CN117025626B - 烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体和应用。本发明克隆获得了烟草硝酸盐转运蛋白的编码基因NtNPF7.4基因，并通过荧光定量PCR对烟草不同组织和器官进行检测，结果表明该基因在烟草的根、茎、叶和花中均有表达。亚细胞定位分析发现，NtNPF7.4蛋白定位在细胞膜上，盐胁迫后NtNPF7.4基因在叶片中的表达量明显升高，说明NtNPF7.4蛋白参与氯离子转运过程。利用基因编辑载体对NtNPF7.4基因进行敲除，构建基因敲除株，敲除株根和叶片中氯离子含量显著升高，这使培育氯离子富集的烟草成为可能，为改善我国烤烟氯含量偏低的情况提供一个新的方向。

Description

烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体 和应用

技术领域

本发明涉及烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体和应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物有两类硝酸盐转运蛋白，即NRT1/PRT和NRT2，其中NRT1/PRT又被命名为NPF。目前已经报道的NPF转运底物有NO3^-、Cl-、多肽、各种激素(IAA、ABA、GA等)、芥子油甘等。植物NPF家族一般由8个亚家族基因组成。研究表明NPF7亚家族成员NPF7.3除了参与硝酸盐转运外还可能参与K⁺转运，atnpf7.3突变体还有侧根发育和叶片衰老表型。此外，有文献提到NPF7.3还可能参与Cl-的转运，但至今尚无确凿证据。

氯是烤烟生长发育所必需的营养元素之一，烤烟含氯量过高和过低，都会降低烟叶品质和产量。烟叶含氯量一般与土壤含氯量有关，所以在土壤含氯量低的地区如：西南地区、鄂西南地区、皖南和福建省烟叶的氯素含量都比较低。一般研究认为，优质烟叶中氯含量以0.3％～0.8％为宜，但我国大部分烟区烟叶氯含量都低于0.3％，在一定程度上影响了烟叶的质量(参考文献：我国主要烟区烤烟氯含量特征比较研究.贵州农业科学，2008,36(1)：106-107)。我国主要烟区烤烟氯含量的区域特征、分布状况分析表明，我国烤烟氯含量普遍偏低，其中，高氯烤烟主要分布在北方(77.32％)，低氯烤烟主要分布在南方(78.23％)，在调查的2712份烤烟样品中，53.32％的样品氯含量低于0.30％，43.10％的样品氯含量在0.30％～0.80％，3.43％的样品氯含量大于0.80％(参考文献：中国主要烟区烤烟氯含量区域特征研究.中国土壤与肥料，2010(2)：49-54)。施用含氯肥料可以使土壤含氯量增加，但是，其增加量与施氯量、降雨量及土壤的透水性有密切关系，并且含氯肥料的使用不当也会造成土壤氯离子的污染。

随着分子生物技术的日益成熟，加上氯营养分子生物学在其它作物方面的成果，在烟草上从分子水平来研究氯的转运机制、氯离子通道以及烟叶对氯吸收的有效基因等对解决我国烤烟氯含量偏低的情况具有重要意义。因此，为进一步了解氯离子转运的分子调控，实现更精准的烟草育种，挖掘筛选参与氯离子转运过程的蛋白和编码基因是人们亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因，该基因能够编码烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4，丰富了烟草氯离子转运相关基因的调控网络。

本发明的第二个目的是提供烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4，本发明通过实验证明NtNPF7.4蛋白参与烟草中氯离子的吸收转运，为调控烟草中氯离子含量奠定基础，对烟草精准育种有重要意义。

本发明的第三个目的是提供基因编辑载体，该基因编辑载体能够实现对NtNPF7.4基因的有效敲除，成功获得NtNPF7.4基因敲除的烟草植株，抑制NtNPF7.4基因的表达，进而提高敲除烟草植株的根和叶片中氯离子的含量。

本发明的第四个目的是提供烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因或基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将烟草植株中NtNPF7.4基因敲除，发现敲除株系的根和叶片中氯离子含量显著升高，获得氯离子含量积累的烟草品种。

本发明的第五个目的是提供NtNPF7.4基因敲除烟草植株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用。

为了实现上述目的，本发明烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因所采用的技术方案是：

烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因，其核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述技术方案的有益效果在于：本发明通过设计特异性引物，克隆获得了烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因，经荧光定量PCR分析，在正常烟草植株中，NtNPF7.4基因主要表达在根、茎、叶和花中。

为了实现上述目的，本发明烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4所采用的技术方案是：

烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4，其氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。

上述技术方案的有益效果在于：经验证，本发明的烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4与烟草中氯离子吸收转运密切相关。

为了实现上述目的，本发明基因编辑载体所采用的技术方案是：

基因编辑载体，所述基因编辑载体中包含根据NtNPF7.4基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtNPF7.4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述技术方案的有益效果在于：利用CRISPR/Cas9技术获得的基因敲除的烟草，相对于VIGS株系，抑制基因表达量的效果更好，更稳定，并可传递至下一代。

作为进一步地改进，依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：

NtNPF7.4-T1_F：GATTGATGGAAGTGTGGATAAGCA(如SEQ ID NO.12所示)；

NtNPF7.4-T1_R：AAAC TGCTTATCCACACTTCCATC(如SEQ ID NO.13所示)。

为了实现上述目的，本发明烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因或基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用所采用的技术方案是：

烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因或基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用。

上述技术方案的有益效果在于：本发明通过CRISPR/Cas9技术，在烟草中敲除NtNPF7.4基因，抑制其表达，获得NtNPF7.4基因敲除的烟草植株，检测发现所得的NtNPF7.4基因敲除株的根和叶片中氯离子含量显著升高，为烟草及其他植物的氯离子含量调控提供新的研究对象，丰富了烟草中氯离子调控的基因网络。

作为进一步地改进，将NtNPF7.4基因敲除，烟草根和叶片中的氯离子含量显著提高。

上述技术方案的有益效果在于：本发明通过对NtNPF7.4基因敲除株的检测，发现与对照烟草植株相比，NtNPF7.4基因敲除株根和叶片中氯离子含量显著升高，获得氯离子富集的烟草品种，为氯离子富集烟草的精准育种奠定基础。

作为进一步地改进，所述氯离子富集烟草品种通过以下方法获得：将基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，通过筛选、鉴定获得氯离子富集烟草品种。

上述技术方案的有益效果在于：农杆菌转化法获得的敲除烟草株系的可操作性强，时间短且成功率高。

为了实现上述目的，本发明NtNPF7.4基因敲除烟草植株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用的技术方案是：

NtNPF7.4基因敲除烟草植株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用。

上述技术方案的有益效果在于：本发明发现在烟草中敲除NtNPF7.4基因，能显著提高根和叶片中的氯离子含量，这为改善我国南方地区烤烟中氯离子含量偏低奠定理论基础，为改善我国烤烟氯含量偏低的情况提供一个新的方向。

本发明通过real-time PCR发现烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因在烟草的根、茎、叶和花组织中均表达。为进一步确认NtNPF7.4基因的功能，通过CRISPR/Cas9技术，构建了敲除NtNPF7.4基因的基因编辑载体，转化后成功获得了抑制NtNPF7.4基因表达的敲除株系。检测结果表明，相比对照植株，NtNPF7.4基因敲除植株中根和叶片中氯离子含量显著上升，说明NtNPF7.4基因与烟草中氯离子的吸收转运密切相关，丰富了烟草硝酸盐转运蛋白的功能体系，为植物氯离子转运调控提供重要的借鉴，为培育新的氯离子富集的植物新品种奠定基础。

附图说明

图1为本发明实验例1中NtNPF7.4基因在不同组织中的表达特征图(柱状图没有标记相同小写字母的表示显著差异)；

图2为本发明实验例1中烟草NtNPF7.4蛋白的亚细胞定位图；

图3为本发明实验例2中盐胁迫下NtNPF7.4基因的表达特征图(柱状图没有标记相同小写字母的表示显著差异)；

图4为本发明实验例3中NtNPF7.4基因敲除的靶位点选择示意图；

图5为本发明实验例4中T₀代基因编辑植株敲除靶位点的测序结果图；

图6为本发明实验例4中NtNPF7.4基因编辑植株根部、叶片氯离子含量图(**代表p<0.01)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

本发明所述的烟草NtNPF7.4基因编码烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4，所述烟草硝酸盐转运蛋白包含的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。所述烟草硝酸盐转运蛋白还可能为由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有影响烟草氯离子转运的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因包含的核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明所述烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因的应用为在烟草植株体内抑制所述NtNPF7.4基因的表达，可提高根和叶片中氯离子的含量。可通多种方法抑制NtNPF7.4基因的表达，如：农杆菌介导转化基因编辑载体、植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码框、优化基因启动子等方法。本发明所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制NtNPF7.4表达即可。

下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：

生物材料：

烟草品种：K326，所使用的种子由国家烟草基因研究中心提供。

载体：pFF19载体由国家烟草基因研究中心提供；pCS1300获赠于武汉天问生物科技有限公司；CRISPR/Cas9载体由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。

菌株：Trans5α化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；GV3101农杆菌感受态细胞，购自上海唯地生物技术有限公司；引物的合成和DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司提供完成。

实验试剂：RNA提取试剂盒(RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒)、基因组提取试剂盒(多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒)购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量试剂盒、反转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit)购自瑞士Roche公司；DNA扩增酶，购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BsaI、质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自宝生物技术有限公司。

实验设备：PCR仪Tprofessional Thermocycler，Biometra公司；定量PCR仪LightCycler96，Roche公司。

烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因的实施例1

本实施例中的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4的实施例1

本实施例中的烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4的氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。

基因编辑载体的实施例1

本实施例的基因编辑载体中包含根据NtNPF7.4基因靶位点所设计的敲除引物序列，所述NtNPF7.4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：

NtNPF7.4-T1_F：GATTGATGGAAGTGTGGATAAGCA(如SEQ ID NO.12所示)；

NtNPF7.4-T1_R：AAAC TGCTTATCCACACTTCCATC(如SEQ ID NO.13所示)。

烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因或基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用的实施例1

本实施例中将包含根据NtNPF7.4基因靶位点所设计的敲除引物序列的基因编辑载体转化烟草植株后，构建获得NtNPF7.4基因敲除的烟草植株，与正常烟草植株相比，该株系根和叶片中氯离子含量显著升高，获得了氯离子富集的烟草品种。

NtNPF7.4基因敲除烟草植株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用的实施例1

本实施例利用CRISPR/Cas9技术，将烟草植株中NtNPF7.4基因敲除，获得NtNPF7.4基因敲除株，敲除株根和叶片中氯离子含量升高，应用于我国氯离子含量偏低土壤中，改善烤烟氯含量偏低的情况，改善烤烟的质量。

实验例1NtNPF7.4基因的表达模式分析和NtNPF7.4基因片段的克隆

本实施例提取K326烟草植株根的总RNA，反转录为cDNA后，通过PCR扩增出NtNPF7.4基因片段，并且利用荧光定量PCR对烟草不同组织、器官中NtNPF7.4基因的表达模式进行分析，具体实施操作如下：

1、NtNPF7.4基因的克隆

NtNPF7.4基因的克隆及获得过程如下所示：

(1)提取RNA，反转录cDNA

将K326种子消毒之后接种在MS培养基上进行萌发，发芽两周后，幼苗移栽到盆里，在培养温度为23～26℃的植物培养间进行培养，待烟苗长至六叶一心时转移至1/2MS液体培养基中继续培养，两周后选取根部进行取样，液氮速冻后备用，采用植物RNA提取试剂盒提取烟草根部总RNA。RNA提取时，参考试剂盒说明书操作即可，然后反转录为cDNA备用。

(2)设计引物，进行PCR扩增

PCR扩增引物序列如下：

NtNPF7.4-F：5’-ATGGCTTGCTTAAACATTG-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

NtNPF7.4-R：5’-TTAGACCTTGAAATCTCCTT-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

以步骤(1)中反转录的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：5×GCL buffer 10μL，cDNA 2μL，上下游引物各1μL，dNTP 6μL，GXL DNAPolymerase 1μL，加灭菌水至50μL。PCR扩增条件为：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、2min，30个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳检测分析并用参照DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收PCR扩增后产物。

纯化产物再连接至pFF19载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，6μL；pFF19载体，1μL；混匀后，25℃连接25min。

将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体转化过程如下所示：

从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上使其溶解，加连接产物于100μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min；42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2min；加入900μL平衡至室温的LB(不含抗生素)液体培养基，37℃摇荡培养1h；4000rpm离心3min，去部分上清，留100μL将沉淀混匀，均匀地涂布到LB固体平板(含50μg/μL卡那霉素)上，倒置培养皿，37℃培养过夜。

翌日，挑单克隆，送出测序。

测序结果及分析结果表明，NtNPF7.4基因基因编码区长度为1788bp个核苷酸；对该基因分析后可知，其所编码的NtNPF7.4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、烟草不同组织、器官中NtNPF7.4基因的表达模式分析

取旺长期K326烟草植株根部、茎部、叶片和花等组织，提取RNA反转录cDNA后，用实时定量PCR的方法检测NtNPF7.4基因在各组织器官中的表达量。以烟草Nt26S基因为内参，进行荧光定量PCR检测，引物序列如下：

检测NtNPF7.4基因的荧光定量引物，引物序列为：

RT-NtNPF7.4-F：5’-CAGTCTCAGGCTTTCAT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

RT-NtNPF7.4-R：5’-TCAAGAACTCTTCTATAG-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

检测烟草Nt26S基因时，具体引物为：

Nt26S-F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’(如SEQ ID NO.7所示)；

Nt26S-R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’(如SEQ ID NO.8所示)。

荧光定量PCR的反应体系为：10μL 2×SYBR I Master，上下游引物各0.5μL，50ngcDNA，加ddH₂O至20μL。

荧光定量PCR的反应条件为：第一步预变性，95℃10s；第二步PCR反应，95℃5s，60℃30s，39个循环；第三步熔解曲线。

每个样品进行3次生物学重复，通过方法分析相对基因表达差异。

荧光定量PCR结果如图1所示(柱状图没有标记相同小写字母的表示显著差异)，结果说明NtNPF7.4基因烟草的根、茎、叶和花中均有表达。

3、烟草NtNPF7.4蛋白的亚细胞定位

设计引物pCS1300-NPF7.4F和pCS1300-NPF7.4R，将NtNPF7.4克隆到含有GFP标签的pCS1300载体上，引物序列为：

pCS1300-NPF7.4F：5’-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGCTTGCTTAAACATTG-3’(如SEQID NO.9所示)；

pCS1300-NPF7.4R：5’-CCCTTGCTCACCATGGATCCGACCTTGAAATCTCCTTGC-3’(如SEQID NO.10所示)。

PCR扩增体系和反应程序同实验例第1部分NtNPF7.4基因的克隆中PCR扩增体系和反应程序，获得的PCR产物用In-Fusion酶连接至pCS1300载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，2μL；pCS1300载体2μL；In-Fusion酶1μL。混匀后，50℃连接15min。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落测序。

测序正确的菌落提取融合质粒GFP-NtNPF7.4，并转化农杆菌，农杆菌转化的步骤如下：

从-80℃冰箱中取出农杆菌GV3101感受态细胞，在冰上冻融，待即将解冻时加入5μL已经构建好的GFP-NtNPF7.4融合载体，轻弹混匀；冰浴30min，液氮中冻5min，然后在37℃水浴5min后立即放冰上；加入900μL的无抗生素的LB液体培养基，200rpm、振荡培养4h；然后将菌液4500rpm离心3min，弃一半体积的上清，重新悬浮后均匀涂于含有Rif(100μg/mL)、和Kan(50μg/mL)的LB固体培养基上，28℃倒置培养约2～3d，直至单菌落形成；挑取单菌落，扩培后对菌液进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌株，即为转化正确的工程菌。

将上述转化正确的农杆菌注射健康的本氏烟叶片，2d后使用激光共聚焦显微镜观察信号在细胞中的分布情况。结果如图2所示，说明NtNPF7.4蛋白定位在细胞膜上(其中，FM为膜定位染料)。

实验例2烟草的盐胁迫试验

为确定NtNPF7.4基因在盐胁迫中的具体响应情况，通过盐胁迫处理普通栽培烟草K326，在不同处理时间采集根部，利用荧光定量PCR的方法对NtNPF7.4基因的表达进行了分析，具体实施操作如下：

(1)盐胁迫实验

烟草K326种植于国家烟草基因研究中心植物培养间，培养条件为：温度(23±1)℃，相对湿度60％±2％，16h光照培养，8h黑暗培养。待烟苗长至六片真叶期，移至Hoagland’s营养液中继续培养，1周后更换营养液时加入300mM NaCl，分别在NaCl处理0h、12h、3d和7d采集根部和叶片，根部取样时用蒸馏水冲洗并用吸水纸吸干水分后经液氮速冻后放-80℃冰箱保存。每个株系设置3个独立重复，每个重复至少选取3株长势一致的烟苗。

(2)qPCR检测NtNPF7.4基因的表达量

将所保存的材料提取RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA后，以烟草Nt26S基因为内参，进行荧光定量PCR检测，具体操作过程如实验例1步骤2中所述。

荧光定量PCR结果如图3所示(柱状图没有标记相同小写字母的表示显著差异)，表明烟草经过盐胁迫后，NtNPF7.4基因在叶片中的表达量显著升高，说明NtNPF7.4基因在盐胁迫中发挥一定作用，可能参与氯离子转运过程。

实验例3基因编辑载体的构建

为进一步了解NtNPF7.4基因在烟草氯离子吸收转运中的功能，构建了用于敲除NtNPF7.4基因的基因编辑载体，具体实施操作如下：

首先，根据CRISPR/Cas9系统的识别特点设计靶位点，在NtNPF7.4基因的第1个外显子区域设计20bp的sgRNA靶点序列，如图4所示，sgRNA靶点序列为：GATGGAAGTGTGGATAAGCA(如SEQ ID NO.11所示)，设计敲除引物序列NtNPF7.4-T1_F和NtNPF7.4-T1_R如下：

NtNPF7.4-T1_F：GATTGATGGAAGTGTGGATAAGCA(如SEQ ID NO.12所示)；

NtNPF7.4-T1_R：AAACTGCTTATCCACACTTCCATC(如SEQ ID NO.13所示)。

设计反应体系，以获得靶位点的DNA双链(退火)，20μL反应体系设计如下：Annealing Buffer for DNAOLigos(5×)，4μL；上下游引物(NtNPF7.4-T1_F、NtNPF7.4-T1_R)，各4μL(50μmoL/μL)；Nuclease-free water补充至20μL。

反应程序为：95℃5min，每8s下降0.1℃，降至25℃；反应产物4℃保存备用，或者直接进行后续反应。

将上述退火产物与BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体进行连接，并筛选获得用于敲除NtNPF7.4基因的CRISPR/Cas9表达载体，20μL连接体系设计如下：退火产物，6μL；酶切产物(BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体)，3μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，2μL；T4DNALigase，1μL；灭菌水补充至20μL，37℃连接3h。

连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过挑取阳性克隆、扩大培养，提取质粒后，经PCR确认载体构建成功后，低温保存，用于农杆菌转化。

实验例4转基因植株的获得及氯离子含量检测

本实验例采用实验例3中构建的基因编辑载体转化农杆菌，并进而转化烟草植株，构建NtNPF7.4基因敲除的转基因植株，具体实施操作如下：

(1)农杆菌的转化

具体的方法同实验例1细胞亚细胞定位中农杆菌转化的步骤。

(2)烟草植株的转化

取生长一个月左右的K326烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5cm大小的叶盘，将处理后叶盘在MS固体培养基上预培养3d；将上述所制备转化后农杆菌工程菌，培养至OD₆₀₀＝0.6左右，4000rpm离心5min收集菌体，再用20mL的MS液体培养基悬浮菌体；然后将上述预培养后叶盘置于菌液中，侵染10min；用无菌的滤纸吸干浸染后叶盘周围多余的菌液，在MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.5mg/L)的固体培养基上暗培养3d；用含有Cef(400mg/L)的无菌水清洗叶盘，并用无菌滤纸吸去多余的液体，将叶盘转到含有6-BA(2mg/L)、NAA(0.5mg/L)、Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体筛选培养基上，28℃光照培养；待不定芽长到0.5cm时，转移到含Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体培养基上生根。

(3)基因编辑株的鉴定

待转化的烟草植株生长一个月左右，取少量叶片，参照植物基因组提取试剂盒说明书提取DNA，通过PCR扩增、克隆、测序的方法，检测阳性转基因株系和突变形式。具体鉴定方法为：

在NtNPF7.4基因组上，设计一对检测引物，该引物位于敲除靶位点的两侧，具体为：

NtNPF7.4-J-F:5’-ggagtgagtacggtgtgcCTTAACGGCTAATGCATG-3’(如SEQ IDNO.14所示)；

NtNPF7.4-J-R：5’-gagttggatgctggatggTCAATAACTGTTAAAGTTG-3’(如SEQ IDNO.15所示)。

注：此处小写的碱基为接头序列。

以T₀代转基因株系DNA模板，进行PCR扩增，反应体系：基因组DNA 1μL，10×buffer2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP 3μL，EasyTaq酶0.5μL，加ddH₂O至20μL；PCR条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；再72℃终延伸10min。PCR产物送Hi-tom测序。

分析测序结果如图5所示，在11株T₀代植株中，检测到NtNPF7.4基因有2种形式的突变，这些突变均发生在敲除的靶位点上，而野生型植株的NtNPF7.4基因未检测到任何突变，这说明在T₀代植株中已经成功实现了对NtNPF7.4基因进行了敲除。

(4)水培试验

NtNPF7.4基因编辑植株T₁代和对照K326植株种植于国家烟草基因研究中心植物培养间，培养条件为：温度(23±1)℃，相对湿度60％±2％，16h光照培养，8h黑暗培养。待烟苗长至六片真叶期，移至Hoagland’s营养液中继续培养，1周后更换一次营养液，再培养3d后取根部和叶片进行后续氯离子含量的测定。根部取样时用蒸馏水冲洗并用吸水纸吸干水分后经液氮速冻后放-80℃冰箱保存。每个株系设置3个独立重复，每个重复至少选取3株长势一致的烟苗。

(5)氯离子含量测定

将保存的根部、叶片样品冷冻干燥后，使用混合型振荡研磨仪对其研磨至粉末状，称取约0.0500g(精确至0.1mg)粉末，置于10mL 5％(体积分数)醋酸中，30℃震荡萃取30min，然后用定性滤纸过滤，滤液经稀释后用美国安莱立思Alalis MP6500型台式pH计测定氯离子含量。

结果如图6所示，NtNPF7.4基因敲除后，根部和叶片中的氯离子含量显著上升(**代表p<0.01)。

综上所述，本发明通过对烟草NtNPF7.4基因的研究，发现NtNPF7.4蛋白定位在细胞膜上；通过基因编辑技术获得NtNPF7.4基因敲除株，水培后，根部和叶片中的氯离子含量显著上升，获得了氯离子积累的烟草植株。本发明构建的NtNPF7.4基因敲除株可以应用于我国氯离子含量偏低土壤中，改善烤烟氯含量偏低的情况，改善烤烟的质量。

最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF7.4基因在氯离子富集烟草品种培育中的应用，其特征在于：将NtNPF7.4基因敲除，烟草根和叶片中的氯离子含量显著提高；所述NtNPF7.4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.一种基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用，其特征在于：所述基因编辑载体中包含根据NtNPF7.4基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtNPF7.4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.根据权利要求2所述的基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用，其特征在于：依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：

NtNPF7.4-T1_F：GATTGATGGAAGTGTGGATAAGCA(如SEQ ID NO.12所示)；

NtNPF7.4-T1_R：AAACTGCTTATCCACACTTCCATC(如SEQ ID NO.13所示)。

4.根据权利要求2或3所述的基因编辑载体在氯离子富集烟草品种培育中的应用，其特征在于：所述氯离子富集烟草品种通过以下方法获得：将基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，通过筛选、鉴定获得氯离子富集烟草品种。

5.NtNPF7.4基因敲除烟草植株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用，其特征在于：所述NtNPF7.4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。