CN118726410A - 促进植物耐旱和早花的蔓花生wrky40转录因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及促进植物耐旱和早花的蔓花生WRKY40转录因子及其应用。所述蔓花生WRKY40转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；通过在植物中过表达所述蔓花生WRKY40转录因子，使转基因植物耐旱性提高，开花时间提前；所述植物包括拟南芥。本发明可为后续阐明植物响应干旱胁迫和早开花的调控机制提供理论支撑，也为耐旱性以及开花习性遗传改良和新种质创制奠定基础。

Description

促进植物耐旱和早花的蔓花生WRKY40转录因子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及促进植物耐旱和早花的蔓花生WRKY40转录因子及其应用。

背景技术

落花生属野生植物具有良好的环境适应性和观赏性，常被用作草坪草；由于其地上部具有高含量的粗蛋白和低含量的粗纤维，也可作为饲草。蔓花生是落花生属多年生野生二倍体植物，是栽培花生的祖先种之一，具有良好的耐旱性。挖掘、利用蔓花生耐旱基因对提高栽培花生的耐旱性具有指导意义。另外，如能促使作为草坪草的蔓花生提前开花，则能提高其观赏性，进而提高商业价值。

干旱胁迫影响花生的产量。干旱胁迫迫使花生根长变短、叶面积减少、气孔关闭、腺体密度下降和蒸腾作用降低。大田研究发现，干旱胁迫影响花生的生殖生长，主要作用于果针发育、荚果发育、灌浆期生物量积累等，最终使花生减产约30%。通过评价我国不同花生品种对干旱的响应发现，干旱胁迫降低了花生的株高、产量和茎叶片增长量。干旱胁迫显著影响叶组织结构，降低单株叶面积、功能叶面积、气孔导度、光合速率和蒸腾速率，增加比叶重。因此，急需提高花生的耐旱性。

WRKY是植物一种重要的转录因子，广泛参与植物生理发育以及生物和非生物胁迫过程。但是蔓花生WRKY是否具有调控植物耐旱性和调控开花习性的功能尚不清楚。

发明内容

为解决蔓花生WRKY转录因子调控植物耐旱性和开花习性相关应用滞后的问题，本发明旨在明确蔓花生WRKY40转录因子在促进植物耐旱和早花中的功能。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种促进植物耐旱和早花的蔓花生WRKY40转录因子，所述蔓花生WRKY40转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种重组表达载体，其包含所述蔓花生WRKY40转录因子。

进一步的，所述重组表达载体是将所述AdWRKY40基因插入pBI121过表达载体质粒的Nco I和Pml I位点之间获得。

第三方面，本发明提供包含所述重组表达载体的重组菌。

进一步的，所述重组菌是将所述重组表达载体转入到农杆菌感受态细胞EHA105获得。

第四方面，本发明提供所述蔓花生WRKY40转录因子在促进植物耐旱和早花中的应用，所述植物包括拟南芥。

第五方面，本发明提供所述重组表达载体在促进植物耐旱和早花中的应用，所述植物包括拟南芥。

第六方面，本发明提供所述重组工程菌在促进植物耐旱和早花中的应用，所述植物包括拟南芥。

本发明申请人课题组经前期研究发现，对蔓花生进行不同程度干旱胁迫处理，并利用qRT-PCR分析WRKY基因家族部分成员的表达量模式，结果显示，蔓花生WRKY40转录因子在干旱胁迫后呈上调差异表达。因此，申请人推测蔓花生WRKY40转录因子能够参与耐旱过程，并且过表达蔓花生WRKY40转录因子的拟南芥在长日照条件呈提前开花表型。该研究为提高植物耐旱性和促进开花的遗传改良及新种质创制奠定理论基础。

蔓花生WRKY40转录因子编码区长度为1098 bp，编码365个氨基酸。本发明使用生物信息学预测方法，在蔓花生响应RNA-seq数据鉴定了蔓花生WRKY40转录因子响应干旱胁迫。

所述工程菌可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的工程菌，比如农杆菌感受态细胞EHA105。但随着科技发展，所述工程菌选择也许会发生变化，或非转基因目的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只有含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围内。

所述蔓花生WRKY40转录因子通过调节植物的气孔导度、发芽率、脯氨酸含量、活性氧含量来提高植物耐旱性。

干旱胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，过表达蔓花生WRKY40转录因子转基因拟南芥的发芽率提高，从而降低失水率；转基因型拟南芥的气孔导度显著小于野生型拟南芥的气孔导度；转基因拟南芥中活性氧含量降低，脯氨酸含量增加。

野生型和过表达蔓花生WRKY40转录因子转基因植物的开花时间存在差异。在正常生长和干旱处理条件，相比野生型植物，过表达蔓花生WRKY40转录因子转基因植物均提前开花。但是，与正常生长条件的转基因植物相比，干旱处理延缓转基因植物的开花时间。与此不同，两种处理条件，野生型植物之间的开花时间无显著差异。

本发明中过表达蔓花生WRKY40转录因子转基因植物的构建方法，具体包括目的基因克隆、目的基因过表达载体构建、目的基因转化农杆菌、目的基因转化拟南芥、阳性株系鉴定、表型观测，确定早开花和抗旱材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现过表达蔓花生WRKY40转录因子在调控拟南芥耐旱和早开花中的作用。通过将过表达蔓花生WRKY40转录因子在拟南芥过表达，增强转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性并提前开花。通过比较该基因过表达拟南芥植株和野生型拟南芥植株，发现过表达蔓花生WRKY40转录因子会导致气孔关闭，能够提高植物的发芽率，降低失水率，但不影响根长的发育；转基因型拟南芥能够清除ROS、促进气孔闭合、积累脯氨酸、早开花。说明过表达蔓花生WRKY40转录因子能够有效增强拟南芥的耐旱性和促进开花，可为后续阐明植物响应干旱胁迫和早开花的调控机制提供理论支撑，也为耐旱性以及开花习性遗传改良和新种质创制奠定基础。

附图说明

图1为本发明中过表达AdWRKY40转基因植株PCR鉴定电泳图。条带1为DNA分子Marker；条带2-7为AdWRKY40转基因阳性植株。

图2为本发明中过表达AdWRKY40转基因拟南芥和野生型拟南芥的发芽率统计图，其中，A为正常生长条件，野生型和转基因株系的发芽表型图，B为干旱条件，野生型和转基因株系的发芽表型图，C为正常生长条件，野生型和转基因株系的发芽率统计图，D为干旱条件，野生型和转基因株系的发芽率统计图，A和B中，1-4依次为野生型拟南芥CK，转基因株系Ad40-2，转基因株系Ad40-4，转基因株系Ad40-5。

图3为本发明中过表达AdWRKY40转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱处理条件的离体叶片的失水率统计图。

图4为本发明中过表达AdWRKY40转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱处理条件的耐旱相关指标测定结果图，其中，A为O₂ ^-浓度统计图，B为H₂O₂浓度统计图，C为SOD含量统计图，D为CAT含量统计图，E为脯氨酸含量统计图。

图5为本发明中过表达AdWRKY40转基因拟南芥和野生型拟南芥的气孔导度测定结果图，其中，A为气孔导度表型图，B为气孔长宽比统计图。

图6为本发明中过表达AdWRKY40转基因拟南芥和野生型拟南芥长期干旱处理的存活率统计图。

图7为本发明中过表达AdWRKY40转基因拟南芥和野生型拟南芥的开花表型和开花时间统计图，其中，A为开花表型图，B为开花时间统计图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了蔓花生WRKY40转录因子的新用途，以下蔓花生WRKY40转录因子或称为AdWRKY40基因，所述AdWRKY40基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGTCTGATGAAGCTAAACAACTTCTCTACCAAGACCTTATTCTAGATCATCATCAGAATCAGAATATTATTGCAGGAGGAGGAAGATTATCCAACAACATGTTCTGTGAGAAGCAGTTTCCATCATCATCATCATCATCATCACAAGTAGCGTTTGATCCATCTTCATACATGAGCTTCACTGAATGCCTTCAAGGAGGGATGGACTATAACTCGCTTGCAACTTCTTTTGGTTTGTCTCCTTCTTCATCGGAGGTCTTTTCATCCATCGAAGGCAACAATAACAATCAAAAGCCCGAAGGTGATGTATTAGGAACTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGTAGTGAAACCCTTGCAACCCTGAACTCATCGATCTCTTCGTCATCATCTGAAGCCGGGGGCGAAGAAGATTCTGGAAAGAGCAACAAAGATAGCCAGGTCAAAGAAGAAGCAGCAGGAGAAACCTCTAAGAAGGGGAACAAGGAGAATAATAATAACAAGAAGAAAGGGGAGAAGAAGCAGAAGGAGCCAAGGTTTGCGTTCATGACAAAGAGCGAGGTTGATCATCTTGAAGATGGATACCGATGGAGAAAATACGGACAGAAAGCCGTTAAGAATAGCCCTTATCCAAGGAGCTACTACAGATGCACGACACAGAAGTGCAGTGTGAAGAAACGTGTGGAGAGGTGTTATCGGGATCCAACGACTGTGATAACAACCTATGAAGGTCAACACAACCATCCAGTCCCCACTTCTTTGAGAGGGAATGCGGCTTCAATGTTCACACCTTCCATGCTCTCCATCTCCGCCCCCACTCCCCTCCTCTCATCCGCCGGACATCACGACCTCGCCCTTTTTGCTCCTCTCTCTCACCACCACAACCAATATTCCGCTGCTTCTGGATCACAATCGTCCTTATTGTTTCATCACCATCAGAGTATTAACAACAACGTTAATAACAACAATATTAATAATAATAATAATAACTCTCTTCTTCTTCTCAATCATCATCATCATCCGTATAATAATCAGCAGCTTCCTCCTGAATATGGCCTCCTTCAAGACATGCTCCCTTCCATGTTCCTCAAGCAAGAGCCATGA。

AdWRKY40基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MSDEAKQLLYQDLILDHHQNQNIIAGGGRLSNNMFCEKQFPSSSSSSSQVAFDPSSYMSFTECLQGGMDYNSLATSFGLSPSSSEVFSSIEGNNNNQKPEGDVLGTGGGGGGGSETLATLNSSISSSSSEAGGEEDSGKSNKDSQVKEEAAGETSKKGNKENNNNKKKGEKKQKEPRFAFMTKSEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPYPRSYYRCTTQKCSVKKRVERCYRDPTTVITTYEGQHNHPVPTSLRGNAASMFTPSMLSISAPTPLLSSAGHHDLALFAPLSHHHNQYSAASGSQSSLLFHHHQSINNNVNNNNINNNNNNSLLLLNHHHHPYNNQQLPPEYGLLQDMLPSMFLKQEP。

实施例1：蔓花生AdWRKY40基因的克隆

本发明是以蔓花生为试验材料，来源是由青岛农业大学草业学院实验室提供。

1、引物设计

利用Primer 5.0软件分析设计扩增AdWRKY40基因的引物，设计的引物及其核苷酸序列如下所示：

AdWRKY40-F：5′-ATGTCTGATGAAGCTAAACAACTTCTC-3′，如SEQ ID NO.3所示；

AdWRKY40-R：5′-TCATGGCTCTTGCTTGAGGAA-3′，如SEQ ID NO.4所示。

2、RNA提取

利用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit RNA提取试剂盒，提取试验材料的总RNA，整个操作过程按照RNA提取试剂盒说明书进行提取流程，再以提取得到的该总RNA为模板经过反转录获得cDNA。

反转录反应程序如下：

第一步使RNA模板变性，在RNase-free离心管中加入1μL RNA和7μL ddH₂O后，在65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

第二步去除基因组DNA，往上一步的混合液中加入2μL 5×gDNA wiper Mix后，用移液器吹打混匀，42℃反应2min。

第三步配制第一链cDNA合成反应液，往上一步的混合液加入2μL 10×RT Mix、2μLHiScript III Enzyme Mix、1μL Oligo(dT)₂₀VN和5μL ddH₂O后，用移液器轻轻吹打混匀。最后在RT-PCR仪中50℃反应45min。

3、基因克隆

以获得的该cDNA为模板，利用引物AdWRKY40-F和AdWRKY40-R进行PCR扩增，获得1098bp的目的片段。

其中，PCR反应体系：取1μL的cDNA模板，5μL的2×Phanta Flash Master Mix，各0.5μL的正、反向引物，最后用ddH₂O补足到10μL；

PCR反应程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸4sec/kb，34个循环数；72℃彻底延伸5min。产物进行琼脂糖凝胶电泳。

4、胶回收与测序

对上述PCR扩增产物进行胶回收、测序，测序序列如SEQ ID NO.1所示。

经过比对AdWRKY40基因的编码区序列一致，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

实施例2：重组植物过表达载体的构建

1、双酶切过表达载体

胶回收后，使用Nco I和Pml I限制性内切酶将回收的PCR扩增产物与pBI121分别进行双酶切，具体步骤参考NEB说明书。

用凝胶电泳法检测酶切序列，对目的条带使用产物纯化试剂盒进行纯化回收，具体操作参考产物纯化试剂盒说明书。将纯化后的PCR扩增产物保存于-20℃冰箱中。

其中，产物纯化试剂盒：FastPure® Gel DNA Extraction Mini Kit产物纯化试剂盒：诺唯赞，南京，中国。

2、同源重组连接目的基因与过表达载体

使用同源重组试剂盒将目的基因片段与双酶切后的过表达载体进行连接，具体步骤参考同源重组试剂盒说明书。

其中，同源重组试剂盒：ClonExpress® Ultra One Step Cloning Kit同源重组试剂盒：诺唯赞，南京，中国。

PCR反应体系：2μL目的片段，3μL线性载体，5μL 2*ClonExpress Mix；

PCR反应程序：50℃连接30min后，立即4℃。

3、重组质粒转化大肠杆菌

把目的条带连接到双酶切的pBI121载体，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，具体步骤参考大肠杆菌感受态细胞DH5α的说明书。

其中，大肠杆菌感受态细胞DH5α：由上海唯地生物技术有限公司提供。

待转化完成后，将大肠杆菌菌液涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中培养36h。用无菌枪头挑取单克隆，用pBI121-F/R通用引物进行菌液PCR鉴定并测序。

其中，pBI121-F/R通用引物及其核苷酸序列如下所示：

pBI121-F：5'-GATATCTCCACTGACGTAAGG-3'，如SEQ ID NO.5所示；

pBI121-R：5'-GCGATCCAGACTGAATGC-3'，如SEQ ID NO.6所示。

将测序正确的单克隆菌液进行活化、保菌和提质粒，具体步骤参考质粒提取说明书。

其中，FastPure Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒：诺唯赞，南京，中国。

LB培养基：LB肉汤，型号HB0128，索奥，青岛，中国。

4、重组质粒转化农杆菌

将AdWRKY40过表达载体质粒转入到农杆菌感受态细胞EHA105中，具体步骤参考农杆菌感受态细胞EHA105的说明书。将转化的农杆菌菌液涂布在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上，倒置于28℃的培养箱中培养36h。用无菌枪头挑取单克隆，用pBI121-F/R通用引物进行菌液PCR鉴定。将鉴定正确的单克隆菌落进行活化和保菌，得到含有pBI121-AdWRKY40重组载体的农杆菌。

其中，农杆菌感受态细胞EHA105：由上海唯地生物技术有限公司提供。

实施例3：AdWRKY40转基因拟南芥植株筛选及表型分析

1、拟南芥植株准备

在超净工作台内将200粒拟南芥种子置入1.5mL离心管中，加入1mL ddH₂O摇晃振荡后，放在小型离心机内进行离心。随后，加入1mL体积分数为75%的酒精消毒30s，再次用ddH₂O洗一遍。加入质量分数为10%的NaClO消毒6min，期间用手摇晃离心管。ddH₂O洗3次后，加入1mL ddH₂O浸泡，吸胀45min。用1mL无菌枪头吸取拟南芥种子，均匀铺在1/2MS固体培养基上，待4℃萌发3d后，将培养皿转移至24℃、16h光照/8h黑暗的光照培养箱中培养，待长出3片真叶后即可移栽至土中。拟南芥在土中继续生长，期间正常浇水管理，至抽薹后，以备遗传转化使用。

其中，1/2MS固体培养基；琼脂粉Agar：博奥拓达，北京，中国；MS粉：型号M519，PhytoTech，美国。

2、侵染菌液制备

挑取含有pBI121-AdWRKY40重组载体的农杆菌菌体，用含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基于28℃恒温摇床上、200rpm培养过夜，至OD₆₀₀为0.8左右。取摇好的菌液200mL，放入离心管内，于24℃、8000rpm条件下离心10min，以收集菌体。将离心后的上清液倒掉，并加入提前准备好的质量分数为5%的蔗糖溶液，将其混匀重悬至OD₆₀₀为1.0左右，制备重悬菌液。随即加入质量分数为0.03%的表面活化剂sliwet-77，获得侵染液备用。

其中，5%蔗糖溶液是用1/2MS溶液配制得到的。1/2MS溶液的配方注册表为向烧杯中加入2.22g的MS粉、8g蔗糖后，加入超纯水定容至1L。用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，调pH到5.85即可。

表面活化剂sliwet-77：型号S9430，索莱宝，北京，中国。

3、蘸花法侵染拟南芥

将拟南芥花序浸入侵染液中60s，立即取出，于黑暗条件下培养24h，随后转入正常条件下继续生长。在7d后，使用棉棒蘸取侵染液涂抹拟南芥花序，进行二次侵染。

侵染后，拟南芥正常管理，直至种子成熟，收获转基因拟南芥成熟种子。

其中，拟南芥花序指的是去掉已结的果荚和盛开的花，仅保留未开放的花苞。

拟南芥正常管理的方法/条件为拟南芥植株在24℃、16h光照/8h黑暗条件下培养，期间用Hoagland营养液补充水分。Hoagland营养液配方如表1所示：

表1营养液配方

4、转基因植株鉴定

将转基因拟南芥成熟种子消毒后，均匀地铺在含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固体培养基上。具体步骤同上述拟南芥种植方法的步骤。待拟南芥幼苗生长至6叶后，取生长良好的叶片，利用CTAB法提取DNA，以野生型拟南芥植株作为阴性对照，用AdWRKY40-F/pBI121-R引物，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性株系。

其中，CTAB法提取DNA的步骤如下：

（1）将65℃预热后的40mL CTAB与20μL RNA酶按照1：2000体积比例混合。

（2）取0.2g叶片装进2mL离心管中，打成匀浆，简单离心，将离心管口的匀浆全部甩到离心管底部，加入700μL的CTAB。

（3）在65℃水浴锅中恒温保存30min，中间颠倒离心管3次。

（4）加入700μL的DNA提取液，充分摇晃使其完全混合。此步骤需避光，防止DNA的分解。

（5）室温下使用高速冷冻离心机在13000rpm 下将混合液离心15min。

（6）取600μL上清，转移到新的离心管中，加入400μL异丙醇，于-20℃混匀放置15min。

（7）将上述反应物在4℃、13000rpm下离心15min，去掉上清后，加入400μL体积分数为75%的乙醇，洗涤三次。

（8）室温下13000 rpm离心5min，去掉上层异丙醇，并吸出多余液体。在超净台内风干，风干后加入100μL的ddH₂O。

（9）4℃过夜放置，获得DNA，-20℃保存备用。

PCR扩增的条件为以拟南芥DNA为模板，用2×Phanta Flash Master Mix试剂盒进行RT-PCR鉴定。

PCR反应体系：取1μL的DNA模板，5μL的2×Phanta Flash Master Mix，各0.5μL的AdWRKY40-F、pBI121-R，最后用ddH₂O补足到10μL。

PCR反应程序：第一步，98℃预变性30sec；第二步，98℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸5sec/kb，进行34个循环数；最后，72℃彻底延伸5min。

野生型拟南芥植株来源由青岛农业大学草业学院实验室提供。

鉴定结果如图1所示，转基因株系出现了1098bp片段，而野生型株系没有，说明AdWRKY40过表达载体已成功导入拟南芥基因组。随机选取3个纯合转基因株系用于后续试验。

具体扩繁步骤如下：在超净工作台内将200粒拟南芥种子置入1.5mL离心管中，加入1mL ddH₂O摇晃振荡后，放在小型离心机内进行离心。随后，加入1mL体积分数为75%的酒精消毒30s，再次用ddH₂O洗一遍。加入质量分数为10%的NaClO消毒6min，期间用手摇晃离心管。ddH₂O洗3次后，加入1mL ddH₂O浸泡，吸胀45min。用1mL无菌枪头吸取拟南芥种子，均匀铺在1/2MS固体培养基上，待4℃萌发3d后，将培养皿转移至24℃、16h光照/8h黑暗的光照培养箱中培养，待长出3片真叶后即可移栽至土中。拟南芥在土中继续生长，期间正常浇水管理，直至种子成熟，收获转基因拟南芥种子。

5、转基因拟南芥耐旱性和开花习性评价

将野生型和阳性纯合转基因型拟南芥种子使用10%次氯酸钠进行表面消毒10min，分别置于含有0mM、100mM、200mM和300mM甘露醇的1/2MS培养基，4℃培养3d，打破种子休眠，置于16h/8h光暗交替的培养箱进行发芽测定。种子子叶变绿，认定为发芽。连续10d统计发芽率，设置3个生物学重复，每个重复20个样本。分别称取0.5g野生型和转基因型拟南芥大小一致的莲座叶片离体置于组织培养箱，湿度28%，光照66%，共3个重复，每20min称重，累计200min，计算相对失水率。分别使用质量体积浓度10%的PEG6000和100µM ABA处理四周龄的野生型和转基因型拟南芥。按照北京索莱宝科技有限公司试剂盒使用说明书，分别测定胁迫前后过氧化氢H₂O₂、超氧阴离子O^2-、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和脯氨酸的含量。野生型拟南芥为对照组，设置3个生物学重复。另外，使用荧光倒置显微镜测量PEG6000处理前后野生型和转基因型拟南芥叶片下表皮细胞气孔的长度和宽度，并使用荧光倒置显微镜自带程序进行拍照，设置50个生物学重复。对四周龄野生型和转基因拟南芥进行30d自然干旱处理，随后进行7d复水培养，统计野生型和转基因拟南芥的存活率。

结果如图2所示，在正常生长状态下，野生型和转基因型拟南芥的发芽率无差异，但是，在300mM甘露醇胁迫，转基因型拟南芥的发芽率高于野生型拟南芥的发芽率。如图3所示，转基因型拟南芥的相对失水率低于野生型拟南芥的相对失水率。如图4所示，干旱胁迫下，转基因型拟南芥积累高浓度的O^2-，低浓度H₂O₂，高含量的SOD酶和CAT酶。相比野生型拟南芥，干旱胁迫下，转基因型拟南芥含有高浓度的脯氨酸。如图5所示，正常生长条件以及10%PEG6000处理3d，转基因型拟南芥的气孔导度显著小于野生型拟南芥的气孔导度。如图6所示，对野生型和转基因拟南芥进行长期干旱处理，复水后，转基因拟南芥的存活率显著高于野生型拟南芥。

将野生型和阳性纯合转基因型拟南芥种子使用10%次氯酸钠进行表面消毒10min，置于1/2MS培养基，4℃培养3d，打破种子休眠，置于16h/8h光暗交替的培养箱进行发芽测定。种子子叶变绿，认定为发芽，即为生长周期第1天。正常生长1周，随后将幼苗移植于温室，土培。统计野生型和转基因植物的开花时间，并于3周龄时进行拍照。

结果如图7所示，在正常生长和干旱处理条件，相比野生型植物，AdWRKY40转基因植物均提前开花。

上述结果表明，AdWRKY40是参与调控拟南芥耐旱性和早开花的重要基因，可以用于调控其它植物的耐旱性和早开花。

实施例4：AdWRKY40基因在蔓花生开花耐旱性遗传改良育种中的应用

在生产实践中，可将上述基因转化蔓花生或花生外植体细胞，再将转化后的愈伤组织培育成植株。通过转基因方法，利用植物表达载体转化外植体细胞以培育耐旱早开花的蔓花生或花生。

在生产实践中，还可将上述基因通过分子标记辅助选择育种方法来增强育种目标的效率和准确性。如利用分子标记将目的基因与蔓花生的耐旱早开花早性状关联，通过检测目的基因的存在，从而达到选择目标性状的目的。本发明中发现了AdWRKY40基因在调控植物耐旱早开花的功能及具体应用，为蔓花生耐旱早开花育种提供了新的基因资源，也为进一步解析AdWRKY40调控植物耐旱早开花的分子机制奠定基础。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变形而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变形属于本发明等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形在内。

Claims (8)

1.一种促进植物耐旱和早花的蔓花生WRKY40转录因子，其特征在于，所述蔓花生WRKY40转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求1中所述蔓花生WRKY40转录因子。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，是将所述蔓花生WRKY40转录因子插入pBI121过表达载体质粒的Nco I和Pml I位点之间获得。

4.包含权利要求3所述重组表达载体的重组工程菌。

5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，是将所述重组表达载体转入到农杆菌感受态细胞EHA105获得。

6.权利要求1所述蔓花生WRKY40转录因子在促进植物耐旱和早花中的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。

7.权利要求2~3任一项所述重组表达载体在促进植物耐旱和早花中的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。

8.权利要求4~5任一项所述重组工程菌在促进植物耐旱和早花中的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。