にある。

シードおよび生成培養液を下記培地で増殖させた。

１、マイコプラズマ・ブロス・ ベース（市販品）・・・・・・・・・・１６．８００　ｇ２、酵母エキス（市販 品）・・・・・・・・　１．０００ｇ３、グルコース・・・・・・・・・−・・ ・　５．０００ｇ４、Ｌ−システィン塩酸塩・・・・・・・・　０．１００ｇ５ 、アンピシリン・φ・ψ・φ拳や・・ψ・　０．２５０ｇ６、酢酸第一タリウム 、Ｕ、Ｓ、Ｐ、　−−−−−−０，２５０ｇ７、フェノール・レッド（指示染料 ） ［シード培地用］　・・・・・・・・・・　０．０２０ｇ８、正常な無菌のブタ 血清（シード 培地に使用する前に、５８．５℃で ３０分間熱処理してもよい）・・・・・　１００．０００ｍ　１９、ＨＡオン水 ”　”　’　”　’　”　”　’ｑ、ｓ、１，０００．０００ｍ１成分が完全に 溶解したときに、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．８±０．４に調整する。この溶液 を、無菌Ｏｊミクロン・デプスフィルター、無菌０．３ミクロン・メンブランフ ィルタ−もしくは無菌容器内に収容された０、２ミクロン・カートリッジフィル ターのいずれかを通して濾過することにより殺菌する。

デプス、メンプランもしくはカートリッジフィルターおよびホルダーは、使用前 に１２１℃で３０分以上殺菌する。

基礎培地は、グルコース、Ｌ−システィン塩酸塩、アンピシリン、およびブタ血 清を除いて、使用前に１２１’Ｃ±２℃で最低３０分間オートクレーブで加熱す ることができる。Ｌ−システィン塩酸塩およびアンピシリンは、０．２ミクロン ・フィルターを通して濾過することにより殺菌し、無菌状態で基礎培地に添加す る。

グルコース溶液は、３０％（ｗ／ｖ）溶液として、　ｌ　２１　’Ｃ±２℃で３ ０分間オートクレーブで別に加熱する。正常無菌ブタ血清を無菌°状態で添加す る。完全培地のｐＨは、無菌の５ＮＮａＯＨを用いて７．８±０．４に調節する 。シード培養培地は２℃ないし７℃で３０日まで保存することが可能であり、オ ートクレーブで加熱した生成培養液は２℃ないし７°Ｃで１０日まで保存可能で ある。

シード培養液は、３０％ないし８０％培地を有する、２５０ないし４．０００ｍ 　ｌポリカーボネートもしくはガラスフラスコ、１２リツトル・ガラスジョツキ 、２８および２００リツトル発酵容器において成長させる。生成培養液は、３０ ％ないし８０％培地を有する、２００ないし３１）０リットル発酵容器内で成長 させる。

マスターシード（“Ｘ”）は、１００％培地中に−２０”Ｃ以下で維持する。生 成シード（“Ｘ＋２”）は、９０％培地および１０％グリセロール中に一２０℃ 以下で維持する。

凍結シード培養液（“Ｘ“もしくは“Ｘ＋２”）を急速解凍し、５％ないし１５ ％（ｖ　／　ｖ　）の割合で培地に接種することにより、種付けもしくは接種の ための浮遊液を調製する。

シード培養液は、５％ないし１５％（ｖ　／　ｖ　）の割合で培地に連続的に移 植する。

シードおよび生成培地を下記技法により接種した。凍結生成シード培養液（“Ｘ ＋２“）を５％ないし１５％（ｖ　／　ｖ　）の割合で用いて２５０ｍ　ｌフラ スコ内の培地に接種し、“Ｘ＋３”継代を生成させる。５％ないし１５％（Ｖ／ Ｖ）の割合での適当な容器への連続的な移植の結果として、続（シード培養液（ “Ｘ＋４”ないし“Ｘ＋９”）を生成させる。２５０ｍ１フラスコ培養液は、５ ％ないし１５％（Ｖ　／　Ｖ　）の割合で用いて４．０００ｍ　ｌフラスコに接 種すればよい。４．０００ｍ　１フラスコ培養液は、５ないし１５％（Ｖ／Ｖ） の割合で用いて１２リツトル・ジヤツキに接種すればよい。１２リツトル・ジヤ ツキ培養液は、５ないし１５％（Ｖ／Ｖ）の割合で用いて２８ないし２００リツ トル発酵容器に接種すればよい。２８ないし２００リツトル発酵容器培養液は、 ５ないし１５％（ｖ　／　ｖ　）の割合で用いて、２００ないし３．０００リツ トルの範囲にある生成発酵容器に接種すればよい。シード培養液および生成培養 液は３７℃±２℃で４８ないし１２０時間インキュベートする。全ての培養液は 、成長期を通じて撹拌しながら培養する。発酵容器は、無菌空気を注入すること により曝気する。シードおよび生成培養液のｐＨは、無菌ＮａＯＨ溶液を添加す ることによって７．４±０．４に維持すればよい。必要に応じて、無菌３０％グ ルコース溶液を生成培養液に添加することができる。

成長の特徴′は顕微鏡観察により決定する。特徴的な成長は、培地（シード培養 液）のｐＨの減少、もしくは培地（生成培養液）のｐＨを維持するためのＮａＯ Ｈの使用の減少に表われる。

成長量は、以下のようなりＮＡフルオロメトリーにより決定する。培養液の１． ５ｍｌアリコート４つを微小遠心管に集める。この試料を１２．０ＯＯＸ　ｇで １０分間遠心する。上清を完全に排出除去し、沈殿物［ｐｅｌｌｅ＋ｓ　］を、 ＩＯｍＭ）リス（ｐＨ７□４）、１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１、ＩｍＭエチレンジ アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、および１％（ｗ／ｖ）　ドデシル硫酸ナトリウム （ＴＮＥＳ）の混合液１２０μｌに再懸濁する。再懸濁した沈殿物を１０秒間激 しく渦状に撹拌する。再懸濁した沈殿物ｌＯμｌを、ガラスキュベツトにおいて 、ヘキスト［Ｂｏｅｃｈｓｌ　］染料溶液（１０ｍＭｔ・リス（ｐＨ７，４）、 １５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１、および１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に０．４ｕ　ｇ／ｍ　１ 　）　２ｒｎ　１と混合する。次いで、このキュベツトを、事前にＤＮＡ標準を 用いて較正したフルオロメーターに据える。蛍光の量は存在するＤＮＡ１ｉに比 例する。培養液中のマイコプラズマ・ハイオニューモニよりＮＡ細胞等ｆｆｉ　 （ＭＨＤＣＥ）数は、下記式を用いて算出する。

回収前に、顕微鏡を用いた評価により特性および成長墓および汚染について精製 培養液を試験する。

不活性化のために、発酵容器内において、Ｌ−ブロモエチルアミンハイドロブロ マイド（ＢＥＡ）を最終濃度が４ｍＭ以上となるように生成培養液に直接添加す る。

この培養液を、撹拌しながら、３７°Ｃ±２℃で１２ないし２４時間維持する。

マイコプラズマは、バイナリ−・エチレンイミンにさらされることにより不活性 化する。Ｌ−ブロモエチルアミンハイドロブロマイド（ＢＥＡ）を含有する生成 培養液のインキュベーション中にその場で生成するバイナリ−・エチレンイミン （ＢＥＩ）（主要不活性化剤）は、発酵容器内において、チオ硫酸ナトリウムを 最終濃度がバイナリ−エチレンイミン（ＢＥＩ）のモル濃度の４倍以上となるよ うに不活性化生成培養液に直接添加することにより中和する。

この培養液を、撹拌しながら、３７°Ｃ±２℃で１２ないし２４時間維持する。

インキュベーションから回収までの最小および最大時間は、それぞれ、４８およ び１４４時間である。

回収するために、生成容器内物質を無菌の容器内に貯留する。回収流体（ｈａｒ ｖｅｓｔ　ｆｌｕｉｄｓ）を、遠心および／または限外濾過により元来の体積の ｌθ％±５％まで濃縮し、および無菌の生理食塩水溶液を用いることにより透析 濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）してもよい。Ｌ−ブロモエチルアミンハイドロブロ マイド（ＢＥＡ）を最終濃度か４ｍＭ以上となるように添加することにより、濃 縮液を再び不活性化することができる。濃縮液を、撹拌しながら、３７℃±２℃ で１２ないし２４時間インキュベートする。その後、不活性化の間に生成したバ イナリ−・エチレンイミン（ＢＥＩ）を、チオ硫酸ナトリウムを最終モル濃度か バイナリ−・エチレンイミン（ＢＥＩ）のモル濃度の４倍となるように添加する ことにより中和する。この濃縮液を、撹拌しなから、３７°Ｃ±２°Ｃで１２な いし２４時間インキュベートする。チメロサールおよびエチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ）を、それぞれ最終濃度１）、０１％および０．０７％となるように 添加する。

特徴のある成長を示す生成培養液のみを回収する。回収に先立ち、各生成容器に 対してグラム染色を行なう。

このバクテリンを、チメロサールおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を 各々０，０１％以下および０．０７％以下添加することにより保存する。

このバクテリンに、アジュバントとしてカルボポール（Ｂ。

Ｆ、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、）を最終濃度０．２％（Ｗ／　Ｖ　）となるよう に添加する。

無菌の生理食塩水を希釈剤として用いることができる。レッド・ダイ（Ｒｅｄ　 Ｄ７ｅ　）　ＦＤ＆Ｃを、最終濃度が１リットル当り１５ｍ　ｇとなるようにバ クテリンに添加することができる。

最終生成物中のマイコプラズマ細胞の濃度は、ＤＮＡフルオロメトリック・アッ セイ（ＤＮＡ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｌｒｉｃ　ａｓｓａｙ）による測定で、投与量 ２．（１ｍ１当り２ＸＩＩ）９マイコプラズマ・ハ容器に入れ、３０分以上撹拌 する。

下記例を参照してこの発明をさらに説明する。しかしながら、それによって発明 の範囲か限定されることを意図するものではなく、限定されると解釈されるもの でもない。

例　１ ４種の異なるマイコプラズマ・バイオニューモニエ（Ｍｈｐ）株、Ｍｈｐ　１０ ０２株、Ｍｈｐ　１００５−ＮＢ１２株、Ｍｈｐ　１００３利株、Ｍｈｐ　１０ ０４−１１株およびＭｈｐ　１００６−４１５株の病原性を評価した。

試験したこれらの株の病原性は、抗原投与したブタの肺の病変により決定した。

この評価に基づいて、Ｍ、ハイオニュ用の株としての使用およびバクテリン調製 のために選択した。

仮性狂犬病試験を受けた３週齢のブタ２９匹を８．８．７および６匹の４群に分 けた。これらのブタを、抗原投与の時期である６週齢まで隔離して飼育した。

４株のマイコプラズマ・バイオニューモニエの各々の低継代ストック培養液を解 凍し、各株の１０％接種物を牛肺疫菌様微生物（Ｐ　Ｐ　Ｌ　Ｏ）完全培地（２ ４頁参照）に添加した。この培養液を３７℃で１２日間インキュベートした。

適当な抗原投与用培養液６ｍｌを、１−１／２インチゴムチューブを装着した１ ０ｍ　ｌシリンジを用いて各々の鼻孔内に投与した。プラスチックバッグを短期 間鼻孔上に保持して吸入を促進させた。この抗原投与を３日間続けて繰り返した 。

抗原投与用接種物の定量は、色変化単位［（ｏｌｏｒ　ｃｈａｎｇｉｎｇｕｎｉ ｔｓ］　（ＣＣＵ）を測定することにより行なった。

全てのブタは、最初の抗原投与の３週間後に安楽死させ、剖検した。肺を取り出 し、特徴的なＭ、バイオニューモニエ病変について検査した。

典型的なＭ、バイオニューモニエ病変がある肺の領域を切除し、適当な無菌容器 に収め、−７０℃で冷凍保存した。後日、以下の結果を表１および２にまとめた 。この研究においては、Ｍ、バイオニューモニエの４種の異なる株を用いた。全 投与量は、９．０ＸｌＯないし９．　Ｏｘ　１０１０ＣＣＵ／ブタの範囲であっ た。肺病変を有する動物／群の割合は、１７％ないし５０％の範囲であった。全 てのブタにおいて、肺病変は心臓葉（ｃａｒｄｉａｃ　１ｏｂｅ）および尖兵（ ａｐｉｃａｌ　１ｏｂｅ　）に限定され、Ｍ、バイオニューモニエの特徴を示し た。

投与ｆｆ１（ＣＣＵ／ブタ）および肺病変の程度の間には相関はないように思わ れた。Ｍ、バイオニューモニエ１００２およびＭｈｐ　１００５−ＮＢ１２は、 最も病原性が高いように思われた。しかしながら、Ｍ、バイオニューモニエ１０ ０２はより早く成長し、我々のＰＰＬＯ培地においてより高いＣＣＵレベルに達 した。

集めた肺試料から抗原投与用株を単離する試みは成功した。

肺との関わり、ＰＰＬＯ培地における成長および分離株を表１ の４種の異なる株の鼻腔内接種の結果 生じる付随肺病変 ９×１０７ １００２　４／８　（５０％） １００５−　ＮＢ１２　９Ｘ　１０６４／８　（５０％）１００３−１　９Ｘ１ ０１０１／６　（１７％）によって生じた付随肺病変 ２１４　左心臓葉（ｃａｒｄｉａｃ　１ｏｂｅ）　−８５％。

左尖兵（ａｐｉｃａｌ　ｌｏｂ＜　）　−１０％。

右心臓葉−８０％、副葉（ａｃｃｅｓｏｒｙｌｏｂｅ）　−６０％。

２１７　病変なし。

２１８　右尖兵−特に腹側表面、右心臓葉前面部−５０％、左尖葉腹側表面− パッチ、左心臓葉−外側５０％９横隔 膜葉（ｄｉａｐｈｒａｇｍａｔｉｃ　１ｏｂｅ）の末端まで広がる背部および腹 部の病変。

左横隔膜葉−背部および腹部表面の ２２１　山燈なし。

２２４　病変なし。

３６８　病変なし。

３６９　両心臓葉−腹側表面。

３７０　左心臓葉−先端１０％。

１００５−　ＮＢ１２ １３２　右尖兵−境界および腹側表面における局所的病変。

１３３　右尖兵および右心臓葉−腹側表面のｔ１韻製高のん汐亭荻戒硬存心臓 １３４　病変なし。

１３５　病変なし。

１３６　病変なし。

１３８　病変なし。

１３９　右尖兵−前面端部−１００％、右心臓葉−腹側表面のパッチ状病変。

１４０　右尖兵−腹側表面のパッチ状病変。

１９　病変なし。

２０　病変なし。

２１　右尖兵−前面端部および外部先端のまばらな病変−ｌＯ％。

２５　病変なし。

１６９　病変なし。

１７０　病変なし。

＋００４−１１ ６　病変なし。

７　病変なし。

８　病変なし。

９　右尖兵−最末端、左尖葉−先端ｌＯ％。

ｌＯ右尖兵−末端 ２５８　病変なし。

３３７　病変なし。

Ａ、ＰＰＬＯブロスｗ　／　０クリスタル・バイオレット（８００ｍ　ｌ　） ａ、ディ７　コ［Ｄｉｌｃｏ　］　Ｐ　Ｐ　Ｌ’Ｏｗ／　ｏクリスルタル・バイ オレット１６．８ｇを脱イオン水に溶解して８００ｍ　ｌとする。

ｂ、マグネットスターシー上において、室温で２時間、５００ｇのアンバーライ ト［ａｍｂｅｒｌＮｅ　］　Ｉ　ＲＡ　４００と混合する。

Ｃ，ペーパーフィルターでアンバーライトを濾過する。

Ｂ、酢酸第一タリウム（２，５ｍ１） ａ、酢酸第一タリウム０．２５ｇを全量２．５ｍｌの脱イオン水に溶解する。

Ｃ，フェノールレッド（０，５ｍ１） ａ、フェノールレッド０．０２ｇを脱イオン水０．５ｍｌに溶解する。

Ｄ、Ｌ−システィン塩酸塩（１ｍｌ） ａ、ｌ−システィン塩酸塩０．１ｇを脱イオン水１．０ｇに溶解する（使用当日 に調製）。

Ｅ、アンピシリン（２，５ｍ１） ａ、アンピシリン０．２５ｇを脱イオン水２．５ｍｌに溶解する（使用当日に調 製）。

Ｆ、グリコース（５０ｍｌ） ａ、グルコースｌＯｇを全量５０ｍ１の脱イオン水に溶解する。

Ｇ、酵母エキス（５０ｍ　ｌ　） ａ、酵母（フライシュマン社［Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ　Ｃｏ、］　）を脱イオン 水１５０ｍ　ｌに溶解してマグネットスターシー上で素早く撹拌する。

ｂ、酵母混合液にＩＯＮ　ＮａＯＨ０，８１ｍ１を徐々に添加する。

ｃ、１５ｐｓｉで１５分間、オートクレーブにおいて加熱する。

ｄ、４℃で一晩保存する。

８、８０００ｒｐｍで３０分間遠心する。

ｆ、上清を注ぎ取って集め、測定する。

ｇ、上清１００ｍ　１当り２ｍｌのｌＮＨＣｌ添加する。

ｈ、　ＩＯ，ｏｏｏｒｐｍで１時間遠心する。

ｉ、上清を注ぎ取り、集める。

ｊ、まず、０．８ミクロン・フィルター、次に０．４５ミクロン・フィルター、 最後に０．２ミクロン−フィルターを通して上清を濾過する。

ｋ、４℃で保存する。

Ｈ，ギブコ［Ｇｉｂｃｏ　］ブタ血清（１００ｍｌ）ａ、５６℃で３０分間、熱 活性化する。

１１、成分の組み合わせ ａ、括弧内に挙げた量で成分を組み合わせる。

ｂ、まず３．０ミクロンやフィルター、次に０．４５ミクロン・フィルター、最 後に０．２ミクロン・フィルターを通して濾過する。

０．３７℃で一晩インキユベートして純度をチェックする。

ｄ、４℃で保存する。

色変化単位 材料および装置 ＭＨｐ完全培地 １２−１２　ｘ　７５ｍｍ　スナップキャップ・プラスチックチューブ ピッペットもしくはコーンウオール［ｃｏｒｎｗａｌｌ］　ンリンジ 培養株 手順： １）総数１２本のチューブの全てに培地１．８ｍｌを入れる。

２）第１のチューブに培養株０．２ｍｌを添加し、チューブ１１まで１０倍希釈 する。チューブ１１から培養株０．２ｍｌを捨てる。

３）チューブ１２には培養株を添加せず、対照として用いる。

４）チューブの蓋を堅固に閉じ、３７°Ｃで１４日間インキュベートする。

５）色変化をチェックして力価を決定する。１４日目に、色が赤色から黄色に変 化した最大の希釈を記録し、以下のようにしてＣＣＵ／ｍｌを算出する。

バイナリ−・エチレンイミン（ＢＥＩ）−不活化、および感染に対してブタを防 御する能力について評価した。

ホルマリンで不活化したバクテリアはＢＥＩで不活化したバクテリアよりも明ら かに高いＥＬＩＳＡ凝集価を与えた。

しかし、ＢＥＩで不活化したバクテリアのみが、感染に対して有意差のある防御 を示した。これらの結果は、局所に分泌される抗体および／または細胞が関与し た免疫が、循環している抗体よりもＭ、バイオニューモニエに対する免疫応答に おいてより重要な役割を果たしていることを示唆している。

これらの結果の評価により、ＢＥＩで不活化したバクテリアをそれ以降の実験に 選んだ。

これらの実験に用いたブタはイオニア・ピッゲス社［１ｏｎｉａ　Ｐｉｇｓ、Ｉ ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄコ　（イオニア、アイオワ）のものである。

マイコプラズマ・バイオニューモニエ菌株１００２は、以前はＰ−５７２３−３ と命名されていた菌株（チャールズ・アームストロング博士、プルデユー［Ｐｕ ｒｄｕｅ］大学）であり、各々の継代に対し１０％濃度の接種量を用い、縫代Ｘ ＋７まで前述のように培養液に連続的に継代した。各々の継代は３７℃で７５ｒ ｐｍで振とうしながら７２−８０時間培養した。

Ｘ＋７ｍ代培養液の培養の最後に、マイコプラズマの成長と濃度の程度を、それ ぞれ、培養液の色と位相差顕微鏡によって可視的に調べた。試料を取りだし定量 的な色調変化単位（ＣＣＵ）法を使って、存在する微生物の数を決定した。

不活化−ホルマリン：　ホルマリンは最終濃度が０．２％になるように４００ｍ 　ｌのＸ＋７培養液に加えた。細胞浮遊液は３７℃で２４時間７５ｒｐｍで振と うした。

不活化−バイナリ−・エチレンイミン（ＢＥＩ）＋　４００ｍ１のＸ＋７培養液 に４０ｍ１の２％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウムをｐＨ７，５に上昇するまで加 えた。０．３３ｇの２−臭化エチルアミン臭化水素塩を含むｌＯｍ　ｌの脱イオ ン水は０．２μｍのフィルターで滅菌し培養液に加えた。培養液はそのまま２４ 時間３７℃で（７５ｒｐｍ）振とう１７た。０．５ｇチオ硫酸ナトリウムを含む ｌＯｍ　１の脱イオン水はフィルターで滅菌しＢＥＩを中和するため不活化した 培養液に加えた。中和した培養液は２４時間３７℃で（７５ｒｐｍ）振とうした 。

バクテリンを調製するために各々の不活化した培養液の細胞は４°Ｃで４０分間 １５０００Ｘ　ｇで沈殿させ、それから約５０ｍ　ｌのＰＢＳで再懸濁し３回同 様に洗浄した。最後の沈殿物は約５０ｍ１のＰＢＳで再懸濁した。再懸濁した細 胞は、最後の調製液か０２％（Ｗ／　Ｖ　）濃度のカルボポールを含むように、 またその２ｍ１ｉｔは５Ｘ　１０１０ＣＣＵの細胞を含むようにカルボポールと 混合した。ワクチンは防腐剤として０．００５％（Ｗ／　Ｖ　）のチメロサール も含んでいる約１週齢と３週齢の子ブタに２ｍｌの特定のバクテリンを首の部分 の筋肉中に接種した。１群のブタは接種せず抗原投与の対照群として使った。

Ｍ、バイオニューモニエ分離株１００２のＸ継代を、前述したようにｌＯ％接種 量を用いて培養液にＸ＋２のレベルまで継代した。培養液は３７℃で８０時間、 ７５ｒｐｍで振とうした。Ｘ＋２継代の培養の最後に、マイコプラズマの成長と 濃度の程度を、ワクチンでのマイコプラズマ濃度と同様の方法で評価した。動物 に最初に接種した同一の日に、数匹の１週齢のブタに上記の抗原投与用培養液２ ｍｌを接種した。接種物は気管に１５ゲージ針で挿入した３　−１／２のフレン チ・トム・キャット・カテーテルを通して注入した。感染症は３週間進行させた 。

試験するブタに対する抗原投与用培養液は前述した通りに調製した。しかし、Ｘ ＋２縫代培養液は７２．９６．１２０時間培養後、抗原投与として使われた。４ 週齢の時点で（２回目の接種をした１週間後）非接種群と接種群は、ｌ　−２ｍ 　ｌのプロムエースヴエタラ−［Ｐｒｏｍ　Ａｃｅ　Ｖｅｔａｌａ＋］　（１： 　１０）溶液で鎮静化した。鎮静後３ｍｌの抗原投与液を外界孔に挿入した短い ゴムチューブに連結したシリンジで鼻孔内に（外界孔あたり　１．５ｍ）注入し た。この方法を同じ培養液を使いそのら５Ｘ１０９ＣＣＵ／ｍ１であった。抗原 投与のとき、３ないし４匹の（３週間前に感染した）種つけ用のブタは、抗原投 与の自然な手段として各々の試験群に一緒に混ぜた。

血液試料は１回目の接種当日（ＰＶ）、２回目の接種当日（Ｖｌ）、抗原投与の 最初の日（Ｖ２）、抗原投与後１週間目（ＰＣＨＩ）　、抗原投与後３週間目（ Ｐ　ＣＨ２）に全ての子ブタから採取した。各々の血液試料からの血清は５６℃ で３０分間熱で不活化し、−２０°Ｃにて保存した。血清はＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に よりＭ、バイオニューモニエ抗体に対する試験を行った。

最初の抗原投与後２１１回目、腹部大静脈へ直接２−５ｍ１の安楽死液を注射し て動物を安楽死させた。胸腔をすぐに開き、肺はそのまま取り出した。肺は写真 を取り、明白な病変は次のように評点した。尖兵［ａｐｉｃａｌ　１ｏｂｅ　］ あるいは心臓葉［ｃａ＋ｄｉａｃ　１ｏｂｅコに対し１０点を割り当て、中葉［ ｉｎｊｅｒｍｅｄｉａｌｅ　１ｏｂｅ　］に対し５点を、横隔膜葉［ｄｉａｐｈ ｒａｇｍａｆｉｃ　ｔ。

ｂｅ］のリーディングエツジ［ｌｅａｄｉｎｇ　ｅｄｇｅ］に対し５点を割り当 てた、したがって、もしこれら全ての領域か全体的に硬化している場合は（めっ たに無い厳しい例であるが）病変点数は５５になるであろう。それから、得られ た実際の点数はその最高点数の割合として表わす。これを％病変点数として定義 する。図は病変点数の記録に用いた。

％病変点数は処置した群の間の有意差を明らかにするためにツーテイル［ｔｗｏ 　ｊａｉ！ｅｄｌスチューデントＴ検定で統計的に分析した。

ＥＬＩＳＡの結果は第１図に示した。１週齢では、接種する前に（ＰＶ）、全て の群は抗Ｍ、　ノ＼イオニューモニエ循環抗体を持っていた。これらの凝集価は 二度目の接種をする前（Ｖｌ）、３週齢で減少していた。抗原投与以前（Ｖ２） 、４週齢では、ホルマリンあるいはＢＥＩで不活化したノくクチリンを接種した 動物は非接種動物より高い凝集価を持っていた。しかし、ホルマリンで不活化し たバクテリンはＢＥＩで不活化したバクテリンよりも劇的に高い凝集価をもたら した。

病変点数の結果を表３に示した。ＢＥＩで不活化したノくクチリンは％病変点数 の平均値を約６０％減少させた。この減少は統計的に高い有意差である（ｐ＜０ ．０１）。

血清学的な応答と％病変点数の間に相関関係はなかった。

ホルマリンで不活化したバクテリンは循環している抗体の最も高い凝集価を誘引 したのに対して、ＢＥＩで不活化したノ（′クチリンのみか抗原投与からブタを 守った。

これらの結果はマイコプラズマ・）＼イオニューモニエの感染に対し、循環して いる抗体は免疫防御においては大きな役割を果たしていないことを示唆している 。局所的に分泌される抗体および／または細胞が関与している免疫が、恐らくよ り重要なのである。ＢＥＩで不活化したノくクチリンは多分免疫系のこれらの武 器を適確に呼び起こすものと思われる。

抗原投与した接種ブタの％病変点数 バクテリン　％病変点数　Ｘ＋ｓ、ｄ。

ホルマリン不活性化　２６．４＋１９．２ａＢＥＩ不活性化　１１．６＋　６． ９ｂ非接種　３０．４＋１３．７ ａ、ツーティルトＴ検定では非接種群と有意の差は見られない（ｐ＞０．５）。

ｂ、ツーティルトＴ検定で非接種群との有意差が見られる（ｐ＜０．０１）。

例３ 実験を続ける中で評価した。バクテリンは１週齢と３週齢のブタに投与した。非 接種のひと腹の子ブタは対照群として用意した。接種群と対照群の一部のブタは 、１か月齢時に感染性の強いＭ、バイオニューモニエを抗原投与した。接種群と 対照群の次の一部のブタは、２か月齢時に抗原投与した。残りの動物は４か月齢 時に抗原投与した。抗原投与からの有意差のある防御は（Ｐ＜０．０５）　ｌ、 ２．４か月齢時での接種群で観察された。これらの結果は１週齢と３週齢での接 種はブタに対して長く持続性のある防御を授けるということを示している。

この実験で使用したバクテリンは１ｍｌ当り９．０１ｏｇｌ。

マイコプラズマ・ハイオニューモニよりＮＡ細胞等Ｊｉ　（ＭＨＤＣＥ）を含ん でいる。

７６匹の１週齢のブタは２つの処置群に分けた。ひと腹の子は処置群間に分配し た。これらの動物６０匹は（処置群当り３０匹）イオニア・フィーダー・ピック ズ社［１ｏｎｉａ　Ｆｅｅｄｅｒ　ＰｉｇＳ］、イオニア、アイオワから入手し た。１６匹の動物は（処置群当り８匹）ソルヴエイ・アニマル拳ヘルス社［５ｏ ｌｖａｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ、Ｉｎｃ、コ、チャールズ・シチー、ア イオワのＳＰＦブタ事業部［５ｗ１ｎｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎコから入手した。

第一の処置群のブタには１週齢時に右耳の後ろの首の筋肉に筋肉内注射で接種し た。注射は２週間後に首の左側に繰り返された。

第二の処置群の動物には接種しなかった。

イオニアブタは３週齢で離乳させ隔離室へ移動させた。ＳＰＦブタは抗原投与す るまでＳＰＦの群れで飼育した。

抗原投与物質は前記したように調製して投与した。１か月齢時で１０匹の接種流 イオニアブタおよび１０匹の対照イオニアブタを、２匹の接種済ＳＰＦブタおよ び２匹の対照ＳＰＦと一緒に隔離室へ移し抗原投与した。２か月齢時で８匹の接 種流イオニアブタおよび８匹の対照イオニアブタを、１匹の接種済ＳＰＦおよび ３匹の対照ＳＰＦと一緒に隔離室へ移し抗原投与した。４か月齢時で８匹の接種 流イオニアブタおよび８匹の対照イオニアブタを、５匹の接種済ＳＰＦブタおよ び３匹の対照ＳＰＦと一緒に隔離室へ移し抗原投与した。

抗原投与の３週間後、全てのブタを安楽死させ、前述したように％肺病突点数を 決定した。この実験の間に死亡したブタは分析には含まなかった。合計８匹の非 接種ブタと６匹の接種ブタが実験の過程で死亡した。それらの動物は一般に弱い 個体であるかひどい腸炎、あるいは胸膜炎、あるいは心膜炎であった。剖検でＭ 、バイオニューモニエに由来しない明白な肺病変、例えば表面の繊維素、胸郭の 癒着、出血性の膿瘍が観察された動物は分析に含まなかった。合計１匹の非接種 ブタと３匹の接種ブタがその様な病変を示した。

％肺病突点数はワンティルト（ｏｎｅ−ｔａｉ　１ｅｄ）スチューデントＴ検定 により統計学的に分析された。

明らかに示し、非接種群を含む全てのブタで観察された。接種群と非接種群共に 平均％病変点数は抗原投与時の動物の月齢にそって減少した。この抗原投与に対 する抵抗性の上昇は、免疫学的なものであるのか、あるいは生理学的な現象であ るのかは明らかではない。

４か月齢時でさえ接種した群に有意（ｐ＜０．０５）の防御か与えられた。前記 したように計算した実際の防御割合は動物の月齢に従って減少した。しかしなが ら、４か月齢時で観察された６３％の防御は病変のかなりの減少を依然として示 してブタにおいて長期間持続する防御を引き起こす能力があることを示している 。１週齢および３週齢で接種したブタは、４か月齢時に達しても有意に防御され ている。平均して市場で防御を与えるに違いない。４か月齢以降中じるＹ、ノ＼ イオニ衣−１ ％病変点数 ２、の 上　上　上 エ　エ　エ　二　厘　二 ：　ｖｓ、ＣＴＬ　Ｔ−１−−イルド 会　有意　（ｐ＜０．０５） 例４ この例のおいては、１ｍｌ当り７．０．８．０．９．０．９．２５および１０． ０　１　ｏ　ｇ　ｌｏＭ、ハイオニューモニよりＮＡ細胞等量て評価した。これ らのバクテリンを、ｌおよび３週齢のブタに２ｍｌ筋肉内注射により投与した。

抗原投与に対する有意（ｐ＜０．０５）の防御を、　１ｍｌ当り≧９．０　１　 ｏ　ｇ　ＩＯＭ　ＨＤＣＥを含有するバクテリンにより引き出した。

この研究に用いられる動物は、イオニア・フィーダー・ピッゲス社、イオニア、 アイダホからのものである。１週齢のブタ１２８匹を、各々１６匹のブタからな る８つの処置群に配置した。これらのブタには識別のためにイヤー・タグを施し た。

３つの群には接種をしなかった。他の５つの群のそれぞれには、５種のバクテリ ンのうちの１種を与えた。右耳の後ろの首の筋肉への２ｍｌ筋肉内（ＩＭ）注射 として、ワクチンを投与した。２週間後、首の左側で注射を繰り返した。　。

これらのブタを３週齢で離乳させ、ツルベイ・アニマル・ヘルス社の研究施設に 移した。ワクチン接種ブタおよびワクチン非接種ブタの群のうちの２群をツルペ イ社の２つの個室に収容した。各非ワクチン接種群のうちの１群を２部屋のうち のいずれかに配置した。第３の非ワクチン接種群は、外部からのＭ、バイオニュ ーモニエの攻撃にさらされるのを避けるために別に収容した。

４週齢の時点で、ワクチン接種およびワクチン非接種群（ＮＶ／ＣＨ）の動物に 病原性の高いＭ、ハイオニューモニ（ＮＶ／ＮＣ）は、抗原投与しないまま残し た。

１．３．４および７週齢時の試験の際に各ブタから血清資料を得た。Ｍ、バイオ ニューモニエに対する抗体を、例２と記述したようにＥＬ　Ｉ　ＳＡにより定量 した。

抗原投与の３週間後、全てのブタを安楽死させ、％肺病変点数を決定した。Ｍ、 バイオニューモニエに由来しない明白な肺病変、すなわち表面の繊維素、胸郭の 癒着または出血性の膿瘍を有する動物は分析には含まなかった。実験の途中で死 んだ動物は分析には含まなかった。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡによる結果を表５に示す。１週齢時には動物はかって、これら母 方由来の抗体のいくらかがマイコプラズマφフロキュラ−［Ｍ７ｃｏｐｌａｓｍ ａ　ｆｌｏｃｕｌｌａｒｅ］に対するものである可能性は捨て切ることは困難で ある。Ｍ、バイオニューモニエとＭ、フロキュラーとはいくつかの抗原を共有し ている。それにもかかわらず、これらの母系抗体は急速に消失するように見え、 ３週齢時には一律に低い。

１ｍｌ当り≧９．０　１　ｏ　ｇ　Ｉ（ＩＭ　ＨＤ　ＣＥを含有するバクテリン でワクチン接種された動物は、３週齢での第２ワクチン接種後に血清転換［５ｅ ｒｏｃｏｎｖｅｒｊｅｄ　］　した。抗原投投与前に、４週齢時のワクチン非接 種・抗原非投与対照群の力価が増加したことは予想外であった。しかしながら、 その増加はワクチン接種群におけるものほど劇的なものではない。

これらの結果は、　１ｍｌ当り≧９．０　１　ｏ　ｇ　Ｉｃ、　Ｍ　ＨＤ　ＣＥ を含有するバクテリンが、Ｍ、バイオニューモニエ循環抗体力価を効果的に引き 出すことを示唆している。

病変点数結果および統計分析を表６に示す。％防御を算出するために、ワクチン 非接種、非抗原投与群の平均％病変点数を他の処置群の平均％病変点数から減じ た。その後、得られた調節済の平均値を下記式に入れた。

ワクチン接種により引き出された％防御が投与量の増加に伴って増加したことは 明らかである。Ｔ検定分析は、１ｍｌ当り≧９．０　１　ｏ　ｇ　１ｏ　Ｍ　Ｈ Ｄ　ＣＥを含有するバクテリンを用いて有意（ｐ＜０．０５）の防御が達成され たことを明らかにした。

１ｍｌ当り７．０　１　ｏ　ｇ　１ｏＭ　ＨＤ　ＣＥを含有するバクテリンを受 けた処置群は、ワクチン非接種の抗原投与された対照群よりも高い平均％病変点 数を有しており、最適量を下回る投与ｆｉｔ　［ｓｕｂｏｐｌｉｍａｌ　ｄｏｓ ｅｓｌが抗原投与後の病変形成を増強（１ｍｌ当り９．０　ｌｏｇｌｏＭＨＤＣ Ｅを含有するバクテリｍ　出血　の悶 −よ−　−１−−ニー　−土− ＮＶ／ＮＣ０，１，５８ＮＤ＊　０．０９０　０．０８６★利用可能な血清試料 なし 人−互 ％病変点数 ％防御１００．Ｏ１Ｏ，Ｏｌ　Ｏ，Ｏｌ　２０．２ｔ　４４．３ｔ　５４．１＆ 　６３．９を艮一旦 統計分析（Ｔ−検定、１テイルト） ☆　ＮＶ／ＣＨ群とは有意に異なる（ｐｒｏ、０５）例５ び溶解質のアッセイを含む。ミニフルオロメーター（ＴＫＯ−１００、ヘーフエ ル・サイエンティフィック［ｈｏｅ［ｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　］　）を使 用し、分光光度計で定量した精製ＤＮＡを用い単位（ＣＣＵ）アッセイ法と比較 する。

マイコプラズマ・バイオニューモニエ研究に関連する問題の１つは、微生物の成 長の監視か困難なことである。塗布効率が成長の異なる段階で大きく変化し、か つコロニーか小さくて成長が非常に遅いために、コロニー形成単位（ＣＦ　Ｕ） え挙げられている。このアッセイは、新鮮な培地のチューブ内に培養液のいくつ かの希釈液を作製することを含む。次いフトを示す。元の培養株の力価は、成長 を示す最高の希釈率で表わされる。ＣＣＵ法は実験誤差が大きく、かつアッセイ に多量の複製チューブを必要とするために、より早くかつより正確な試験か必要 であった。

ベキスト３３２５８染料およびＴＫＯ１００ＤＮＡミニフルオロメーターは、ヘ ーフエル・サイエンティフィック−プロダクツから購入した。ニシン精子ＤＮＡ はシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から購入した 。他の全ての化学薬品は、シグマ・ケミカル社から購入した試薬グレードのもの でりに、シェイク・フラスコ内の培養液２００ｍ　ｌ中で成長させた。６つのフ ラスコに接種し、平行してインキュベートした。

２４時間間隔で各培養液から試料を取り出し、ｐＨの測定並びにＣＣＵおよびＤ ＮＡアッセイを行った。各時点で、６つの培養液の各々のｐＨ値を平均した。

色変化アッセイは、例１に記述した通りに行なった。６つの培養液からのＣＣＵ の結果を各時点で平均した。

ＤＮＡアッセイのために、各培養液のアリコー）１．５ｍｌを微小遠心管に集め 、１２．０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心した。上清を完全に吸引除去し、沈殿物を 、１０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、１５０ｍＭ　ＮａＣ３１ｍＭ　ＥＤＴＡおよ び１％（ｗ／　ｖ　）ドデシル硫酸ナトリウム（ＴＮＥＳ）の１２０μｍに再懸 濁した。再懸濁した沈殿物を１０秒間渦状に激しく撹拌した。ガラスキュベツト 内において、再懸濁液１０μｍを、０．０４％（Ｗ／■）へキスト染料を含有す る１０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１および１ｍＭ　ＥＤＴ Ａと混合した。このキュベツトをＴＫＯ１００ＤＮＡミニフルオロメーター内に 据えた。このミニフルオロメーターは、ＴＮＥＳ中に希釈されたニシン精子ＤＮ Ａ標準を用いて事前に較正されたものである。得られた読取り値または各サンプ ラーの４種のアリコートの各々を平均し、６つの培養液の結果も平均した。

アッセイのダイナミック線形応答レンジは、試験試料１０μｍ当りＤＮＡ約２０ −２０００ｎ　ｇであった。これは、培養液１ｍｌ当りＤＮＡ　０．１６−１６ μｇの有効レンジに変換された。

ｘｉｎ、　Ｔｈｅ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ 、　４２：　４１４−４７０（１９７８）　）。これは、細胞１個当りＤＮＡ　 ８Ｘ１０”μｇに相当する。したがって、蛍光光度アッセイの下限は、（培養液 １ｍｌ当りＤＮＡ　Ｏ，１６ｕｇ）　＋　（細胞１個当りＤＮＡ８Ｘ　１０”μ ｇ）−培養液１ｍｌ当り２Ｘ　１０”細胞　である。

上限は、この値の１００倍もしくはＩｍ１当り２Ｘ１０１０細胞である。

このアッセイは、細胞濃度の間接測定である。したがって、結果は、Ｍ、ハイオ ニューモニよりＮＡ細胞等量または１ｍ１当りのＭＨＤＣＥで表わされる。

対数増殖期（２４−７２時間）の間、ＭＨＤＣＥとＣＣＵ読取り値との間には良 好な相関が存在する。ＭＨＤＣＥは、ＣＣＵ値より　４−５倍高い。一般に、Ｃ ＣＵアッセイはマイコプラズマ濃度を低く見積もるように感じられる。したがっ て、ＤＮＡアッセイはＭ、バイオニューモニエ細胞の真の数をより正確に反映し 得る。ＣＣＵアッセイは内在的に実験誤差を生じる傾向がある。ＣＣＵアッセイ の正確性の改善には、多数の複製チューブとより細分化した希釈系列（２倍もし くは３倍）が必要とされる。ＤＮＡアッセイの実験誤差を生じる傾向はより小さ い。ＤＮＡアッセイには、種々の試料操作および包含される小容量測定に起因す る幾つかの誤差がある。

しかしながら、この誤差は試験を実行するオペレーターの技術に関連するもので ある。多くのオペレーターは、限られた量のトレーニングおよび経験の後には非 常に上手（ＤＮＡアッセイを行なう。

ＤＮＡアッセイは、生細胞中であっても、死細胞中であっても、あるいは溶液中 のフリーのものであっても全てのＤＮＡを測定する。一方、ＣＣＵアッセイは、 生細胞のみを測定する。これは、０時間での培養液中のＭＨＤＣＥが２４時間で のものよりも僅かに高いのは何故なのかを説明している。

０時間でのＤＮＡ測定の実質的な部分は、恐らく、死細胞または過酷な移送の結 果生き残れなかった細胞におけるものなのである。

静止期培養液（〉７２時間）においては、ＣＣＵアッセイは成長可能な細胞の損 失を明らかに示している。Ｍ、バイオニューモニエは酸性条件に感受性であり、 この死による損失は恐ら＜ｐＨに関連するものである。ＤＮＡアッセイは比較的 応答が遅い。これは、検出されるＤＮＡを死細胞が依然として有しているためで あると推測される。

Ｍ、バイオニューモニエを定量するためのＣＣＵアッセイは、幾つかの欠点に悩 む。第１に、恐らく、これはマイコプラズマ細胞の数を低く見積もる。第２に、 実験誤差を生じる傾向にある。この誤差を減少させるためには、多数の複製チュ ーブ、高価な培地、および人手を必要とする。第３に、このアッセイは完了まで に少なくとも１４日を必要とする。

ＤＮＡアッセイは、これらの問題の全てを解消する。マイコプラズマ細胞の見積 りはＣＣＵの見積りよりも４−５倍高く、真の細胞総数をより正確に反映する。

適正な装置およびトレーニングか与えられた場合には、ＤＮＡアッセイはｃｃＵ アッセイよりも実験誤差を生じる傾向が小さい。最後に、ＤＮＡアッセイは１５ −３０分を必要とする（複数の試料を分析しようとする場合にはより多くの時間 を必要とする）。これは、ＤＮＡアッセイを、マイコプラズマ培養液のリアルタ イムの監視に適当なものとする。ＤＮＡアッセイは、それらが生きているか死ん でいるかにかかわらず、およびその代謝状態にかかわらず、全ての細胞をａｊ定 することを忘れるべきではない。

したがって、このアッセイは、マイコプラズマ成長曲線の対数増殖期において最 も有益である。

第１ＩＪ 第２１７ Ｅ二；己ニコ　Ｆｖ　Ｅ＝＝；：］　ｖＩ　Ｃコニ乏ヨコＶ２　ＥΣ互ミＩＰＣ Ｈ１ｒｚＸＸｊＵ　ＰＣＭ］国際調査報告 −惰−一一一〇−Ｔ４ｍ、、　ＰＣＴ　／ＬＩ５９１１０５８５８Ｇｒｏｕｐ　 ｒｒ、ｃｌａｉｍｓ　１フー１９．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｗｎｒ、ｈｏｃｌ 　ｏｆ　（ｎａ（！？、（ｖａｔ（ｒ＋ｇ　ａｍｌｃｒＯｏｒｇｐｎｉｅｍ。

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Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．マイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染に対してブタを免疫するに 有効な量の、バイナリー・エチレンイミンで不活性化された病原性の高いマイコ プラズマ・ハイオニューモニエ分離株、および生理学的に許容し得る担体を含有 するバクテリン。
2. ２．病原性の高いマイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株が、１００２と命 名された分離株（ＡＴＣＣ受付番号５５０８８）を含む請求の範囲第１項記載の バクテリン。
3. ３．マイコプラズマ・ハイオニューモニエの有効免疫量が、少なくとも　２×１ ０９マイコプラズマ・ハイオニューモニエＤＮＡ細胞等量である請求の範囲第１ 項記載のバクテリン。
4. ４．有効量のアジュバントをさらに含む請求の範囲第１項記載のバクテリン。
5. ５．アジュバントがアクリル酸のポリマーを含む請求の範囲第４項記載のバクテ リン。
6. ６．有効量のアジュバントがバクテリンの約０．２％（Ｗ／Ｖ）をなす請求の範 囲第５項記載のバクテリン。
7. ７．バクテリンの製造方法であって、 （ａ）培養液中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの病原性の高い分離株を 適切な培地で成長させ；（ｂ）成長した病原性の高いマイコプラズマ・ハイオニ ューモニエをバイナリー・エチレンイミンで処理してマイコプラズマ・ハイオニ ューモニエを不活性化し；（ｃ）得られた不活性化マイコプラズマ・ハイオニュ ーモニエを濃縮し； （ｄ）得られた濃縮、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエを回収し； および （ｅ）回収された濃縮、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエを生理学 的に許容し得る適切な担体と混合してバクテリンを処方する ことを含むバクテリンの製造方法
8. ８．工程（ａ）において、病原性の高い分離株が１００２と命名された分離株（ ＡＴＣＣ受付番号５５０８８）を含む請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．工程（ａ）において、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株を約４８ 時間ないし約１４４時間成長させる請求の範囲第７項記載の方法。
10. １０．工程（ｂ）において、処理が、 （ｉ）マイコプラズマ・ハイオニューモニエ培養液を約４ｍＭの濃度のバイナリ ー・エチレンイミンと接触させ；（ｉｉｉ）マイコプラズマ・ハイオニューモニ エを不活性化するに有効な条件下で培養液をインキュベートし；および（ｉｉｉ ）有効中和濃度のチオ硫酸ナトリウムを添加することにより培養液中のバイナリ ー・エチレンイミンを中和することを含む請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．工程（ｉｉ）において、有効な条件が少なくとも約１２時間のインキュベ ーションを含む請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．工程（ｉｉｉ）において、チオ硫酸ナトリウムの有効中和濃度が約１６ｍ Ｍである請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．工程（ｉ）において、マイコプラズマ・ハイオニューモニエと接触するバ イナリー・エチレンイミンが、Ｌ−ブロモエチルアミン塩酸塩を培養液に添加す ることによりその場で形成される請求の範囲第１０項記載の方法。
14. １４．工程（ｅ）において、混合が、有効濃度のＥＤＴＡおよび有効濃度のチメ ロサールを混合することをさらに含む請求の範囲第７項記載の方法。
15. １５．有効濃度のＥＤＴＡは、バクテリンの少なくとも約０．０７％（Ｗ／Ｖ） をなす請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．有効濃度のチメロサールは、バクテリンの約０．０１％（Ｗ／Ｖ）をなす 請求の範囲第１４項記載の方法。
17. １７．マイコプラズマ・ハイオニューモニエの病原性の高い株の不活性化方法で あって、 （ａ）マイコプラズマ・ハイオニューモニエの培養液を約４ｍＭの濃度のバイナ リー・エチレンイミンと接触させ；（ｂ）この培養液をマイコプラズマ・ハイオ ニューモニエの不活性化に有効な条件下でインキュベートし；および（ｃ）中和 有効濃度のチオ硫酸ナトリウムを添加することにより培養液中のバイナリー・エ チレンイミンを中和することを含む不活性化方法。
18. １８．工程（ｂ）において、有効な条件が少なくとも約１２時間のインキュベー ションを含む請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．工程（ｃ）において、チオ硫酸ナトリウムの有効中和濃度が約１６ｍＭで ある請求の範囲第１７項記載の方法。
20. ２０．マイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染に対してブタを免疫する 方法であって、少なくとも請求の範囲第１項に記載のバクテリンの１回用量をブ タに投与してマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に対してブタを免疫する ことを含む免疫方法。
21. ２１．バクテリンを筋肉内に投与する請求の範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．投与量が、１ｍ１当り約１０９マイコプラズマ・ハイオニューモニエＤＮ Ａ細胞等量含有するバクテリンの約２ｍ１を包含する請求の範囲第２０項記載の 方法。
23. ２３．ブタにバクテリンを２回投与する請求の範囲第２０項記載の方法であって 、１回目がブタの誕生の約１週間後、２回目が約３週間後である方法。
24. ２４．１００２と命名され（ＡＴＣＣ受付番号５５０８８）、バイナリー・エチ レンイミンで不活性化された、病原性の高いマイコプラズマ・ハイオニューモニ エ分離株。