CN115896128A - 一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13、编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13、编码基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过设计特异性引物，克隆获得了烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13的编码基因NtNPF6.13基因。通过亚细胞定位分析发现，NtNPF6.13蛋白定位在细胞膜上，盐胁迫后NtNPF6.13基因的表达量明显下降。通过基因编辑载体对NtNPF6.13基因进行敲除，构建出NtNPF6.13基因敲除株，敲除株根部氯离子含量显著下降，叶片氯离子含量显著升高，这使培育氯离子富集的烟草成为可能，为改善我国烤烟氯含量偏低的情况提供一个新的方向。

Description

一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13、编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13及其编码基因及应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物有两类硝酸盐转运蛋白即NRT1/PRT和NRT2，其中NRT1/PRT又被命名为NPF。目前已经报道的NPF转运底物有NO3^-、Cl^-、多肽、各种激素(IAA、ABA、GA等)、芥子油甘等。其中，NPF转运Cl-的报道主要集中在拟南芥、玉米和苜蓿三种植物中，烟草NPF转运氯离子的研究尚无报道。

氯是烤烟生长发育所必需的营养元素之一，在烟草体内担负着一定的生理功能，对烟叶产量和品质也有一定的积极作用，烤烟含氯量过高和过低，都会降低烟叶品质和产量。烟叶含氯量一般与土壤含氯量有关。所以在土壤含氯量低的地区如：西南地区、鄂西南地区、皖南和福建省烟叶的氯素含量都比较低。韩忠明等认为，我国烤烟氯含量偏低，各烟区烤烟氯含量均低于国外优质烤烟氯含量。一般研究认为，优质烟叶中氯含量以0.3％～0.8％为宜，但我国大部分烟区烟叶氯含量都低于0.3％，在一定程度上影响了烟叶的质量(参考文献：我国主要烟区烤烟氯含量特征比较研究.贵州农业科学，2008,36(1)：106-107)。李强等对我国主要烟区烤烟氯含量的区域特征、分布状况分析表明，我国烤烟氯含量普遍偏低，其中，高氯烤烟主要分布在北方(77.32％)，低氯烤烟主要分布在南方(78.23％)，在调查的2712份烤烟样品中，53.32％的样品氯含量低于0.30％，43.10％的样品氯含量在0.30％～0.80％，3.43％的样品氯含量大于0.80％(参考文献：中国主要烟区烤烟氯含量区域特征研究.中国土壤与肥料，2010(2)：49-54)。施用含氯肥料可以使土壤含氯量增加，但是，其增加量与施氯量、降雨量及土壤的透水性有密切关系，并且含氯肥料的使用不当也会造成土壤氯离子的污染。

随着分子生物技术的日益成熟，加上氯营养分子生物学在其它作物方面的成果，在烟草上从分子水平来研究氯在烟株体内的转运机制，氯离子通道以及烟叶对氯吸收的有效基因等对解决我国烤烟氯含量偏低的情况具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因，该基因能够编码烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13。

本发明第二个目的是提供一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13，该蛋白与烟草中氯离子吸收转运相关，在氯离子含量积累的烟草育种中具有十分重要的应用价值。

本发明第三个目的是提供烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集的烟草品种中的应用，将该基因进行基因编辑后，增加氯离子从根部向地上部的转运，烟草叶片氯离子含量增加，获得氯离子含量积累的烟草品种。

本发明的第四个目的是提供NtNPF6.13基因敲除株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

NtNPF6.13基因与氯离子吸收转运相关，通过抑制其表达，增加氯离子向地上部的转运，，对于培育氯离子富集的烟草品种具有重要意义。

一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

NtNPF6.13蛋白被NtNPF6.13基因编码表达，与氯离子吸收转运相关，通过抑制其表达，氯离子的从根部向地上部转运的能力增强，可以获得氯离子富集的烟草品种。

烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集的烟草品种中的应用。

NtNPF6.13基因与氯离子吸收转运相关，通过抑制其表达，增加氯离子向地上部的转运，获得氯离子富集的烟草品种，为改善我国烤烟氯含量偏低的情况提供一个新的方向。

优选地，所述抑制NtNPF6.13基因的表达是构建基因编辑载体，对烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因进行敲除。

优选地，基因编辑载体通过如下方法获得：将靶位点双链DNA连接至基因编辑空载体上，测序鉴定。

进一步优选地，靶位点双链DNA对应的sgRNA序列为：GCTCTTAGATCCTCCTCCGG。

进一步优选地，所述基因编辑空载体是CRISPR/Cas9载体。

优选地，氯离子富集的烟草品种通过以下方法获得：将基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，最后筛选鉴定，进而获得氯离子富集的烟草品种。

NtNPF6.13基因敲除株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用。

附图说明

图1为本发明实施例3中NtNPF6.13基因在不同组织中的表达特征图；

图2为本发明实施例3中烟草NtNPF6.13蛋白的亚细胞定位图；

图3为本发明实施例3中盐胁迫下NtNPF6.13基因的表达特征图；

图4为本发明实施例3中NtNPF6.13基因敲除的靶位点选择示意图；

图5为本发明实施例3中T₀代基因编辑植株敲除靶位点的测序结果图；

图6为本发明实施例3中NtNPF6.13基因编辑植株根部、叶片氯离子含量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：

生物材料：

烟草品种：K326，所使用的种子由国家烟草基因研究中心提供。

载体：pFF19载体由国家烟草基因研究中心提供；pCS1300获赠于武汉天问生物科技有限公司；CRISPR/Cas9载体由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。

菌株：Trans5α化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；GV3101农杆菌感受态细胞，购自上海唯地生物技术有限公司；引物的合成和DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司提供完成。

实验试剂：RNA提取试剂盒(RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒)、基因组提取试剂盒(多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒)购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量试剂盒、反转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)购自瑞士Roche公司；DNA扩增酶，购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BsaI、质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自宝生物技术有限公司。

实验设备：PCR合成仪Tprofessional Thermocycler，Biometra公司；定量PCR仪LightCycler96，Roche公司。

实施例1烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因

本实施例的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例2烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13

本实施例的烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集的烟草品种中的应用

本实施例的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集的烟草品种中的应用，具体说明如下：

1、硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因与氯离子转运相关

1)NtNPF6.13基因的克隆

NtNPF6.13基因的克隆及获得过程如下所示：

(1)提取RNA，反转录cDNA

将K326种子消毒之后接种在MS培养基上进行萌发，发芽两周后，幼苗移栽到盆里，在培养温度为23～26℃的植物培养间进行培养，待烟苗长至六叶一心时转移至1/2MS液体培养基中继续培养，两周后选取根部进行取样，液氮速冻后备用，采用植物RNA提取试剂盒提取烟草根部总RNA。RNA提取时，参考试剂盒说明书操作即可，然后反转录为cDNA备用。

(2)设计引物，进行PCR扩增

参考现有其他物种中NPF6.3序列，根据茄科基因组数据库(https://solgenomics.net)上的基因序列，设计PCR扩增引物序列如下：

NtNPF6.13-F：5’-ATGGCACTTCCTGAGACAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

NtNPF6.13-R：5’-TCAATGACAAACCGGTCCAT-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

以步骤(1)中反转录的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、2min，30个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳检测分析并用参照DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收PCR扩增后产物。

纯化产物再连接至pFF19载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，6μL；pFF19载体，1μL；混匀后，25℃连接25min。

将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体转化过程如下所示：

从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上使其溶解，加连接产物于100μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min；42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2min；加入900μL平衡至室温的LB(不含抗生素)液体培养基，37℃摇荡培养1h；4000rpm离心3min，去部分上清，留100μL将沉淀混匀，均匀地涂布到LB固体平板(含50μg/μL卡那霉素)上，倒置培养皿，37℃培养过夜。

翌日，挑单克隆，送出测序。

测序结果及分析结果表明，NtNPF6.13基因基因编码区长度为1785bp个核苷酸；对该基因分析后可知，其所编码的NtNPF6.13蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2)烟草不同组织、器官中NtNPF6.13基因的表达模式分析

取旺长期植株根部、茎部、叶片和花等组织，提取RNA反转录cDNA后，用实时定量PCR的方法检测NtNPF6.13基因在各组织器官中的表达量。以烟草Nt26S基因为内参，进行荧光定量PCR检测，引物序列如下：

检测NtNPF6.13基因的荧光定量引物，引物序列为：

RT-NtNPF6.13-F：5’-TAGGACCATGAGTTGTTTG-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

RT-NtNPF6.13-R：5’-TAGGACCATGAGTTGTTTG-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

检测烟草Nt26S基因时，具体引物为：

Nt26S-F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’(如SEQ ID NO.7所示)；

Nt26S-R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’(如SEQ ID NO.8所示)。

荧光定量PCR的条件为：第一步预变性，95℃10s；第二步PCR反应，95℃5s，60℃30s，39个循环；第三步熔解曲线。

每个样品进行3次生物学重复，通过

方法分析相对基因表达差异。

荧光定量PCR结果如图1所示，结果说明NtNPF6.13基因主要在烟草的根部和茎部表达。

3)烟草NtNPF6.13蛋白的亚细胞定位

设计引物pCS1300-NPF6.13F和pCS1300-NPF6.13R，将NtNPF6.13克隆到含有GFP标签的pCS1300载体上，引物序列为：

pCS1300-NPF6.13F：5’-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGCACTTCCTGAGACAC-3’(如SEQID NO.9所示)；

pCS1300-NPF6.13R：5’-CCCTTGCTCACCATGGATCCATGACAAACCGGTCCAT-3’(如SEQ IDNO.10所示)。

PCR扩增体系和反应程序同实施例3第1)部分NtNPF6.13基因的克隆中PCR扩增体系和反应程序，获得的PCR产物用In-Fusion酶连接至pCS1300载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，2μL；pCS1300载体2μL；In-Fusion酶1μL。混匀后，50℃连接15min。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落测序。

测序正确的菌落提取融合质粒GFP-NtNPF6.13，并转化农杆菌，农杆菌转化的步骤如下：

从-80℃冰箱中取出农杆菌GV3101感受态细胞，在冰上冻融，待即将解冻时加入5μL已

经构建好的GFP-NtNPF6.13融合载体，轻弹混匀；冰浴30min，液氮中冻5min，然后在37℃水浴5min后立即放冰上；加入900μL的无抗生素的LB液体培养基，200rpm、振荡培养4h；然后将菌液4500rpm离心3min，弃一半体积的上清，重新悬浮后均匀涂于含有Rif(100μg/mL)、和Kan(50μg/mL)的LB固体培养基上，28℃倒置培养约2～3d，直至单菌落形成；挑取单菌落，扩培后对菌液进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌株，即为转化正确的工程菌。

健康的本氏烟，将上述转化正确的农杆菌注射烟草叶片，2d后使用激光共聚焦显微镜观察信号在细胞中的分布情况。结果如图2所示，说明NtNPF6.13蛋白定位在细胞膜上。其中，GFP为绿色荧光蛋白；FM为膜定位染料；Chlorophyll fluorescence为叶绿体荧光；Bright filed为明场；merged明场及荧光所有重叠。

4)烟草的盐胁迫试验

NtNPF6.13基因在盐胁迫中的具体响应情况，通过盐胁迫处理普通栽培烟草K326，在不同处理时间采集根部，利用荧光定量PCR的方法对NtNPF6.13基因的表达进行了分析，相关试验简要介绍如下。

(1)盐胁迫实验

烟草K326种植于国家烟草基因研究中心植物培养间，培养条件为：温度(23±1)℃，相对湿度60％±2％，16h光照培养，8h黑暗培养。待烟苗长至六片真叶期，移至Hoagland’s营养液中继续培养，1周后更换营养液时加入300mM NaCl，分别在盐处理0h、12h、3d和7d采集根部，取样时用蒸馏水冲洗并用吸水纸吸干水分后经液氮速冻后放-80℃冰箱保存。每个株系设置3个独立重复，每个重复至少选取3株长势一致的烟苗。

(2)qPCR检测NtNPF6.13基因的表达量

将所保存的材料提取RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA后，以烟草Nt26S基因为内参，进行荧光定量PCR检测，具体操作过程酮实施例3步骤2)中所述。

荧光定量PCR结果如图3所示，表明烟草经过盐胁迫后，NtNPF6.13基因的表达量显著下降，尤其时盐胁迫12h时下降幅度最大，这说明NtNPF6.13基因在盐胁迫中发挥一定作用。

2、基因编辑载体的构建

为进一步了解NtNPF6.13基因在烟草氯离子吸收转运中的功能，构建了用于敲除NtNPF6.13基因的CRISPR/Cas9表达载体，下面就构建过程简要介绍如下。

首先，根据CRISPR/Cas9系统的识别特点设计靶位点，在NtNPF6.13基因的第1个外显子区域设计20bp的sgRNA靶点序列(如图4所示)：GCTCTTAGATCCTCCTCCGG，设计敲除引物序列NtNPF6.13-T1_F和NtNPF6.13-T1_R如下：

NtNPF6.13-T1_F：GATTGCTCTTAGATCCTCCTCCGG(如SEQ ID NO.11所示)；

NtNPF6.13-T1_R：AAACCCGGAGGAGGATCTAAGAGC(如SEQ ID NO.12所示)。

设计反应体系，以获得靶位点的DNA双链(退火)，20μL反应体系设计如下：Annealing Buffer for DNA OLigos(5×)，4μL；上下游引物(NtNPF6.13-T1_F、NtNPF6.13-T1_R)，各4μL(50μmoL/μL)；Nuclease-free water补充至20μL。

反应程序为：95℃5min，每8s下降0.1℃，降至25℃；反应产物4℃保存备用，或者直接进行后续反应。

将上述退火产物与BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体进行连接，并筛选获得用于敲除NtNPF6.13基因的CRISPR/Cas9表达载体，20μL连接体系设计如下：退火产物，6μL；酶切产物(BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体)，3μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，2μL；T4 DNALigase，1μL；灭菌水补充至20μL，37℃连接3h。

连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过挑取阳性克隆、扩大培养，提取质粒后，经PCR确认载体构建成功后，低温保存，用于农杆菌转化。

3、转基因植株的获得及氯离子含量检测

将上述步骤所构建CRISPR/Cas9表达载体转化农杆菌，并进而转化烟草植株，构建NtNPF6.13基因敲除的转基因植株，具体实验过程如下所示。

(1)农杆菌的转化

具体的方法同实施例3细胞亚细胞定位中农杆菌转化的步骤。

(2)转化烟草植株

取生长一个月左右的烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5cm大小的叶盘，将处理后叶盘在MS固体培养基上预培养3d；

将上述所制备转化后农杆菌工程菌，培养至OD₆₀₀＝0.6左右，4000rpm离心5min收集菌体，再用20mL的MS液体培养基悬浮菌体；

然后将上述预培养后叶盘置于菌液中，侵染10min；

用无菌的滤纸吸干浸染后叶盘周围多余的菌液，在MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.5mg/L)的固体培养基上暗培养3d；

用含有Cef(400mg/L)的无菌水清洗叶盘，并用无菌滤纸吸去多余的液体，将叶盘转到含有6-BA(2mg/L)、NAA(0.5mg/L)、Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体筛选培养基上，28℃光照培养；

待不定芽长到0.5cm时，转移到含Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体培养基上生根。

(3)基因编辑的鉴定

待生长一个月左右，取少量叶片，参照植物基因组提取试剂盒说明书提取DNA，通过PCR扩增、克隆、测序的方法，检测阳性转基因株系和突变形式。具体鉴定方法为：

在NtNPF6.13基因组上，设计一对检测引物，该引物位于敲除靶位点的两侧，具体为：

NtNPF6.13-J-F：5’-ggagtgagtacggtgtgcCTTCCTGAGACACAGCAAG-3’(如SEQ IDNO.13所示)；

NtNPF6.13-J-R：5’-gagttggatgctggatggTTCCCATCTAATCTCGCC-3’(如SEQ IDNO.14所示)。

注：此处小写的碱基为接头序列。

以T₀代转基因株系DNA模板，进行PCR扩增；PCR条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；再72℃终延伸10min。PCR产物送Hi-tom测序。

分析测序结果如图5所示，在11株T0代植株中，检测到NtNPF6.13基因有3种形式的突变，这些突变均发生在敲除的靶位点上，而野生型植株的NtNPF6.13基因未检测到任何突变，这说明在T₀代植株中已经成功实现了对NtNPF6.13基因进行了敲除。

(4)水培试验

NtNPF6.13基因编辑植株T1代和对照K326植株种植于国家烟草基因研究中心植物培养间，培养条件为：温度(23±1)℃，相对湿度60％±2％，16h光照培养，8h黑暗培养。待烟苗长至六片真叶期，移至Hoagland’s营养液中继续培养，1周后更换一次营养液，再培养3d后取根部进行后续氯离子含量的测定。根部取样时用蒸馏水冲洗并用吸水纸吸干水分后经液氮速冻后放-80℃冰箱保存。每个株系设置3个独立重复，每个重复至少选取3株长势一致的烟苗。

(5)氯离子含量测定

将保存的根部、叶片样品冷冻干燥后，使用混合型振荡研磨仪对其研磨至粉末状，称取约0.0500g(精确至0.1mg)粉末，置于10ml 5％(体积分数)醋酸中，30℃震荡萃取30min，然后用定性滤纸过滤，滤液经稀释后用美国安莱立思Alalis MP6500型台式pH计测定氯离子含量。

结果如图6所示，NtNPF6.13基因编辑后，根部氯离子含量显著下降，而叶片中的氯离子含量显著上升。

综上所述，本发明通过对烟草NtNPF6.13基因的研究，发现NtNPF6.13蛋白定位在细胞膜上，与氯离子转运相关；通过基因编辑技术获得NtNPF6.13基因敲除株，水培后，根部氯离子含量显著下降，而叶片中的氯离子含量显著上升，获得了氯离子积累的烟草植株。本发明构建的NtNPF6.13基因敲除株可以应用于我国氯离子含量偏低土壤中，改善烤烟氯含量偏低的情况，改善烤烟的质量。

Claims (9)

1.一种烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集烟草品种中的应用，其特征在于：通过抑制NtNPF6.13基因的表达，促进氯离子向地上部的转运，提高烟草中氯离子的含量。

4.如权利要求3所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集烟草品种中的应用，其特征在于：所述抑制NtNPF6.13基因的表达是构建基因编辑载体，对烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因进行敲除。

5.如权利要求4所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集烟草品种中的应用，其特征在于：基因编辑载体通过如下方法获得：将靶位点双链DNA连接至基因编辑空载体上，测序鉴定。

6.如权利要求5所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集烟草品种中的应用，其特征在于：靶位点双链DNA对应的sgRNA序列为：GCTCTTAGATCCTCCTCCGG。

7.如权利要求5所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集烟草品种中的应用，其特征在于：所述基因编辑空载体是CRISPR/Cas9载体。

8.如权利要求3～7中任一项所述的烟草硝酸盐转运蛋白编码基因NtNPF6.13基因在获得氯离子富集烟草品种中的应用，其特征在于：所述氯离子富集的烟草品种通过以下方法获得：将基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，最后筛选鉴定，进而获得氯离子含量积累的烟草品种。

9.NtNPF6.13基因敲除株在改善氯离子含量偏低土壤中烤烟氯含量偏低方面的应用。

Images