CN118374452A - 使用膜蛋白制备治疗性外来体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用新鉴定的在外来体表面上富集的蛋白质制备治疗性外来体的方法。具体地，本发明提供了使用蛋白质进行外来体的亲和纯化的方法。它还提供了将治疗性肽定位在外来体上并通过使用所述蛋白质将外来体靶向特定器官、组织或细胞的方法。所述方法包括产生表面工程化外来体，其包括一种或多种密度更高的外来体蛋白，或所述外来体蛋白的变体或片段。

Description

使用膜蛋白制备治疗性外来体

本申请是申请号为201880055135.4，申请日为2018年8月24日，申请人为科迪亚克生物科学公司，发明创造名称为“使用膜蛋白制备治疗性外来体”的发明专利申请的分案申请。

序列表

本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。2018年8月22日创建的所述ASCII副本命名为40714PCT_CRF_sequencelisting.txt并且大小为175,092字节。

背景技术

外来体是细胞间通讯的重要中介物。它们也是许多疾病(诸如癌症)的诊断和预后的重要生物标记物。作为药物递送媒介物，外来体作为一种新的治疗方式在许多治疗领域提供了许多优于传统药物递送方法的优势。

将外来体用于治疗目的要求外来体不含或基本不含杂质，包括但不限于污染蛋白、DNA、碳水化合物和脂质。目前的纯化方法不能提供足够的选择性来除去大量的这些杂质，因此期望另外的方法来提高纯度。

此外，随着外来体越来越频繁地用于人疾病的治疗，它们可能难以满足临床预期，因为它们赋予分子靶向、免疫逃避和控制药物释放的物理化学参数具有异质性。这主要是由于外来体特性(例如组成、大小、形状、刚性、表面电荷、亲水性、稳定性以及配体类型和密度)、有效载荷特性(例如药物类型、溶解度、载荷、效力、给药、免疫响应和释放动力学)和体内外来体运输的生理障碍(例如免疫监视、颗粒外渗、组织靶向、组织渗透和细胞摄取)的异质性和复杂性。尽管已经做出了相当大的努力，但用于获得具有所期望特性的治疗性外来体(例如含有治疗有效载荷并具有适当靶向部分的外来体)的离散亚群的有效方法还不容易获得。

需要适合的方法来产生、分离和纯化外来体的离散亚群，以更好地实现基于外来体的技术的治疗用途和其他应用。

发明内容

本发明的一个方面涉及制备治疗用外来体的新方法。具体地，所述方法使用新鉴定的在外来体表面上富集的表面标记物。具体地，一组蛋白质(例如前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)；巴斯金(basigin，BSG)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)；整合素β-1(ITGB1)；整合素α-4(ITGA4)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A 2)；以及一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)被鉴定为在外来体表面上高度富集。

新鉴定的蛋白质可以用于本发明的各种实施方案。本发明的一个方面涉及通过结合新鉴定的外来体蛋白和治疗蛋白来产生融合蛋白，并产生在表面上含有融合蛋白的工程化外来体。治疗蛋白的天然全长或生物活性片段可以通过与外来体-富集的蛋白质缀合而被运输到外来体的表面。使用如本文提供的新鉴定的外来体蛋白的方法比使用本领域已知的一些其他外来体支架蛋白(例如，Lamp2B、PDGFR、乳凝集素CD9、CD63和/或CD81或其片段)的方法更好地产生表面工程化外来体。不希望受理论的束缚，据信新鉴定的蛋白质更好，因为本领域已知的几种外来体支架蛋白—即四跨膜蛋白质，如CD9、CD63和CD81，在外来体腔中具有它们的C-末端和N-末端两者。

本发明的另一个方面涉及使用所有外来体共有或源自单一细胞类型的所有外来体共有的外来体蛋白，通过亲和纯化从非均相溶液如细胞培养基或血浆纯化外来体。一些实施方案涉及通过使用特异于外来体亚群的表面标记物从总外来体分离外来体亚群。

本发明的另一个方面涉及当外来体是污染产物时从样品中去除外来体的方法。例如，可以从污染的外来体纯化天然或工程化病毒。因此，本文所述的外来体蛋白可以用于选择性地从生物过程中去除外来体，其中具有相似大小、形状和/或电荷的其他颗粒是所期望的产物。

本发明的另一个方面涉及表面工程化外来体的产生或使用，所述外来体被设计用于更有效的亲和纯化，或用于在表面上呈现靶向部分或治疗相关蛋白。例如，外来体表面可以被修饰以在表面上以更高的密度含有天然全长外来体蛋白和/或天然外来体蛋白的片段或修饰的蛋白质。

本发明还涉及一种用于生产这种表面工程化外来体的生产细胞或一种产生所述生产细胞的方法。外源多核苷酸可以暂时或稳定地导入生产细胞，以使生产细胞产生表面工程化外来体。

具体地，本发明的一个方面涉及一种分离外来体的方法，其包括以下步骤：(1)提供包含外来体的样品；(2)将样品与对靶蛋白具有亲和力的结合剂接触，其中靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体；以及(3)基于靶蛋白与结合剂之间的结合分离外来体。

在一些实施方案中，所述样品从体外生长的细胞获得，任选地，其中所述细胞是HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或间充质干细胞(MSC)。在一些实施方案中，所述样品从受试者的体液中获得。

在一些实施方案中，所述细胞被遗传修饰以表达靶蛋白。在一些实施方案中，所述细胞包含编码靶蛋白的表达质粒。在一些实施方案中，所述细胞被遗传修饰以包含表达对结合剂具有亲和力的标签的外源序列，其中外源序列被插入所述细胞基因组中。在一些实施方案中，外源序列被插入位于编码PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的内源序列3’或5’末端的基因组位点。在一些实施方案中，内源序列不编码IGSF8。在一些实施方案中，外源序列被插入位于编码PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的内源序列内的基因组位点。

在一些实施方案中，靶蛋白是包含标签和PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体的融合蛋白。在一些实施方案中，外来体包含靶蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白不是IGSF8或其片段或修饰。在一些实施方案中，所述细胞被遗传修饰以具有ADAM10的降低表达。

在一些实施方案中，外来体包含靶蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白选自PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2和ATP转运蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的片段或变体。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQ ID NO:33的多肽。在一些实施方案中，靶蛋白是包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体以及亲和标签的融合蛋白，其中亲和标签对结合剂具有亲和力。在一些实施方案中，靶蛋白不包含IGSF8或其片段或修饰。

在一些实施方案中，结合剂包含免疫球蛋白、蛋白质、肽或小分子。在一些实施方案中，结合剂附着到固体支撑物，任选地，其中固体支撑物包括多孔琼脂糖珠、微量滴定板、磁珠或膜。

在一些实施方案中，固体支撑物形成色谱柱。在一些实施方案中，通过将样品施加到色谱柱来执行使样品与结合剂接触的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(1)将样品的子集与对不同靶蛋白具有亲和力的不同结合剂接触；和(2)基于不同靶蛋白与不同结合剂之间的结合分离外来体。在一些实施方案中，不同靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ATP转运蛋白或其片段或变体。在一些实施方案中，不同靶蛋白包含SEQ ID NO:33的多肽。

本发明的另一个方面涉及一种通过本文提供的方法生产的外来体。

在又另一个方面，本发明涉及一种包含本发明的外来体和赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含的大分子浓度低于包含外来体源的样品，其中所述大分子是核酸、污染蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。在一些实施方案中，药物组合物基本上不含大分子。

本发明的另一个方面涉及一种包含靶蛋白的外来体，其中靶蛋白的至少一部分由外源序列表达，并且靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体。在一些实施方案中，靶蛋白不包含IGSF8或其片段或变体。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQ ID NO:33的多肽。

在一些实施方案中，基于靶蛋白与结合剂之间的结合来分离外来体。

在一些实施方案中，由被遗传修饰以包含外来体序列的细胞生产外来体，任选地，其中所述细胞是HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或间充质干细胞(MSC)。在一些实施方案中，所述细胞被遗传修饰以具有ADAM10的降低表达。

在一些实施方案中，所述细胞包含含有外源序列的质粒。

在一些实施方案中，所述细胞包含插入细胞基因组的外源序列。在一些实施方案中，外源序列被插入位于编码PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的基因组序列3’或5’末端的基因组位点。在一些实施方案中，外源序列被插入编码PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的基因组序列。在一些实施方案中，外源序列不编码IGSF8。

在一些实施方案中，靶蛋白是包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体以及亲和标签的融合蛋白，其中亲和标签对结合剂具有亲和力。在一些实施方案中，靶蛋白不包含IGSF8或其片段。

在一些实施方案中，靶蛋白是包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体和治疗性肽的融合蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白不包含IGSF8或其片段。

治疗性肽可以选自天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。治疗性化合物可以选自核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。

治疗性肽可以是抗体或其片段或变体。治疗性肽可以是酶、配体、受体或其片段或变体。治疗性肽可以是抗菌肽或其片段或变体。

在一些实施方案中，靶蛋白是包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体和靶向部分的融合蛋白。靶向部分可以对器官、组织或细胞具有特异性。在一些实施方案中，靶蛋白不包含IGSF8或其片段。

在一些实施方案中，外来体还包含第二、不同的靶蛋白，其中所述不同的靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体。在一些实施方案中，基于不同的靶蛋白与不同的结合剂之间的结合来分离外来体。在一些实施方案中，靶蛋白不包含IGSF8或其片段。

在一个方面，本发明涉及一种包含本发明的外来体和赋形剂的药物组合物。

在一些实施方案中，药物组合物基本上不含大分子，其中所述大分子选自核酸、污染蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物及其组合。

在一个方面，本发明涉及一种用于生产本文所述外来体的细胞。

具体地，一些实施方案涉及一种用于生产外来体的细胞，其包含插入编码PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的基因组序列的外源序列，其中外源序列和基因组序列编码融合蛋白。在一些实施方案中，基因组序列不编码IGSF8。

外源序列可以编码亲和标签。

外源序列可以编码治疗性肽。治疗性肽可以选自天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。治疗性化合物可以选自核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。治疗性肽可以是抗体或其片段或变体。治疗性肽可以是酶、配体、受体或其片段或变体。治疗性肽可以是抗菌肽或其片段或变体。

外源序列可以编码靶向部分。靶向部分可以对器官、组织或细胞具有特异性。

在一些实施方案中，所述细胞被遗传修饰以具有ADAM10的降低表达。

在一个方面，本发明提供了一种由本发明的细胞系生产的外来体。在一些实施方案中，外来体包括表面上的融合蛋白，其密度高于不同外来体表面上的不同融合蛋白，其中不同外来体由不同细胞系生产，所述细胞系包含插入编码常规外来体蛋白的不同基因组序列的外源序列，其中外源序列和不同基因组序列编码不同的融合蛋白。在一些实施方案中，常规外来体蛋白选自CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、LAMP2、LAMP2B及其片段。

在另一个方面，本发明涉及一种分离非外来体物质的方法，其包括以下步骤：提供包含外来体和非外来体物质的样品；将样品与对靶蛋白具有亲和力的结合剂接触，其中靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体，从而诱导外来体与结合剂结合；以及分离非外来体物质。

在一些实施方案中，非外来体物质是病毒或蛋白质。在一些实施方案中，非外来体物质是慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或其他包膜或非包膜病毒。在一些实施方案中，非外来体物质是重组蛋白。在一些实施方案中，分离的非外来体物质基本上不含外来体。

在一些实施方案中，靶蛋白还包含亲和标签，其中亲和标签对结合剂具有亲和力。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQ ID NO:33的多肽。在一些实施方案中，结合剂包含免疫球蛋白、蛋白质、肽或小分子。在一些实施方案中，结合剂附着到固体支撑物，任选地，其中固体支撑物包括多孔琼脂糖珠、微量滴定板、磁珠或膜。在一些实施方案中，固体支撑物形成色谱柱。在一些实施方案中，通过将样品施加到色谱柱来执行使样品与结合剂接触的步骤。

在一些实施方案中，本文所述的纯化方法用于纳米囊泡的纯化。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法针对纳米囊泡。

附图说明

附图仅出于说明的目的描绘了本发明的各种实施方案。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不脱离本文所述的本发明的原理的情况下，可以采用本文示出的结构和方法的可替代实施方案。

图1提供了超速离心后含样品的Optiprep^TM密度梯度的图像。标有括号的是含有外来体的顶部级分(“顶部”)、含有细胞碎片的中间级分(“中间”)和含有高密度聚集体和细胞碎片的底部级分(“底部”)。

图2是示出从Optiprep^TM超速离心的顶部级分鉴定的蛋白质(Y轴)和从底部级分鉴定的蛋白质(X轴)的点图。虚线上方绘制的蛋白质代表外来体-富集的蛋白质，而虚线下方的蛋白质代表非特异于外来体的蛋白质。

图3提供了PTGFRN(SEQ ID NO:1)的胰蛋白酶肽覆盖图。

图4提供了IGSF8(SEQ ID NO:14)的胰蛋白酶肽覆盖图。

图5提供了巴斯金(BSG)(SEQ ID NO:9)的胰蛋白酶肽覆盖图。

图6A示出了从HEK293细胞收集的总细胞裂解物(左)和纯化的外来体群体(右)的蛋白质印迹图片。图6B示出了用抗PTGFRN的抗体对图6A中提供的凝胶进行蛋白质印迹的结果。在右列检测到的带对应于图6A中约110kDa处的带。

图7A示出了使用自形成Optiprep^TM梯度从纯化收集的12个级分的蛋白质印迹。图7B示出了用抗ITGA4、ITGB1、PTGFRN、IGSF3、IGSF8、巴斯金、Alix或Syntenin的抗体对图7A所示凝胶进行蛋白质印迹的结果。每种新的外来体表面蛋白(ITGA4、ITGB1、PTGFRN、IGSF8、巴斯金)在与熟知的外来体标记物蛋白(Alix、Syntenin)相同的级分中被检测到。

图8说明了用于本发明各种实施方案的外来体表面蛋白(ITGA4、ITGB1、PTGFRN、IGSF8、BSG)，例如，用于靶向外来体表面上的融合蛋白，或作为外来体亲和纯化的靶。

图9A说明了PTGFRN的结构，其中鉴定了与PTGFRN的C末端融合的IgV结构域(箭头)和GFP的边界。图9B提供了从过表达各种GFP-PTGFRN融合蛋白的细胞培养物中分离的蛋白质印迹外来体的凝胶图片。使用抗GFP的抗体检测GFP-PTGFRN融合蛋白。

图10提供了一张凝胶图片，其运行从过表达各种GFP-PTGFRN融合蛋白的细胞中分离的纯化外来体的总蛋白。

图11A说明了PTGFRN的结构，其中鉴定了与PTGFRN的N末端融合的IgV结构域(箭头)和FLAG的边界。图11B提供了从过表达各种FLAG-PTGFRN融合蛋白的细胞培养物中分离的蛋白质印迹外来体的凝胶图片。使用抗FLAG标签的抗体检测GFP-PTGFRN融合蛋白。

图12A提供了运行从野生型细胞(ADAM10+)或ADAM10敲除细胞(ADAM10-)分离的纯化外来体的总蛋白的凝胶图片，每个细胞表达含有全长PTGFRN(PTGFRN-GFP)或截短PTGFRN(PTGFRN_IgV3-GFP)的GFP融合蛋白。图12B提供了使用抗ADAM10抗体对图12A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。图12C提供了使用抗GFP抗体对图12A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图13说明了含有PTGFRN的融合蛋白的结构，其缺少六个IgV结构域中的五个(PTGFRN_IgV6)、FLAG标签和融合配偶体蛋白。

图14A提供了PTGFRN_IgV6(#451)(SEQ ID NO:42)的序列和PTGFRN_IgV6的序列截短突变体，它们缺少四个(#452)(SEQ ID NO:43)、八个(#453)(SEQ ID NO:44)或十二个(#454)(SEQ ID NO:45)附加氨基酸。图14B提供了运行从过表达融合蛋白#451、452、453或454的细胞中分离的纯化外来体的总蛋白的凝胶图片。图14C提供了使用抗FLAG抗体对图14B的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图15提供了从过量表达各种GFP融合蛋白(GFP融合蛋白含有融合到常用的pDisplay支架(PDGF受体)、PalmPalm(棕榈酰化序列)、CD81或者全长PTGFRN(FL)或PTGFRN_454(sIgV)内腔侧的GFP)的细胞中分离的外来体中检测到的GFP荧光信号。

图16A说明了融合蛋白的结构，其含有IGSF8和与IGSF8的C末端融合的GFP。图16B提供了一张凝胶图片，其运行了从未转染的HEK293细胞(天然的)或HEK细胞中分离的外来体的总蛋白，所述HEK细胞用编码IGFS8-GFP融合蛋白的构建体稳定转染。图16B还在底部提供了用抗GFP抗体对样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图17提供了从过量表达各种GFP融合蛋白(GFP融合蛋白含有融合到常用的pDisplay支架(PDGF受体)、CD81、全长IGSF8或者全长PTGFRN(FL)或PTGFRN_454(sIgV)内腔侧的GFP)的细胞中分离的外来体中检测到的GFP荧光信号。

图18提供了融合蛋白的结构，所述融合蛋白含有PTGFRN的细胞外结构域(ECD)、位于N末端处的内源性信号肽(SP)、PAR1切割位点和位于C-末端处的Fc结构域。图18公开了SEQ ID NO:46。

图19A提供了在280nm UV荧光下，使用Superdex 200柱(Millpore Sigma)对PBSpH 7.4中PTGFRN的纯化ECD的凝胶过滤色谱结果。图19B提供了凝胶过滤色谱洗脱液的SDS-PAGE凝胶图片，所述洗脱液含有纯化的PTGFRN的ECD。

图20A提供了PTGFRN ECD、抗VLA4抗体和BSA的尺寸排阻色谱/多角度光散射(SEC-MALS)结果。图20B提供了在不存在氯化胍(GuHCl)或者存在1M或2M氯化胍(GuHCl)的情况下，PTGFRN ECD的尺寸排阻色谱(SEC)结果。指示了代表PTGFRN单体或二聚体的峰。

图21提供了在pH 7.4的结合测定中鉴定为PTGFRN胞外结构域结合配偶体的前三个命中(顶部)，以及在pH 5.6的结合测定中鉴定的前五个命中(底部)。

图22提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究在LGALS1浓度增加的情况下，PTGFRN与LGALS1之间的相互作用。

图23提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究在乳糖浓度增加的情况下，PTGFRN与LGALS1之间的相互作用。

图24提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究在抗CD315抗体浓度增加的情况下，PTGFRN与抗CD315抗体之间的相互作用。

图25提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究在从HEK293分离的天然外来体浓度增加的情况下，抗CD315抗体与天然外来体之间的相互作用。

图26提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究在修饰的外来体浓度增加的情况下，抗CD315抗体与被修饰以过表达PTGFRN的外来体(PTGFRN++外来体)之间的相互作用。

图27提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于比较抗CD315抗体与天然外来体之间，或者抗CD315抗体与过表达PTGFRN(PTGFRN++)的修饰的外来体之间的相互作用。

图28提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究抗CD315抗体与全长PTGFRN之间，或者抗CD315抗体与PTGFRN的一系列截短突变体之间的相互作用。

图29A提供了运行体内生物素化蛋白的凝胶图片，所述生物素化蛋白包括从转染的HEK细胞中分离的重组PTGFRN的截短突变体，和从HEK293细胞中纯化的外来体。图29B提供了使用合并的多克隆PTGFRN抗体对图29A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图30提供了生物层干涉测量(BLI)结果，用于研究多克隆PTGFRN抗体与PTGFRN的各种截短突变体之间的相互作用。

图31提供了从不同来源(HEK293SF、肾；HT1080，结缔组织；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳腺；Raji，淋巴母细胞；间充质干细胞(MSC)，骨髓)的各种细胞系纯化的外来体的表面蛋白(PTGFRN、IGSF8、IGSF3、BSG、SLC3A2、ITGB1、CD81和CD9)的肽谱匹配(PSM)数。

图32A提供了运行天然和PTGFRN敲除(KO)外来体的凝胶图片。图32B提供了使用合并的多克隆PTGFRN抗体对图32A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图33提供了来自纯化天然(y轴)和PTGRN KO(x轴)外来体的肽谱匹配(PSM)散点图。

图34提供了BLI结果，用于研究单克隆抗CD315抗体与天然、PTGFRN++、PTGFRN KO外来体之间的相互作用。

图35A提供了聚丙烯酰胺凝胶的图片，所述凝胶来自使用固定化单克隆抗PTGFRN抗体的天然和PTGFRN敲除(KO)外来体的体外外来体纯化。图35B提供了使用抗PTGFRN抗体对图35A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图36A提供了运行天然外来体或被工程化以表达PTGFRN-BDDFIII的被修饰的外来体的聚丙烯酰胺凝胶图片。图36B提供了使用CD81抗体(顶部)或FVIII抗体(底部)对图36A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图37A提供了运行天然外来体或被工程化以表达XTEN-PTGFRN-GFP的被修饰的外来体的聚丙烯酰胺凝胶图片。图37B提供了使用ALIX抗体(顶部)或GFP抗体(底部)对图37A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图38是一个图，其提供了四个不同组外来体(被工程化以表达(i)CD9-GFP，(ii)CD81-GFP，或(iii)PTGFRN-GFP的被修饰的外来体，或(iv)未修饰的天然外来体)中GFP阳性颗粒的百分比(黑条，左y轴)和平均荧光强度(灰条，右y轴)。

图39提供了表达GFP融合蛋白的被修饰的外来体的GFP荧光强度(FU)，所述GFP融合蛋白含有天然PTGFRN(PTGFRN-GFP)、带有其自身信号肽的截短PTGFRN(454-PTGFRN-GFP)或带有DsbA11合成信号肽的截短PTGFRN(454-PTGFRN-GFP)。

图40A示出了融合蛋白的结构，其由识别凝集素CLEC9A的单链Fab、全长PTGFRN、GFP和FLAG标签组成。图40B提供了使用抗ALIX抗体(顶部)或GFP抗体(底部)对Optiprep^TM纯化的外来体进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图41提供了BLI结果，用于研究CLEC9A-Fc与被修饰以表达融合蛋白的外来体之间的相互作用，所述融合蛋白由识别凝集素CLEC9A的单链Fab、全长PTGFRN、GFP和FLAG标签(“αCLEC9A-PTGFRN”)组成。

图42提供了从带有抗PTGFRN、ALIX、TSG101、CD63、CD9或CD81抗体的HEK293SF细胞(“HEK”)或MSC(“MSC”)纯化的蛋白质印迹外来体的凝胶图片。

图43A提供了聚丙烯酰胺凝胶的图片，其运行从未转染的HEK细胞、用表达融合到FLAG标签的全长PTGFRN的质粒(“PTGFRN-FLAG质粒”)转染的HEK细胞、未转染的CHO细胞或用PTGFRN-FLAG质粒转染的CHO细胞纯化的外来体。图43B提供了使用抗PTGRN抗体对图43A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。图43C提供了使用抗FLAG标签抗体对图43A的样品进行蛋白质印迹的凝胶图片。

图44A-B说明了使用CD9(图44A)或PTGFRN(图44B)测试外来体腔内货物蛋白装载的实验系统。图44A说明了表达融合到GFP、FLAG标签和FKBP的CD9的细胞，其可以在雷帕霉素存在下与融合到V5标签和FKBP的mCherry相互作用。图44B说明了表达融合到GFP、FLAG标签和FKBP的PTGFRN的细胞，其可以在雷帕霉素存在下与融合到V5标签和FKBP的mCherry相互作用。

图45A提供了运行从图44A(CD9)或图44B(PTGFRN)所示细胞培养样品中纯化的外来体的聚丙烯酰胺凝胶的图片(顶部)。所述图还提供了使用抗FLAG(αFlag)或V5(αV5)抗体的蛋白质印迹结果(底部)。图45B提供了来自图45A中蛋白质印迹的FLAG和V5的带强度，通过测密术测量并归一化至收集的外来体的量。

具体实施方式

4.1.定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术性和科学性术语具有本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予其的含义。

如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指细胞衍生的囊泡，其包含封闭内部空间的膜。细胞外囊泡包括所有膜结合囊泡，其直径小于其来源细胞的直径。通常，细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm，并且可以包含在内部空间内、显示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨越膜的各种大分子货物。所述货物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为示例而非限制，细胞外囊泡包括凋亡体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)从细胞衍生的囊泡、囊泡细胞器和活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可以源自活的或死的生物体、移植的组织或器官和/或培养的细胞。

如本文所用，术语“外来体”是指细胞衍生的小(直径在20-300nm之间，更优选直径在40-200nm之间)囊泡，其包括封闭内部空间的膜，并且由所述细胞通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合而产生。外来体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效载荷(例如治疗剂)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其他分子。外来体可以源自生产细胞，并基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。外来体是细胞外囊泡的一种。一般来说，外来体生产/生物发生不会导致生产细胞的破坏。

如本文所用，术语“纳米囊泡”是指细胞衍生的小(直径在20-250nm之间，更优选直径在30-150nm之间)囊泡，其包括封闭内部空间的膜，并且通过直接或间接操作由所述细胞产生，使得在没有所述操作的情况下所述生产细胞将不产生所述纳米囊泡。所述生产细胞的适当操作包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声波处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可能导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡的群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合从生产细胞衍生的囊泡。纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效载荷(例如治疗剂)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其他分子。一旦根据所述操作从生产细胞衍生出纳米囊泡，就可以基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离出纳米囊泡。纳米囊泡是细胞外囊泡的一种。

如本文所用，术语“表面工程化外来体”是指其组成被膜修饰的外来体。例如，膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等组成上被修饰。所述组成可以通过化学、物理或生物方法改变，或者通过由先前或同时被化学、物理或生物方法修饰的细胞产生。具体地，所述组成可以通过基因工程改变，或者通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生。

如本文所用，术语蛋白质的“修饰”是指对蛋白质的非突变氨基酸序列具有至少15％识别率的蛋白质。蛋白质的修饰包括蛋白质的片段或变体。蛋白质的修饰还可以包括对蛋白质的片段或变体的化学或物理修饰。

如本文所用，术语蛋白质的“片段”是指与天然存在的蛋白质相比在N-和/或C-末端缺失的蛋白质。优选地，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的片段保留特异性地靶向外来体的能力。这种片段也被称为“功能片段”。片段是否是所述意义上的功能片段可以通过任何本领域已知的方法来评估，以确定外来体的蛋白质含量，包括蛋白质印迹、FACS和片段与自体荧光蛋白质例如像GFP的融合。在一个特定的实施方案中，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白的片段保留了天然存在的PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白特异性地靶向外来体的能力的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。

如本文所用，术语蛋白质的“变体”是指通过本领域已知的方法比对后与另一蛋白质共享特定氨基酸序列同一性的蛋白质。蛋白质的变体可以包括另一种蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。在一个特定的实施方案中，所述变体是与PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的片段具有至少70％同一性的变体。在一些实施方案中，PTGFRN的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:1的PTGFRN或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，BSG的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:9的BSG或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，IGSF2的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:34的IGSF2或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，IGSF3的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:20的IGSF3或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，IGSF8的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:14的IGSF8或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ITGB1的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:21的ITGB1或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ITGA4的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:22的ITGA4或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，SLC3A2的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:23的SLC3A2或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP1A1的变体或片段变体与根据SEQ IDNO:24的ATP1A1或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP1A2的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:25的ATP1A2或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP1A3的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:26的ATP1A3或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP1A4的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:27的ATP1A4或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP1B3的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:28的ATP1B3或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP2B1的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:29的ATP2B1或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP2B2的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:30的ATP2B2或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP2B3的变体或片段变体与根据SEQID NO:31的ATP2B3或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，ATP2B4的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:32的ATP2B4或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在上述每种情况下，优选变体或片段变体保留特异性地靶向外来体的能力。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman和Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson和Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins和Sharp,Gene 73:15237-44(1988)；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)Corpet等人,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang等人,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)；以及Pearson等人,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)中。NCBI基本局部比对研究工具(BLAST)[Altschul 20等人,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)J可来自若干来源，包括国家生物信息中心(NBCl,Bethesda,Md.)和在因特网上获得以与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx关联使用。BLAST和如何使用所述程序确定序列同一性的描述可以在NIH(国家卫生研究院)下属的NCBI(国家生物技术信息中心)官方网站上访问。

本文提供的任何蛋白质的叙述涵盖蛋白质的功能变体。术语蛋白质的“功能变体”是指蛋白质的变体，其保留了特异性地靶向外来体的能力。

如本文所用，术语“生产细胞”是指用于产生外来体的细胞。生产细胞可以是体外培养的细胞，或者体内的细胞。生产细胞包括但不限于已知能有效产生外来体的细胞，例如HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和间充质干细胞(MSC)。

如本文所用，术语“靶蛋白”是指可以靶向外来体表面的蛋白。靶蛋白可以是天然地靶向外来体膜的非突变蛋白，或者所述非突变蛋白的片段或变体。靶蛋白可以是融合蛋白，其含有flag标签、治疗性肽、靶向部分、或附着到所述非突变蛋白的其他肽，或所述非突变蛋白的变体或片段。靶蛋白可以包括跨膜蛋白、整合蛋白、外周蛋白或通过接头附着到膜的可溶性蛋白。

如本文所用，术语“污染蛋白”是指是与外来体不相关的蛋白质。例如，污染蛋白包括未被封闭在外来体中且未附着或结合到外来体膜中的蛋白质。

如本文所用，术语“分离(isolate)”、“分离(isolated)”和“分离(isolating)”或“纯化(purify)”、“纯化(purified)”和“纯化(purifying)”以及“提取(extracted)”和“提取(extracting)”可互换使用，并且是指已经经历一个或多个纯化过程(例如选择或富集期望的外来体制剂)的期望EV的制剂状态(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)。在一些实施方案中，如本文所用的分离或纯化是从含有生产细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)外来体的过程。在一些实施方案中，分离的外来体组合物没有可检测的不期望活性，或者可替代地，不期望活性的水平或量等于或低于可接受的水平或量。在其他实施方案中，分离的外来体组合物具有的所期望外来体的量和/或浓度等于或高于可接受的量和/或浓度。在其他实施方案中，与获得所述组合物的起始材料(例如，生产细胞制剂)相比，分离的外来体组合物富集。与起始材料相比，这种富集可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、或大于99.9999％。在一些实施方案中，分离的外来体制剂基本上不含残留的生物产品。在一些实施方案中，分离的外来体制剂100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含、95％不含、94％不含、93％不含、92％不含、91％不含或90％不含任何污染性生物物质。残留的生物产品可能包括非生物物质(包括化学物质)或不需要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。基本上不含残留生物产物还意味着外来体组合物不含可检测的生产细胞，并且仅外来体是可检测的。

术语“赋形剂”或“载体”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰性物质。术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”涵盖美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何药剂，以及不会对受试者造成显著刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和特性的任何载体或稀释剂。包括赋形剂和载体，它们可用于制备药物组合物，并且通常是安全、无毒和期望的。

如本文所用，术语“有效载荷”是指作用于与EV接触的靶(例如靶细胞)的治疗剂。可以被引入外来体和/或生产细胞的有效载荷包括治疗剂，如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽如酶的DNA或mRNA分子，或具有调节功能的RNA分子如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA)、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)。

如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家畜(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，具体是人。本文所述的方法适用于人疗法和兽医学应用两者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在其他实施方案中，受试者是人。

如本文所用，术语“基本上不含”意指包含外来体的样品包含质量/体积(m/v)百分比浓度小于10％的大分子。一些级分可能含有小于0.001％、小于0.01％、小于0.05％、小于0.1％、小于0.2％、小于0.3％、小于0.4％、小于0.5％、小于0.6％、小于0.7％、小于0.8％、小于0.9％、小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％或小于10％(m/v)的大分子。

如本文所用，术语“大分子”意指核酸、污染蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。

如本文所用，术语“常规外来体蛋白”意指先前已知在外来体中富集的蛋白质，包括但不限于CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽。

4.2.其他解释惯例

本文列举的范围应理解为所述范围内的所有值(包括所列举的端点值)的速记法。例如，范围1至50应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组中的任何数值、数值组合或子范围。

4.3.外来体蛋白

本发明的一个方面涉及外来体蛋白的鉴定、使用和修饰，所述外来体蛋白在外来体膜上高度富集。此类外来体蛋白可以通过用质谱或本领域已知的其他方法分析高度纯化的外来体来鉴定。

外来体蛋白包括富集在外来体膜上的各种膜蛋白，如跨膜蛋白、整合蛋白和外周蛋白。它们包括各种CD蛋白、转运蛋白、整合素、凝集素和钙粘蛋白。具体地，所述蛋白质包括但不限于(1)前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)，(2)巴斯金(BSG)，(3)免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)，(4)免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)，(5)整合素β-1(ITGB1)，(6)整合素α-4(ITGA4)；(7)4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2)；(8)一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)，和(9)免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2)。

根据生产细胞、生产条件、纯化方法或外来体的预期应用，可以选择性地使用本文鉴定的一种或多种外来体蛋白。例如，富集在特定外来体群体上的外来体蛋白可以用于纯化特定外来体群体。可以鉴定富集在具有特定大小范围、靶向部分、电荷密度、有效载荷等的某些外来体表面上的外来体蛋白，并将其用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，可以同时或随后使用多于一种的外来体蛋白来产生、纯化和分离治疗性外来体。

4.4.表面工程化外来体

本发明的另一方面涉及表面工程化外来体的产生和使用。表面工程化外来体具有其组成被修饰的膜。例如，可以通过改变膜的蛋白质、脂质或聚糖含量来修饰它们的膜组成。

在一些实施方案中，表面工程化外来体通过化学和/或物理方法(如PEG诱导的融合和/或超声波融合)产生。

在其他实施方案中，表面工程化外来体由基因工程产生。由遗传修饰的生产细胞或遗传修饰细胞的后代产生的外来体可以含有修饰的膜组合物。在一些实施方案中，表面工程化外来体具有较高或较低密度的外来体蛋白，或者包括外来体蛋白的变体或片段。

例如，表面工程化外来体可以由用编码外来体蛋白或外来体蛋白变体或片段的外源序列转化的细胞产生。包括由外源序列表达的蛋白质的外来体可以包括修饰的膜蛋白组合物。

外来体蛋白的各种修饰或片段可以用于本发明的实施方案。例如，被修饰以对结合剂具有增强亲和力的蛋白质可以用于产生表面工程化外来体，所述外来体可以使用结合剂纯化。可以使用被修饰以更有效地靶向外来体和/或膜的蛋白质。还可以使用被修饰以包含特异性且有效靶向外来体膜所需的最小片段的蛋白质。

还可以使用融合蛋白，例如，融合到亲和标签(例如，His标签、GST标签、谷胱甘肽-S-转移酶、S-肽、HA、Myc、FLAG^TM(Sigma-Aldrich公司)、MBP、SUMO和蛋白A)的外来体蛋白或其片段可以用于使用对亲和标签特异的结合剂纯化或去除表面工程化外来体。

具有治疗活性的融合蛋白也可以用于产生表面工程化外来体。例如，融合蛋白可以包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体和治疗性肽。治疗性肽选自天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。治疗性化合物可以是核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物或小分子。治疗性肽可以是抗体、酶、配体、受体、抗菌肽或其片段或变体。在一些实施方案中，治疗性肽是核酸结合蛋白。核酸结合蛋白可以是Dicer(一种Argonaute蛋白)、TRBP或MS2噬菌体外壳蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白另外地包含一种或多种RNA或DNA分子。所述一种或多种RNA可以是miRNA、siRNA、引导RNA、lincRNA、mRNA、反义RNA、dsRNA或其组合。

在一些实施方案中，治疗性肽是蛋白质-蛋白质相互作用系统的一部分。在一些实施方案中，蛋白质-蛋白质相互作用系统包括FRB-FKBP相互作用系统，例如，如Banaszynski等人,J Am Chem Soc.2005年4月6日；127(13):4715-21中所述的FRB-FKBP相互作用系统。

融合蛋白可以靶向外来体表面，并为外来体提供治疗活性。在一些实施方案中，融合蛋白不包含IGSF8或其片段或修饰。

在一些实施方案中，使用了具有靶向部分的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体和靶向部分。靶向部分可以用于将外来体靶向特定器官、组织或细胞，以使用外来体进行治疗。在一些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。抗体及其抗原结合片段包括全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体及其片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、鼠-人抗体、鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，例如像scFv、(scFv)₂、Fab、Fab’和F(ab')₂、F(ab1)₂、Fv、dAb和Fd片段、双抗体和抗体相关多肽。抗体及其抗原结合片段也包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所期望的生物活性或功能。

在一些实施方案中，融合蛋白不包含IGSF8或其片段或修饰。

在一些实施方案中，与本领域已知的表面工程化外来体相比，本文所述的表面工程化外来体展现出优异的特征。例如，通过使用本文提供的新鉴定的外来体蛋白产生的表面工程化外来体与现有技术中的外来体(例如使用常规外来体蛋白产生的那些外来体)相比，在其表面上含有更高度富集的修饰蛋白质。此外，与本领域已知的表面工程化外来体相比，本发明的表面工程化外来体可以具有更大、更特异或更可控的生物活性。例如，包含与本文所述外来体表面蛋白或其片段(例如PTGFRN或其片段)融合的治疗性或生物学相关外源序列的表面工程化外来体可以比与本领域已知的支架融合具有更多期望的工程化特征。本领域已知的支架蛋白包括四次跨膜蛋白分子(例如CD63、CD81、CD9等)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2和LAMP2B)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、GPI锚蛋白、乳凝集素及其片段，以及对这些蛋白质或其片段中的任一种具有亲和力的肽。先前，外源蛋白的过表达依赖于外源蛋白在外来体上的随机或随意分布来产生表面工程化外来体。这导致外来体上外源蛋白的低水平、不可预测的密度。因此，本文所述的外来体表面蛋白质及其片段在新的外来体组合物及其制备方法方面提供了重要的进展。

在一些实施方案中，包含含有外源序列和本文新鉴定的外来体表面蛋白的融合蛋白的表面工程化外来体比包含与本领域已知的常规外来体蛋白(例如CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽)缀合的外源序列的相似工程化外来体具有更高的融合蛋白密度。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来体表面上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。

在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的片段类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。

在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，PTGFRN的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，BSG的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，IGSF2的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，IGSF3的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，IGSF8的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，ITGB1的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，ITGA4的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，SLC3A2的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与使用常规外来体蛋白(例如四次跨膜蛋白分子，像CD63)类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，ATP转运蛋白的融合蛋白、其变体、片段、片段的变体或修饰在外来体表面上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体表面上的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来体表面上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。

本文提供的融合蛋白可以包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体和附加肽。附加肽可以附接到外来体蛋白或其片段或变体的N末端或C末端。附加肽可以位于附接到外来体蛋白的外来体内部(内腔侧)或外部。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体和两个附加肽。这两个附加肽可以附接到外来体蛋白或其片段或变体的N末端或C末端。在一些实施方案中，两个附加肽中的一个附接到外来体蛋白或其片段或变体的N末端，并且两个附加肽中的另一个附接到C末端。附加肽可以位于附接到外来体蛋白的外来体内部(内腔侧)或外部或两者。

4.5.用于生产表面工程化外来体的生产细胞

本发明的外来体可以由体外生长的细胞或受试者的体液产生。当外来体由体外细胞培养物产生时，各种生产细胞，例如HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或间充质干细胞(MSC)可以用于本发明。

可以对生产细胞进行遗传修饰，使其包含一个或多个外源序列，以产生表面工程化外来体。遗传修饰的生产细胞可以含有通过瞬时或稳定转化引入的外源序列。外源序列可以作为质粒引入生产细胞。外源序列可以在靶位点或随机位点处，稳定地整合到生产细胞的基因组序列中。在一些实施方案中，产生稳定的细胞系用于生产表面工程化外来体。

外源序列可以插入生产细胞的基因组序列中，位于编码外来体蛋白的内源序列的上游(5’-末端)或下游(3’-末端)。本领域已知的各种方法可以用于将外源序列引入生产细胞。例如，使用各种基因编辑方法(例如，使用同源重组、转座子介导系统、loxP-Cre系统、CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修饰的细胞在本发明的范围内。

外源序列可以包括编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的变体或片段的序列。可以引入编码外来体蛋白的序列的额外拷贝，以产生以更高密度具有外来体蛋白的表面工程化外来体。可以引入编码外来体蛋白的变体或片段的外源序列，以产生含有外来体蛋白的修饰或片段的表面工程化外来体。可以引入编码亲和标签的外源序列，以产生含有融合蛋白的表面工程化外来体，所述融合蛋白包含附接到外来体蛋白的亲和标签。

在一些实施方案中，与从相同或相似生产细胞类型分离的天然外来体相比，表面工程化外来体具有更高的外来体蛋白密度。在一些实施方案中，与所述天然外来体相比，所述外来体蛋白在所述表面工程化外来体上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体相比，所述外来体蛋白在所述表面工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰外来体蛋白相比，包含外来体蛋白的融合蛋白在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰外来体蛋白相比，外来体蛋白的片段或变体在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。

在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰PTGFRN相比，PTGFRN、PTGFRN的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰BSG相比，BSG、BSG的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰IGSF2相比，IGSF2、IGSF2的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰IGSF3相比，IGSF3、IGSF3的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰ITGB1相比，ITGB1、ITGB1的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰ITGA4相比，ITGA4、ITGA4的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰SLC3A2相比，SLC3A2、SLC3A2的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰ATP转运蛋白相比，ATP转运蛋白、ATP转运蛋白的片段或变体或其修饰在所述表面工程化外来体上以以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。

在一些实施方案中，生产细胞被进一步修饰以包含额外的外源序列。例如，可以引入额外的外源序列来调节内源基因表达，或者产生包含特定多肽作为有效载荷的外来体。在一些实施方案中，生产细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的变体或片段，并且另一个编码有效载荷。在一些实施方案中，可以进一步修饰生产细胞以包含赋予外来体额外功能(例如，特定靶向能力、递送功能、酶功能、体内半衰期的增加或减少等)的额外外源序列。在一些实施方案中，生产细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的变体或片段，并且另一个编码赋予外来体额外功能的蛋白质。

在一些实施方案中，生产细胞被修饰以包含两个外源序列，这两个外源序列中的每一个都编码外来体表面上的融合蛋白。在一些实施方案中，与从相同或相似细胞类型的未修饰细胞分离的天然外来体相比，来自生产细胞的表面工程化外来体具有更高的外来体蛋白密度。在一些实施方案中，与从相同或相似细胞类型的未修饰细胞分离的天然外来体相比，表面工程化外来体以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度含有外来体蛋白。在一些实施方案中，生产细胞被进一步修饰以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个额外的外源序列。

更具体地，可以从用编码一种或多种外来体表面蛋白或其变体(包括但不限于：(1)前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)，(2)巴斯金(BSG)，(3)免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)，(4)免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)，(5)整合素β-1(ITGB1)，(6)整合素α-4(ITGA4)；(7)4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2)；(8)一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)，和(9)免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2))的序列转化的细胞产生表面工程化外来体。本文所述的一种或多种外来体表面蛋白中的任一种都可以在生产细胞中从质粒、插入基因组的外源序列或其他外源核酸如合成信使RNA(mRNA)表达。

在一些实施方案中，所述一种或多种外来体表面蛋白在用编码其全长内源形式的外源序列转化的细胞中表达。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:1的PTGFRN蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:9的BSG蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:14的IGSF8蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQID NO:20的IGSF3蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:21的ITGB1蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:22的ITGA4蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:23的SLC3A2蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQID NO:24的ATP1A1蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:25的ATP1A2蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:26的ATP1A3蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:27的ATP1A4蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:28的ATP1B3蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:29的ATP2B1蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:30的ATP2B2蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:31的ATP2B3蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:32的ATP2B4蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:34的IGSF2蛋白。

可以从用编码一种或多种外来体表面蛋白(包括但不限于：(1)前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)，(2)巴斯金(BSG)，(3)免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)，(4)免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)，(5)整合素β-1(ITGB1)，(6)整合素α-4(ITGA4)；(7)4F2细胞表面抗原重链(SLC3A 2)；(8)一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)，和(9)免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2))片段的序列转化的细胞产生表面工程化外来体。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的N-末端缺失至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸的外来体表面蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的C-末端缺失至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸的外来体表面蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的N-末端和C-末端两者缺失至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸的外来体表面蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码缺乏天然蛋白质的一个或多个功能或结构结构域的外来体表面蛋白的片段。

在一些实施方案中，外来体表面蛋白的片段与一种或多种异源蛋白质融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述片段的N-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述片段的C-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述片段的N-末端和C-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质是人蛋白质。

表面工程化外来体可以从用编码PTGFRN片段的序列转化的细胞产生。在一些实施方案中，PTGFRN的片段缺乏一个或多个功能或结构结构域，如IgV。例如，PTGFRN的片段可以包含SEQ ID NO:2-7或33的多肽。在一些实施方案中，PTGFRN的片段与一种或多种异源蛋白质融合。所述一种或多种异源蛋白质可以与所述PTGFRN片段的N-末端融合。所述一种或多种异源蛋白质可以与所述PTGFRN片段的C-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述PTGFRN片段的N-末端和C-末端两者融合。在一些实施方案中，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，异源蛋白质是人蛋白质。在一些实施方案中，与所述PTGFRN片段融合的所述异源蛋白质另外地含有信号序列肽。所述信号序列肽可以是SEQ ID NO:8的多肽。

表面工程化外来体可以从用编码巴斯金片段的序列转化的细胞产生。在一些实施方案中，巴斯金的片段缺乏一个或多个功能或结构结构域，如IgV。例如，巴斯金的片段可以包含SEQ ID NO:10-12的多肽。在一些实施方案中，巴斯金的片段与一种或多种异源蛋白质融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述巴斯金片段的N-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述巴斯金片段的C-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述巴斯金片段的N-末端和C-末端两者融合。在一些实施方案中，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，异源蛋白质是人蛋白质。在一些实施方案中，与所述巴斯金片段融合的所述异源蛋白质另外地含有信号序列肽。所述信号序列肽可以是SEQ ID NO:13的多肽。

表面工程化外来体可以从用编码IGSF8片段的序列转化的细胞产生。在一些实施方案中，IGSF8的片段缺乏一个或多个功能或结构结构域，如IgV。例如，IGSF8的片段可以包含SEQ ID NO:15-18的多肽。在一些实施方案中，IGSF8的片段与一种或多种异源蛋白质融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述IGSF8片段的N-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述IGSF8片段的C-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述IGSF8片段的N-末端和C-末端两者融合。在一些实施方案中，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，异源蛋白质是人蛋白质。在一些实施方案中，与所述IGSF8片段融合的所述异源蛋白质另外地含有信号序列肽。所述信号序列肽可以是SEQ ID NO:19的多肽。

表面工程化外来体可以从用编码IGSF2片段的序列转化的细胞产生。在一些实施方案中，IGSF2的片段缺乏一个或多个功能或结构结构域，如IgV。在一些实施方案中，IGSF2的片段与一种或多种异源蛋白质融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述IGSF2片段的N-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述IGSF2片段的C-末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质与所述IGSF2片段的N-末端和C-末端两者融合。在一些实施方案中，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，异源蛋白质是人蛋白质。在一些实施方案中，与所述IGSF2片段融合的所述异源蛋白质另外地含有信号序列肽。所述信号序列肽可以是SEQ ID NO:35的多肽。

在一些实施方案中，表面工程化外来体包含与天然外来体表面蛋白的全长或片段相同或相似的序列的多肽，所述天然外来体表面蛋白包括但不限于：(1)前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)，(2)巴斯金(BSG)，(3)免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)，(4)免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)，(5)整合素β-1(ITGB1)，(6)整合素α-4(ITGA4)；(7)4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2)；(8)一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)，和(9)免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2)。在一些实施方案中，所述肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段50％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 50％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段60％相同，例如与SEQ IDNO:1-34 60％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段70％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 70％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段80％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 80％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段90％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 90％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段95％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 95％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段99％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 99％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体表面蛋白的全长或片段99.9％相同，例如与SEQ ID NO:1-34 99.9％相同。

4.6.亲和纯化

本发明的一些实施方案涉及使用富集在外来体膜上的蛋白质与固定化结合剂之间的特异性结合相互作用来分离、纯化和亚分级分离外来体。这些方法通常包括以下步骤：(1)施加或装载包含外来体的样品，(2)任选地使用适当的缓冲液洗涤掉未结合的样品组分，所述缓冲液保留外来体的靶蛋白与结合剂之间的结合相互作用，以及(3)通过改变缓冲液条件从固定的结合剂洗脱(解离和回收)外来体，使得结合相互作用不再发生。

一些实施方案涉及一种使用富集在外来体膜上的蛋白质与固定化结合剂之间的特异性结合相互作用从样品中去除外来体的方法。在所述情况下，与结合剂结合的外来体不会从结合剂洗脱，并且可以收集不与结合剂结合的级分。所述方法可以用于纯化包含外来体和非外来体物质如病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或任何其他包膜或非包膜病毒)或重组蛋白(例如抗体、酶或其他多肽)的样品，其中外来体是污染颗粒。结合的外来体可以保持与结合剂的结合，并且收集非外来体物质，其基本上不含外来体。

用于此分离、纯化、亚分级分离或去除过程的靶蛋白可以是从生产细胞基因组产生的内源性蛋白质，通过遗传修饰引入生产细胞的蛋白质，或通过化学、物理或其他生物方法修饰的蛋白质。在一些情况下，所述蛋白质是非突变蛋白质或突变蛋白质，例如内源性蛋白质的变体或片段。在一些情况下，所述蛋白质是融合蛋白。

对靶蛋白具有亲和力的各种结合剂可以用于本发明的实施方案。例如，对靶蛋白具有特定亲和力的蛋白质、肽和小分子可以用作结合剂。在一些实施方案中，结合剂从有机或无机来源获得。来自有机来源的结合剂的实例包括血清蛋白、凝集素或抗体。来自无机来源的结合剂的实例包括硼酸、金属螯合物和三嗪染料。

结合剂可以化学固定或偶联到固体支撑物，使得对结合剂具有特异性亲和力的外来体被结合。可以使用各种形式的固体支撑物，例如多孔琼脂糖珠、微量滴定板、磁珠或膜。在一些实施方案中，固体支撑物形成色谱柱，并可以用于外来体的亲和色谱法。

在一些情况下，使用填充有结合剂和固体支撑物的柱，通过柱色谱法完成外来体的分离、纯化、亚分级分离和去除。在一些实施方案中，含有外来体的样品穿过柱以允许凝固，洗涤缓冲液穿过柱，并且洗脱缓冲液随后施加到柱并收集。这些步骤可以在环境压力下或施加额外的压力下完成。

在一些情况下，使用分批处理来完成外来体的分离、纯化、亚分级分离和去除。例如，将样品加入到附着到容器中固体支撑物的结合剂中，混合、分离固体支撑物，除去液相，洗涤，离心，加入洗脱缓冲液，再离心并除去洗脱液。

在一些情况下，可以采用混合法。例如，将样品加入到附着到容器中固体支撑物的结合剂中，随后将结合到外来体的固体支撑物包装到柱上，并在柱上进行洗涤和洗脱。

在一些情况下，使用附着到微量滴定板、磁珠或膜的结合剂来完成外来体的分离、纯化、亚分级分离和去除。在所述情况下，将样品加入到附着到固体支撑物的结合剂中，随后进行以下步骤：混合、分离固体支撑物，除去液相，洗涤，除去洗涤缓冲液，加入洗脱缓冲液，并除去洗脱液。

结合剂与外来体上的靶蛋白之间的结合是在对结合剂与外来体上的靶蛋白之间的特异性相互作用而言最佳的各种生理条件下进行的。结合外来体的洗脱可以通过直接改变盐浓度、pH、pI、电荷和离子强度或通过梯度来实现。

在一些实施方案中，将用一种结合剂分离、纯化或亚分级分离的样品随后用不同的结合剂处理。

在一些实施方案中，串联使用多于一个的柱，其中多个柱中的每一个都含有对不同靶蛋白特异的不同结合剂。

在一些实施方案中，单个柱含有多种结合剂，每种结合剂对不同的靶蛋白特异。

在一些情况下，结合剂和固体支撑物通过引入定期消毒步骤而被重复使用。例如，它们可以用丙二醇、异丙醇、高离子强度和/或氢氧化钠的组合进行消毒。

4.6.1.样品制备

本文所述的方法可以用于从包含外来体的各种样品中纯化、分离、亚分级分离或除去外来体。在一些实施方案中，所述样品是含有外来体的澄清收获材料。在一些情况下，所述样品包含通过本领域熟知的纯化方法部分纯化的外来体。例如，超滤/渗滤、羟基磷灰石色谱法、疏水相互作用色谱法、深度过滤或离子交换结合/洗脱色谱法可以用于在应用于亲和纯化的结合剂之前部分纯化外来体。

在一些情况下，部分纯化的材料被进一步加工以具有某些生理条件(例如，pH、温度、盐浓度、盐类型、极性)以便与结合剂的期望相互作用。样品可以通过稀释或浓缩以获得一定的外来体浓度，或者通过添加赋形剂以改变外来体的结构来制备。在一些情况下，部分纯化的材料在没有任何操作的情况下被施加到结合剂。

4.6.2.结合

本文所述的方法需要外来体的靶蛋白与结合剂之间的特异性相互作用。通过改变盐浓度、pH和/或用有机改性剂、乙二醇、丙二醇或尿素降低极性，可以进行高通量筛选，以鉴定适合特异性结合的缓冲条件。靶蛋白与结合剂之间的相互作用也可以根据样品条件(例如，每体积色谱树脂负载的样品量、外来体浓度、杂质浓度)、负载缓冲液(例如，pH、盐浓度、盐类型、极性)和其他物理条件(例如，温度)而变化。此外，添加改变外来体结构的赋形剂也可以改变它们的相互作用。此外，停留时间可以基于杂质与外来体之间的不同吸附速率来调节。因此，可以测试本文所述的各种纯化条件，以鉴定所述步骤的理想条件。

类似的方法可以用于提高纯度和产量，并有助于富集、消耗或分离外来体的亚群体。这些特性，连同最大化负载挑战和应用更严格的洗脱条件，可用于进一步提高外来体的浓度。

4.6.2.1.洗脱

外来体的洗脱可以通过用有机改性剂、乙二醇、丙二醇或尿素改变盐浓度、pH和/或极性来实现。

可以在固定pH下，通过使用增加梯度(步长或线性)的单价阳离子卤化物盐(例如氯化钠、氯化钾、溴化钠、氯化锂、碘化钠、溴化钾、溴化锂、氟化钠、氟化钾、氟化锂、碘化锂、乙酸钠、乙酸钾、乙酸锂和碘化钾)、二价或三价盐(例如氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸钠、硫酸镁、三氯化铬、硫酸铬、柠檬酸钠、氯化铁(III)、氯化钇(III)、磷酸钾、硫酸钾、磷酸钠、氯化亚铁、柠檬酸钙、磷酸镁和氯化铁)或其组合，在洗脱缓冲液中，通过增加单价阳离子卤化物盐(例如氯化钠、氯化钾、溴化钠、氯化锂、碘化钠、溴化钾、溴化锂、氟化钠、氟化钾、氟化锂、碘化锂、乙酸钠、乙酸钾、乙酸锂和碘化钾)、二价或三价盐(例如氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸钠、硫酸镁、三氯化铬、硫酸铬、柠檬酸钠、氯化铁(III)、氯化钇(III)、磷酸钾、硫酸钾、磷酸钠、氯化亚铁、柠檬酸钙、磷酸镁和氯化铁)或其组合的浓度来实现外来体的选择性洗脱。

通过在柱负载阶段流过杂质，在选择性赋形剂洗涤期间洗脱杂质，并且在洗脱期间选择性洗脱产物，同时使额外的杂质保留与柱结合，可以实现相当高的外来体纯度。从柱洗脱液测得的吸光度可以指示通过所述方法获得的外来体的纯度。

洗脱还可以通过调节pH范围、盐、有机溶剂、小分子、洗涤剂、两性离子、氨基酸、聚合物、温度以及以上的任何组合来实现。类似的洗脱剂可以用于提高纯度、提高产量和分离外来体的亚群体。

洗脱还可以用具有不同特性(如pH、盐、有机溶剂、小分子、洗涤剂、两性离子、氨基酸、聚合物、温度以及以上的任何组合)的多种洗脱缓冲液来进行。可以收集多个洗脱级分，其中收集在每个级分中的外来体具有不同的特性。例如，在一个级分中收集的外来体具有比其他级分中的外来体更高的纯度、更小或更大的平均大小、优选的组成等。

具有不同特性的洗脱缓冲液可以作为连续流施加，同时收集多个洗脱级分。洗脱级分可以在等度洗脱或梯度洗脱期间收集。一旦收集了至少一个洗脱级分，则可以分析洗脱级分的组成。例如，外来体、宿主细胞蛋白质、污染蛋白、DNA、碳水化合物或脂质的浓度可以在每个洗脱级分中测量。也可以测量每个洗脱级分中外来体的其他特性。所述特性包括平均大小、平均电荷密度以及与生物分布、细胞摄取、半衰期、药效学、效力、剂量、免疫响应、负载效率、稳定性或对其他化合物的反应性相关的其他生理特性。

4.6.2.2.洗涤

任选地，可以通过在洗脱前洗涤样品来进一步提高外来体的纯度。在一些实施方案中，赋形剂可以是洗涤缓冲液。赋形剂可以是具有特定pH范围、盐、有机溶剂、小分子、洗涤剂、两性离子、氨基酸、聚合物以及以上的任何组合的溶液。

更具体地，赋形剂可以包括精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、钙、钠、锂、钾、碘化物、镁、铁、锌、锰、尿素、丙二醇、铝、铵、胍基聚乙二醇、EDTA、EGTA、洗涤剂、氯化物、硫酸盐、羧酸、唾液酸、磷酸盐、乙酸盐、甘氨酸、硼酸盐、甲酸盐、高氯酸盐、溴、硝酸盐、二硫苏糖醇、β巯基乙醇或磷酸三正丁酯。

赋形剂还可以包含洗涤剂，选自十六烷基三甲基氯化铵、辛氧基醇-9、TRITON^TM X-100(即聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)和可从Sigma-Aldrich获得的TRITON^TMCG-110；十二烷基硫酸钠；十二醇硫酸钠；脱氧胆酸；聚山梨醇酯80(即聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)；聚山梨醇酯20(即聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)；醇乙氧基化物；烷基聚乙二醇醚；癸基葡萄糖苷；辛基葡糖苷(octoglucosides)；SafeCare；可从DOWChemical获得的ECOSURF^TM EH9、ECOSURF^TM EH6、ECOSURF^TM EH3、ECOSURF^TM SA7和ECOSURF^TMSA9；可从BASF获得的LUTENSOL^TM M5、LUTENSOL^TM XL、LUTENSOL^TM XP和APG^TM 325N；可从AIRPRODUCTS获得的TOMADOL^TM 900；可从CRODA获得的NATSURF^TM 265；可从Bestchem获得的SAFECARE^TM1000；可从DOW获得的TERGITOL^TM L64；辛酸；可从Lubrizol获得的CHEMBETAINE^TMLEC；以及Mackol DG。

4.6.3.改善结果的其他方法

可以通过调节进料物质来提高每体积色谱树脂中可以负载的外来体的量，例如，通过增加外来体的浓度、降低杂质的浓度、改变pH、降低盐浓度、降低离子强度或改变外来体的特定亚群体。由于传质限制以及外来体在树脂上的缓慢吸附和解吸，可以通过在柱装载期间减慢流速、采用较长的柱来增加停留时间来增加每体积色谱树脂中可以装载的外来体的量。

4.7.应用

4.7.1.外来体的纯化

将外来体用于医疗目的要求外来体不含或基本不含杂质，包括但不限于大分子，如核酸、污染蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物、小分子、金属或其组合。本发明提供了一种从污染的大分子纯化外来体的方法。在一些实施方案中，纯化的外来体基本上不含污染的大分子。

4.7.2.外来体的亚分级分离

本发明的实施方案还提供了基于外来体的膜蛋白、大小、电荷密度、配体类型(例如四次跨膜蛋白)和肝素或其他硫酸化碳水化合物结合位点亚分级分离外来体群体的方法。亲和标签、装载和洗脱缓冲液组合物和方案的选择可以导致不同外来体亚群体的洗脱。

例如，本发明的实施方案提供了纯化具有较小或较大大小的外来体群体的方法。外来体的大小可以通过所述领域可用的方法来确定。例如，可以通过纳米粒子跟踪分析、多角度光散射、单角度光散射、尺寸排阻色谱法、分析超速离心、场流分级分离、激光衍射、可调电阻脉冲传感或动态光散射来测量大小。

本发明的实施方案还涉及基于外来体的电荷密度对其进行亚分级分离的方法。外来体的电荷密度可以通过电位滴定、阴离子交换、阳离子交换、等电聚焦、ζ电位、毛细管电泳、毛细管区带电泳、凝胶电泳来确定。

本发明的实施方案还涉及基于其他生理特性，如生物分布、细胞摄取、半衰期、药效学、效力、给药、免疫响应、装载效率、稳定性或对其他化合物的反应性，对外来体进行亚分级分离。所述方法能够分离适合特定应用的外来体群体。

4.8.外来体的表征

在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括表征包含在每个收集级分中的外来体的步骤。在一些实施方案中，可以提取外来体的内容物用于研究和表征。在一些实施方案中，外来体是分离的，并通过包括但不限于大小、形状、形态或分子组成如核酸、蛋白质、代谢物和脂质的度量来表征。

4.8.1.外来体含量的测量

外来体可以包括蛋白质、肽、RNA、DNA和脂质。总RNA可以使用酸-酚:氯仿萃取法提取。然后，可以在回收含有总RNA的小RNA的条件下，或者在将长度小于200个核苷酸的小RNA物种从较长的RNA物种如mRNA中分离出来的条件下，使用玻璃纤维过滤器纯化RNA。因为RNA以小体积洗脱，所以分离RNA可能不需要醇沉淀步骤。

外显子组合物可以通过本领域已知的方法进行评估，包括但不限于转录组学、测序、蛋白质组学、质谱或HP-LC。

可以使用本领域技术人员熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR、Northern印迹分析、溶液杂交检测)来测量与分离的外来体相关的核苷酸组成(包括RNA和DNA)。在一个特定的实施方案中，通过以下测量至少一种RNA的水平：逆转录来自外来体组合物的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种RNA特异性探针寡核苷酸(例如，包含RNA特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交以提供外来体组合物的杂交谱，并将外来体组合物杂交谱与对照样品产生的杂交谱进行比较。测试样品中至少一种RNA的信号相对于对照样品的改变指示RNA的组成。

另外，可以由已知RNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备微阵列。所述阵列可以为每种RNA含有两种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，并且另一种对RNA的前体(例如miRNA和前miRNA)具有特异性。所述阵列还可以含有对照，如一个或多个与人直系同源物仅相差几个碱基的小鼠序列，其可以用作杂交严格性条件的对照。来自两种物种的tRNA和其他RNA(例如rRNA、mRNA)也可以印刷在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。微芯片上还可以包括一种或多种用于非特异性杂交的适当对照。为此，基于与任何已知RNA没有任何同源性来选择序列。

微阵列可以使用本领域已知的技术制造。例如，适当长度(例如40个核苷酸)的探针寡核苷酸在C6位置处被5’-胺修饰，并使用可商购获得的微阵列系统(例如GeneMachineOmniGrid.^TM _.100微阵列和Amersham CodeLink.^TM)印刷在活化的载玻片上。通过用标记引物逆转录靶RNA来制备对应于靶RNA的标记的cDNA寡聚体。在第一条链合成之后，RNA/DNA杂交体被变性以降解RNA模板。然后在杂交条件下，例如6倍，将如此制备的标记靶cDNA与微阵列芯片杂交。SSPE/30％甲酰胺在25℃下持续18小时，随后以0.75.倍洗涤。TNT在37℃下持续40分钟。在阵列上固定探针DNA识别样品中互补靶cDNA的位置处，杂交发生。标记的靶cDNA标记阵列上发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出由一系列杂交事件组成，从而表明外来体制剂中特定cDNA序列的相对丰度，以及因此相应互补RNA的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚体是生物素标记的cDNA，由生物素标记的引物制备。然后通过使用例如链霉亲和素-Alexa647缀合物直接检测含有生物素的转录物来处理微阵列，并利用常规扫描方法进行扫描。阵列上每个点的图像强度与外来体中相应RNA的丰度成正比。

数据挖掘工作由生物信息学完成，包括扫描芯片、信号采集、图像处理、归一化、统计处理和数据比较以及路径分析。因此，微阵列可以以高通量性能同时分析成百上千多核苷酸。mRNA表达的微阵列谱分析成功地为基础研究中的基因表达研究提供了有价值的数据。并且所述技术已在制药工业和临床诊断中得到进一步应用。随着越来越多的miRNA数据的获得，以及miRNA在基因调控中重要性的证据的积累，微阵列成为高通量miRNA研究的有用技术。利用多核苷酸探针分析miRNA水平也可以各种物理形式进行。例如，微量滴定板或自动化的使用可用于促进大量测试样品的处理。

4.8.2.外来体大小的测量

在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量纯化级分中包含的外来体和/或外来体群体的大小。在一些实施方案中，外来体大小被测量为最长的可测量尺寸。一般来说，外来体最长的一般尺寸也称为其直径。

可以使用本领域已知的各种方法测量外来体的大小，例如纳米粒子跟踪分析、多角度光散射、单角度光散射、尺寸排阻色谱法、分析超速离心、场流分级分离、激光衍射、可调电阻脉冲传感或动态光散射。

可以使用动态光散射(DLS)和/或多角度光散射(MALS)测量外来体大小。使用DLS和/或MALS测量外来体大小的方法是本领域技术人员已知的，并且包括纳米粒子跟踪测定(NTA，例如，使用Malvern Nanosight NS300纳米粒子跟踪装置)。在一个具体实施方案中，使用Malvern NanoSight NS300确定外来体大小。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有由NTA(例如，使用Malvern NanosightNS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体具有由NTA(例如，使用Malvern NanosightNS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有由NTA(例如，使用Malvern NanosightNS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。

可以使用可调电阻脉冲传感(TRPS)测量外来体大小。在一个具体实施方案中，由TRPS测量的外来体大小是使用iZON qNANO Gold确定的。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体具有由TRPS(例如，iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有由TRPS(例如，使用iZONqNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。

可以使用电子显微镜测量外来体大小。在一些实施方案中，用于测量外来体大小的电子显微镜方法是透射电子显微镜。在一个具体实施方案中，用于测量外来体大小的透射电子显微镜是Tecnai^TMG2Spirit BioTWIN。使用电子显微镜测量外来体大小的方法是本领域技术人员熟知的，并且任何这样的方法都可以适用于测量外来体大小。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有由扫描电子显微镜(例如，Tecnai^TMG2SpiritBioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。

4.8.3.外来体电荷密度的测量

在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量纯化级分中包含的外来体和/或外来体群体的电荷密度。在一些实施方案中，电荷密度通过电位滴定、阴离子交换、阳离子交换、等电聚焦、ζ电位、毛细管电泳、毛细管区带电泳或凝胶电泳来测量。

4.8.4.外来体蛋白密度的测量

在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量外来体表面上的外来体蛋白密度。表面密度可以计算或表示为每单位面积的质量、每单位面积的蛋白质数量、每个外来体的分子数量或分子信号强度、蛋白质的摩尔量等。表面密度可以通过本领域已知的方法进行实验测量，例如，通过使用生物层干涉测量法(BLI)、FACS、蛋白质印迹法、荧光(例如，GFP-融合蛋白)检测法、纳米流式细胞术、ELISA、αELISA和/或通过测量蛋白质凝胶上的带进行测密术。

4.9.实施例

提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明，并且不意图限制本发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮微升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；等。

除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药学方法。此类技术在文献中有充分说明。参见例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；AL.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前版本(current addition))；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第21版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,2005)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(l992)。

4.9.1.实施例1：外来体蛋白的鉴定

4.9.1.1.外来体的集合

在9天后，从HEK293 SF细胞的高密度悬浮培养物的上清液中收集外来体。过滤上清液，并用阴离子交换色谱进行分级分离，并且用氯化钠的步长梯度洗脱。蛋白质浓度最高的峰级分含有外来体和污染细胞组分。分离峰级分，并通过超速离心在Optiprep^TM(60％碘克沙醇w/v)密度梯度上进一步分级分离。

通过在SW 32 Ti转子的38.5mL Ultra-Clear(344058)管中以133,900x g在4℃下超速离心3小时来浓缩外来体级分。将沉淀的物质重新悬浮在1mL PBS和3mL Optiprep^TM中，使最终碘克沙醇浓度达到45％。对于Optiprep^TM梯度，在SW 41 Ti转子的12mL Ultra-Clear(344059)管中，用4mL含有重悬物质的45％碘克沙醇、3mL30％碘克沙醇、2mL 22.5％碘克沙醇、2mL 17.5％碘克沙醇和1mL PBS制备4层无菌梯度。将Optiprep^TM梯度在4℃下以150,000x g超速离心16小时，以分离外来体级分。超速离心产生已知含有外来体的顶部级分、含有中等密度细胞碎片的中间级分以及含有高密度聚集体和细胞碎片的底部级分(图1)。然后从管顶部约3mL处轻轻收集外来体层。

将外来体级分在38.5mL Ultra-Clear(344058)管中的约32mL PBS内稀释，并在4℃下以133,900x g超速离心3小时，以沉淀纯化的外来体。然后将沉淀的外来体重新悬浮在最小体积的PBS(约200μL)中，并在4℃下储存。

4.9.1.2.用于LC-MS/MS分析的样品制备

为了测定特异于外来体的蛋白质，通过液相色谱-串联质谱法分析Optiprep^TM梯度的顶部级分和底部级分。所有样品均在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液或PBS和5％蔗糖中接收。在分析之前，通过二辛可宁酸(BCA)测定法测定每个样品的总蛋白质浓度，之后在PBS缓冲液中将每个样品适当稀释至125μg/mL。接下来，将50.0μL每个样品加入到含有等体积外来体裂解缓冲液(60mM Tris、400mM GdmCl、100mM EDTA、20mM TCEP、1.0％ Triton X-100)的单独1.5mL微量离心管中，随后转移2.0μL 1.0％ Triton X-100溶液。然后将所有样品在55℃下孵育60分钟。

通过在-20℃下加入1250μL乙醇进行蛋白质沉淀。为了提高效率，将样品剧烈涡旋大约10分钟，并且然后在-20℃下孵育60分钟。在孵育后，将样品在水浴中超声处理5分钟。通过在4℃下以15,000g离心5分钟来沉淀沉淀的物质。倾析上清液，并使用氮气彻底干燥沉淀的物质。将沉淀重悬于30.0μL消化缓冲液(30mM Tris、1.0MGdmCl、100mM EDTA、50mMTCEP、pH 8.5)中，这也减少了二硫键。通过加入5.0μL烷基化溶液(375mM碘乙酰胺，50mMTris，pH8.5)并在室温下在黑暗中孵育所得溶液至少30分钟来烷基化游离半胱氨酸残基。

在孵育后，使用30.0μL 50mM Tris pH 8.5稀释每个样品，并且通过加入2.0μg胰蛋白酶开始蛋白水解消化。将所有样品混合，并且然后在37℃下孵育过夜。在孵育后，通过加入5.0μL 10％甲酸停止胰蛋白酶活性。在通过LC-MS/MS分析之前，使用Pierce C18旋转柱对每个样品进行脱盐。在该过程结束时，将每个样品干燥并在50.0μL水中用0.1％甲酸复溶，并且转移到HPLC小瓶进行分析。

4.9.1.3.LC-MS/MS分析

将样品注入UltiMate 3000RSCLnano(Thermo Fisher Scientific)低流量色谱系统中，并且将胰蛋白酶肽以1.000μL/min的流速使用负载流动相(MPL:水，0.1％甲酸)装载到Acclaim PepMap 100C18捕集柱(75μm x 2cm，3μm粒度，孔径，Thermo FisherScientific)上。以300nL/min的流速通过EASY-Spray C18分析柱(75μm x 25cm，2μm粒度，孔径，Thermo Fisher Scientific)，将肽用流动相A(MPA:水，0.1％甲酸)和流动相B(MPB:乙腈，0.1％甲酸)梯度洗脱和分离。用于洗脱的逐步梯度从2％ MPB开始，其中将其在装载过程中保持8分钟。然后MPB的百分比在35分钟内从2％增加到17％，在45分钟内又从17％增加到25％，并且最后在10分钟内从25％增加到40％。通过在5分钟内增加到98％MPB，然后在那里保持10分钟，去除最疏水的物质。所述方法的总运行时间为135分钟，并允许有足够的时间进行柱再平衡。在不同的分析注射之间进行洗涤循环，以最大限度地减少残留。

用Q Exactive Basic(Thermo Fisher Scientific)质谱仪进行质量分析。以70,000的分辨率在400-1600Da的m/z范围内测量前体离子质谱。使用27的碰撞能量选择10个最强的前体离子并在HCD池中将其片段化，并且以35,000的分辨率在200-2000Da的m/z范围内测量MS/MS谱。选择电荷状态为2-4的离子进行片段化，并将动态排除时间设置为30秒。将含有14种常见聚硅氧烷的排除列表用于最大限度地减少已知污染物的错误识别。

4.9.1.4.数据处理

首先使用Proteome Discoverer软件(2.1.1.21版，Thermo Fisher Scientific)和Sequest HT算法结合Target Decoy PSM验证器对蛋白质进行鉴定和定量(无标签)。搜索针对完整的Swiss-Prot智人(分类9606版本2017-05-10:42,153个条目)参考数据库，以及含有E1a蛋白的自定义Uniprot数据库(7个条目)进行。使用以下搜索参数：酶、胰蛋白酶；最多2处缺失切割；6个残基的最小肽长度；10ppm前驱体质量公差；和0.02Da片段质量公差。搜索还包括特定的动态修改(M的氧化；N或Q的脱酰胺；S、T或Y的磷酸化；肽末端E的焦谷氨酸化；以及蛋白质N末端的乙酰化)和静态修饰(C的脲甲基化)。

在Target Decoy PSM验证器中，最大δCn以及严格和宽松的目标错误发现率(FDR)都被设置为1，因为使用Scaffold软件(版本4.8.2，Proteome Software Inc.)再次搜索数据。在Scaffold中，也使用X！串联开源算法搜索数据，以使用99.0％的蛋白质阈值、最少2个肽和95％的肽阈值来鉴定蛋白质。

为了确定新的外来体特异性蛋白质的身份，对Optiprep^TM梯度顶部外来体级分相对于较低级分中发现的蛋白质进行了总肽谱匹配(PSM)比较。如图2所示，顶部级分蛋白质(Y轴)和底部级分蛋白质(X轴)之间的相关性很弱。虚线上方绘制的蛋白质代表外来体-富集的蛋白质，而虚线下方的那些代表污染物-富集的蛋白质。重要的是，已鉴定出许多在外来体级分中高度富集的膜相关蛋白，包括(1)前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)，(2)巴斯金(BSG)，(3)免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)，(4)免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)，(5)整合素β-1(ITGB1)，(6)整合素α-4(ITGA4)；(7)4F2细胞表面抗原重链(SLC3A 2)；和(8)一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)。如图3-5中胰蛋白酶肽覆盖图所示，质谱研究导致PTGFRN(图3)、IGSF8(图4)和巴斯金(图5)的广泛覆盖。总之，这些结果表明，存在许多在纯化外来体群体中富集的跨膜蛋白，它们可以用于从异质群体中纯化外来体或用作产生工程化外来体的支架。

4.9.2.实施例2：表面蛋白表达的验证

为了证实质谱研究中鉴定的外来体特异性蛋白质在外来体表面上高度富集，对来自HEK293细胞的总细胞裂解物和纯化的外来体群体进行了蛋白质印迹。如图6A所示，总蛋白质模式在总细胞裂解物(左)与外来体裂解物(右)之间有很大差异。具体地，在外来体裂解物中存在一个在约110kDa处的强带，而在总细胞裂解物中没有。PTGFRN的蛋白质印迹显示在外来体裂解物中有一个预期大小为约110kDa的带，但在细胞裂解物中没有(图6B)，这表明PTGFRN在外来体中高度富集，并且在总外来体裂解物中可以视觉检测到。

质谱研究表明存在几种新的外来体相关膜蛋白。为了进一步证实这种关联，在自形成Optiprep^TM梯度上纯化外来体级分，并通过蛋白质印迹分析。如图7A所示，在梯度的所有级分中都检测到总蛋白，并且外来体标记蛋白Alix和Syntenin在级分2-6中富集。重要的是，所分析的每种新的表面标记蛋白都富集在这些相同的级分中，这表明它们与外来体有很强的特异性关联(图7B)。这些跨膜蛋白质在外来体上高度表达和富集的证明提供了通过使用针对这些蛋白质中任一种的结合剂纯化外来体的机会，以及产生含有与这些新蛋白质中任一种融合的异源蛋白质的高表达表面修饰的外来体的机会(图8)。

4.9.3.实施例3：PTGFRN的结构域表征

PTGFRN、BSG、IGSF3和IGSF8都是I型单程跨膜蛋白质，其N-末端面向细胞外/囊泡外环境，并且C-末端位于细胞质/细胞外腔内，并含有至少两个免疫球蛋白V(IgV)重复序列，如图8所示。PTGFRN是质谱分析中检测到的最高富集的表面蛋白，如图2所示。编码图9A和9B中描述的GFP与全长PTGFRN或PTGFRN的各种IgV截短突变体之间的融合蛋白的表达构建体在HEK293细胞中稳定地表达。使用实施例1中描述的方法从HEK293细胞培养物中分离外来体，并使用抗GFP抗体通过蛋白质印迹分析。如图9B所示，在纯化的外来体中检测到GFP与全长或截短的PTGFRN之间融合蛋白的表达。有趣的是，第一个IgV结构域的缺失导致了较低的分子量带(标记为“切割的产物”)，而全长蛋白的过表达检测不到所述带。这种较小的产物在所有截短突变体中都被一致检测到，从而表明它是蛋白酶切割的结果。将含有各种GFP-PTGFRN融合蛋白的外来体在SDS-PAGETGX Stain-Free Gel(Bio-Rad公司)上进行分析，以测量总外来体蛋白。将结果提供于图10中。GFP与全长PTGFRN融合蛋白的表达很容易检测到并且非常丰富，在纯化的外来体中的水平高达总蛋白的约50％(泳道2)。较低分子量的切割产物(标记为“切割的产物”)是不清晰可见的，并且因此在天然外来体或过表达全长PTGFRN的外来体中不存在(泳道1和2)，这表明蛋白质N-末端处的第一个IgV结构域(IgV 1)可以阻止PTGFRN的切割。

然后全长PTGFRN和各种截短的PTGFRN突变体在HEK293细胞中稳定地表达为具有N-末端FLAG标签(图11A)。收集来自细胞培养物的外来体，并用抗FLAG抗体通过蛋白质印迹进行分析。将结果提供于图11B中。与在其C-末端含有GFP的融合蛋白相反(图9和10)，在N-末端含有FLAG标签的融合蛋白不产生低分子量带(在图11B中标记为“无切割产物”)，并且以低水平检测到较短的截短。该结果表明切割事件很可能去除了与蛋白质印迹所用的FLAG表位相连的蛋白质的N-末端(图11B)。

在细胞裂解物中较不能检测到PTGFRN，并且在纯化的外来体中检测到完整的和切割的PTGFRN的混合物，如图6A和B中提供的蛋白质印迹结果所表明。这表明PTGFRN在被定位和整合在外来体膜中或在外来体形成过程中被切割。ADAM10(去整合素和金属蛋白酶结构域10)是一种常规的外来体蛋白和一种膜相关的金属蛋白酶。用Cas9和四种靶向ADAM10基因座的引导RNA(CRISPR32174_SG、CRISPR726928_SG、CRISPR726931_SG和CRISPR726933_SG，Thermo Fisher Scientific)转染HEK293细胞以产生ADAM10敲除细胞。然后用编码含有与GFP融合的全长PTGFRN的融合蛋白或含有缺乏与GFP融合的前三个IgV结构域的截短PTGFRN(PTGFRN_IgV3-GFP)的不同融合蛋白的构建体稳定地转染ADAM10敲除细胞(ADAM10-)或野生型细胞(ADAM10+)。从这些细胞分离外来体，并使用抗GFP抗体通过总蛋白PAGE和蛋白质印迹来测量融合蛋白的表达。图12A显示在每条泳道上装载了相当数量的总蛋白质。使用抗ADAM10抗体(ab124695；Abcam)的蛋白质印迹显示敲除细胞中ADAM 10的有效缺失(图12B)。如图12C(泳道1和2)所提供，使用抗GFP抗体的蛋白质印迹显示在野生型(ADAM10+)和ADAM10敲除细胞(ADAM10-)两者中含有全长PTGFRN和GFP的融合蛋白的高水平表达。该结果与图9B中的结果一致，其中未检测到含有全长PTGFRN的融合蛋白的切割。有趣的是，先前检测到的PTGFRN_IgV3-GFP切割产物在野生型细胞中检测到，但在ADAM10敲除细胞中不存在(图12C，泳道3和4)。这表明ADAM10介导外来体PTGFRN片段的切割。该结果还表明，含有截短PTGFRN片段的融合蛋白在来自缺乏ADAM10(ADAM10-)的细胞的外来体上更能成功地表达。

PTGFRN可以用作高密度外来体修饰/装载的有吸引力的融合配偶体，但由于其大小(约100kDa)，更小的截短版本将是优选的，以允许大的生物活性分子的共表达。在每种IgV截短突变体中检测到的ADAM10依赖性切割对高密度装载来说是一个问题，因为任何融合蛋白的一定百分比将从外来体表来面切割，从而降低装载/展示的程度。为了鉴定促进高密度外来体表面展示而不遭受蛋白酶切割的最小PTGFRN片段，将缺少六个IgV结构域(PTGFRN_IgV6)中的五个的PTGFRN表达为与FLAG标签和融合配偶体蛋白的融合(图13)。含有PTGFRN_IgV6的融合蛋白的表达产生了先前鉴定的预测切割产物(图14B，#451)。还测试了一次缺少四个额外氨基酸的PTGFRN_IgV6的系列截短突变体，并且除去12个氨基酸产生了不经历PTGFRN切割的外来体(图14A，图14B，#454)。PTGFRN#454是SEQ ID NO:33的多肽。另外，因为FLAG标签位于切割位点的N-末端，所以PTGFRN_IgV6的较短截短导致融合蛋白的较高表达，从而表明这些截短不会发生切割(图14C)。

图15中提供的结果进一步表明，全长PTGFRN(FL)和PTGFRN_454(sIgV)将是外来体上和/或外来体中高密度表达内腔蛋白(C-末端融合)或表面蛋白(N-末端)的理想融合配偶体。为了验证这一假设，测试了几种支架蛋白产生高密度展示外来体的能力。包含支架蛋白和GFP的融合蛋白在细胞培养物中表达，特别是含有GFP的融合蛋白，所述GFP融合到常用的pDisplay支架(PDGF受体)、PalmPalm(棕榈酰化序列)、CD81或者全长PTGFRN(FL)或PTGFRN_454(sIgV)内腔侧。从稳定表达每种融合蛋白的细胞中纯化的外来体的剂量滴定表明，PTGFRN融合蛋白比任何其他支架，包括熟知的外来体蛋白CD81，产生大得多的GFP荧光。与pDisplay支架相比，全长PTGFRN和sIgV导致装载效率提高了>25倍(图15)。这些结果表明，使用全长PTGFRN或截短的PTGFRN(sIgV)(其足够短以除去切割位点)作为融合配偶体允许高密度展示或外来体装载。

4.9.4.实施例4：IGSF8过表达不会导致高密度外来体展示

PTGFRN的表达水平表明它将是用于产生经工程化的外来体的理想融合配偶体。为了确定含免疫球蛋白的蛋白质家族的其他成员是否适用于外来体工程化，用IGFS8-GFP融合蛋白稳定地转染HEK293细胞，并纯化所得外来体(图16A)。如图16B所提供，将天然外来体和IGSF8-GFP外来体在使用色氨酸结合染料来检测蛋白质的SDS-PAGETGX Stain-Free Gel(Bio-Rad,Inc.)上进行分析。IGSF8含有10个色氨酸残基，使其易于检测。使用抗GFP抗体的蛋白质印迹证实了IGSF8-GFP在过表达的外来体上的表达(图16B，底部)。有趣的是，当IGSF8-GFP外来体与至pDisplay支架(PDGF受体)、CD81或全长PTGFRN(FL)或PTGFRN_454(sIgV)的GFP融合物相比进行GFP荧光测试时，IGSF8(FL IGSF8)未能显示出用pDisplay观察到的超过低水平随机展示的GFP富集(图17)。该结果表明，并非每个IgV家族成员都可以作为融合蛋白用于工程化高密度外来体表面展示/腔内装载，并且PTGFRN和其他家族成员在这方面优于IGSF8。然而，在未修饰的外来体表面上检测到高水平的IGSF8表达，这将允许IGSF8用作外来体亲和纯化的靶标。

4.9.5.实施例5：PTGFRN细胞外结构域在哺乳动物细胞中的表达和表征

PTGFRN的胞细外结构域(ECD)为98kDa，并且含有六个串联的IgV重复序列。PTGFRN的ECD由于其大小和高表达水平，可能是外来体亲和纯化试剂的理想靶标。为了表征PTGFRN的这一区段，PTGFRN ECD被表达为一种融合蛋白，其内源信号肽位在N-末端处(SP)，并且PAR1切割位点和Fc结构域在C-末端处(图18)。PAR1是凝血酶的底物，并且可以用于使用蛋白A树脂洗脱Fc融合蛋白。PTGFRN具有9个预测的N-连接糖基化位点和6个预测的二硫键，这排除了使用细菌表达系统产生内源性糖蛋白。使用用于产生高产哺乳动物重组蛋白的Expi293表达系统(Thermo Fisher Scientific)过表达PTGFRN ECD。将来自转染的Expi293细胞的条件细胞培养基进行0.2μm过滤并在蛋白A上纯化，随后进行低pH甘氨酸洗脱和立即中和。用凝血酶处理除去Fc标签，并使切割的蛋白质汇集物在蛋白A上重新运行。收集流通液，浓缩，并在制备型SEC上抛光。使用Superdex 200柱(GE Healthcare)通过凝胶过滤色谱在PBS pH 7.4中分析经纯化的PTGFRN ECD，并在280nm UV荧光下检测。图19A显示了约55mL处的单个洗脱峰，并且图19B显示了当洗脱峰在变性SDS-PAGETGXStain-Free Gel(Bio-Rad,Inc.)上分析时，预测的PTGFRN ECD大小处的单个蛋白质产物，表明PTGFRN ECD可以从哺乳动物细胞中纯化。

为了证实PTGFRN ECD的正确表达，使用BSA和抗VLA4抗体作为比较标准，通过尺寸排阻色谱/多角度光散射(SEC-MALS)分析纯化的蛋白质。重组PTGFRN ECD以其预测分子量的约2倍洗脱(198kDa，而预测分子量为98kDa；图20A)。为了确定PTGFRN ECD在溶液中是否形成同二聚体，在不存在氯化胍(GuHCl)或存在1M或2M氯化胍(GuHCl)的情况下，使重组PTGFRN ECD在PBS中的分析性SEC柱(Tosoh，7.8x30cm，G3000SW xl)上运行。图20B示出了在增加的GuHCl(无GuHCl(曲线标记为“PTGFRN”)、1M GuHCl(曲线标记为“PTGFRN+1M GuHCl”)或2M GuHCl(曲线标记为“PTGFRN+2M GuHCl”))下的PTGFRN ECD洗脱曲线，以及预测的二聚峰向单体峰的转化。这些结果表明PTGFRN ECD形成同二聚体，并且PTGFRN二聚化可能自然地发生在外来体表面上。

4.9.6.实施例6：PTGFRN蛋白阵列

PTGFRN在文献中的表征很差，并且其作为外来体蛋白的作用在很大程度上尚未被探索。PTGFRN也称为CD9配偶体1(CD9P-1)，因为它与也存在于外来体表面上的CD9相互作用。为了进一步了解PTGFRN与哪些蛋白质结合，产生了重组单生物素化的人PTGFRN ECD，并在含有超过20,000种蛋白质的蛋白质微阵列上进行了探测，所述蛋白质涵盖81％的人蛋白质组(CDI Laboratories)。在pH 5.6和7.4下进行结合分析，以分别代表酸化内体和胞质溶胶的pH。在pH 7.4下鉴定出9个阳性命中，并且在pH 5.6下鉴定出16个。在pH 5.6和pH 7.4下鉴定三种蛋白质(LGALS1，半乳糖凝集素-1；FCN1，纤维胶凝蛋白-1；MGAT4B，α-1,3-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶B)(图21)。已知LGALS1与单体碳水化合物和复合多糖结合，但并不认为是PTGFRN结合配偶体。为了证实PTGFRN与LGALS1之间的相互作用，将生物素化的重组PTGFRN ECD结合到链霉亲和素光学探针，并使用RED96(Pall)通过生物层干涉术(BLI)进行分析。通过BLI证实半乳糖凝集素-1与PTGFRN的剂量依赖性结合(图22)。LGALS1与PTGFRN之间的相互作用是可逆的，并且由乳糖以剂量依赖的方式竞争(图23)，证明了这种相互作用的特异性。这些结果还表明，可以通过使用PTGFRN结合配偶体作为亲和试剂来纯化外来体。

4.9.7.实施例7：抗PTGFRN抗体与PTGFRN或外来体的结合

将生物素化的PTGFRN与RED96(Pall)的链霉亲和素探针结合，并在PBS+0.1％ Tween 20中与增加浓度的抗CD315(PTGFRN的别名(MABT883，Millipore Sigma))单克隆大鼠抗体一起孵育。检测到剂量依赖性结合，从而表明抗体特异性识别PTGFRN(图24)。为了确定抗CD315抗体是否能与外来体结合，将抗CD315抗体与蛋白L探针结合，并与增加量的Optiprep^TM纯化的HEK293外来体一起孵育(图25)。如图25所示，与纯化的外来体孵育后的剂量依赖性偏转表明抗CD315抗体可以识别外来体表面上的内源性PTGFRN。用通过全长PTGFRN稳定地转染的HEK293细胞进行类似实验，以产生PTGFRN过表达的外来体(PTGFRN++外来体)。将过表达的外来体与固定的抗CD315抗体一起孵育，并导致剂量依赖性偏转，这表明抗体与外来体之间的特异性结合(图26)。为了比较抗体与天然或PTGFRN过表达外来体的结合程度，在抗CD315抗体存在下孵育每个品种的1.1E11外来体，并通过BLI测量。如图27所示，PTGFRN过表达外来体导致比天然外来体大得多的偏转，这表明PTGFRN水平的增加导致更大的结合，并且因此PTGFRN结合可以用于外来体纯化。

4.9.8.实施例8：由抗PTGFRN抗体进行的结构域识别

实施例6和7中的结果表明，可以基于与PTGFRN的亲和相互作用来纯化外来体。使用上述Expi293系统将全长PTGFRN和一系列截短突变体表达为单生物素化重组蛋白(图28，左侧)。将每一种截短与抗CD315抗体一起孵育，并通过BLI测量结合。仅全长PTGFRN结合抗CD315抗体，表明所述表位在第一个IgV结构域中蛋白质的N-末端处。

通过给兔子注射与图28中的构建体1相似但缺乏生物素化序列的PTGFRN重组全长外结构域产生多克隆抗体汇集物。用蛋白A从末端血液中纯化多克隆抗体汇集物，并测试其对PTGFRN截短片段的反应性。将每个片段都在变性SDS-PAGE TGXStain-Free Gel(Bio-Rad,Inc.)上进行分析确认正确长度蛋白质的表达(图29A)。然后使用汇集的多克隆兔抗体对样品进行蛋白质印迹，并在每个泳道以及对照天然外来体中检测到正确大小的带，确认与多克隆PTGFRN抗体的特异性反应性(图29B)。为了证实该结果，通过BLI分析了每个生物素化的PTGFRN片段，并且结果如图30所提供。与多克隆抗体汇集物一起孵育显示出在所有条件下的结合，表明与PTGFRN的每个IgV结构域的抗体的广泛反应性。

4.9.9.实施例9：来自不同细胞系的外来体表达IgV家族成员和其他新的表面蛋白

使不同来源组织的细胞系(HEK293SF，肾；HT1080，结缔组织；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳腺；Raji，淋巴母细胞)生长至对数期，并转移至补充有外来体耗竭血清的培养基中约6天。使骨髓源性间充质干细胞(MSC)在3D微载体上生长5天，并在无血清培养基中补充3天。分离上清液，并使用上述Optiprep^TM密度梯度超速离心法纯化外来体。如上所述，通过LC-MS/MS分析每个纯化的外来体，对几种外来体表面蛋白(PTGFRN、IGSF8、IGSF3、BSG、SLC3A2、ITGB1、CD81和CD9)的肽谱匹配(PSM)数进行定量，并且结果提供在图31中。在大多数纯化的外来体群体中，可检测到四次跨膜蛋白CD81和CD9，但在一些情况下，它们等于或低于其他表面标记物(例如，在所有细胞系中将CD9与PTGFRN、BSG和SLC3A2进行比较)。这一发现表明，新鉴定的表面标记物，包括IgV蛋白家族成员，是用于开发源自不同组织的几种不相关细胞系的外来体亲和纯化方法的合适靶标。

4.9.10.实施例10：PTGFRN敲除细胞和外来体的产生

为了产生PTGFRN敲除细胞，用重组Cas9和靶向PTGFRN外显子2和跨膜区的引导RNA转染HEK293SF细胞。由ThermoFisher产生的靶向外显子2的引导RNA包括：(1)CGTTGGCAGTCCGCCTTAAC，CRISPR926045_CR(SEQ ID NO:36)；(2)CATAGTCACTGACGTTGCAG，CRISPR926054_CR(SEQ ID NO:37)；(3)TTGTGGAGCTTGCAAGCACC，CRISPR926055_CR(SEQ IDNO:38)；和(4)GTTCTTTATGTGGAGCTCCA，CRISPR926071_CR(SEQ ID NO:39)。由ThermoFisher产生的靶向跨膜区的引导RNA包括(1)TATCCCTTGCTGATCGGCGT，TMgRNA5.1.97(SEQ ID NO:40)；(2)GCTGCAGTACCCGATGAGAC，TMgRNA3.7.87(SEQ ID NO:41)。

通过PCR和测序证实了PTGFRN外显子2和跨膜区的靶向基因编辑和缺失。如上所述纯化来自五个克隆PTGFRN敲除(PTGFRN KO)细胞系的外来体，并使用实施例8中描述的多克隆兔抗体汇集物通过PAGE和蛋白质印迹进行分析。如图32B所示，在五个敲除克隆中的任一个中都没有检测到对应于PTGFRN的带，这表明在产生细胞和经纯化的外来体中PTGFRN被靶向缺失。重要的是，外来体产生产量和整体蛋白带模式(图32A)不受PTGFRN缺失的影响，从而表明PTGFRN KO外来体可以用于实验目的。

为了确定PTGFRN缺失是否改变了经纯化的外来体的蛋白质组谱，通过比较质谱分析了天然外来体和PTGFRN KO外来体。如图33所示，天然和PTGFRN KO外来体的蛋白质含量非常相似，其中唯一的例外是PTGFRN，其在PTGFRN KO外来体中是检测不到的。组之间的外来体标记物Alix、CD81、TSG101和CD9无显著差异。这些数据表明PTGFRN可以从外来体中去除，而不会改变外来体的蛋白质组谱。

为了验证PTGFRN缺失导致PTGFRN的完全功能性去除，并证明实施例7中描述的抗PTGFRN(抗CD315)抗体对PTGFRN有特异性，使用BLI对天然外来体、过表达PTGFRN的外来体(PTGFRN++)和PTGFRN KO外来体进行了外来体结合实验。类似于图27和实施例7中描述的实验结果，PTGFRN++外来体以比天然外来体更大的亲和力结合到固定化的抗CD315抗体(图34)。相反，相同数量的PTGFRN KO外来体未能结合到固定化抗体(图34)，表明PTGFRN缺失破坏了PTGFRN KO外来体与抗PTGFRN亲和试剂的相互作用。

4.9.11.实施例11：外来体可以用识别PTGFRN的亲和试剂纯化

如实施例8所述，从免疫的兔子产生抗PTGFRN的定制单克隆抗体。为了确定是否可以通过拉PTGFRN分离外来体，将5x10¹⁰个天然或PTGFRN KO外来体加入到磁性蛋白A珠(目录号10001D；Invitrogen)或用10μg定制的抗PTGFRN单克隆抗体功能化的蛋白A珠中。将每个外来体-珠混合物在室温下孵育30分钟，并用PBS+0.1％v/v20洗涤三次。通过在洗脱缓冲液(20mM甘氨酸pH 3.6，2x Laemmli样品缓冲液(目录号1610737，Bio-Rad,Inc.)，10％β-巯基乙醇)中于95℃下孵育10分钟洗脱洗涤的珠子，并且通过PAGE和抗PTGFRN蛋白印迹(使用不同的定制抗PTGFRN单克隆抗体)分析煮沸的上清液。通过PAGE分析的总蛋白仅在抗PTGFRN抗体存在的天然外来体条件下显示对应于PTGFRN分子量的带(图35A)。通过蛋白质印迹证实该带为PTGFRN(图35B)。HC和LC分别对应于用于纯化的抗PTGFRN抗体的重链和轻链。这些数据表明，含PTGFRN的外来体可以通过在外来体表面上拉PTGFRN而从溶液中纯化出来。

4.9.12.实施例12：不同的异源蛋白质可以融合到PTGFRN，以促进外来体上的过表达

图11、13、14和15中提供的实验数据表明，通过使用PTGFRN作为过表达支架，几种蛋白质可以显著地过表达。使用PTGFRN的过表达明显优于使用其他外来体过表达支架的表达。为了确定通过与PTGFRN融合可以成功地过表达的蛋白质的宽度，产生了几种工程化外来体。因子VIII(FVIII)是一种参与凝血级联的大酶。将缺乏B结构域的FVIII片段(BDDFVIII)融合到PTGFRN的N-末端(面向外的一侧)，并在HEK293SF细胞中表达。通过PAGE(图36A)和蛋白质印迹(图36B)分析纯化的外来体。通过在细胞培养物中加工全长FVIII而产生的FVIII轻链在工程化外来体中容易检测到，但在使用抗FVIII抗体(图36B；目录号GMA-8025，Green Mountain Antibodies)的天然外来体中检测不到。全长FVIII的分子量为165kDa，其明显大于PTGFRN的分子量(约120kDa)，表明非常大的蛋白质，包括酶，可以在外来体表面上成功地表达为PTGFRN融合体。

上述PTGFRN融合配偶体都是具有有序三维结构的蛋白质。肽(Amunix；Mountain View，CA)具有长的、无序的、重复的序列，其中与它们的一级序列相比，表观分子量显著增加。编码XTEN(一种包含随机化288个氨基酸的蛋白质，其包括8％ Ala、12％Glu、18％ Gly、17％ Pro、28％ Ser和17％ Thr)、PTGFRN片段(SEQ ID NO:33)和GFP的融合构建体在HEK293SF细胞中稳定地表达。通过PAGE(图37A)和蛋白质印迹(图37B)分离和分析经纯化的外来体。如图37B所示，通过蛋白质印迹检测融合蛋白的C-末端GFP，从而证明融合蛋白在纯化的外来体上的框架内翻译。这些结果表明，非结构蛋白也可以稳定地表达为PTGFRN的融合体。此外，这些结果表明异源蛋白质可以同时地融合到PTGFRN的N-和C-末端，并导致完整的蛋白质分别展示在外来体表面和腔上。因此，PTGFRN是一种稳健的支架，可用于蛋白质融合，其大小为从几个氨基酸(例如FLAG标签)到N-或C-末端中的一个或两个上的超过150kDa(BDDFVIII)的不同结构和类别。

4.9.13.实施例13：PTGFRN序列比其他外来体过表达系统更擅长在外来体上表达异源蛋白

实施例3和图15中的数据表明，PTGFRN在大量外来体群体中表达异源蛋白质方面优于其他外来体支架。然而，这些结果不能区分外来体子集表达增加和纯化群体中所有外来体中表达均匀增加。出于开发一致的外来体治疗的目的，优选具有表达一致增加的同质外来体群体，而不是异质外来体群体，包括高度过表达的外来体和未修饰的外来体。为了解决这个问题，我们使用Flow NanoAnalyzer(NanoFCM公司；Xiamen，China)通过纳米流式细胞术逐个颗粒地表征外来体群体中的单个外来体。Flow NanoAnalyzer可以测量直径小至10nm的单个纳米粒子的光散射和荧光发射。从稳定转染的HEK293SF细胞中分离编码至CD9、CD81或PTGFRN的腔GFP融合物的天然外来体和修饰的外来体，并通过如上所述的密度梯度超速离心纯化。通过设置为激发488/发射509的Flow NanoAnalyzer进行的分析表明，在逐个颗粒分析中，对于GFP表达，CD9-GFP外来体的阳性率为约48％，CD81-GFP外来体的阳性率为约80％，并且PTGFRN-GFP外来体的阳性率为约97％(图38，左侧)。此外，平均荧光强度(MFI)遵循类似的趋势，其中PTGFRN-GFP外来体比CD81-GFP外来体整体亮约2倍(图38，右侧)。这些数据表明，被修饰以表达PTGFRN-GFP融合蛋白的外来体是高度表达融合蛋白的同质外来体群体，并且总体表达水平远高于表达融合到其他外来体支架的GFP的天然或其他修饰的外来体。

PTGFRN的N-末端由预测的信号肽序列(氨基酸1-21；SEQ ID NO:8)组成。为了确定该序列是否可以增强转基因在纯化的外来体上的表达，将PTGFRN信号肽与异源蛋白DsbA11的信号肽进行了比较。用编码以下的表达构建体稳定地转染HEK293SF细胞：(i)与GFP融合的全长野生型PTGFRN；(ii)PTGFRN的短片段(454-PTGFRN；SEQ ID NO:33)，其含有与GFP融合的内源性PTGFRN信号肽；或(iii)PTGFRN的短片段(454-PTGFRN；SEQ ID NO:33)，其内源性PTGFRN信号肽被来自细菌基因DsbA11的信号肽替代(Koerber等人，Journal ofmolecular biology,427.2(2015):576-586)，融合到GFP。如图39所示，表达含有全长或截短的含有内源性PTGFRN信号肽的PTGFRN-GFP的GFP融合蛋白的细胞以相似高水平产生包括GFP的外来体。然而，表达含有截短的PTGFRN和DsbA11信号肽的GFP融合蛋白的细胞以低得多水平产生表达GFP的外来体。这些结果表明PTGFRN信号肽促进了工程化外来体的高密度修饰。

4.9.14.实施例14：使用PTGFRN作为支架，抗体片段可以在外来体表面上功能性地表达

上述实验数据表明，PTGFRN是一种易于多种蛋白质过表达的稳健支架。抗体和抗体的抗原结合片段是一类重要的治疗性肽，其在许多疾病的治疗中具有不同的应用。为了确定功能性抗原结合片段是否可以使用PTGFRN作为支架在外来体上表达，稳定地转染HEK29SF细胞，以过表达由识别凝集素CLEC9A的单链Fab(克隆10B4，Millipore Sigma，目录号04-148；并且如Caminschi等人,Blood,112:8(2008)所述)、全长PTGFRN、GFP和FLAG标签组成的融合蛋白(图40A)。使Optiprep^TM纯化的外来体在无染色蛋白凝胶上运行，并用抗FLAG标签的抗体印迹，显示全长融合蛋白显著过表达(图40B)。

通过BLI测试了纯化的抗CLEC9A外来体结合至固定化CLEC9A-Fc(R&D系统，目录号6049-CL-050；并且如Uto等人,Nature Communications 7:11273(2016)所述)。将CLEC9A-Fc在PBS+0.1％(v/v)Tween 20中以0.5μg/ml的最终浓度与蛋白A探针结合，并与1x10¹¹个未修饰的外来体或被修饰以表达融合蛋白的外来体一起孵育，所述融合蛋白由识别凝集素CLEC9A的单链Fab、全长PTGFRN、GFP和FLAG标签(“αCLEC9A-PTGFRN”)组成，如图40A所示。如图41所示，仅抗CLEC9A-PTGFRN外来体结合到CLEC9A-Fc探针，从而证明了细胞表面标记物与被工程化以过表达抗原结合片段的外来体之间的功能识别。

4.9.15.实施例15：间充质干细胞表达PTGFRN

来自几种细胞类型的治疗性外来体已经用于研究和临床目的。几个品种的干细胞(包括神经前体干细胞和间充质干细胞)已被证明具有治疗益处，但大多数使用这些细胞的研究依赖于天然的、未修饰的外来体。因此，期望工程化这些细胞系以过表达特异性配体或其他靶蛋白。使骨髓来源的间充质干细胞在基于1.1L微载体的3D生物反应器系统中生长。在细胞扩增五天后，丢弃生长培养基，并且将细胞在无血清培养基中再培养三天。将无血清培养基通过100μm过滤器过滤以除去微载体，并以低速离心以除去细胞碎片和污染物。然后如实施例1所述，通过Optiprep^TM密度梯度超速离心纯化澄清的培养基。通过蛋白质印迹分析了来自HEK293SF细胞和MSC的纯化外来体的PTGFRN，以及已建立的外来体蛋白ALIX、TSG101、CD63、CD9和CD81。如图42所示，所有这些蛋白质都在HEK293SF细胞和MSC两者中表达，这表明外来体蛋白，例如PTGFRN，可以用作产生表面工程化MSC外来体的支架。

4.9.16.实施例16：PTGFRN可以在来自非人细胞的外来体上过表达

实施例9和15中的结果证明，许多人来源的细胞天然地表达PTGFRN和实施例1中鉴定的其他新的外来体蛋白。为了确定PTGFRN是否可以用作通用的外来体支架蛋白，用表达与PTAG标签融合的全长PTGFRN的质粒(“PTGFRN-FLAG质粒”)稳定地转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。使用实施例1中描述的方法从野生型HEK293SF细胞、用PTGFRN-FLAG质粒转染的HEK293SF细胞、CHO细胞和用PTGFRN-FLAG质粒转染的CHO细胞中纯化外来体。如图43A-C所示，PTGFRN-FLAG在HEK293SF细胞和CHO细胞中均成功地过表达，如通过无染色PAGE(图43A)和使用针对PTGFRN(图43B)和FLAG(图43C)的抗体的蛋白印迹所检测。该结果表明，非人细胞(例如，CHO细胞)以及人细胞(例如，HEK细胞)可以产生过表达人PTGFRN的外来体。该结果表明PTGFRN是一种用于从许多不同的细胞类型和物质中产生工程化外来体的通用支架蛋白。

4.9.17.实施例17：与常规外来体蛋白相比，PTGFRN提供了提高的腔内货物装载

先前的实施例证明PTGFRN过表达导致外来体比常规外来体蛋白具有更大的蛋白质数量和/或活性(例如，实施例13；图15)。由于PTGFRN是一种跨膜蛋白，并且其N-末端位于外囊面上，且其C-末端位于外来体腔中，因此PTGFRN可能是一种合适的支架蛋白以用于装载载有货物蛋白的外来体的腔。为了研究这种可能性，将HEK293SF细胞工程化以稳定地表达二分报告系统，所述系统使用小分子雷帕霉素来促进蛋白质-蛋白质相互作用。将CD9(图44A)或PTGFRN(图44B)融合到GFP、FLAG标签和FKBP。还将所述细胞工程化以稳定地表达融合到V5标签和FRB的mCherry。在小分子雷帕霉素的存在下，蛋白质FRB和FKBP二聚形成稳定的复合物。因此，在雷帕霉素的存在下培养细胞可以在胞外生物发生过程中使mCherry货物蛋白与CD9或PTGFRN缔合。从这些细胞中纯化的外来体将被洗涤以除去雷帕霉素，从而允许释放出mCherry作为外来体腔中的可溶性货物。(图44A-B)。

使CD9负载报告细胞在雷帕霉素存在下生长0、1或2天。使PTGFRN负载报告细胞在雷帕霉素存在下生长5天。在不存在雷帕霉素的情况下，从细胞培养物纯化外来体，允许在外来体腔中释放货物。使纯化的外来体样品在变性聚丙烯酰胺凝胶上运行，并分析总蛋白的存在和对支架蛋白(抗FLAG)或mCherry货物(抗V5)的蛋白质印迹。与CD9样品相比，用少得多的材料将PTGFRN样品装载在聚丙烯酰胺凝胶上，但PTGFRN很容易通过FLAG蛋白质印迹检测到。在PTGFRN与CD9支架样品之间，也检测到了可比水平的货物mCherry(图45A)。当通过测密术测量支架和货物蛋白带并归一化至收集的外来体的量时，PTGFRN支架以更高的水平表达，并能够装载CD9支架蛋白中包含的多得多的mCherry货物(图45B)。这些数据表明，PTGFRN可以作为至内腔装载肽的融合蛋白表达，其表达程度比常规外来体蛋白CD9更高，并且与常规外来体蛋白相比，PTGFRN的使用导致更大的定向货物装载。这些数据表明，复杂的多部件工程化系统可以用于PTGFRN支架的环境中，并在外来体腔中产生稳健的货物装载。

4.9.18.实施例18：修饰的外来体蛋白的产生

使用编码整个外来体蛋白或截短的外来体蛋白的多核苷酸产生编码修饰的外来体蛋白的多核苷酸。通过筛选各种截短的外来体蛋白并选择具有最佳掺入外来体膜并与结合剂相互作用能力的截短的蛋白质来选择特定的截短的外来体蛋白。通过纳米流式细胞术检测截短的蛋白质对外来体膜的靶向。

通过将编码亲和标签(谷胱甘肽-S-转移酶、S-肽、FLAG标签、GFP等)的多核苷酸添加到编码完整或截短的外来体蛋白(例如PTGFRN、BSG、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2和ATP转运蛋白)的多核苷酸来产生编码修饰的外来体蛋白的多核苷酸。修饰的多核苷酸表达融合蛋白。进一步修饰所述多核苷酸，以改善其靶向外来体膜和/或其对结合剂的亲和力。

通过将编码治疗性肽(例如，抗体、酶、配体、受体、抗微生物肽、其变体或片段)的多核苷酸添加到编码完整或截短的外来体蛋白(例如PTGFRN、BSG、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2和ATP转运蛋白)的多核苷酸来产生编码修饰的外来体蛋白的不同类型的多核苷酸。修饰的多核苷酸表达于外来体表面上呈递的融合蛋白。融合蛋白保持治疗性肽的治疗活性。

通过将编码靶向部分(例如，对特定器官、组织或细胞具有特异性的靶向部分)的多核苷酸添加到编码完整或截短的外来体蛋白(例如PTGFRN、BSG、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2和ATP转运蛋白)的多核苷酸来产生编码修饰的外来体蛋白的不同类型的多核苷酸。修饰的多核苷酸表达于外来体表面上呈递的融合蛋白。融合蛋白允许外来体靶向特定的器官、组织或细胞。

修饰的外来体蛋白在外来体表面上的定位也通过纳米流式细胞术进行测试。

4.9.19.实施例19：表面工程化外来体的产生

通过引入编码外来体蛋白或外来体蛋白的变体或片段的外源序列来制备产生表面工程化外来体的生产细胞。瞬时转染编码外来体蛋白的质粒以诱导外来体蛋白在外来体表面上的高水平表达。瞬时转染编码修饰的外来体蛋白的质粒以产生在表面上具有修饰的外来体蛋白的外来体。

将编码外来体蛋白、外来体蛋白变体或片段的多核苷酸、或编码亲和标签、治疗性肽或靶向部分的外源序列稳定地转化到生产细胞中，以产生表面工程化外来体。将编码亲和标签、治疗性肽或靶向部分的外源序列插入编码外来体蛋白的基因组位点，以产生包含附着到外来体蛋白的亲和标签的融合蛋白。将编码修饰的外来体蛋白的多核苷酸敲入编码外来体蛋白的基因组位点。

通过稳定地转染至少两种多核苷酸产生生产细胞系，每种多核苷酸编码外来体蛋白、外来体蛋白的变体或片段或外源肽(例如亲和标签、靶向部分、治疗性肽)。还通过将两个或更多个外源序列(例如，编码亲和标签、标记物、靶向肽、治疗性肽等的外源序列)插入编码外来体蛋白的基因组序列内或紧邻内的多个基因组位点中，以产生包含多种修饰的外来体蛋白的表面工程化外来体，来产生不同的生产细胞系。多种修饰的外来体蛋白中的每一种都靶向外来体的表面。外来体对两种不同的结合剂具有亲和力，并被结合剂中的一种或两种纯化。

4.9.20.实施例20：通过亲和纯化分离、纯化和亚分级分离外来体

通过在温和条件下洗脱的生物淘选/定向进化开发了用于外来体亲和纯化的结合剂。

使结合剂附着到固体支撑物(例如多孔琼脂糖珠)，并形成常规色谱系统(例如GEAKTA)。将含有外来体的样品施加到柱以进行亲和纯化

5.通过引用并入

出于所有目的将本申请中引用的所有公布、专利、专利申请以及其他文献以引用的方式整体特此并入，其程度正如出于所有目的将每个单独的公布、专利、专利申请或其他文献单独地指明以便以引用的方式并入。

6.等效物

本公开尤其提供大麻素组合物和伴随组合物。本公开还提供了通过施用大麻素和伴随组合物来治疗神经退行性疾病的方法。虽然已经示出和描述了各种具体实施方案，但上述说明不是限制性的。应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种变化。在阅读本说明书之后，许多变化对于本领域技术人员而言将为显而易见的。

Claims (20)

1.一种制备包含外来体的组合物的方法，包括用编码支架蛋白的核苷酸序列转染生产细胞，其中所述支架蛋白包含前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN)、巴斯金(BSG)、免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2)、免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)、免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8)、整合素β-1(ITGB1)、ITGA4(整合素α-4)、4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2)、ATP转运蛋白，或其片段或其变体，其中产生表达所述支架蛋白的外来体。

2.根据权利要求1的方法，进一步包括分离产生的外来体。

3.根据权利要求2的方法，其中所述支架蛋白是包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体以及多肽序列的融合蛋白。

4.根据权利要求3的方法，其中所述多肽序列包含治疗蛋白、靶向部分或其任何组合。

5.根据权利要求1的方法，其中所述支架蛋白以比天然外来体中存在的支架蛋白的密度高约2倍至约1000倍的密度存在于外来体上。

6.根据权利要求1的方法，其中所述外来体还包含靶向部分。

7.根据权利要求1的方法，其中所述外来体进一步包含治疗蛋白，所述治疗蛋白包含：

(a)抗体或其抗原结合片段，

(b)酶或其功能片段，

(c)配体或其功能片段，

(d)受体或功能片段，

(e)抗微生物肽或功能片段，

(f)(a)-(e)中任一项的功能片段，或

(g)(a)-(f)的任意组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗蛋白与所述支架蛋白融合。

9.根据权利要求1的方法，其中所述外来体还包含治疗化合物。

10.根据权利要求1的方法，其中所述生产细胞包括HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或间充质干细胞(MSC)。

11.根据权利要求1的方法，其中所述组合物还包含由活细胞通过直接质膜出芽产生的囊泡。

12.通过权利要求1的方法产生的外来体。

13.一种药物组合物，其包含权利要求12所述的外来体和赋形剂。

14.一种治疗有需要的受试者中的疾病的方法，包括向所述受试者施用权利要求12的外来体。

15.一种包含支架蛋白的外来体，所述支架蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF8、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体，其中所述支架蛋白以比天然外来体中支架蛋白的密度更高的密度存在。

16.一种药物组合物，其包含权利要求15所述的外来体和赋形剂。

17.一种用于产生权利要求15所述的外来体的细胞系。

18.权利要求17的细胞系，其包含HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或间充质干细胞(MSC)。

19.一种治疗有需要的受试者中的疾病的方法，包括向所述受试者施用权利要求15的外来体。

20.权利要求15的外来体，其中所述支架蛋白的密度比天然外来体中存在的支架蛋白的密度高约32倍至约400倍。