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CN110812357B - 比阿培南在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用 - Google Patents

比阿培南在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用 Download PDF

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CN110812357B
CN110812357B CN201911077892.4A CN201911077892A CN110812357B CN 110812357 B CN110812357 B CN 110812357B CN 201911077892 A CN201911077892 A CN 201911077892A CN 110812357 B CN110812357 B CN 110812357B
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bovine
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Abstract

本发明提供比阿培南在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用。本发明首次发现化合物比阿培南能够有效抑制牛肠道病毒病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，经实验证明，比阿培南对MDBK细胞的半数毒性浓度(CC50)大于100μM，而对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM；比阿培南对牛肠道病毒病毒的治疗指数大于1.67，表明其具有开发成预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物的前景，为比阿培南开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗BEV药物奠定实验基础并提供新的视野。

Description

比阿培南在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用
技术领域
本发明属于医药药物技术领域，具体涉及比阿培南在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛肠道病毒(Bovine Enterovirus，BEV)是小RNA病毒科、肠道病毒属成员。小RNA病毒是一个极为繁杂的病毒科，可分为鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属等5个属，共200多种病毒，能引起人和动物的多种疾病，如甲肝、口蹄疫等，在医学和兽医学研究中均具有重大意义。早期的研究将牛肠道病毒分为两个血清型，即BEV-1和BEV-2；后来随着分子生物学的发展，2006年Roland Zell等人对目前已经分离的牛肠道病毒进行系统的基因序列比较分析，又将牛肠道病毒分为A和B两个族，即BEV-A和BEV-B，在BEV-A和BEV-B之内又分别包含2个和3个基因型。
2005年初北京的牛场中发生牛肠道病毒感染，严重影响了畜牧业生产。部分牛场的产奶牛普遍(约80％)出现了严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数(10-15％)严重的还有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，且产奶量大幅下降(约30％)。约两周后康复，康复后大多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平，特别是日产35千克以上高产奶牛，而且还存在污染奶制品的风险。但目前我国对牛肠道疾病的防治还很薄弱，尚无针对牛肠道疾病的疫苗，因此研发能抑制和杀灭牛肠道病毒的药物对我国奶牛养殖业具有重大意义。
比阿培南(Biapenem)是一种碳青霉烯类合成抗生素，其能通过抑制细菌细胞壁的合成而发挥抗菌作用，对革兰阳性、革兰阴性的需氧和厌氧菌有广谱抗菌活性。然而，对于其是否有抗病毒作用尚未有报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供比阿培南在预防和/或治疗牛肠道病毒相关疾病中的应用，本发明首次证实比阿培南能够有效抑制牛肠道病毒病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物的前景。本发明的应用为首次公开，且与比阿培南已知的临床用药用途不同。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供比阿培南在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用。
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛肠道病毒病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
同时，所述预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中，比阿培南取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，比阿培南对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM。
本发明的第二个方面，提供比阿培南在制备抗牛肠道病毒的药物中的应用。
本发明的第三个方面，提供比阿培南在制备抑制和/或杀灭牛肠道病毒的药物中的应用。
根据本发明，不仅公开了比阿培南在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用，而且还公开了，施用比阿培南与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，比阿培南还可以与其它非药物活性成分组合使用。
有鉴于此，本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物，所述药物组合物由比阿培南与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
其中，比阿培南取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，比阿培南对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM；比阿培南对牛肠道病毒的治疗指数大于1.67。
在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的比阿培南对牛肠道病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛肠道病毒生活周期的多个阶段，可以实现对牛肠道病毒的直接杀灭作用。
本发明的有益技术效果：
本发明首次发现青霉烯类合成抗生素类化合物比阿培南能够有效抑制牛肠道病毒病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，经实验证明，比阿培南对MDBK细胞的半数毒性浓度(CC50)大于100μM，而对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM；比阿培南对牛肠道病毒病毒的治疗指数大于1.67，表明其具有开发成预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物的前景，为比阿培南开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗牛肠道病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明比阿培南抗BEV损伤细胞的作用图；
其中：其中图1A为病毒对照组；图1B为MDBK正常细胞组；图1C为感染细胞药物试验组(施用100μM比阿培南)；
图2为实施例2中比阿培南对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图；
图3为实施例3中比阿培南对BEV的半数有效浓度(EC50)图；
图4为实施例4中比阿培南不同时间点给药对BEV抑制的效果图；
图5为实施例5中比阿培南对BEV直接杀伤作用效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
正如背景技术所介绍的，现有技术中，迄今尚未有关于比阿培南用于预防和/或治疗牛肠道病毒相关疾病的报道。
有鉴于此，本发明建立了牛肠道病毒在细胞水平上药物筛选体系，确定了比阿培南对MDBK细胞的半数毒性浓度(CC50)大于100μM，对牛肠道病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM，比阿培南对牛肠道病毒的治疗指数大于1.67。
本发明还提供了根据病毒的致病机制，分别采用不同时间点给药实验以及先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
本发明的一个具体实施方式中，提供比阿培南在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用。并因此，比阿培南对于预防和/或治疗牛肠道病毒病毒相关的疾病是有效的。
本发明所述化合物比阿培南(Biapenem，CAS号：120410-24-4)是由日本Lederle公司和美国氰氨公司于1989年开发的注射用碳青霉烯类抗生素，其对G+菌、G-菌和厌氧菌等均有广谱和强效抗菌活性，结构式如下：
Figure BDA0002263044850000061
其中，预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中，比阿培南取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，比阿培南对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM；
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛肠道病毒病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
本发明的又一具体实施方式中，提供比阿培南或包含比阿培南的组合物或其制剂在制备抗牛肠道病毒的药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供比阿培南或包含比阿培南的组合物或其制剂在制备抑制和/或杀灭牛肠道病毒的药物中的应用。
根据本发明，不仅公开了比阿培南在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用，而且还公开了，施用比阿培南与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，比阿培南还可以与其它非药物活性成分组合使用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物，所述药物组合物由比阿培南与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
其中，比阿培南可以取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，比阿培南对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM；当然，当比阿培南与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭牛肠道病毒等与本发明上述相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
根据本发明的实施方式，比阿培南在药物浓度安全范围内，随着浓度的升高，抑制或杀灭效果随之提升。本发明所述的药物在浓度安全范围内即指药物在抑制或杀灭牛肠道病毒时，对牛肠道病毒的易感细胞没有伤害。
在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的比阿培南对牛肠道病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛肠道病毒生活周期的多个阶段，可以实现对牛肠道病毒的直接杀灭作用。
本发明的又一具体实施方式中，所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭牛肠道病毒或者协助抑制和/或杀灭牛肠道病毒的物质。
本发明的又一具体实施方式中，其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素A或维生素E、生育酚或维生素原、抗氧化剂，例如抗坏血酸，以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂，以及它们的混合物。
所述药物组合物的给药剂型可以是固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
所述药物组合物的给药剂型进一步可以是片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。需要说明的是，本申请实施例中使用的牛肠道病毒由山东省农业科学院奶牛研究中心分离获得，经鉴定其属于BEV-A族基因1型。
具体分离及鉴定方法如下：将新鲜的牛粪便用PBS稀释，反复冻融3次，5 000r/min离心5min，取上清液加入青霉素(200IU/mL)、链霉素(100μg/mL)，取200μL上清液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取BEV病毒基因组RNA,反转录为cDNA，用BEV特异性引物进行PCR扩增，将PCR鉴定为阳性的粪便上清液用0.22μm的滤膜过滤除菌，取1ml接种MDBK单层细胞，37℃吸附1h，弃去，加入含有2％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，每12h观察细胞病变情况，连续观察4d。将出现病变(CPE)的细胞反复冻融3次，收集细胞病毒液，同时鉴定获得的细胞病毒夜是否是BEV单一感染，若不是单一病毒感染，使用噬斑纯化的方法获得BEV单一感染的细胞病毒液。经BEV结构蛋白VP1和VP3系统进化树分析鉴定，该分离株属于BEV-A族基因1型。
实施例1病毒TCID50的测定
将MDBK细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔3×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将牛肠道病毒连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID50。
表1TCID50 of BEV
Figure BDA0002263044850000091
Figure BDA0002263044850000101
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数,并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算牛肠道病毒的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(3.25-0.5)＝-3.75
TCID50＝10-3.75/0.1mL
即将该病毒稀释103.75接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例2比阿培南对MDBK细胞的毒性实验：
MDBK细胞是牛肠道病毒的易感细胞。因此，首先检测比阿培南对MDBK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDBK 3×104个/孔)。
(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养4h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算比阿培南的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图2所示。
结果：比阿培南出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定比阿培南半数中毒浓度为大于100μM。
实施例3比阿培南对牛肠道病毒的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种3×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID50的牛肠道病毒稀释液(用2％FBS DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照100μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定490nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对牛肠道病毒的有效抑制率。从结果可以看出，比阿培南在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛肠道病毒的半数有效浓度(EC50)为60μM。比阿培南对牛肠道病毒的治疗指数大于1.67。
实施例4作用机制的初步研究
通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了牛肠道病毒的敏感细胞MDBK细胞中，进而初步判断比阿培南的作用时期。具体实验步骤如下：
(1)在96孔板的每个孔中接种3×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。
(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μL的待测药物，记为-2h。
(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的牛肠道病毒稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μL。同时在第3列的三个复孔中加入50μL相应待测物，此刻记为0h。
(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的MDBK细胞作为病毒对照组。
(6)培养48h后，进行OD值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。
结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，比阿培南在病毒感染细胞-2h、0h时加药，对病毒有明显的抑制作用，说明比阿培南可能主要作用于牛肠道病毒生活周期的早期阶段。
实施例5化合物比阿培南不同时间加入对牛肠道病毒复制的影响
我们将筛选出的效果较好毒性较低的比阿培南进行了进一步的作用机制研究。分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的100TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：比阿培南与牛肠道病毒预先作用的给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，通过分析软件，比阿培南对牛肠道病毒的作用效果如图5所示。从图中可以看出，在这种作用式下，比阿培南对牛肠道病毒表现出一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。表明比阿培南对牛肠道病毒具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对牛肠道病毒吸附的阻断作用
按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：CPE观察结果显示，药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。细胞活力检测结果显示，此种药物对牛肠道病毒的有效抑制率在20％以下，表明比阿培南不能阻止牛肠道病毒对细胞的吸附作用。
(3)药物对牛肠道病毒复制的阻断作用
按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
结果：CPE观察结果显示，病毒预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。检测结果显示，比阿培南对牛肠道病毒的有效抑制率低于20％，表明比阿培南不能阻断在细胞中的复制作用。
本发明应用实施例以牛肾细胞(MDBK)为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现比阿培南的新型抗病毒作用，对牛肠道病毒有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.比阿培南在制备治疗牛肠道病毒感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述比阿培南的药物浓度不低于60μM。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，比阿培南在制备抗牛肠道病毒药物中的应用。
4.如权利要求1所述应用，其特征在于，比阿培南在制备抑制和/或杀灭牛肠道病毒的药物中的应用。
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