CN118147175B - MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的应用。所述MtCOMT13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MtCOMT13基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用基因工程手段为过表达遗传转化，具体包括目的基因克隆、目的基因过表达载体构建、目的基因转化农杆菌、目的基因转化拟南芥、阳性株系鉴定、表型观测，为植物耐盐抗旱性分子调控机制研究奠定理论基础。

Description

MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的应用。

背景技术

豆类植物是重要的粮食和牧草，为人类和动物提供优质的蛋白质、维生素和微量元素等营养物质。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）具有基因组小、生命周期短、自花授粉能力强、大量突变体等优点，且与紫花苜蓿亲缘关系近、基因组同源性高，因此成为苜蓿生物学问题研究的模式植物。

在环境制约因素中，盐碱化和干旱是影响植物生长发育和生理生化代谢的主要非生物胁迫，最终将导致作物产量降低。长期以来，土壤盐碱化被认为是世界范围内的常见环境现象，并且正在成为土地退化的全球性问题，尤其在干旱和半干旱地区发生频率更高。在我国，盐碱化和干旱的土地面积逐年增加，作物产量受到严重影响，致使农业发展和粮食安全受到限制。

植物在遭受盐和干旱等非生物胁迫时细胞内会积累大量的活性氧，进而引发细胞氧化还原系统稳态紊乱。过量的活性氧通过破坏核酸、氧化蛋白等造成细胞结构破坏，阻碍细胞正常生理代谢功能发挥，从而限制植物生物量和产量形成。

褪黑素是高等植物中普遍存在的吲哚类激素，在调节植物生长发育如根器官发生、开花、衰老等方面发挥重要作用。此外，褪黑素还被证明是一种重要抗氧化剂，可以通过直接清除活性氧或间接增加抗氧化酶活性、光合效率和代谢产物合成等增强植物对多种非生物胁迫的耐受性，如寒冷、盐、干旱、氧化胁迫和营养缺乏。

COMT（Caffeic acid O-methyltransferase）是植物的功能基因家族之一，参与植物生长发育调控与非生物胁迫应答。目前，在模式植物拟南芥和水稻中已经证实了COMT基因具有调控耐盐性的功能，然而有关蒺藜苜蓿COMT基因家族的鉴定还未见报道，其调控植物耐盐抗旱的功能尚不清楚。即目前尚未有蒺藜苜蓿COMT基因家族在调控植物耐盐抗旱性的相关应用。

发明内容

为解决现有技术中目前尚未有蒺藜苜蓿COMT基因家族在调控植物耐盐抗旱性的相关应用的问题，本发明旨在明确MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的功能及具体应用。为实现上述目的，以解决上述技术问题。本发明采用如下技术方案：

本发明申请人课题组经前期研究发现，对蒺藜苜蓿进行不同程度盐胁迫和干旱胁迫处理，并利用qRT-PCR分析COMT基因家族中部分成员的表达量变化，结果显示，盐胁迫下MtCOMT13的表达量是对照的8.96倍，干旱胁迫下MtCOMT13的表达量是对照的3.91倍。因此，申请人推测MtCOMT13基因能够参与蒺藜苜蓿耐盐抗旱性的调控。为了验证上述推测，对MtCOMT13基因进行功能研究，阐明其在调控植物耐盐抗旱性中的作用，将对植物耐盐抗旱性的遗传改良及新种质创制奠定理论基础。

基于上述研究，本发明提供了MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的应用，所述MtCOMT13基因的编码区序列如SEQ ID NO.1所示。

所述MtCOMT13基因为褪黑素生物合成的关键限速基因，其编码区长度为1098bp，所编码蛋白质的相对分子量为40kDa，理论等电点为5.67，属于相对稳定的亲水性酸性蛋白质。本发明是从蒺藜苜蓿MtCOMT基因家族中通过盐胁迫和干旱胁迫筛选鉴定获得的。

本发明还提供了一种扩增所述MtCOMT13基因的引物对，所述引物对包括MtCOMT13-F和MtCOMT13-R；

其中，MtCOMT13-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3；MtCOMT13-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

上述引物对是利用Primer 5.0设计的，由生工生物有限公司（上海）合成，具有从蒺藜苜蓿基因组中克隆MtCOMT13基因全长编码区的作用。

本发明还提供了一种包含所述MtCOMT13基因的重组表达载体、或所述重组表达载体的工程菌或宿主细胞。利用所述MtCOMT13基因构建重组表达载体、或所述重组表达载体的工程菌或宿主细胞，将重组表达载体或所述重组表达载体的工程菌或宿主细胞转入植物中，以提高植物的耐盐抗旱性。

其中，所述重组表达载体包括所述MtCOMT13基因，还包括用于连接所述MtCOMT13基因的质粒。

优选地，所述质粒包括pCAMBIA3301过表达载体、pFGC-eYFP载体、 pEarlyGate100载体。

通过包含所述蒺藜苜蓿耐盐抗旱基因MtCOMT13的重组表达载体可以转化获得含MtCOMT13基因重组表达载体的工程菌或宿主细胞，如含pCAMBIA3301-MtCOMT13的大肠杆菌或农杆菌。

所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的工程菌或宿主细胞，比如大肠杆菌感受态细胞DH5α、农杆菌感受态细胞EHA105和农杆菌感受态细胞GV3101。但随着科技发展，所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化，或非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只有含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围内。

通过包含所述蒺藜苜蓿耐盐抗旱基因MtCOMT13的所述重组表达载体的工程菌或宿主细胞可以创制过表达MtCOMT13的转基因阳性植株和种子。

本发明还提供了所述MtCOMT13基因或其编码的蛋白或所述重组载体、工程菌或宿主细胞在提高植物耐盐抗旱性中的应用。

其中，所述植物包括拟南芥和苜蓿。具体的，苜蓿为蒺藜苜蓿和紫花苜蓿。

优选地，使拟南芥转化入如所述MtCOMT13基因或其编码的蛋白。

利用蘸花法将包含pCAMBIA3301-MtCOMT13重组表达载体的农杆菌菌液侵染拟南芥花序，使目的基因转化进入拟南芥中。

优选地，所述MtCOMT13基因通过调节光合作用来提高植物耐盐抗旱性。具体地，所述MtCOMT13基因用以调节植物叶绿素含量来提高植物耐盐抗旱性。

所述MtCOMT13基因用于调节植物的气孔导度、蒸腾速率和净光合速率来提高植物耐盐抗旱性。

盐胁迫和干旱胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，过表达MtCOMT13转基因拟南芥叶片的气孔导度、蒸腾速率、净光合速率得到显著改善，表明MtCOMT13基因调控盐和干旱胁迫下植株的光合作用。

本发明还提供了一种培育耐盐抗旱转基因植物的方法，将含有所述MtCOMT13基因在拟南芥中过表达，获得耐盐抗旱性增强的转基因拟南芥。

本发明所提供的培育耐盐抗旱转基因植物方法，具体包括目的基因克隆、目的基因过表达载体构建、目的基因转化农杆菌、目的基因转化拟南芥、阳性株系鉴定、表型观测，确定耐盐抗旱材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现MtCOMT13基因在调控拟南芥耐盐抗旱性中的应用。通过将蒺藜苜蓿MtCOMT13基因在拟南芥中过表达，增强转基因拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的抗性。通过比较该基因过表达拟南芥植株和野生型拟南芥植株，发现MtCOMT13基因过表达植株的生长表型和光合作用均显著优于野生型。说明MtCOMT13基因能够有效增强拟南芥的耐盐抗旱性，可为后续阐明植物响应盐胁迫和干旱胁迫的调控机制提供理论支撑，也为耐盐抗旱性遗传改良和新种质创制奠定基础。

附图说明

图1为本发明中过表达MtCOMT13转基因植株PCR鉴定电泳图。

图2为本发明中过表达MtCOMT13转基因植株中目的基因相对表达量。

图3为本发明中过表达MtCOMT13转基因拟南芥和野生型拟南芥的表型分析；其中，A为盐和干旱胁迫对转基因拟南芥植株生长表型的影响；B为盐和干旱胁迫对转基因拟南芥叶绿素含量的影响；C为盐和干旱胁迫对转基因拟南芥气孔导度的影响；D为盐和干旱胁迫对转基因拟南芥胞间CO₂浓度的影响；E为盐和干旱胁迫对转基因拟南芥蒸腾速率的影响；F为盐和干旱胁迫对转基因拟南芥净光合速率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种蒺藜苜蓿耐盐抗旱基因MtCOMT13的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGGTTCAACAGGTGAAACTCAAATAACACCAACTCACATATCAGATGAAGAAGCAAACCTCTTCGCCATGCAACTAGCAAGTGCCTCAGTTCTTCCCATGGTTTTAAAATCAGCTCTTGAACTTGATCTCTTAGAAATCATTGCTAAAGCTGGACCTGGTGCTCAAATTTCACCTATTGAAATTGCTTCTCAGCTCCCAACAACTAACCCTGAAGCACCGGTTATGCTGGACCGTATCTTGCGTCTATTGGCTTGTTACAATATCCTCACTTGTTCTGTTCGTACTCAACAAGATGGAAAGGTTCAGAGACTTTATGGTTTGGCTACTGTTGCTAAGTATCTGGTTAAGAATGAAGATGGAGTATCCATTTCTGCTCTTAACCTCATGAATCAGGATAAAGTTCTCATGGAAAGCTGGTACCACCTAAAAGATGCAGTCCTTGATGGGGGCATTCCATTCAACAAGGCTTATGGAATGACAGCCTTTGAATACCATGGAACAGATCCAAGGTTTAACAAGGTTTTCAACAAGGGGATGTCTGATCACTCTACCATCACAATGAAGAAAATTCTTGAGACCTACACAGGTTTTGAAGGCCTTAAATCTCTTGTTGATGTAGGTGGTGGTACTGGAGCTGTAATTAACACGATTGTCTCAAAATATCCCACCATTAAGGGTATTAATTTTGATTTACCCCATGTCATTGAAGATGCTCCATCTTATCCAGGAGTTGAGCATGTTGGTGGAGACATGTTTGTCAGTATTCCAAAGGCTGATGCTGTTTTTATGAAGTGGATTTGTCATGACTGGAGTGATGAGCACTGCTTGAAATTTTTGAAGAACTGCTATGAAGCACTGCCAGACAATGGAAAAGTGATTGTGGCAGAATGCATACTTCCAGTGGCTCCAGATTCAAGCCTGGCCACAAAAGGTGTGGTTCACATTGATGTAATCATGTTGGCTCATAATCCAGGTGGGAAAGAGAGAACACAGAAAGAGTTTGAGGATCTTGCCAAAGGTGCTGGATTCCAAGGTTTCAAAGTTCATTGTAATGCTTTCAACACATACATCATGGAATTTCTTAAGAAGGTTTAA。

该基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MGSTGETQITPTHISDEEANLFAMQLASASVLPMVLKSALELDLLEIIAKAGPGAQISPIEIASQLPTTNPEAPVMLDRILRLLACYNILTCSVRTQQDGKVQRLYGLATVAKYLVKNEDGVSISALNLMNQDKVLMESWYHLKDAVLDGGIPFNKAYGMTAFEYHGTDPRFNKVFNKGMSDHSTITMKKILETYTGFEGLKSLVDVGGGTGAVINTIVSKYPTIKGINFDLPHVIEDAPSYPGVEHVGGDMFVSIPKADAVFMKWICHDWSDEHCLKFLKNCYEALPDNGKVIVAECILPVAPDSSLATKGVVHIDVIMLAHNPGGKERTQKEFEDLAKGAGFQGFKVHCNAFNTYIMEFLKKV。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 蒺藜苜蓿MtCOMT13基因的克隆

本发明是以二倍体蒺藜苜蓿R108为试验材料，二倍体蒺藜苜蓿R108的来源是由青岛农业大学草业学院实验室提供。

引物设计

利用Primer 5.0软件分析设计扩增MtCOMT13目的片段的引物，设计的引物及其核苷酸序列如下所示：

MtCOMT13-F（SEQ ID NO.3）：5′-ATGGGTTCAACAGGTGAAACTCA-3′；

MtCOMT13-R（SEQ ID NO.4）：5′-TTAAACCTTCTTAAGAAATTCCATGATG-3′。

RNA提取

利用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Polysaccharides&Polyphenolics-rich）RNA提取试剂盒，提取试验材料的总RNA，整个操作过程按照RNA提取试剂盒说明书进行提取流程，再以提取得到的该总RNA为模板经过反转录获得cDNA。

其中，FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Polysaccharides&Polyphenolics-rich）：诺唯赞，南京，中国。

反转录反应程序如下：

第一步使RNA模板变性，在RNase-free离心管中加入1μL RNA和7μL ddH₂O后，在65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

第二步去除基因组DNA，往上一步的混合液中加入2μL 5×gDNA wiper Mix后，用移液器吹打混匀，42℃反应2min。

第三步配制第一链cDNA合成反应液，往上一步的混合液加入2μL 10×RT Mix、2μLHiScript III Enzyme Mix、1μL Oligo(dT)₂₀VN和5μL ddH₂O后，用移液器轻轻吹打混匀。最后在RT-PCR仪中50℃反应45min。

基因克隆

以获得的该cDNA为模板，利用引物MtCOMT13-F和MtCOMT13-R进行PCR扩增，获得1098bp的目的片段。

其中，PCR反应体系：取1μL的cDNA模板，5μL的2×Phanta Flash Master Mix（DyePlus），各0.5μL的正、反向引物，最后用ddH₂O补足到10μL；

PCR反应程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸4sec/kb，34个循环数；72℃彻底延伸5min。产物进行琼脂糖凝胶电泳。

胶回收与测序

对上述PCR扩增产物进行胶回收、测序，测序序列如SEQ ID NO.1所示。

经过比对MtCOMT13基因的编码区序列一致，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

实施例2 重组植物过表达载体pCAMBIA3301-MtCOMT13的构建

1、双酶切过表达载体

胶回收后，使用Nco I和Pml I限制性内切酶将回收的PCR扩增产物与pCAMBIA3301过表达载体的质粒分别进行双酶切，具体步骤参考NEB说明书。

用凝胶电泳法检测酶切序列，对目的条带使用产物纯化试剂盒进行纯化回收，具体操作参考产物纯化试剂盒说明书。将纯化后的PCR扩增产物保存于-20℃冰箱中。

其中，产物纯化试剂盒：FastPure® Gel DNA Extraction Mini Kit产物纯化试剂盒：诺唯赞，南京，中国。

2、同源重组连接目的基因与过表达载体

使用同源重组试剂盒将目的基因片段与双酶切后的过表达载体进行连接，具体步骤参考同源重组试剂盒说明书。

其中，同源重组试剂盒：ClonExpress® Ultra One Step Cloning Kit同源重组试剂盒：诺唯赞，南京，中国。

PCR反应体系：取2μL目的片段、3μL线性载体、5μL2*ClonExpress Mix；

PCR反应程序：50℃连接30min后，立即4℃。

3、重组质粒转化大肠杆菌

把目的条带连接到酶切好的pCAMBIA3301过表达载体后，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，具体步骤参考大肠杆菌感受态细胞DH5α的说明书。

其中，大肠杆菌感受态细胞DH5α：上海唯地生物技术有限公司。

待转化完成后，将大肠杆菌菌液涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中培养36h。用无菌枪头挑取单克隆，用pCAMBIA3301-F/R通用引物进行菌液PCR鉴定并测序。

其中，pCAMBIA3301-F/R通用引物及其核苷酸序列如下所示：

pCAMBIA3301-F（SEQ ID NO.5）：5'-GAAACCTCCTCGGATTCCATTG-3'；

pCAMBIA3301-R（SEQ ID NO.6）：5'-ATTGCGGGACTCTAATCATAAAAAC-3'。

将测序正确的单克隆菌液进行活化、保菌和提质粒，具体步骤参考质粒提取说明书。

其中，质粒：FastPure Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒：诺唯赞，南京，中国。

LB培养基：LB肉汤，型号HB0128，索奥，青岛，中国。

4、重组质粒转化农杆菌

将MtCOMT13过表达载体质粒转入到农杆菌感受态细胞EHA105中，具体步骤参考农杆菌感受态细胞EHA105的说明书。将转化的农杆菌菌液涂布在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上，倒置于28℃的培养箱中培养36h。用无菌枪头挑取单克隆，用pCAMBIA3301-F/R通用引物进行菌液PCR鉴定。将鉴定正确的单克隆菌落进行活化和保菌，得到含有pCAMBIA3301-MtCOMT13重组载体的农杆菌。

其中，农杆菌感受态细胞EHA105：上海唯地生物技术有限公司。

pCAMBIA3301-F（SEQ ID NO.5）：5'-GAAACCTCCTCGGATTCCATTG-3'；

pCAMBIA3301-R（SEQ ID NO.6）：5'-ATTGCGGGACTCTAATCATAAAAAC-3'。

实施例3 转基因功能验证-MtCOMT13转基因拟南芥植株筛选及表型分析

1、拟南芥植株准备

在超净工作台内将200粒拟南芥种子置入1.5mL离心管中，加入1mL ddH₂O摇晃振荡后，放在小型离心机内进行离心。随后，加入1mL 体积分数为75%的酒精消毒30s，再次用ddH₂O洗一遍。加入质量分数为10%的NaClO消毒6min，期间用手摇晃离心管。ddH₂O洗3次后，加入1mL ddH₂O浸泡，吸胀45min。用1mL无菌枪头吸取拟南芥种子，均匀铺在1/2MS固体培养基上，待4℃萌发3d后，将培养皿转移至24℃、16h光照/8h黑暗的光照培养箱中培养，待长出3片真叶后即可移栽至土中。拟南芥在土中继续生长，期间正常浇水管理，至抽薹后，以备遗传转化使用。

其中，1/2MS固体培养基；琼脂粉Agar：博奥拓达，北京，中国；MS粉：型号M519，PhytoTech，美国。

2、侵染菌液制备

挑取含有pCAMBIA3301-MtCOMT13重组载体的农杆菌菌体，用含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基于28℃恒温摇床上、200rpm培养过夜，至OD₆₀₀为0.8左右。取摇好的菌液200mL，放入离心管内，于24℃、8000rpm条件下离心10min，以收集菌体。将离心后的上清液倒掉，并加入提前准备好的质量分数为5%的蔗糖溶液，将其混匀重悬至OD₆₀₀为1.0左右，制备重悬菌液。随即加入质量分数为0.03%的表面活化剂sliwet-77，获得侵染液备用。

其中，5%蔗糖溶液是用1/2MS溶液配制得到的。1/2MS溶液的配方注册表为向烧杯中加入2.22g的MS粉、8g蔗糖后，加入超纯水定容至1L。用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，调pH到5.85即可。

表面活化剂sliwet-77：型号S9430，索莱宝，北京，中国。

3、蘸花法侵染拟南芥

将拟南芥花序浸入侵染液中60s，立即取出，于黑暗条件下培养24h，随后转入正常条件下继续生长。在7d后，使用棉棒蘸取侵染液涂抹拟南芥花序，进行二次侵染。

侵染后，拟南芥正常管理，直至种子成熟，收获转基因拟南芥成熟种子。

其中，拟南芥花序指的是去掉已结的果荚和盛开的花，仅保留未开放的花苞。

拟南芥正常管理的方法/条件为拟南芥植株在24℃、16h光照/8h黑暗条件下培养，期间用Hoagland营养液补充水分。Hoagland营养液配方如表1所示：

表1 Hoagland营养液配方

4、转基因植株鉴定

将转基因拟南芥成熟种子消毒后，均匀地铺在含有7.5μg/mL PPT（草丁膦）的1/2MS固体培养基上。具体步骤同上述拟南芥种植方法的步骤。待拟南芥幼苗生长至6叶后，取生长良好的叶片，利用CTAB法提取DNA，以野生型拟南芥植株作为阴性对照，用MtCOMT13-F/pCAMBIA3301-R引物，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性株系。

其中，CTAB法提取DNA的步骤如下：

（1）将65℃预热后的40mL CTAB与20μL RNA酶按照1：2000体积比例混合。

（2）取0.2g叶片装进2mL离心管中，打成匀浆，简单离心，将离心管口的匀浆全部甩到离心管底部，加入700μL的CTAB。

（3）在65℃水浴锅中恒温保存30min，中间颠倒离心管3次。

（4）加入700μL的DNA提取液，充分摇晃使其完全混合。此步骤需避光，防止DNA的分解。

（5）室温下使用高速冷冻离心机（Legend Micro 21R，Thermo Fisher，美国）在13000rpm 下将混合液离心15min。

（6）取600μL上清，转移到新的离心管中，加入400μL异丙醇，于-20℃混匀放置15min。

（7）将上述反应物在4℃、13000rpm下离心15min，去掉上清后，加入400μL体积分数为75%的乙醇，洗涤三次。

（8）室温下13000 rpm离心5min，去掉上层异丙醇，并吸出多余液体。在超净台内风干，风干后加入100μL的ddH₂O。

（9）4℃过夜放置，获得DNA，-20℃保存备用。

PCR扩增的条件为以拟南芥DNA为模板，用2×Phanta Flash Master Mix（DyePlus）试剂盒（诺唯赞，南京，中国）进行RT-PCR鉴定。

PCR反应体系：取1μL的DNA模板，5μL的2×Phanta Flash Master Mix（Dye Plus），各0.5μL的MtCOMT13-F、pCAMBIA3301-R引物，最后用ddH₂O补足到10μL。

PCR反应程序：第一步98℃预变性30sec；第二步98℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸5sec/kb，进行34个循环数；最后72℃彻底延伸5min。

野生型拟南芥植株来源由青岛农业大学草业学院实验室提供。

MtCOMT13-F（SEQ ID NO.3）：5′-ATGGGTTCAACAGGTGAAACTCA-3′；

pCAMBIA3301-R（SEQ ID NO.6）：5′-ATTGCGGGACTCTAATCATAAAAAC-3′。

鉴定结果如图1所示，转基因株系出现了1098bp片段，而野生型株系没有，说明MtCOMT13过表达载体已成功导入拟南芥中。

待转基因阳性拟南芥生长至6叶时，剪取拟南芥幼嫩叶片于灭菌的2mL离心管（带钢珠）中，放入液氮中速冻，使用冷冻研磨仪（JXFSTPRP-CLN，净信，中国）进行磨碎。按FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Polysaccharides&Polyphenolics-rich）RNA提取试剂盒（诺唯赞，南京，中国）说明书加入试剂，提取阳性植株幼嫩叶片RNA，并使用超微量分光光度计（Nano Drop One，Thermo Fisher，美国）进行RNA浓度测定。提取好的RNA保存于-80℃超低温冰箱备用。经RNA完整性检测后，使用HiScript III 1st Strand cDNASynthesis Kit（+gDNA wiper）反转录试剂盒（诺唯赞，南京，中国）将RNA反转录成cDNA。将cDNA稀释成200ng/μL，以qMtCOMT13-F/qMtCOMT13-R为引物，进行qRT-PCR检测MtCOMT13基因的相对表达水平。

其中，qMtCOMT13-F（SEQ ID NO.7）：5'-CCAACAACTAACCCTGAA-3'；

qMtCOMT13-R（SEQ ID NO.8）：5'-CACCTACATCAACAAGAGA-3'。

qRT-PCR的条件为以蒺藜苜蓿Actin基因作为内参基因。

qRT-PCR反应体系：总体积为20μL，具体如下表2。

qRT-PCR反应程序：使用BioRad仪器进行qRT-PCR扩增。具体程序如下：第一步预变性95℃进行30sec；第二步95℃反应10sec，60℃反应30sec，进行40个循环反应；第三步在循环结束后，于85℃生成溶解曲线。

表2 实时荧光定量PCR反应体系

结果如图2所示，转基因植株中MtCOMT13的相对表达量显著高于野生型植株，说明成功获得MtCOMT13基因的过表达植株。将3株具有代表性的株系扩繁，收获T3代种子用于后续试验。

具体扩繁步骤如下：在超净工作台内将200粒拟南芥种子置入1.5mL离心管中，加入1mL ddH₂O摇晃振荡后，放在小型离心机内进行离心。随后，加入1mL体积分数为75%的酒精消毒30s，再次用ddH₂O洗一遍。加入质量分数为10%的NaClO消毒6min，期间用手摇晃离心管。ddH₂O洗3次后，加入1mL ddH₂O浸泡，吸胀45min。用1mL无菌枪头吸取拟南芥种子，均匀铺在1/2MS固体培养基上，待4℃萌发3d后，将培养皿转移至24℃、16h光照/8h黑暗的光照培养箱中培养，待长出3片真叶后即可移栽至土中。拟南芥在土中继续生长，期间正常浇水管理，直至种子成熟，收获转基因拟南芥种子。

5、转基因拟南芥表型观察

将萌发7d后长势一致的野生型、MtCOMT13过表达拟南芥幼苗移栽至装有蛭石的花盆中，待生长21d后，对植株分别进行盐胁迫和干旱胁迫处理。每组处理设置三个生物学重复。胁迫处理后，植株继续生长3周，随后立即观察记录植株表型特征。并利用光合仪测定叶绿素含量、气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率和净光合速率等光合参数。

其中，光合仪：型号LI-6800，中国Ecotek。

盐胁迫处理：采用300mM NaCl进行盐胁迫处理，即对在装有蛭石的花盆内生长21d后的拟南芥植株直接浇灌含300mM NaCl的营养液，每隔3天补充一次，直至盐处理21d。设置三个生物学重复。

干旱胁迫：采用停止浇水的自然干旱法进行干旱胁迫处理，即对在装有蛭石的花盆内生长21d后的拟南芥植株停止浇灌，直至干旱处理21d。设置三个生物学重复。

结果如图3所示，在盐胁迫下，与野生型植物的莲座叶严重萎蔫和部分失绿相比，过表达MtCOMT13转基因拟南芥的叶片仍然保持深绿色。自然干旱胁迫后，野生型拟南芥的叶片完全枯萎，而过表达MtCOMT13转基因拟南芥的叶片仍为浅绿色。

此外，过表达MtCOMT13拟南芥的气孔导度、蒸腾速率和净光合速率显著高于野生型拟南芥，而胞间CO₂浓度显著低于野生型拟南芥。说明过表达MtCOMT13基因提高了拟南芥的耐盐抗旱性。

上述结果表明，MtCOMT13是参与调控拟南芥耐盐抗旱性的重要基因，可以用于调控植物耐盐抗旱性中。

实施例4 MtCOMT13基因在蒺藜苜蓿和紫花苜蓿耐盐抗旱性遗传改良育种中的应用

在生产实践中，可将上述基因转化蒺藜苜蓿和紫花苜蓿外植体细胞，再将转化后的愈伤组织培育成植株。通过转基因方法，利用植物表达载体转化外植体细胞以培育耐盐抗旱性蒺藜苜蓿和紫花苜蓿，进而可以改善蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的耐盐抗旱性。

在生产实践中，还可将上述基因通过分子标记辅助选择育种方法来增强育种目标的效率和准确性。如利用分子标记将目的基因与蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的耐盐抗旱性状关联，通过检测目的基因的存在，从而达到选择目标性状的目的。本发明中发现了MtCOMT13基因在调控植物耐盐抗旱性中的功能及具体应用，为蒺藜苜蓿和紫花苜蓿耐盐抗旱性育种提供了新的基因资源，也为进一步解析MtCOMT13调控植物耐盐抗旱性的分子机制奠定基础。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无须创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员以本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.MtCOMT13基因或其编码的蛋白在提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性中的应用，其特征在于，所述MtCOMT13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MtCOMT13基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

利用所述MtCOMT13基因构建重组表达载体，将重组表达载体转入拟南芥或苜蓿中，以提高拟南芥或苜蓿的耐盐抗旱性；

所述MtCOMT13基因通过调节光合作用来提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性；所述MtCOMT13基因用于调节拟南芥或苜蓿叶绿素含量来提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性；所述MtCOMT13基因用于调节拟南芥或苜蓿的气孔导度、蒸腾速率和净光合速率来提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性。

2.根据权利要求1所述的MtCOMT13基因或其编码的蛋白在提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性中的应用，其特征在于，扩增如权利要求1所述的MtCOMT13基因的引物对包括MtCOMT13-F和MtCOMT13-R；

其中，MtCOMT13-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；MtCOMT13-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的MtCOMT13基因或其编码的蛋白在提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性中的应用，其特征在于，所述重组表达载体包括所述MtCOMT13基因，还包括用于连接所述MtCOMT13基因的质粒。

4.根据权利要求3所述的MtCOMT13基因或其编码的蛋白在提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性中的应用，其特征在于，所述质粒包括pCAMBIA3301过表达载体。

5.根据权利要求1所述的MtCOMT13基因或其编码的蛋白在提高拟南芥或苜蓿耐盐抗旱性中的应用，其特征在于，将含有权利要求1所述的MtCOMT13基因在拟南芥中过表达，获得耐盐抗旱性增强的转基因拟南芥。