CN116769718A

CN116769718A - 一种工程化细胞外囊泡及用途

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Publication number: CN116769718A
Application number: CN202310429909.8A
Authority: CN
Inventors: 张昊; 颜文静
Original assignee: Nanjing Yiwei Jianhua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Yiwei Jianhua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-21
Filing date: 2023-04-21
Publication date: 2023-09-19
Also published as: WO2024216978A1

Abstract

本发明提供了在细胞外囊泡，尤其是外泌体中装载生物活性物质的方法。该方法包括产生管腔工程化外泌体，其包括一个或多个浓度较高的外泌体蛋白质，外泌体蛋白质的修饰或片段，或外泌体蛋白质与治疗或货物蛋白质的融合蛋白。所述制造方法包括产生工程化外泌体，所述外泌体包含高于在野生型外泌体中观察到的高浓度蛋白、蛋白的修饰或片段或蛋白与有效载荷的融合蛋白中的一种或多种。

Description

一种工程化细胞外囊泡及用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，提供了一种富含支架蛋白的细胞外囊泡，尤其是外泌体，其可用作预防或治疗癌症和其它疾病的作用。

背景技术

外泌体是细胞间通讯的重要介质。在许多疾病(诸如癌症)的诊断和预后中，它们也是重要的生物标志物。在制药领域，外泌体通常作为药物递送媒介物，外泌体作为新的治疗方式在许多治疗领域中提供了优于常规药物递送方法的许多有利方面。

外泌体的主要特征是具有将生物活性有效载荷包含在其内部空间或腔内的能力。众所周知，外泌体包含内源性有效载荷，包括mRNA、miRNA、DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质，但所需治疗有效载荷的特异性装载的能力目前受到限制。外泌体可以通过在生产细胞中过表达所需的治疗有效载荷来装载，但由于有效载荷被随机定位到细胞的外泌体加工中心，这种装载的效率通常有限。此外，可通过例如电穿孔来离体装载纯化的外泌体，如siRNA。这些方法的效率可能很低，或者仅限于小的有效载荷。因此，产生高效明确的装载型外泌体(loaded exosome)可以更好地实现基于外泌体技术的治疗性用途和其它应用。

发明内容

细胞外囊泡(EV)，例如外泌体、小囊泡、大囊泡中，存在多种常规内源性蛋白，以外泌体为例，这些蛋白可以调节外泌体膜与受体细胞的融合、外泌体膜交换以及融合作用等，发明人通过筛选并鉴定一组外泌体膜表面的蛋白，在生产细胞中过表达所需所述蛋白，使这些蛋白作为支架蛋白富集在外泌体中，尤其是外泌体膜上，其相较于内源性蛋白，具有显著较高的浓度。

所述筛选并鉴定的支架蛋白包括：ENPP1、Rab7a、STX7、STX4、EPCAM、CXADR、TRFC、TRFC-81、CD55、IST1、VTA1、SNAP23、AT1A1、PDL1、VAMP2、Sytenin。

上述支架蛋白中，ENPP1、Rab7a、EPCAM、STX7、CXADR被证明具有优选的效果，尤其是ENPP1在各方面均具有良好的效果，其具有优良的负载水平，以及较短的细胞吞噬时间和吞噬效率。

ENPP1(SEQ ID NO:1)是一种包含925个氨基酸的蛋白质，它包含N端胞质域(CD)、穿膜区域(TM)、生长激素B样结构域1(SMB1)、生长激素B样结构域2(SMB2)、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域。

此外，ENPP1的截短体被证明足以指导荧光蛋白载物分子的高效负载，达到比ENPP1全长蛋白装载量更高的程度。

根据ENPP1蛋白的结构域进行截短，具体的，截短体596(SEQ ID NO:5)包含CD、TM、SMB1、SMB2，和磷酸二酯酶催化域。截短体190(SEQ ID NO:4)包含CD、TM、SMB1和SMB2结构域。截短体144(SEQ ID NO:3)由CD、TM和SMB1结构域组成，截短体52(SEQ ID NO:2)仅包含CD结构域。

尤其优选的，截短体144在工程外泌体中能允许有效的、可重复的将活性体，例如治疗性蛋白质高效的装载到外泌体的腔内或腔外，而无需额外的体外操作步骤。

本发明目的在于提供一种分离的包含支架蛋白的细胞外囊泡，所述囊泡优选为外泌体，所述支架蛋白为外源序列表达的蛋白。

所述支架蛋白包含N端胞质域(CD)、穿膜区域(TM)、生长激素B样结构域1(SMB1)、生长激素B样结构域2(SMB2)、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域中的一个或多个。

在一些实施方案中，所述支架蛋白至少包含穿膜区域(TM)，所述穿膜区域包含VLSLVLSVCVLTTILGCIFGL(SEQ ID NO:6)氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述支架蛋白至少包含CD、TM、SMB1结构域。

在一些实施方案中，所述支架蛋白至少包含：CD、TM、SMB1、SMB2、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域；

在一些实施方案中，所述支架蛋白至少包含：CD、TM、SMB1、SMB2和磷酸二酯酶催化域；

在一些实施方案中，所述支架蛋白至少包含：CD、TM、SMB1和SMB2结构域；

在一些实施方案中，涉及通过将支架蛋白与天然全长蛋白或生物活性分子或片段(例如，治疗相关蛋白、靶向肽)融合表达或自组装，使融合或自组装的蛋白存在于EV内腔表面或腔外的方法，以及由此方法得到的包含所述蛋白的EV。天然全长蛋白或生物活性分子(例如，治疗相关蛋白质、靶向肽)的生物活性片段可以通过与支架蛋白缀合而转运至EV的内腔或腔外。

本发明的一些实施方案涉及生产工程化EV，尤其是外泌体的细胞改造方法，所述方法通过将质粒瞬时或稳定地引入Expi293F细胞，以产生工程化外泌体。在一些实施方案中，细胞包含含有外源序列的质粒。

本发明的实施方案中，所述工程化EV中，支架蛋白相较于常规内源性蛋白有着更高的密度。在一些实施方案中，常规内源性EV(例如，外泌体)蛋白选以下组：PDGFRN、LAM2B及其片段，以PTGFRN作为阳性对照。

在一些实施方案中，外源性序列被插入ENPP1、Rab7a、STX7、EPCAM、CXADR的N端或C端。

在一些实施方案中，支架蛋白是包含支架蛋白，例如ENPP1、Rab7a、STX7、EPCAM、CXADR或其片段和治疗活性物质，例如活性蛋白、治疗性肽、靶向性肽的融合蛋白。

在一些实施方案中，外源序列编码生物活性分子(例如，治疗性肽、靶向肽)。在一些实施方案中，治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰，抗微生物肽或其片段或修饰。治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连接至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，治疗性肽是抗体或其片段或其修饰。在特定的实施方案中，抗体是纳米抗体。本发明的EV中使用的抗体可以是本领域已知的任何抗原结合分子，包括例如替代抗体形式、抗原-药物缀合物(ADC)或免疫毒素。

在一些实施方案中，所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。

在一些实施方案中，外源序列编码靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分对器官、组织或细胞是特异的。

在一些实施方案中，编码序列经过密码子优化。

另一方面，本发明还涉及改变小分子药物的药代动力学或药效学特征的方法。这些方法包括将所述小分子装载到EV上和/或EV中存在的结合蛋白上，以调节所述小分子药物的体内和潜在的体外性质。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含前述的的细胞外囊泡和药学上可接受的载剂。

本发明还提供生产上述细胞外囊泡的改造的细胞，优选的，所述细胞，包括载体，所述载体包含编码前述支架蛋白和生物活性分子的核酸序列。优选的，所述核酸序列可操作地连接至启动子。

本发明还提供将生物活性分子锚定至细胞外囊泡的方法，包括将生物活性分子连接至前述的支架蛋白上。

本发明的技术方案是通过如下步骤实现的：

第一步：鉴定高密度支架蛋白

来自悬浮培养的Expi293F细胞培养基，通过过滤和超速离心处理以制备EV(外泌体)颗粒。提取的外泌体通过WB，NTA和电镜进行表征。通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定在外泌体上高密度的支架蛋白。

第二步：高密度支架蛋白的验证

为评估高密度支架蛋白将融合伙伴引导到EV的相对能力，使用FLAG标记支架蛋白并用GFP作为替代货物分子加载到EV腔内。通过施加抗生素建立编码GFP融合支架蛋白的Expi293F细胞系(支架蛋白细胞系)。

流式细胞术测定支架蛋白细胞系的GFP表达以确定细胞GFP的水平，免疫印迹试验(westernblot,WB)测定总外泌体中GFP的含量。流式纳米分析仪(NanoFCM)测量单个囊泡的GFP荧光。通过三种方式进行高密度支架蛋白的验证，并进一步筛选得到加载GFP到EV腔内更高的候选支架蛋白。

第三步：候选支架蛋白的验证

质谱检测支架蛋白细胞系产生的外泌体(工程化外泌体)中GFP表达，WB测量了每个EV中GFP的负载水平。工程化外泌体与细胞共孵育确定细胞吞噬外泌体的时间以及吞噬的效率。

第四步：构建能够展示多种生物活性分子的工程化外泌体

通过一系列筛选验证得到比PTGFRN更优的支架蛋白，以ENPP1为例构建工程化外泌体展示生物活性分子。根据ENPP1蛋白的结构域，构建ENPP1的截短体以确定EV定位相关的最小序列。构建将生物活性分子融合表达在ENPP1的C端的质粒，通过瞬转Expi293F细胞以产生工程化外泌体并可在外泌体表面展示不同的生物活性分子。结合共聚焦、qPCR实验和WB实验验证生物活性因子的功能。

第五步：验证优选支架蛋白加载多种生物活性分子的功能

ENPP1具有将高水平GFP加载到EV管腔中的能力，在此基础上，进一步扩展可以装载到EV的货物(生物活性物质)类型范围。通过融合到ENPP1截短体管腔的N端片段以加载不同大小和复杂性的生物活性因子，包括但不限于FGF18,ANGPTL3,CRISPR-Cas13d和CRISPR-Cas9。结合qPCR实验、RIP实验和共聚焦显微镜验证负载生物活性因子的功能。

第六步：验证工程外泌体加载广泛类别mRNA的功能

基于RNA的疗法非常有希望用于治疗多种疾病，因为它们能够以多种可能的方式解决遗传起源问题。然而，RNA分子不能穿过细胞膜，因此安全有效的运载工具至关重要。EV是内源性纳米级颗粒，具有多种特性，使其成为治疗性RNA递送剂的理想候选者。为此，本发明利用144的分选作用将MS2蛋白分选到外泌体中，此外，将MS2识别茎环结构loop置于目的mRNA的非编码区，利用RNA与结合蛋白的特异结合实现mRNA在外泌体中的高效装载。

附图说明

图1：Expi293F细胞外泌体高密度支架蛋白鉴定图；

图2：高密度支架蛋白效果验证图；

图3：ENPP1截短体载量评价图；

图4：本发明支架蛋白在EV表面展示靶向肽图；

图5：本发明支架蛋白在EV表面展示靶向肽图；

图6：本发明支架蛋白在EV腔内加载CRISPR-Cas13d图；

具体实施方式

本发明不限于所描述的特定组合物或过程步骤。本领域技术人员在阅读本公开时可理解，本文所描述且说明的各个个别方面具有离散的组分和特征，所述组分和特征可与任何另外的若干方面的特征分离或组合而不偏离本公开的范围或精神。任何所陈述的方法均可以以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

本发明的具体实施方式并非是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可通过参考说明书整体来限定。还应理解，本发明所用的术语仅用于描述特定方面的目的，且不旨在是限制性的，本公开的范围将只由所附权利要求限制。

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对保护范围构成限定。所用的仪器设备、耗材和试剂除特别说明以外，均为市售商品化产品。

第一步：Expi293FEV的获得及表征

1.Expi293FEV的提取

Expi293F细胞以1×10⁶个/ml接种到250ml的培养瓶中，当密度达到4×10⁶个/ml时，收集上清。在4℃下500g离心10min以去除细胞沉淀。收集上清，4℃下3000g离心20min以去除细胞碎片。收集上清，4℃下10000g离心30min，收集上清并通过0.22um滤膜。过滤后的上清通过Evtrap磁珠吸附得到EV。

2.质谱方法检测外泌体蛋白。

每例样品取适量肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统(ThermoScientific)进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为80％ACN/0.1％甲酸。色谱柱以100％的A液平衡。样品进样后经过色谱分析柱进行梯度分离，流速为300nl/min。

液相分离梯度如下：0分钟---3分钟，B液线性梯度从2％到8％；3分钟---81分钟，B液线性梯度从8％到40％；81分钟---83分钟，B液线性梯度从40％到95％；83分钟----90分钟，B液维持在95％。

肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为90min；检测模式为：正离子，母离子扫描范围：400-1200m/z，一级质谱分辨率：60,000@m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：30ms。

肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：30,000@m/z 200，AGCtarget:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2 Activation Type:HCD，Isolation window：1.6Th，Normalized collision energy：28。

第二步：支架蛋白的筛选及验证

1.支架蛋白的筛选

根据以下标准筛选高密度支架蛋白：A.Expi293F外泌体高密度的蛋白质(蛋白质丰度>1×10⁷)；B.膜蛋白；C.排除现有技术的蛋白。共筛选得到21个蛋白：ENPP1、Rab7a、STX7、STX4、EPCAM、CXADR、TRFC、TRFC-81、CD55、IST1、VTA1、SNAP23、AT1A1、PDL1、VAMP2、Sytenin，上述蛋白用于后续的验证，实验结果见附图1A、1B，其中，图1A为质谱鉴定Expi293F外泌体的蛋白，热图展示外泌体标记基因的丰度；图1B为韦恩图展示外泌体高密度的膜蛋白。

2.稳转细胞系的构建和验证

构建上述支架蛋白的质粒并通过电转仪(celetrix)转染到Expi293F细胞中。通过定期传代补充新霉素来构建稳定的细胞系，直到细胞系活力恢复到90％以上。流式检测90％以上的细胞表达GFP，被认为稳转细胞系构建成功，见附图2A。

3.工程化外泌体粒径的表征

使用Nanocoulter仪器测量工程化外泌体的粒径变化。与Expi293F外泌体的粒径相比，工程化外泌体异质性更高、粒径分布范围更广，但集中在60-150nm之间。见附图2B。

4.工程化外泌体的GFP富集

使用1um粒径的磁珠捕获外泌体进行常规流式分析，可以获得外泌体总的荧光强度。流式纳米分析仪(DxFLEX)可分析小于可见光波长颗粒的细胞仪，可用于测量单个外泌体的GFP荧光。根据实施例1.2的WB操作步骤检测工程化外泌体GFP的表达。结合两种纳米流式检测方案和WB结果看，Rab7a、ENPP1、EPCAM、STX7、CXADR、TRFC、PDL1、SNAP23、Sytenin、VAMP2、VTA1、TRFC-81和CD55在至少一种检测方案种确认在其外泌体中存在丰富的GFP。见附图2C、2D。

5.工程化外泌体载量的计算

通过WB法绘制His标准曲线并计算工程化外泌体的载体。简言之，外泌体(1×10¹⁰)的蛋白裂解物，His重组蛋白(25ng，50ng，100ng,200ng,400ng,800ng和1600ng)进行上样，检测Flag和His的蛋白表达。接下来，通过质谱法检测工程化外泌体中GFP的表达。首先，通过ImageJ计算His蛋白的灰度值并绘制标准曲线，R2＝0.9716。其次，根据工程化外泌体的灰度值结合外泌体的个数计算每个外泌体加载Flag的数量。由图2G可知，Rab7a(～600个/EV)和ENPP1(～500个/EV)过表达的工程化外泌体载量要高于PTGFRN(～400个/EV)。进一步的，质谱方法也表明Rab7a和ENPP1的载量高于PTGFRN。因此，ENPP1和Rab7a都被进一步评估为用于在EV展示感兴趣的蛋白质的支架。上述实验结果参见附图2E-H。

第三步：工程化外泌体被细胞摄取的效率

1.工程化外泌体与细胞共孵育

每孔接种100w个Expi293F细胞于6孔板中，并将1×10¹⁰个工程化外泌体(ENPP1、Rab7a和PTGFRN来源的外泌体)与细胞共孵育，24h后收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，PBS清洗两遍，离心后取细胞沉淀，根据WB法检测细胞内Flag表达。见附图2I，由结果可知，尽管Rab7a来源的工程化外泌体的GFP装载量高但其不易被细胞吞噬，而ENPP1来源的工程化外泌体被细胞吞噬内化的效率远高于PTGFRN来源的工程化外泌体。综上，无论是内容物负载量还是被细胞吞噬内化的能力，ENPP1来源的工程化外泌体都要优于PTGERN来源的外泌体。

第四步：ENPP1能够在EV表面展示多种蛋白质

1.ENPP1截短体载量评价

ENPP1是一种包含925个氨基酸的蛋白质，它包含N端胞质域(CD)、穿膜区域(TM)、生长激素B样结构域1(SMB1)、生长激素B样结构域2(SMB2)、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域。根据ENPP1蛋白的结构域进行截短，在截短体或全长(FL,SEQ ID NO:1)的N端加载EGFP并在C端加入Flag标签，根据此结构进行构建质粒。具体的，截短体596(SEQ ID NO:5)包含CD、TM、SMB1、SMB2，和磷酸二酯酶催化域。截短体190(SEQ ID NO:4)包含CD、TM、SMB1和SMB2结构域。截短体144(SEQ ID NO:3)由CD、TM和SMB1结构域组成，截短体52(SEQ ID NO:2)仅包含CD结构域。通过瞬转得到ENPP1全长和ENPP1截短体的细胞，流式细胞技术评价细胞中GFP的表达。收集48h的上清提取外泌体后Nanocoulter仪器进行外泌体计数，通过WB法检测Flag的表达，用以评价ENPP1全长和截短体的EGFP装载量。流式结果表明，尽管截短体52的转染效率高，但是其外泌体装载的效率很低。进一步的研究发现，TM和SMB1结构域一旦缺失外泌体中ENPP1的表达会大幅度降低，这个结果提示该结构域是ENPP1在外泌体定位必不可少的结构。此外，与FL相比，截短体596在外泌体中的表达大幅度降低，提示核酸酶样结构域同样参与了ENPP1在外泌体中的定位。根据WB灰度值计算所得144的外泌体负载Flag的数量约600个，ENPP1全长外泌体负载的数量约200个。参见附图3。

2.ENPP1及截短体负载靶向肽

构建六个质粒，分别编码ENPP1-CAP(软骨细胞亲和肽)、144-CAP、EPCAM-CAP、STX7-CAP、CXADR-CAP和PTGFRN-CAP。ENPP1-CAP质粒包含糖基化序列(GNSTM)、CAP序列(DWRVIIPPRPSA)和位于ENPP1蛋白C端的甘氨酸-丝氨酸间隔区。其他质粒构建方法与上述相同。瞬时转染上述质粒以生产含有CAP肽的外泌体。CAP肽的外泌体与1mM的DiI染料按照体积比400:1在37°避光孵育30min，0.22um滤膜去掉游离未结合的染料，得到DiI标记的外泌体。

12孔板底部铺好细胞爬片，每孔加入8w个大鼠软骨细胞，37℃培养箱静置过夜。取20ug标记好加入到12孔板中，共孵育3h，弃去细胞培养基。PBS洗涤3遍，4％多聚甲醛固定20min。PBS洗3遍，加入500ul DMEM并滴一滴Hochest染色，37℃孵育30min。滴一滴抗猝灭试剂在载玻片上，固定爬片，使用共聚焦FV1000检测细胞摄取外泌体的效率。结果如图4和5所示，对象支架蛋白融合CAP表达的实验组能观察到显著的DiI信号，信号显著大于空外泌体对照组，表明CAP肽促进了外泌体进入到软骨细胞中。此外，共聚焦结果证明了EPCAM、STX7、CXADR、ENPP1和截短的144支架均可有效的在EV表面展示功能性的蛋白。

第五步：ENPP1可实现广泛类别蛋白质的EV管腔加载

1.FL ENPP1和截短的144支架负载CRISPR-Cas13d

将CRISPR-Cas13d构建在ENPP1和截短的144支架的N端，通过瞬转以产生腔内富含CRISPR-Cas13d的外泌体。通过实时荧光定量PCR检测细胞和外泌体中Cas13d和sgRNA的表达。参见附图6A-D，其中，图6A-B构建ENPP1-Cas13d融合质粒和144-Cas13d的融合质粒，细胞中分别检测cas13d和sgRNA的表达；图6C-D为外泌体中分别检测cas13d和sgRNA的表达，其中NC为空外泌体。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：使用Vazyme公司的逆转录试剂盒HiScript II Q RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R223-01)和qPCR试剂盒AceQ Universal SYBR qPCRMaster Mix(Q511-02)。实验中涉及的相关引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。

sgRNA：sense:CACCGAACCCCTACCAAC，

antisense:TGCTGTTTCAAACCCCGAC；

Cas13d：sense:AGCTGACCAACTCCTTCTCC，

antisense:GCATCACTTCCCTGAGCTTG；

GAPDH：sense:AGACAGCCGCATCTTCTTGT，

antisense:CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。

2.受体细胞摄取外泌体sgRNA和Cas13d蛋白

将负载CRISPR-Cas13d的外泌体，空外泌体(NC)空外泌体(NC)(是否正确)与293T细胞进行共孵育，48h收集细胞，检测细胞中Cas13d和sgRNA的表达。见附图6E-F。

相对于空外泌体，ENPP1和截短的144支架外泌体分别与细胞共孵育，可将细胞中cas13d的含量分别提高了6.13和6.82倍，sgRNA的含量分别提高3.72和3.15倍。

Claims

1.一种分离的包含支架蛋白的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白为外源序列表达的蛋白，所述支架蛋白包含N端胞质域(CD)、穿膜区域(TM)、生长激素B样结构域1(SMB1)、生长激素B样结构域2(SMB2)、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域中的一个或多个。

2.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白的密度高于所述细胞外囊泡的常规内源性蛋白。

3.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白至少包含穿膜区域。

4.如权利要求3所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述穿膜区域包含VLSLVLSVCVLTTILGCIFGL氨基酸序列。

5.如权利要求3所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白至少包含N端胞质域、穿膜区域、生长激素B样结构域1；或至少包含：N端胞质域、穿膜区域、生长激素B样结构域1和生长激素B样结构域2结构域；或至少包含：N端胞质域、穿膜区域、生长激素B样结构域1、生长激素B样结构域2和磷酸二酯酶催化域；或至少包含：N端胞质域、穿膜区域、生长激素B样结构域1、生长激素B样结构域2、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域。

6.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述N端胞质域、穿膜区域、生长激素B样结构域1、生长激素B样结构域2、磷酸二酯酶催化域、核酸酶样结构域通过接头连接。

7.如权利要求6所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述接头包含肽键或一个或多个氨基酸。

8.如权利要求1-7任一项所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白选自ENPP1、Rab7a、STX7、STX4、EPCAM、CXADR、TRFC、TRFC-81、CD55、IST1、VTA1、SNAP23、AT1A1、PDL1、VAMP2、Sytenin或其片段、变体、衍生物或修饰。

9.如权利要求1-8任一项所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白的长度至少约52个，至少约62个，至少约76个，至少约77个，至少约78个，至少约79个，至少约80个，至少约81个，至少约82个，至少约83个，至少约84个，至少约85个，至少约86个，至少约87个，至少约88个，至少约89个，至少约90个，至少约91个，至少约92个，至少约93个，至少约94个，至少约95个，至少约96个，至少约97个，至少约100个，至少约105个，至少约110个，至少约115个，至少约120个，至少约125个，至少约130个，至少约135个，至少约140个，至少约144个，至少约154个，至少约164个，至少约170个，至少约180个，至少约190个，至少约290个，至少约390个，至少约490个，至少约596个，至少约690个，至少约790个，至少约890个或至少约925个氨基酸。

10.如权利要求8所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白具有和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。

11.如权利要求1-10任一项所述的细胞外囊泡，其特征在于，包含连接至支架蛋白的生物活性分子。

12.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述生物活性分子在所述细胞外囊泡的内腔表面、内腔上或外腔表面。

13.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述支架蛋白和生物活性分子组成融合蛋白，所述生物活性分子为活性蛋白、治疗性肽或靶向性肽。

14.如权利要求13所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述生物活性分子由外源性编码。

15.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述生物活性分子通过接头连接至所述的支架蛋白。

16.如权利要求15所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述接头包含肽键或一个或多个氨基酸。

17.如权利要求15-16任一项所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述接头包括可切割的接头或柔性接头。

18.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述生物活性分子包括蛋白质、多肽、肽、多核苷酸、化合物、病毒、毒素、类毒素、毒素的无毒突变体、离子载体、离子载体的载剂、形成通道或孔的部分、正共刺激分子的活化剂、正共刺激分子的结合配偶体的活化剂或其任意组合。

19.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述蛋白质包括免疫原性蛋白质、重组肽、天然肽、合成肽、抗体、融合蛋白、酶、细胞因子、配体、受体、转录因子、T细胞受体(TCR)、T细胞共受体、主要组织相容性复合物(MHC)、人白细胞抗原(HLA)及其衍生物、肿瘤抗原、CRIPSR家族内蛋白、DNA或RNA编辑蛋白复合物、RNA和DNA结合蛋白、互作类蛋白或上述各种物质的任意组合。

20.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述病毒包括腺相关病毒、细小病毒、逆转录病毒、腺病毒或其任意组合。

21.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述生物活性分子是负检查点调节剂的抑制剂或负检查点调节剂的结合配偶体的抑制剂。

22.如权利要求21所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述负检查点调节剂选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、含T细胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白3(TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、CD20、CD39和CD73。

23.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述毒素是白喉毒素。

24.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述类毒素是破伤风类毒素。

25.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述毒素的无毒突变体是白喉毒素的无毒突变体。

26.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述正共刺激分子是TNF受体超家族成员。

27.如权利要求26所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述TNF受体超家族成员选自由以下组成的组：CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受体、TACI、BAFF受体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP和XEDAR。

28.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述正共刺激分子的活化剂是TNF超家族成员。

29.如权利要求28所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述TNF超家族成员选自由以下组成的组：TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体和EDA-2。

30.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述正共刺激分子是CD28超家族共刺激分子。

31.如权利要求30所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述CD28超家族共刺激分子是ICOS或CD28。

32.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，正共刺激分子的活化剂是ICOSL、CD80或CD86。

33.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15。

34.如权利要求19所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、粘蛋白1(MUC1)、Tn-MUC1、粘蛋白16(MUC16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、肿瘤蛋白p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、间皮素、VEGFR、α-叶酸受体、CE7R、IL-3、癌-睾丸抗原、MART-1gp100和TNF相关凋亡诱导配体。

35.如权利要求19所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述CRIPSR家族内蛋白包括Cas9或Cas13。

36.如权利要求18所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述多核苷酸包括DNA或RNA适配体。

37.如权利要求1-36任一项所述的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡是外泌体、小囊泡或大囊泡。

38.一种药物组合物，其包含权利要求1-37任一项所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载剂。

39.一种细胞，其产生权利要求1-37中任一项所述的细胞外囊泡。

40.如权利要求39所述的细胞，其特征在于，包括载体，所述载体包含编码权利要求1-37任一项所述的支架蛋白和/或生物活性分子的核酸序列。

41.如权利要求40所述的细胞，其特征在于，所述核酸序列可操作地连接至启动子。

42.一种将生物活性分子锚定至细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括将生物活性分子连接至权利要求1-37任一项所述的支架蛋白。