CN103436535A

CN103436535A - 一种硝酸盐转运体基因AtNRT1.5及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN103436535A
Application number: CN2013101250264A
Authority: CN
Inventors: 徐江; 徐小栋; 东方阳; 鲁黎明; 王西瑶; 张少斌; 麻艳超; 迟志海; 洪雪; 付金东; 赵明; 丁在松
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2013-12-11

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域。具体为拟南芥硝酸盐转运体基因AtNRT1.5的功能验证。本发明利用AtNRT1.5基因T-DNA插入突变体CS870797的纯合株系研究该基因在植物氮素高效利用方面的功能。实验结果表明，突变体在高氮(MS)培养基上生长受抑，根系显著短于野生型；在低氮条件下，两者根系生长没有差异；但突变体干重低于野生型。含氮量的测定结果表明，突变体根系含氮量高于野生型，而地上部含氮量则极显著低于野生型，在高氮(MS)培养基上差异更为明显。说明ATNRT1.5基因突变后，根系吸氮能力并未受到明显影响，而氮素由根系向地上部转运的能力显著降低。预计该基因的过量表达可提高植物的氮素利用能力并在植物氮素营养高效分子育种中具有较大的经济价值。

Description

一种硝酸盐转运体基因AtNRT1.5及其编码蛋白与应用

所属技术领域

本发明属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥硝酸盐转运体(Nitrate transporters，NRTs)家族关键基因ATNRT1.5在低氮胁迫下的反应和作用机理，以及该基因在营养高效植物新品种培育中的应用。

背景技术

氮是植物必需的营养元素之一，是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素、酶等的组成成分。氮素供应不足会影响植物的生长发育，限制农作物的产量；而氮肥施用过量则使氮素利用率下降，不仅造成资源浪费，而且引起环境污染。通过挖掘植物自身遗传潜能，克隆耐低氮和氮素营养高效的基因，并利用转基因技术培育氮素利用效率提高的新品种是解决这一问题的重要途径之一。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科、芸薹属植物，它不仅是第一个完成基因组序列测定的模式植物(Athanasios Theologis.et al.，Nature，2000，408：791-826)，而且具有植株小，生长周期短，种子数量多，基因组小且易于进行遗传转化，自花授粉而又易于杂交等优点。因此在植物分子生物学及转基因相关技术领域中，拟南芥被作为模式植物广泛加以研究和应用。

硝酸盐转运体是一类专司硝态氮吸收、运输的转运蛋白。研究发现拟南芥中存在一个由53个成员组成的NRT1基因家族。已有的研究证明ATNRT1.5为低亲和性硝酸盐转运体基因，参与硝酸盐从根部到地上部的转运(Shan-Hua Lin et al.，Plant Cell，2008，20：2514-2528)。但至今还没有该基因在不同氮素条件下调控植株生长发育的报道。

发明内容

本发明提供一个拟南芥低亲和性硝酸盐转运体基因，以及该基因对低氮胁迫的反应和生理机制。

所提供的低亲和性硝酸盐转运体基因为ATNRT1.5(AT1G32450)。

上述基因具有SEQ ID No.1的碱基序列。

上述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

ATNRT1.5基因的T-DNA插入突变体CS870797是从ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。

通过上述鉴定，获得ATNRT1.5基因T-DNA插入突变体CS870797的纯合株系，并以之为材料进行低氮处理，观察表型并拍照。然后对低氮处理后的拟南芥幼苗进行耐低氮相关指标的测定，包括：主根长测量，地上部干重测量，根部和地上部含氮量统计。

附图说明

图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明所获ATNRT1.5基因T-DNA插入突变体株系CS870797为纯合插入株系，其转录本被敲除。

图2显示野生型和突变体在不同氮素浓度培养基上处理7天的表型照片，结果表明在正常氮素浓度(MS)培养基上，突变体生长比野生型弱，表现高氮利用缺陷的表型，尤其是根长显著短于野生型；而在低氮(含0.2mM NO₃ ^-)条件下，突变体生长与野生型没有差异，二者根长一致。

图3显示野生型和突变体在不同氮素浓度培养基上处理7天后的根系长度的测量结果，结果表明在MS培养基上突变体根长显著低于野生型(P＝0.035)；而在低氮(含0.2mM NO₃ ^-)培养基上，突变体根长与野生型没有差异(P＝0.8922)。

图4显示野生型和突变体在不同氮素浓度培养基上处理7天后地上部干重的差异，结果表明在MS培养基上突变体地上部干重显著低于野生型，而在低氮(含0.2mM NO₃ ^-)培养基上突变体地上部干重极显著地低于野生型(P＝0.031)。

图5显示不同氮素处理后野生型和突变体根部和地上部含氮量差异，结果表明在无外源氮培养条件下突变体根部含氮量显著高于野生型(P＝0.02)，而地上部含氮量则极显著低于野生型(P＝0.0001)；在10mM硝酸盐培养条件下两只根部含氮量无差异，而地上部含氮量极显著低于野生型(P＝0.0001)，。

具体实施方式

下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。

1.拟南芥幼苗培养：

野生型和突变体种子分别用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，消毒后的种子放入4℃冰箱春化2天后点布于含1％琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上，置于22℃光照培养箱中萌发生长。

2.纯合突变体的鉴定

DNA提取：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片，研磨成糊状，加400μl SDS提取液(0.5％SDS(W/V)；200mMTris-Hcl，PH＝8.0；250mM NaCl；25mM EDTA)；12,000r/min，离心3min；取上清，加等体积异丙醇轻轻摇晃，静置30min；13,000r/min，离心5min；弃上清，用1ml95％乙醇冲洗1-2次后，自然风干，加去离子水30μl，4℃保存备用。

RNA提取：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1％DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约1g左右，于液氮中研磨成粉状，加1ml TRIZOL提取液混匀，静置10min；4℃下12,000r/min离心10min；取上清加300μl氯仿混匀，静置10min后4℃下12,000r/min离心15min，样品分为3层，RNA位于上层水相中；取500μl水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀10-20min；12,000r/min离心10min，弃上清；用75％酒精洗涤1-2次，7,000r/min离心2min，晾干1min左右，加60μl无RNase水，轻轻震荡使RNA溶解，-70℃冰箱保存备用。

RT-PCR：所用反转录试剂盒(#k1621)购自Fermentas。First strand cDNAsynthesis：管中加入RNA1μl，oligo(dT)18primer1μl，RNase-free water1μl，65℃处理5min后迅速冰浴冷却；然后再加5×Reaction buffer4μl，RibolockTMRNase inhibitor(20u/μl)1μl，10mM dNTP Mix2μl，RevertAidTM H MinusM-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μl)1μl，42℃反应60min；70℃终止反应5min，产物于-20℃冰箱保存备用。

PCR检测：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我们设计了2对引物，1对用于T-DNA插入检测(LP1：5′-GGGTTTTCTTTTTGGTTTGATG-3′，RP1：5′-TATCTCGGTGTTCCAACAAGG-3′)并结合T-DNA左边界通用引物LB1：5′-AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3′，通过PCR鉴定获得纯合插入突变体。另外1对引物用于RT-PCR检测(LP2：5′-CGTTAGCAAATGGACAGGGAC-3′；RP2：5′-CCTCTTCACT CTCGGTGTCATAGT-3′)。PCR反应体系如下：10×buffer2μl，dNTP0.8μl，Primer LP/RP各1μl，DNA1μl，dH2O14μl，Taq酶0.2μl。PCR程序如下：94℃，3min；(94℃，45sec；58℃，45sec；72℃，60sec)×30cycles；72℃，5min。产物采用1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳分离，恒压100V电泳20min，用BIO-RAD凝胶成像扫描仪拍照记录检测结果。

PCR和RT-PCR检测的结果表明我们鉴定到AtNRT1.5基因T-DNA插入突变体CS870797的纯合插入株系，其转录本被敲除。

3.不同浓度氮素处理：

在含1％琼脂的固体MS培养基上生长5天的幼苗，分别转移到含有0mM、0.2mM或10mMNO₃ ^-的培养基上，野生型和突变体各转5-6株；除不同氮素含量外，培养基中还包括1mM KH2PO4，1mM MgSO4，0.25mM CaCl2，0.1mMNa-Fe-ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)，1mM KCl，30mM H₃BO₃，5mMMnSO₄，1mM ZnSO₄，1mM CuSO₄，0.7mM Na₂MoO₄，用NaOH调PH值至5.7-5.75。22℃培养14天后拍照，统计根长、地上部干重和含氮量等指标。

主根长测量结果表明，在MS培养基上生长的突变体根长极显著低于野生型(P＝0.035)；而在含有0.2mM NO₃ ^-的培养基上，突变体根长与野生型没有差异(P＝0.8922)。说明AtNRT1.5作为低亲和性的硝酸盐转运体，功能缺失后限制了高氮水平下的植株生长，对根系的影响更甚。这一现象及其机理之前未见报道。

地上部干重测量结果表明，突变体地上部干重显著低于野生型，在低氮条件下表现更为明显(P＝0.031)，说明ATNRT1.5基因敲除后，突变体植株从根系向地上部分转运氮素的能力减弱，使得地上部的生长受到抑制。

根部和地上部含氮量的测定结果也表明，在不同氮素浓度下，突变体根系含氮量高于野生型，而地上部含氮量则极显著低于野生型(P＝0.0001)，在高氮(MS)培养基上差异更为明显。说明ATNRT1.5基因敲除后，对根系吸氮能力影响不大，而更主要地是影响了氮素向对地上部的转运。

Claims

1.拟南芥硝酸盐转运体基因AtNRT1.5，其碱基序列如SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRT1.5编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2。

3.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRT1.5敲除突变体的氮素处理方法及条件。

4.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRT1.5敲除突变体在不同氮素处理条件下所获得的表型及其相关试验数据。

5.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRT1.5及其同源序列在制备氮素营养高效转基因植物中的应用。