CN110179785B - 魏特酮在制备治疗或预防手足口病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出魏特酮或其溶剂化物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。该魏特酮或其药学上可接受的盐毒副作用小，能够有效地抑制手足口病病毒引起的细胞病变、抑制病毒复制、降低病毒载量、减少或消除感染小鼠死亡、延长生存实验以及平抑炎症等。该化合物或其药学上可接受的盐可以进一步开发为治疗或预防手足口病的药物，剂型和给药方式多样，具有广泛的应用前景。

Description

魏特酮在制备治疗或预防手足口病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种魏特酮在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。

背景技术

手足口病是由病毒引起的儿童传染病，为我国法定丙类传染病。该病主要感染0-6岁的婴幼儿，以2-3岁儿童感染最为常见，手足口病发病初期在患儿四肢末端以及口腔等处引起疱疹或溃疡，患儿多在1-2周内痊愈。然而，少数病例病情进展迅速，可在发病1-5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、呼吸和血液循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。

尽管有手足口病疫苗已经获批上市，但其安全性和有效性仍有待进一步的临床验证；另一方面，目前临床上还没有直接靶向引起手足口病的病毒的特效药物，临床主要采取对症治疗的策略；而广谱抗病毒药物利巴韦林在应用于婴幼儿时有致畸和抑制生长发育的风险。因此，仍有必要去开发新的化合物以弥补现有技术在这一方面的不足。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种甘草中提取的活性成分在制备治疗或预防手足口病药物中的应用，从而为临床治疗或预防手足口病提供一种小分子化合物。

本发明的目的通过下列技术方案实现：

本发明提供了魏特酮或其溶剂化物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。

进一步地，本发明所述应用中，所述手足口病包括由肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒B组2型、5型或埃可病毒引起的手足口病。

优选地，本发明所述应用中，所述手足口病是由肠道病毒71型或柯萨奇病毒A组16型引起的手足口病。

对于治疗或预防手足口病药物，在本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余可以是其它具有类似作用或者发挥协同作用的活性成分、也可以是或进一步包括药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

进一步地，所述的药物为以魏特酮或其溶剂化物或药学上可接受的盐为活性成分，与药学上可接受的辅料，制备得到的临床上允许的剂型。

具体地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、分散剂、注射剂或喷雾剂等多种剂型。魏特酮或其盐给药方式多样，既可以注射给药，也可以口服给药。

本发明中，所述药学上可接受的盐包括但不限于化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

所述的药学上可接受的辅料是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行相应的预防或治疗。

本发明首先通过MTS法检测了魏特酮对Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的毒性情况；其次，研究了魏特酮对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型感染的Vero细胞的保护作用，病毒抑制率呈剂量依赖效应；第三，利用PCR检测了药物对病毒核酸复制的影响，结果表明魏特酮能够干预病毒感染早期事件，抑制病毒复制，降低宿主细胞内病毒载量，促进病毒转阴；第四，研究发现魏特酮具有广谱的抗病毒作用；最后，通过多种给药方式发现魏特酮均能够延长感染小鼠生存时间，提高生存率，抑制感染小鼠炎症因子释放，平抑炎症。综合实验结果分析，确定魏特酮可以用于预防和治疗手足口病毒的感染。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、魏特酮是一种天然小分子化合物，TC50约20.2μmol/L；

2、魏特酮能够剂量依赖地抑制EV71和CoxA16病毒感染，呈剂量依赖效应；

3、干预病毒感染早期事件，抑制病毒复制，降低感染细胞内EV71和CoxA16病毒载量，促进病毒转阴；

4、在抗手足口病病毒方面具有广谱性，对能够引起手足口病症状的病毒柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型，柯萨奇病毒B组2和5型以及埃可病毒均具有明显的抑制作用；

5、缓解病毒引起的症状、减轻或消除病毒感染导致的炎症和死亡等；延长感染病毒小鼠生存时间，提高小鼠存活率；

6、平抑病毒感染导致的小鼠炎症因子释放；

7、给药方式多样，既可以注射给药，也可以口服给药。

综上所述，魏特酮可以作为新的治疗或预防手足口病药物进行开发，为治疗或预防手足口病提供一种新的途径和手段。

具体实施方式

根据2015版药典，中药材甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflate Bat)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根和根茎。魏特酮是从甘草中提取的天然黄酮类化合物，结构式如下：

根据系统命名法，魏特酮的化学名称为5,7,4’-三羟基-6-异戊烯基异黄酮(Wighteone，CAS号：51225-30-0)，目前关于魏特酮的有益作用报道较少，尚没有文献报道魏特酮具有抗手足口病方面的应用。

模型是化合物活性及作用机理的载体，手足口病毒感染可诱导多种细胞凋亡，包括人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)、Jurkat细胞、神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、成胶质细胞瘤细胞(SF268)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人微血管内皮细胞以及HeLa细胞等，在实际的研究中由于RD细胞和Vero细胞对病毒的敏感性较好，常用于细胞水平的抗病毒研究。在动物模型方面，1-7日龄的小鼠对病毒敏感，常用作动物模型。小鼠接种病毒后3-5天出现拒乳和体重下降等症状，6-8天四肢出现僵直性瘫痪等明显症状，9-14天后根据病毒接种量的不同自愈或死亡。

下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明：

实施例1魏特酮的Vero细胞毒性

1.材料与方法

1.1细胞与培养方法

采用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为细胞模型(由军事医学科学院微生物流行病研究所提供，下同)，采用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自江苏凯基生物技术股份有限公司)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后传代，细胞传代比例1/3-1/4。

1.2试剂

MTS细胞增殖定量检测试剂盒(购自Promega公司)；魏特酮(购自上海源叶生物科技有限公司，下同)。

1.3仪器

微孔板读数仪(购自Perkin Elmer公司，型号：EnSpire，下同)；倒置显微镜(购自Olympus公司，型号：CKX41，下同)；二氧化碳培养箱(购自Forma Scientific公司，型号：Forma Steri-Cycle 371，下同)；生物安全柜(购自上海洁佳空气净化技术有限公司，下同)。

1.4实验设计

取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×10⁵个·mL^-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中。加入200μL不同浓度的含药DMEM培养基(魏特酮浓度从400μmol/L起连续2倍梯度稀释5个梯度，共计6个给药浓度，胎牛血清终浓度为2.5％)作为样品组，同时设置对照组(培养基中不含任何受试药物)，各处理组含3个复孔，CO₂培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用微孔板读数仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以[A(样品组)/A(对照组)]×100％作为各组的细胞存活率，计算样品对Vero细胞的半数毒性浓度(TC₅₀)。

1.5统计学处理

所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理，实验数据以均值±标准误表示，组间数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

表1魏特酮对Vero细胞活力的影响(％，均值±标准误，n＝3)

注：*表示各样品组数据与对照组相比，在P<0.05的水平上具有显著差异。

本研究明确了魏特酮对Vero细胞的毒性情况，如表1所示，魏特酮对Vero细胞的毒性作用呈明显的量效关系，细胞活力随给药浓度提高而逐步降低，表明魏特酮对细胞的毒性逐步增加，根据表1数据计算得魏特酮对Vero细胞TC₅₀＝20.2μmol/L。

实施例2魏特酮对EV71和CoxA16病毒感染Vero细胞的保护及抑制病毒复制作用

1.材料与方法

1.1细胞与培养方法

采用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为细胞模型，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后传代，细胞传代比例1/3-1/4。

1.2病毒株

EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1；CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829，均由军事医学科学院微生物流行病研究所提供，下同。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID₅₀)为10⁸/mL，CoxA16 TCID₅₀为10^8.5/mL。

1.3试剂

MTS细胞增殖定量检测试剂盒；魏特酮；总RNA提取试剂盒(TRIzol法)(购自美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒Prime Script ^TM(购自宝生物工程(大连)有限公司)；肠道病毒71型及柯萨奇病毒16型核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)(购自上海之江生物科技股份有限公司)。

1.4仪器

微孔板读数仪；倒置显微镜；二氧化碳培养箱；生物安全柜；普通PCR仪(购自ABI公司，型号：2720)；荧光定量PCR仪(购自ABI公司，型号：StepOne Plus ^TM)。

1.5实验设计

1.5.1取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×10⁵个·mL^-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中。加入50μL CoxA16或EV71病毒悬液(100TCID₅₀)，加入50μL不同浓度的含药DMEM培养基(魏特酮浓度从20μmol/L开始以2倍梯度连续稀释5个浓度，共计6个给药浓度，胎牛血清终浓度为2.5％)，同时设置对照组(既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各处理组含3个复孔，CO₂培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用微孔板读数仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以[A(样品组)-A(模型组)]/[A(对照组)-A(模型组)]×100％作为各组的抑制率，计算样品对CoxA16和EV71病毒的半最大效应浓度(EC₅₀)和选择指数(SI＝TC₅₀/EC₅₀)。

1.5.2研究感染细胞病毒载量：取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至2×10⁵个·mL^-1，每孔接种1mL于6孔板中，加入1mL含2000TCID₅₀CoxA16或EV71病毒的DMEM培养基以及药物魏特酮(终浓度为10μmol/L)，同时设置对照组(既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各组处理含2个复孔，CO₂培养箱中培养8h后参照试剂盒说明书分别提取RNA，合成cDNA以及检测病毒载量。

1.6统计学处理

所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理，实验数据以均值±标准误表示，组间数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1魏特酮对EV71和CoxA16病毒的抑制作用

表2魏特酮对EV71和CoxA16病毒的抑制率(％，均值±标准误，n＝3)

本研究探讨了魏特酮对EV71和CoxA16病毒的抑制作用，如表2所示，魏特酮对EV71和CoxA16病毒的抑制呈剂量依赖效应，抑制率随给药剂量的增加逐渐提高到最高值后趋于稳定，其中10μmol/L浓度的病毒抑制效果最佳。根据表2中数据计算得魏特酮抑制EV71病毒半EC₅₀＝5.3μM，SI＝3.8，抑制CoxA16病毒EC₅₀＝3.9μM，SI＝5.2。

2.2魏特酮对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用

表3魏特酮对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用(均值±标准误，n＝6)

注：ND表示未检出；*表示各组数据与对照组相比，在P<0.05的水平上具有显著差异

本研究探讨了魏特酮对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用，如表3所示，10μmol/L魏特酮能够显著抑制细胞内EV71和CoxA16病毒复制，降低病毒载量，表明魏特酮具有促进病毒转阴的作用。

实施例3魏特酮抗手足口病毒的广谱性研究

1.材料与方法

1.1细胞与培养方法

采用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为细胞模型，取传代次数为130～145之间的细胞用于实验。细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后传代，传代比例1/3-1/4。

1.2病毒株

柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)。临用前测定各病毒TCID₅₀分别为10⁸、10^7.5、10⁷、10⁶、10^8.5、10^7.5、10⁷和10^7.5/mL，上述病毒均由中科院武汉病毒研究所提供。

1.3试剂

MTS细胞增殖定量检测试剂盒；魏特酮。

1.4仪器

微孔板读数仪；倒置显微镜；二氧化碳培养箱；生物安全柜。

1.5实验设计

取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×10⁵个·mL^-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中，加入50μL病毒悬液(100TCID₅₀)，加入50μL含药DMEM培养基(魏特酮终浓度为250μg/mL，胎牛血清终浓度为2.5％)，同时设置对照组(培养基中既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各处理组含3个复孔，CO₂培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用微孔板读数仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以[A(样品组)-A(模型组)]/[A(对照组)-A(模型组)]×100％作为各组的抑制率，计算魏特酮对各病毒株的EC₅₀和SI。

1.6统计学处理

所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理。

2.结果

表4魏特酮对多种手足口病毒的EC₅₀和SI

如表4所示，10μmol/L魏特酮对多种能够引起手足口病症状的病毒均具有明显的抑制作用，EC₅₀从3.46-5.49μmol/L不等。本实施例表明，魏特酮在抑制手足口病毒方面具有广谱性。

实施例4魏特酮注射给药延长病毒感染小鼠生存时间、抑制小鼠死亡和炎症因子释放

1.材料与方法

1.1动物

5日龄ICR小鼠(Mus musculus)，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2病毒株

EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1，CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID50)为10⁸/mL，CoxA16病毒TCID₅₀为10^8.5/mL。

1.3试剂与耗材

羽扇豆魏特酮(Lupiwighteone，缩写：LWT，CAS号：104691-86-3，购自上海源叶生物科技有限公司)、利巴韦林注射液(缩写：RBV，购自鲁抗辰欣药业有限公司)、注射液用生理盐水、一次性无菌注射器。细胞因子白细胞介素-6(IL-6)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)。

1.4实验方法

(1)病毒悬液配制：根据病毒TCID₅₀值，临用前采用DMEM培养基将两病毒分别稀释至10⁷TCID₅₀/mL。

(2)药液配制：魏特酮和羽扇豆魏特酮采用5％(w/v)碳酸氢钠预溶解，注射用生理盐水稀释至所需剂量，0.22μm微孔滤膜过滤后待用。利巴韦林注射液于临用前摇匀开瓶，采用生理盐水稀释至所需剂量(10mg/kg)。

(3)分组、造模与给药：5日龄小鼠按照表5进行分组、造模及给药。分组：小鼠随机分为13组：空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组、10mg/kg羽扇豆魏特酮治疗EV71组(EV71+LWT)、10mg/kg羽扇豆魏特酮治疗CoxA16组(CoxA16+LWT)、魏特酮高、中和低剂量组(20、10和5mg/kg)，利巴韦林组(RBV)10mg/kg，每组含13只小鼠。造模：各组小鼠腹腔注射EV71或CoxA16病毒悬液，每只0.1mL，空白对照组以注射生理盐水代替。给药：造模结束后，每只小鼠进行腹腔注射给药(空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组以注射生理盐水代替)，每次0.1mL，每日1次，连续给药13日。造模后第6天每组各取3只小鼠，摘眼球处死取血清测定细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量(这3只小鼠因提前处死，故未计入终点生存情况)。动物实验过程的所有操作，都根据科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》进行。

(4)统计指标：每日记录小鼠存活情况，统计小鼠死亡率、平均生存时间和各细胞因子含量。

2.结果

表5魏特酮注射给药缓解EV71和CoxA16病毒导致的小鼠死亡(n＝10)

注：

和*表示该组数据与EV71模型组相比，P<0.05；^$和^#表示该组数据与CoxA16模型组相比，P<0.05。

如表5所示，与阳性药利巴韦林注射液相似，魏特酮中剂量组(10mg/kg)明显抑制EV71病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达42.9％；魏特酮中剂量(10mg/kg)明显抑制CoxA16病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达47.4％。同时，其他各剂量的魏特酮也具有相似的药效，不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间。羽扇豆魏特酮是与魏特酮具有类似结构的的异戊烯基异黄酮类化合物，10mg/kg羽扇豆魏特酮注射液给药对EV71和CoxA16病毒感染的乳鼠死亡率没有改善，仅能微弱延长乳鼠的平均生存期，但与各自模型组相比没有显著性差异(P>0.05)。

表6小鼠血清细胞因子含量(ng/L，n＝3)

注：*和^#分别表示该组数据与EV71模型组和CoxA16模型组相比P<0.05。^&和^Δ分别表示该组数据与EV71+RBV组和CoxA16+RBV相比P<0.05。

如表6所示，EV71病毒感染导致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量异常升高，魏特酮高、中和低剂量组(20、10和5mg/kg)不同程度地抑制EV71病毒或CoxA16病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)，显著优于阳性药利巴韦林注射液的抑制效果；以魏特酮中剂量组抑制效果最为明显，魏特酮中剂量组(10mg/kg)明显平抑EV71病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)；类似的，魏特酮中剂量组(10mg/kg)明显抑制CoxA16病毒引起的小鼠细胞因子升高(P<0.05)。10mg/kg羽扇豆魏特酮注射液给药对EV71和CoxA16病毒感染导致的炎症因子分泌仅具有微弱的抑制作用，但与各自模型组相比没有显著性差异(P>0.05)。

由表5和表6表明：魏特酮注射给药能够显著降低EV71和CoxA16病毒致小鼠死亡率，延长小鼠存活时间，并能显著抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状。而具有与其类似结构的羽扇豆魏特酮则没有显著的抑制手足口病毒活性。

实施例5魏特酮口服给药延长病毒感染小鼠生存时间、抑制小鼠死亡和炎症因子释放

研究目的：通过动物实验，研究魏特酮口服给药延长病毒感染小鼠生存时间、抑制小鼠死亡和炎症因子释放的作用。

1.材料与方法

1.1动物

5日龄ICR小鼠(Mus musculus)，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2病毒株

EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1，CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID₅₀)为10⁸/mL，CoxA16病毒TCID₅₀为10^8.5/mL。

1.3试剂与耗材

利巴韦林口服液(缩写：RBVO，购自辅仁药业集团有限公司、生理盐水、灌胃器。细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)ELISA测定试剂盒均购自eBioScience公司。

1.4实验方法

(1)病毒悬液配制：根据病毒TCID50值，临用前采用DMEM培养基将两病毒稀释至10⁷TCID₅₀/mL。

(2)药液配制：魏特酮采用5％(w/v)碳酸氢钠预溶解，生理盐水稀释至所需剂量。利巴韦林口服液临用前摇匀开瓶，采用生理盐水稀释至所需剂量(0.32g/kg)。

(3)分组、造模与给药：5日龄小鼠按照表7进行分组、造模及给药。分组：小鼠随机分为13组：空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组、魏特酮高、中和低剂量组(50、20和10mg/kg)以及利巴韦林组(RBVO)0.32g/kg，每组含13只小鼠。造模：各组小鼠分别腹腔注射EV71或CoxA16病毒悬液，每只0.1mL，空白对照组以注射生理盐水代替。给药：造模结束后，每只小鼠进行灌胃给药(空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组以生理盐水代替)，每次0.1mL，每日1次，连续给药13日。造模后第6天每组各取3只小鼠，摘眼球处死取血清测定细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量(这3只小鼠因提前处死，故未计入终点生存情况)。动物实验过程的所有操作，都根据科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》进行。

(4)统计指标：每日记录小鼠存活情况，统计小鼠死亡率、平均生存时间和各细胞因子含量。

2.结果

表7魏特酮口服给药缓解EV71和CoxA16病毒导致的小鼠死亡(n＝10)

注：

和*表示该组数据与EV71组相比，P<0.05；^$和^#表示该组数据与CoxA16组相比，P<0.05。

如表7所示，与阳性药利巴韦林口服液相似，魏特酮中剂量组(20mg/kg)明显抑制EV71病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达36.1％；魏特酮中剂量(20mg/kg)明显抑制CoxA16病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达46.2％。同时，其他各剂量的魏特酮也具有相似的药效，不同程度地减少病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间。

表8小鼠血清细胞因子含量(ng/L，n＝3)

注：*和^#分别表示该组数据与EV71和CoxA16组相比P<0.05。^&和^Δ分别表示该组数据与EV71+RBVO组合CoxA16+RBVO相比P<0.05。

如表8所示，EV71病毒感染导致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量异常升高，魏特酮高、中和低剂量组(50、20和10mg/kg)不同程度地抑制EV71病毒或CoxA16病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)，显著优于阳性药利巴韦林口服液的抑制效果；以魏特酮中剂量组抑制效果最为明显，魏特酮中剂量组(20mg/kg)明显平抑EV71病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)；类似的，魏特酮中剂量组(20mg/kg)明显抑制CoxA16病毒引起的小鼠细胞因子升高(P<0.05)。

由表7和表8数据表明：魏特酮口服给药能够明显降低EV71和CoxA16病毒致小鼠死亡率，延长小鼠存活时间，并能显著抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状。

本发明实施例中使用的各病毒，仅是为了举例说明魏特酮对肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型感染Vero细胞的保护及抑制病毒复制作用，对能够引起手足口病症状的病毒柯萨奇病毒A组(包括但不限于4、5、7、9和10型)、柯萨奇病毒B组(包括但不限于2和5型)以及埃可病毒均具有明显的抑制作用，能够降低肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型导致的小鼠死亡率，抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状，但本发明化合物所针对的各病毒并不局限于上述实施例来源。本领域技术人员应该清楚，只要使用具有相应致病性的且鉴定为肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组4、5、7、9、10型和16型、柯萨奇病毒B组2和5型、埃可病毒的病毒，均适用于本发明。

而且，本发明提出的化合物毒副作用小，能够有效地抑制手足口病病毒引起的细胞病变、抑制病毒复制、降低病毒载量、减少或消除感染小鼠死亡、延长生存实验以及平抑炎症等。因此，该化合物或其药学上可接受的盐可以进一步开发为治疗或预防手足口病的药物，剂型和给药方式多样，具有广泛的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.魏特酮或药学上可接受的盐在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述手足口病包括由肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒B组2型、5型或埃可病毒引起的手足口病。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述手足口病是由肠道病毒71型或柯萨奇病毒A组16型引起的手足口病。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

5.根据权利要求1-4任一所述应用，其特征在于，所述的药物为以魏特酮为活性成分，与药学上可接受的辅料，制备得到的临床上允许的剂型。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或喷雾剂。