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CN114854766A - 一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体及其应用 - Google Patents

一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体及其应用 Download PDF

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CN114854766A CN202210576433.6A CN202210576433A CN114854766A CN 114854766 A CN114854766 A CN 114854766A CN 202210576433 A CN202210576433 A CN 202210576433A CN 114854766 A CN114854766 A CN 114854766A
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Abstract

本发明公开了一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtAIDP1基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体具有两个碱基缺失的突变，该突变使NtAIDP1基因编码蛋白质序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变氨基酸。本发明通过系统研究，首次提出了一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，本发明提出的降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体获得的烟草植株，烟叶中烟碱含量比对照降低50%，使烟叶的烟碱含量显著降低。

Description

一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体及其应用
技术领域
本发明涉及遗传工程技术领域，更具体地，涉及一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体及其应用。
背景技术
烟碱是栽培烟草烟叶中重要的特征性化合物，占烟草总生物碱的95%左右。
随着烟草制品市场品类的多元化发展，烟草工业对不同烟碱梯度烟叶的需求日益迫切，其中包括低烟碱含量烟草。因此，有必要研究降低烟叶烟碱含量的基因突变体及其应用以解决上述技术问题。
经过多年的研究，烟碱合成调控机理的研究获得长足的进展。多个转录因子基因家族参与其中，例如bHLH基因家族的NbbHLH2, NtMYC2a，ERF家族基因NtERF189, NtERF115等。通过调控这些转录因子基因能够改变烟叶烟碱含量，如过表达MYC2a 或者ERF115显著提高转基因烟草烟碱含量，编辑敲除MYC2a基因能够显著降低烟草的烟碱含量。另外，通过调控烟碱合成途径基因也能够改变烟叶烟碱含量，如编辑敲除BBL 家族基因获得了烟碱含量极低的烟草。
发明内容
本发明主要目的在于获得降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，定位出该NtAIDP1基因突变体的突变位点及突变类型。在此基础上，提供降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体的应用，用于降低烟草植株的烟叶烟碱含量。
因此，一方面，本发明提供了一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，即：ATGGTTGATTGTAAGATAGAAGATAACAAAGAAACCCTGCCAGAAAAGGGGGATGCCATTTCCAGTAGCGGCGTCACAAATGGCACCGAGTTGAAAAAGGACATACTCTCAGAAAAAGAGAACTTGGGCGAAGAGTTGGTGGCTCCAGGGAAGGAGCTGTTTCAAGATGTCGGTAGTTGCACAAAGAGTGAGACCCCAGTTCAGCATACTTGATGCTACGAGTCCTCGGGTGCAGAATGAAGAAGGAGACTCAGCAGACGAAAAGGTTTTGTTCAAATCTCCCACCGTTGCCTCCAAAGCTGAAGGCGATGTAAATGCTAGTGAATCTCAAGGCCCTCGTGGCTGCAGGGACAGTACTAATCTTGATTCTACCGATCAATTGGACTCCATCATCCAGAATGAGAGTCTTATCAAAATTAGAGCGGATGATGAAGAACTTAAAAAACAGAAAGATGGGGTGACTGAAGGGGAGGTAAGTGGTCAGGCAACTAAAATGGAATCATGTACGATATATGTTGCTGGAAAAGAGGAACTGAAAATTGGAGTGAAGAGGTGTACCTCACTCTTAAACAATAAAGAAATGGAGGAGAACTTGAAGCGAGGAGCAATTCTGAAGCAGGCATCAACGGAAAATGAAACAAAGGAGGGATCGGATGATGTGTTGAAAGAGACAGAGGTGCTATCAGCCAATAAAATAAAGGATGAATTACTAAAGTCCGAATTGGATGTTGAACATGAGATTGATGTGAAAACTCCTGGCAAGACCTTTCTGCTGGATATAAATCCCATCGGGGGCGATGAGTCTGGAACAGAGGAAGAGCAAGCTGCATTTATGAAAGGGCTAGAGACTTTCCACAAAGAAAGGTGCTTGGAGTTCAAGGCCCCGCGGTTCTATGGAGAGCCATTAAATTGTCTCAAGTTGTGGAGAGCAGTGATCAGACTTGGTGGTTATGAGCAGGTAACATCATGCAAGCTATGGCGGCAAGTAGGAGAATCATTCAAACCCCCCAAGACTTGTACTACTGTCTCTTGGACATTCCGATGTTTTTACGAGAAGGCCCTACTAGAATATGAAAAGCACAAAATGCGTAGTGGTGAGCTTCCATTTGCTGAAGCTGCTTTTGCAGAACCTACTAGTTCTGGAATCCAGGGGAATCAAGCCTCCGGATCTGGTAGAGCGAGAAGAGATGCGGCAGCTCGAGCGATGCAAGGTTGGCATTCTCAACGTCTTCTTGGTAATGGTGAGGTTGGAGATCCTATCATTAAGGAGAAGAACTCTGTGTCTATGCCAAAGCGTGAAAAGCAACTTAAAAACATTGGTTTGAAGCGGAAAAAGCCATCCCCCATGGAGCAGGTTGCCAAAGTTACATGCATGAAAGTATCAAAACCGCATTTGGAGACAATGGTGGTGGATATTGGCCCTCCTGCTGACTGGGTGAAGATCAATGTGCAGAGAACTAAGGATTGTTACGAAGTGTATGCTTTAGTTCCTGGCCTTTTGCGTGAAGAGGTTCGCGTGCAGTCTGATCCAGCTGGGCGCTTGGTTATTTCTGGCCAACCTGAACAGCTGGACAATCCTTGGGGTGTTGCTCCATTCAAAAAGGTAGTCAGTTTACCTTCAAGAATTGATCCTCACCAGACCTCTGCTGTGGTTACTCTGCATGGGCAGCTCTTTGTGCGTGTACCATTTGAACAATCAAATATTTAG。
与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtAIDP1基因野生型相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体具有缺失突变，该突变使NtAIDP1基因编码氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
本发明中NtAIDP1基因序列在200-201位缺失AC两个碱基，造成移码突变，该突变能够显著降低烟草烟叶中烟碱含量。
进一步地，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体编码的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，MVDCKIEDNKETLPEKGDAISSSGVTNGTELKKDILSEKENLGEELVAPGKELFQDVGSCTKSETPVQHT。
第二方面，本发明还提供一种NtAIDP1基因突变体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1、构建CRISPR/CAS9载体：
（1）根据NtAIDP1 基因组序列设计靶位点，所述靶位点为：
PAM：CCAGACTTCAGCATACTTGATGC；
（2）根据步骤（1）中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物为：
P1：ATTGGCATCAAGTATGCTGAAGTC；
P2：AAACGACTTCAGCATACTTGATGC；
（3）根据步骤（1）中的靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物为：
NtAIDP1-SdF: TCACAAATGGCACCGAGTTG；
NtAIDP1-SdR: GATGGAGTCCAATTGATCGG；
（4）根据步骤（2）中的得到的靶位点引物通过退火形成互补DNA oligo，得到dsDNA；
（5）酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤（4）中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；
（6）将步骤（5）中得到的连接产物转化为大肠杆菌后进行菌落PCR检测，经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到pHSE401-AIDP1载体；
所述菌落PCR检测时，所用引物设计为:
U6-26p-F：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；
U6-26p-R：CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC；上述引物对NtAIDP1基因突变体检测的特异性好，准确性高；
测序时所用引物为：U6-26p-F。
2、农杆菌转化
（7）将农杆菌感受态细胞C58C1溶解后加入步骤（6）中得到的载体pHSE401-AIDP1进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆；
3、烟草转化
（8）将步骤（7）中得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液；
（9）取野生型烟草叶片利用乙醇和HgCl2处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；
（10）将步骤（9）中得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入步骤（8）中得到的含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中进行侵染，随后将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；
（11）待步骤（10）中的芽长至3~5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗；
4、测序筛选编辑材料
（12）待步骤（11）中的T0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取DNA，经扩增后得扩增产物，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株NtAIDP1基因缺失两个碱基（AC）的编辑材料；种植该编辑材料得T1代植株，通过测序筛选该基因纯合突变单株并收种，获得具有NtAIDP1纯合突变的T2代烟草种子。
第三方面，本发明提供所述NtAIDP1基因突变体应用于降低烟草植株烟叶的烟碱含量。
（13）对步骤（12）中得到的具有NtAIDP1基因纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T383-2010的方法检测植株烟叶烟碱含量。
（14）含有突变序列的T2代烟草相比含有SEQ ID NO:1野生型序列的烟草叶片烟碱含量显著降低。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过系统研究，首次提出了一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，本发明提出的降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体烟草植株，烟叶中烟碱含量比对照降低50%，使烟叶的烟碱含量显著降低。
2、本发明通过系统研究，通过构建CRISPR/CAS9载体，农杆菌转化、烟草转化及测序筛选编辑材料，获得NtAIDP1基因序列200-201位缺失两个碱基（AC），造成移码突变的突变体，该突变体烟叶的烟碱含量显著降低，满足烟草工业对低烟碱烟叶的需求。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步解释。
附图说明
图1为突变体突变位点测序峰图。
图2为本发明NtAIDP1突变体株系与野生型烟草叶片烟碱含量对比示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1，本发明的第一方面，本发明提供了一种降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体的核苷酸序列如SEQID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtAIDP1基因野生型相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体具有200-201位缺失两个碱基的突变，该突变使NtAIDP1基因编码氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
烟草野生型烟草植株的NtAIDP1基因的cDNA序列如下所示：
ATGGTTGATTGTAAGATAGAAGATAACAAAGAAACCCTGCCAGAAAAGGGGGATGCCATTTCCAGTAGCGGCGTCACAAATGGCACCGAGTTGAAAAAGGACATACTCTCAGAAAAAGAGAACTTGGGCGAAGAGTTGGTGGCTCCAGGGAAGGAGCTGTTTCAAGATGTCGGTAGTTGCACAAAGAGTGAGACCCCAGACTTCAGCATACTTGATGCTACGAGTCCTCGGGTGCAGAATGAAGAAGGAGACTCAGCAGACGAAAAGGTTTTGTTCAAATCTCCCACCGTTGCCTCCAAAGCTGAAGGCGATGTAAATGCTAGTGAATCTCAAGGCCCTCGTGGCTGCAGGGACAGTACTAATCTTGATTCTACCGATCAATTGGACTCCATCATCCAGAATGAGAGTCTTATCAAAATTAGAGCGGATGATGAAGAACTTAAAAAACAGAAAGATGGGGTGACTGAAGGGGAGGTAAGTGGTCAGGCAACTAAAATGGAATCATGTACGATATATGTTGCTGGAAAAGAGGAACTGAAAATTGGAGTGAAGAGGTGTACCTCACTCTTAAACAATAAAGAAATGGAGGAGAACTTGAAGCGAGGAGCAATTCTGAAGCAGGCATCAACGGAAAATGAAACAAAGGAGGGATCGGATGATGTGTTGAAAGAGACAGAGGTGCTATCAGCCAATAAAATAAAGGATGAATTACTAAAGTCCGAATTGGATGTTGAACATGAGATTGATGTGAAAACTCCTGGCAAGACCTTTCTGCTGGATATAAATCCCATCGGGGGCGATGAGTCTGGAACAGAGGAAGAGCAAGCTGCATTTATGAAAGGGCTAGAGACTTTCCACAAAGAAAGGTGCTTGGAGTTCAAGGCCCCGCGGTTCTATGGAGAGCCATTAAATTGTCTCAAGTTGTGGAGAGCAGTGATCAGACTTGGTGGTTATGAGCAGGTAACATCATGCAAGCTATGGCGGCAAGTAGGAGAATCATTCAAACCCCCCAAGACTTGTACTACTGTCTCTTGGACATTCCGATGTTTTTACGAGAAGGCCCTACTAGAATATGAAAAGCACAAAATGCGTAGTGGTGAGCTTCCATTTGCTGAAGCTGCTTTTGCAGAACCTACTAGTTCTGGAATCCAGGGGAATCAAGCCTCCGGATCTGGTAGAGCGAGAAGAGATGCGGCAGCTCGAGCGATGCAAGGTTGGCATTCTCAACGTCTTCTTGGTAATGGTGAGGTTGGAGATCCTATCATTAAGGAGAAGAACTCTGTGTCTATGCCAAAGCGTGAAAAGCAACTTAAAAACATTGGTTTGAAGCGGAAAAAGCCATCCCCCATGGAGCAGGTTGCCAAAGTTACATGCATGAAAGTATCAAAACCGCATTTGGAGACAATGGTGGTGGATATTGGCCCTCCTGCTGACTGGGTGAAGATCAATGTGCAGAGAACTAAGGATTGTTACGAAGTGTATGCTTTAGTTCCTGGCCTTTTGCGTGAAGAGGTTCGCGTGCAGTCTGATCCAGCTGGGCGCTTGGTTATTTCTGGCCAACCTGAACAGCTGGACAATCCTTGGGGTGTTGCTCCATTCAAAAAGGTAGTCAGTTTACCTTCAAGAATTGATCCTCACCAGACCTCTGCTGTGGTTACTCTGCATGGGCAGCTCTTTGTGCGTGTACCATTTGAACAATCAAATATTTAG（SEQ ID NO：1）。
本发明发生200-201位缺失突变的NtAIDP1基因突变体，在上述野生型烟草植株序列中加框显示。该位点的核苷酸改变将导致NtAIDP1基因编码的氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
通过测序筛选纯合突变单株并收种，获得具有NtAIDP1突变的可显著降低烟叶烟碱含量的T2代烟草种子；根据本发明的实施例，该突变的核酸序列为培育低烟碱烟草品种提供基因资源。
本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
进一步地，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体编码的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，MVDCKIEDNKETLPEKGDAISSSGVTNGTELKKDILSEKENLGEELVAPGKELFQDVGSCTKSETPVQHT。
其中，野生型烟草NtAIDP1基因cDNA编码的氨基酸序列如下：
MVDCKIEDNKETLPEKGDAISSSGVTNGTELKKDILSEKENLGEELVAPGKELFQDVGSCTKSETPDFSILDATSPRVQNEEGDSADEKVLFKSPTVASKAEGDVNASESQGPRGCRDSTNLDSTDQLDSIIQNESLIKIRADDEELKKQKDGVTEGEVSGQATKMESCTIYVAGKEELKIGVKRCTSLLNNKEMEENLKRGAILKQASTENETKEGSDDVLKETEVLSANKIKDELLKSELDVEHEIDVKTPGKTFLLDINPIGGDESGTEEEQAAFMKGLETFHKERCLEFKAPRFYGEPLNCLKLWRAVIRLGGYEQVTSCKLWRQVGESFKPPKTCTTVSWTFRCFYEKALLEYEKHKMRSGELPFAEAAFAEPTSSGIQGNQASGSGRARRDAAARAMQGWHSQRLLGNGEVGDPIIKEKNSVSMPKREKQLKNIGLKRKKPSPMEQVAKVTCMKVSKPHLETMVVDIGPPADWVKINVQRTKDCYEVYALVPGLLREEVRVQSDPAGRLVISGQPEQLDNPWGVAPFKKVVSLPSRIDPHQTSAVVTLHGQLFVRVPFEQSNI（SEQ ID NO.2）。
通过对比发现，与SEQ ID NO.1相比，本发明的NtAIDP1基因突变体的cDNA具有200-201位缺失两个碱基的突变，进而，其编码产物与野生型的NtAIDP1的氨基酸序列相比，在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。综上，以上突变可显著改变NtAIDP1基因的功能。
实施例2，请参考图1，根据本发明的第二方面，提出了NtAIDP1基因突变体的制备方法, 具体制备方法包括以下步骤：
1、构建CRISPR/CAS9载体：
（1）根据NtAIDP1 基因组序列设计靶位点，所述靶位点为：
PAM：CCAGACTTCAGCATACTTGATGC；
（2）根据步骤（1）中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物为：
名称 序列（5’→3’）
P1 ATTGGCATCAAGTATGCTGAAGTC
P2 AAACGACTTCAGCATACTTGATGC
（3）根据步骤（1）中的靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物为：
名称 序列（5’→3’）
NtAIDP1-SdF TCACAAATGGCACCGAGTTG
NtAIDP1-SdR GATGGAGTCCAATTGATCGG
扩增长度为320bp。
（4）制备dsDNA：根据步骤（2）中的得到的靶位点引物通过退火形成互补DNAoligo，得到dsDNA；具体反应体系为：反应体系50μL，包括P1 20μL，P2 20μL，10×Annealingbuffer 5μL，灭菌双蒸水5μL。退火程序为：95℃，5min；90℃，1 min；80℃，1 min；70℃，1min；60℃，1 min；50℃，1min；40℃，1 min；30℃，1 min；20℃，1 min；10℃，1 min。
（5）酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤（4）中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；
具体步骤为：利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系50μL，包括：质粒 5μL，10×buffer 5μL，Bsa I 2μL，灭菌双蒸水38μL，37℃酶切1h；
酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，可见1200bp 和 11520bp两个条带，回收11520bp的酶切产物备用；
利用T4 DNA连接酶将所回收的大片段酶切产物与步骤(4)所制备dsDNA进行连接，连接体系20μL：所回收载体酶切产物 3μL，退火所形成dsDNA产物 10μL，T4 DNA buffer 2μL，T4 DNA 连接酶 1μL，灭菌双蒸水 4μL，16℃过夜连接，得到连接产物；
（6）测序验证：将步骤（5）中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆（pHSE401载体抗性为卡那霉素）并进行菌落PCR检测；所述菌落PCR检测时，所用引物设计为:
名称 序列（5’→3’）
U6-26p-F TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
U6-26p-R CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC
经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到pHSE401-AIDP1载体；
测序时所用引物为上述U6-26p-F。
2、农杆菌转化
（7）将农杆菌感受态细胞C58C1溶解后加入步骤（6）中得到的载体pHSE401-AIDP1进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆。具体为：从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞（C58C1），放置冰上溶解后加入载体pHSE401-AIDP1 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有卡那霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆。
3、烟草转化
（8）将步骤（7）中得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液；具体为：挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时进行侵染。
（9）取野生型烟草叶片利用乙醇和HgCl2处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；具体为：将野生型烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍。
（10）将步骤（9）中得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入步骤（8）中得到的含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中进行培养后，将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；具体为：将步骤（9）中得到的无菌野生型烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、潮霉素(20mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2~3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽。
（11）待步骤（10）中的芽长至3~5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗；具体为; 将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中。
4、测序筛选编辑材料
（12）待步骤（11）中的0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取DNA，经扩增后得扩增产物，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株NtAIDP1基因缺失2个碱基的编辑材料；种植该编辑材料得T1代植株，通过测序筛选纯合突变单株并收种，获得具有NtAIDP1纯合突变的T2代烟草种子。具体为:待 T0代转基因苗生长1周左右，选取20株烟苗取叶片并利用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)提取DNA，利用步骤（3）中设计的引物NtAIDP1-SdF/SdR进行扩增，扩增产物纯化后利用正向引物测序。对测序结果分析，获得一株NtAIDP1基因缺失2个碱基的编辑材料（如图1所示）。种植该编辑材料T1代植株，通过测序筛选纯合突变单株并收种获得T2代种子。
实施例3，请参考图2，本发明的另一方面在于提供NtAIDP1基因突变体应用于降低烟叶烟碱的含量。
（13）对步骤（12）中得到的具有NtAIDP1纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T383-2010的方法检测植株烟叶烟碱含量；具体为：在温室种植得到的突变体株系与野生型烟草植株对照，在烟株旺长期，取整株叶片，杀青烘干，利用YC/T383-2010的方法检测烟叶烟碱含量。
（14）含有突变序列的T2代烟草相比含有SEQ ID NO:1野生型序列的烟草叶片烟碱含量显著降低；如图2所示，降低至50%左右。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草农业科学研究院
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATTGGCATCAAGTATGCTGAAGTC
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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AAACGACTTCAGCATACTTGATGC
<210> 3
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<212> DNA
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TCACAAATGGCACCGAGTTG
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GATGGAGTCCAATTGATCGG
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<212> DNA
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TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
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<213> 人工序列
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CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC
<210> 7
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ATGGTTGATTGTAAGATAGAAGATAACAAAGAAACCCTGCCAGAAAAGGGGGATGCCATTTCCAGTAGCGGCGTCACAAATGGCACCGAGTTGAAAAAGGACATACTCTCAGAAAAAGAGAACTTGGGCGAAGAGTTGGTGGCTCCAGGGAAGGAGCTGTTTCAAGATGTCGGTAGTTGCACAAAGAGTGAGACCCCAGACTTCAGCATACTTGATGCTACGAGTCCTCGGGTGCAGAATGAAGAAGGAGACTCAGCAGACGAAAAGGTTTTGTTCAAATCTCCCACCGTTGCCTCCAAAGCTGAAGGCGATGTAAATGCTAGTGAATCTCAAGGCCCTCGTGGCTGCAGGGACAGTACTAATCTTGATTCTACCGATCAATTGGACTCCATCATCCAGAATGAGAGTCTTATCAAAATTAGAGCGGATGATGAAGAACTTAAAAAACAGAAAGATGGGGTGACTGAAGGGGAGGTAAGTGGTCAGGCAACTAAAATGGAATCATGTACGATATATGTTGCTGGAAAAGAGGAACTGAAAATTGGAGTGAAGAGGTGTACCTCACTCTTAAACAATAAAGAAATGGAGGAGAACTTGAAGCGAGGAGCAATTCTGAAGCAGGCATCAACGGAAAATGAAACAAAGGAGGGATCGGATGATGTGTTGAAAGAGACAGAGGTGCTATCAGCCAATAAAATAAAGGATGAATTACTAAAGTCCGAATTGGATGTTGAACATGAGATTGATGTGAAAACTCCTGGCAAGACCTTTCTGCTGGATATAAATCCCATCGGGGGCGATGAGTCTGGAACAGAGGAAGAGCAAGCTGCATTTATGAAAGGGCTAGAGACTTTCCACAAAGAAAGGTGCTTGGAGTTCAAGGCCCCGCGGTTCTATGGAGAGCCATTAAATTGTCTCAAGTTGTGGAGAGCAGTGATCAGACTTGGTGGTTATGAGCAGGTAACATCATGCAAGCTATGGCGGCAAGTAGGAGAATCATTCAAACCCCCCAAGACTTGTACTACTGTCTCTTGGACATTCCGATGTTTTTACGAGAAGGCCCTACTAGAATATGAAAAGCACAAAATGCGTAGTGGTGAGCTTCCATTTGCTGAAGCTGCTTTTGCAGAACCTACTAGTTCTGGAATCCAGGGGAATCAAGCCTCCGGATCTGGTAGAGCGAGAAGAGATGCGGCAGCTCGAGCGATGCAAGGTTGGCATTCTCAACGTCTTCTTGGTAATGGTGAGGTTGGAGATCCTATCATTAAGGAGAAGAACTCTGTGTCTATGCCAAAGCGTGAAAAGCAACTTAAAAACATTGGTTTGAAGCGGAAAAAGCCATCCCCCATGGAGCAGGTTGCCAAAGTTACATGCATGAAAGTATCAAAACCGCATTTGGAGACAATGGTGGTGGATATTGGCCCTCCTGCTGACTGGGTGAAGATCAATGTGCAGAGAACTAAGGATTGTTACGAAGTGTATGCTTTAGTTCCTGGCCTTTTGCGTGAAGAGGTTCGCGTGCAGTCTGATCCAGCTGGGCGCTTGGTTATTTCTGGCCAACCTGAACAGCTGGACAATCCTTGGGGTGTTGCTCCATTCAAAAAGGTAGTCAGTTTACCTTCAAGAATTGATCCTCACCAGACCTCTGCTGTGGTTACTCTGCATGGGCAGCTCTTTGTGCGTGTACCATTTGAACAATCAAATATTTAG
<210> 8
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
MVDCKIEDNKETLPEKGDAISSSGVTNGTELKKDILSEKENLGEELVAPGKELFQDVGSCTKSETPDFSILDATSPRVQNEEGDSADEKVLFKSPTVASKAEGDVNASESQGPRGCRDSTNLDSTDQLDSIIQNESLIKIRADDEELKKQKDGVTEGEVSGQATKMESCTIYVAGKEELKIGVKRCTSLLNNKEMEENLKRGAILKQASTENETKEGSDDVLKETEVLSANKIKDELLKSELDVEHEIDVKTPGKTFLLDINPIGGDESGTEEEQAAFMKGLETFHKERCLEFKAPRFYGEPLNCLKLWRAVIRLGGYEQVTSCKLWRQVGESFKPPKTCTTVSWTFRCFYEKALLEYEKHKMRSGELPFAEAAFAEPTSSGIQGNQASGSGRARRDAAARAMQGWHSQRLLGNGEVGDPIIKEKNSVSMPKREKQLKNIGLKRKKPSPMEQVAKVTCMKVSKPHLETMVVDIGPPADWVKINVQRTKDCYEVYALVPGLLREEVRVQSDPAGRLVISGQPEQLDNPWGVAPFKKVVSLPSRIDPHQTSAVVTLHGQLFVRVPFEQSNI
<210> 9
<211> 1708
<212> DNA
<213> 人工序列
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ATGGTTGATTGTAAGATAGAAGATAACAAAGAAACCCTGCCAGAAAAGGGGGATGCCATTTCCAGTAGCGGCGTCACAAATGGCACCGAGTTGAAAAAGGACATACTCTCAGAAAAAGAGAACTTGGGCGAAGAGTTGGTGGCTCCAGGGAAGGAGCTGTTTCAAGATGTCGGTAGTTGCACAAAGAGTGAGACCCCAGTTCAGCATACTTGATGCTACGAGTCCTCGGGTGCAGAATGAAGAAGGAGACTCAGCAGACGAAAAGGTTTTGTTCAAATCTCCCACCGTTGCCTCCAAAGCTGAAGGCGATGTAAATGCTAGTGAATCTCAAGGCCCTCGTGGCTGCAGGGACAGTACTAATCTTGATTCTACCGATCAATTGGACTCCATCATCCAGAATGAGAGTCTTATCAAAATTAGAGCGGATGATGAAGAACTTAAAAAACAGAAAGATGGGGTGACTGAAGGGGAGGTAAGTGGTCAGGCAACTAAAATGGAATCATGTACGATATATGTTGCTGGAAAAGAGGAACTGAAAATTGGAGTGAAGAGGTGTACCTCACTCTTAAACAATAAAGAAATGGAGGAGAACTTGAAGCGAGGAGCAATTCTGAAGCAGGCATCAACGGAAAATGAAACAAAGGAGGGATCGGATGATGTGTTGAAAGAGACAGAGGTGCTATCAGCCAATAAAATAAAGGATGAATTACTAAAGTCCGAATTGGATGTTGAACATGAGATTGATGTGAAAACTCCTGGCAAGACCTTTCTGCTGGATATAAATCCCATCGGGGGCGATGAGTCTGGAACAGAGGAAGAGCAAGCTGCATTTATGAAAGGGCTAGAGACTTTCCACAAAGAAAGGTGCTTGGAGTTCAAGGCCCCGCGGTTCTATGGAGAGCCATTAAATTGTCTCAAGTTGTGGAGAGCAGTGATCAGACTTGGTGGTTATGAGCAGGTAACATCATGCAAGCTATGGCGGCAAGTAGGAGAATCATTCAAACCCCCCAAGACTTGTACTACTGTCTCTTGGACATTCCGATGTTTTTACGAGAAGGCCCTACTAGAATATGAAAAGCACAAAATGCGTAGTGGTGAGCTTCCATTTGCTGAAGCTGCTTTTGCAGAACCTACTAGTTCTGGAATCCAGGGGAATCAAGCCTCCGGATCTGGTAGAGCGAGAAGAGATGCGGCAGCTCGAGCGATGCAAGGTTGGCATTCTCAACGTCTTCTTGGTAATGGTGAGGTTGGAGATCCTATCATTAAGGAGAAGAACTCTGTGTCTATGCCAAAGCGTGAAAAGCAACTTAAAAACATTGGTTTGAAGCGGAAAAAGCCATCCCCCATGGAGCAGGTTGCCAAAGTTACATGCATGAAAGTATCAAAACCGCATTTGGAGACAATGGTGGTGGATATTGGCCCTCCTGCTGACTGGGTGAAGATCAATGTGCAGAGAACTAAGGATTGTTACGAAGTGTATGCTTTAGTTCCTGGCCTTTTGCGTGAAGAGGTTCGCGTGCAGTCTGATCCAGCTGGGCGCTTGGTTATTTCTGGCCAACCTGAACAGCTGGACAATCCTTGGGGTGTTGCTCCATTCAAAAAGGTAGTCAGTTTACCTTCAAGAATTGATCCTCACCAGACCTCTGCTGTGGTTACTCTGCATGGGCAGCTCTTTGTGCGTGTACCATTTGAACAATCAAATATTTAG
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<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
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MVDCKIEDNKETLPEKGDAISSSGVTNGTELKKDILSEKENLGEELVAPGKELFQDVGSCTKSETPVQHT

Claims (6)

1.一种改变烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，即：ATGGTTGATTGTAAGATAGAAGATAACAAAGAAACCCTGCCAGAAAAGGGGGATGCCATTTCCAGTAGCGGCGTCACAAATGGCACCGAGTTGAAAAAGGACATACTCTCAGAAAAAGAGAACTTGGGCGAAGAGTTGGTGGCTCCAGGGAAGGAGCTGTTTCAAGATGTCGGTAGTTGCACAAAGAGTGAGACCCCAGTTCAGCATACTTGATGCTACGAGTCCTCGGGTGCAGAATGAAGAAGGAGACTCAGCAGACGAAAAGGTTTTGTTCAAATCTCCCACCGTTGCCTCCAAAGCTGAAGGCGATGTAAATGCTAGTGAATCTCAAGGCCCTCGTGGCTGCAGGGACAGTACTAATCTTGATTCTACCGATCAATTGGACTCCATCATCCAGAATGAGAGTCTTATCAAAATTAGAGCGGATGATGAAGAACTTAAAAAACAGAAAGATGGGGTGACTGAAGGGGAGGTAAGTGGTCAGGCAACTAAAATGGAATCATGTACGATATATGTTGCTGGAAAAGAGGAACTGAAAATTGGAGTGAAGAGGTGTACCTCACTCTTAAACAATAAAGAAATGGAGGAGAACTTGAAGCGAGGAGCAATTCTGAAGCAGGCATCAACGGAAAATGAAACAAAGGAGGGATCGGATGATGTGTTGAAAGAGACAGAGGTGCTATCAGCCAATAAAATAAAGGATGAATTACTAAAGTCCGAATTGGATGTTGAACATGAGATTGATGTGAAAACTCCTGGCAAGACCTTTCTGCTGGATATAAATCCCATCGGGGGCGATGAGTCTGGAACAGAGGAAGAGCAAGCTGCATTTATGAAAGGGCTAGAGACTTTCCACAAAGAAAGGTGCTTGGAGTTCAAGGCCCCGCGGTTCTATGGAGAGCCATTAAATTGTCTCAAGTTGTGGAGAGCAGTGATCAGACTTGGTGGTTATGAGCAGGTAACATCATGCAAGCTATGGCGGCAAGTAGGAGAATCATTCAAACCCCCCAAGACTTGTACTACTGTCTCTTGGACATTCCGATGTTTTTACGAGAAGGCCCTACTAGAATATGAAAAGCACAAAATGCGTAGTGGTGAGCTTCCATTTGCTGAAGCTGCTTTTGCAGAACCTACTAGTTCTGGAATCCAGGGGAATCAAGCCTCCGGATCTGGTAGAGCGAGAAGAGATGCGGCAGCTCGAGCGATGCAAGGTTGGCATTCTCAACGTCTTCTTGGTAATGGTGAGGTTGGAGATCCTATCATTAAGGAGAAGAACTCTGTGTCTATGCCAAAGCGTGAAAAGCAACTTAAAAACATTGGTTTGAAGCGGAAAAAGCCATCCCCCATGGAGCAGGTTGCCAAAGTTACATGCATGAAAGTATCAAAACCGCATTTGGAGACAATGGTGGTGGATATTGGCCCTCCTGCTGACTGGGTGAAGATCAATGTGCAGAGAACTAAGGATTGTTACGAAGTGTATGCTTTAGTTCCTGGCCTTTTGCGTGAAGAGGTTCGCGTGCAGTCTGATCCAGCTGGGCGCTTGGTTATTTCTGGCCAACCTGAACAGCTGGACAATCCTTGGGGTGTTGCTCCATTCAAAAAGGTAGTCAGTTTACCTTCAAGAATTGATCCTCACCAGACCTCTGCTGTGGTTACTCTGCATGGGCAGCTCTTTGTGCGTGTACCATTTGAACAATCAAATATTTAG。
2.根据权利要求1所述改变烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体，其特征在于，所述降低烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，即：MVDCKIEDNKETLPEKGDAISSSGVTNGTELKKDILSEKENLGEELVAPGKELFQDVGSCTKSETPVQHT。
3.如权利要求1或2所述改变烟叶烟碱含量的NtAIDP1基因突变体的应用，其特征在于：所述NtAIDP1基因突变体在降低烟叶中烟碱含量上的应用。
4.根据权利要求1所述NtAIDP1基因突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法步骤包括，靶位点引物对：
P1：ATTGGCATCAAGTATGCTGAAGTC；
P2：AAACGACTTCAGCATACTTGATGC。
5.根据权利要求4所述NtAIDP1基因突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法步骤包括，检测引物对：
NtAIDP1-SdF: TCACAAATGGCACCGAGTTG；
NtAIDP1-SdR: GATGGAGTCCAATTGATCGG。
6.根据权利要求5所述NtAIDP1基因突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法步骤包括，菌落PCR检测引物对：
U6-26p-F：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；
U6-26p-R：CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690661A (zh) * 2020-06-01 2020-09-22 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草NtbHLH13基因突变体及分子鉴定方法和应用
CN116751787A (zh) * 2023-04-29 2023-09-15 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草烟碱代谢相关转录因子NtbHLH66及其编码基因、RNAi干扰载体和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用
CN113801884A (zh) * 2021-08-11 2021-12-17 云南省烟草农业科学研究院 一种提高烟叶烟碱含量的NtJAZ1基因突变体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用
CN113801884A (zh) * 2021-08-11 2021-12-17 云南省烟草农业科学研究院 一种提高烟叶烟碱含量的NtJAZ1基因突变体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAIYUN ZHAO 等: "NtAIDP1, a novel NtJAZ interacting protein, binds to an AT-rich region to activate the transcription of jasmonate-inducible genes in tobacco", 《JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY》, pages 1 - 9 *
ZHAO,C. 等: "Nicotiana tabacum A/T-rich interaction domain containing protein 1 mRNA, partial cds", 《GENBANK DATABASE》, pages 024827 *
宋中邦 等: "硃砂烟基因表达模式及烟碱转化率分析", 《中国烟草学报》, pages 75 - 80 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690661A (zh) * 2020-06-01 2020-09-22 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草NtbHLH13基因突变体及分子鉴定方法和应用
CN116751787A (zh) * 2023-04-29 2023-09-15 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草烟碱代谢相关转录因子NtbHLH66及其编码基因、RNAi干扰载体和应用

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