CN119242657B - 橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其应用，属于基因工程技术领域。本发明在橡胶树中克隆了一种ERF类转录因子HbERF105基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，通过分子生物学实验和基因工程手段证明，该基因积极响应低温胁迫，能有效提高转基因植物的耐寒性，为橡胶树耐寒分子育种提供了基因资源，有效解决橡胶树耐寒品种缺乏和育种效率低的现状。

Description

橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其应用。

背景技术

橡胶树是典型的热带经济作物，原产于巴西亚马逊河流域，世界上公认的适宜种植区为南纬10°至北纬15°，而部分橡胶树种植区位于北纬18°至24°，被列为非传统植胶区，属于世界植胶区的最北端，经常遭遇10℃以下的低温寒害。当环境温度低于橡胶树的临界寒害温度(15℃)时，就会对树体造成寒害，气温越低寒害越严重。一般情况下，气温≤10℃，对橡胶树幼树的新陈代谢产生有害影响，光合作用停止；当气温≤5℃时，橡胶树出现不同程度的寒害，割面和树茎接合处就会有少量爆皮流胶，树梢和树干枯死，导致橡胶产量下降。

低温胁迫已成为制约天然橡胶产业发展的主要瓶颈。目前橡胶树耐寒育种主要采用杂交育种，需要近30年才能培育一个新品种。橡胶树育种周期长，效率低，已不能满足天然橡胶产业对品种的需求。因此发掘耐寒相关的基因，解析其响应低温胁迫的分子机制，通过基因工程等分子育种技术改良橡胶树品种耐寒性，增强品种的适应性，加快橡胶树品种的培育速度，已成为橡胶树育种工作的重要内容。

发明内容

本发明的目的是提供橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明在橡胶树中克隆了一种ERF类转录因子HbERF105基因，通过分子生物学实验和基因工程手段证明，该基因积极响应低温胁迫，能有效提高转基因植物的耐寒性，为橡胶树耐寒分子育种提供了基因资源，有效解决橡胶树耐寒品种缺乏和育种效率低的现状。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因，所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述HbERF105基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种重组载体，所述重组载体上包含上述HbERF105基因。

本发明还提供一种重组菌，所述重组菌中包含上述HbERF105基因或上述重组载体。

本发明还提供上述HbERF105基因及其编码的蛋白质、上述重组载体或上述重组菌在调控植物耐寒性中的应用。

本发明还提供一种调控植物耐寒性的方法，包括利用遗传转化技术，将上述HbERF105基因转入植物体内，提高所述植物耐寒性的步骤。

本发明还提供上述HbERF105基因及其编码的蛋白质、上述重组载体或上述重组菌在培育耐寒植物品种中的应用。

本发明还提供一种培育耐寒植物品种的方法，包括利用遗传转化技术，将上述HbERF105基因转入植物体内，构建所述HbERF105基因稳定过表达的转基因耐寒植物的步骤。

本发明还提供检测上述HbERF105基因表达量的试剂在耐寒性植物品种早期筛选中的应用。

本发明还提供检测上述HbERF105基因的试剂在培育耐寒植物品种中的应用。

本发明中，上述植物包括但不限于拟南芥和橡胶树。

本发明公开了以下技术效果：

（1）本发明首次克隆了一种橡胶树ERF类转录因子基因HbERF105，该基因DNA序列无内含子，开放阅读框为825bp，编码274个氨基酸，为后续该基因的研究和应用奠定了理论基础。

（2）本发明证实了橡胶树HbERF105基因与耐寒性相关，能够积极响应低温胁迫，并公开了该基因在橡胶树内的表达模式及在低温胁迫下的响应方式，为橡胶树耐寒品种筛选方法的建立提供了技术支持。

（3）本发明证实了在橡胶树遗传育种研究中，利用转基因技术将HbERF105基因在植物中过表达，能够加快植物对环境的适应速度，提高植物存活率，有效提高其耐寒性，对改良品种耐寒性，培育新品种，加快育种进程有积极作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为HbERF105蛋白的亚细胞定位结果图；其中，箭头所指位置为HbERF105蛋白；

图2为低温胁迫下HbERF105在不同品种橡胶树叶片中的表达模式统计图；

图3为转基因拟南芥T2代株系的PCR鉴定结果图；其中，OE1-OE7为转基因拟南芥T2代株系编号，CK为野生型拟南芥株系，M为Marker；

图4为低温胁迫前的拟南芥生长状态表型图；

图5为低温胁迫完成时的拟南芥生长状态表型图；

图6为低温胁迫完成7天后的拟南芥生长状态表型图；

图7为低温胁迫完成14天后的拟南芥生长状态表型图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明的技术方案如下：

本发明自橡胶树品种93114中克隆出一种橡胶树ERF类转录因子基因HbERF105，分析了该基因的结构组成，并通过亚细胞定位技术确定了HbERF105蛋白定位于细胞核位置。本发明还通过低温胁迫处理橡胶树幼苗，检测低温胁迫下幼苗中HbERF105基因的表达模式，揭示了HbERF105基因可能与橡胶树耐寒性有关。

为了验证HbERF105基因对橡胶树耐寒性的调控作用，本发明以模式生物拟南芥为受体植物，通过构建HbERF105转基因过表达重组载体及转基因过表达阳性植株，对转基因过表达阳性植株进行低温胁迫处理，证实了HbERF105基因过表达能够提高植物对低温环境的适应能力。

本发明中重组载体的构建方法可采用本领域公知的方法进行。

在本发明一些实施方式中，重组载体的构建方法为如下任一种方法：

酶切连接法、同源重组法、重叠延伸PCR法。

在本发明一些实施方式中，所述重组载体的构建方法为酶切连接法。

本发明中检测HbERF105基因的表达模式可采用本领域公知的方法进行。

在本发明一些实施方式中，检测HbERF105基因的表达模式时使用的检测试剂为采用以下任一种方法的试剂：

聚合酶链反应、核酸杂交法、免疫学检测法和生物质谱法。

聚合酶链反应可以进一步选自荧光定量PCR（可以结合TaqMan探针进行检测）和数字PCR等；

核酸杂交法可以进一步选自原位杂交和转录组芯片等；

免疫学检测法可以进一步选自WB、IP、IHC和抗体芯片等。

在本发明一些实施方式中，所述检测试剂为用于检测所述基因表达的荧光定量PCR。

本发明实施例中，所涉及的生物材料来源如下：

载体pCAMBIA1300-GFP购自北京海玛博尔生物科技有限公司；载体pXCS-HAStrep由国家橡胶树育种中心保存，记载在文献“翟琪麟,安泽伟,李雅超,等.一种植物双基因共表达载体的构建及应用[J].农业生物技术学报, 2013”中；

农杆菌EHA105和GV3101(MP90RK)均购自北京酷来搏科技有限公司。

实施例1 HbERF105基因的克隆

根据橡胶树转录组数据和基因组信息，设计HbERF105基因克隆引物ERF105-F和ERF105-R。克隆过程如下：

提取橡胶树品种93114的基因组DNA，以ERF105-F和ERF105-R为引物，进行扩增。

ERF105-F：ATGGCACCACACGAAGCTTCAACCTTGG（SEQ ID NO.1）；

ERF105-R：CACAACCATGAGCCTAGAATA TCCCATCG（SEQ ID NO.2）。

扩增体系：DNA模板0.6μL，2×PCR MasterMix 5μL，引物ERF105-F（10μM）和ERF105-R（10μM）各0.2μL，无菌超纯水4μL。

扩增程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，共 30 个循 环；72℃10 min。

将扩增产物进行测序，所得序列如SEQ ID NO.3所示，测序结果表明，该基因DNA序列无内含子，开放阅读框为825bp，编码274个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

HbERF105基因：

Atggcaccacacgaagcttcaaccttggagctcattcagcaatacctcctcactgactccaatcttgatactttttgcaattcccataacttttttaaaactgaaacccaagaatttgattgctttccgccacagcgaccagagttcaagcctcaactggttcataaatcttcgagtttgagccagcggaaacccaccatgagtaaaatatcgatacctcctccagcaaatttgaaccccatcccacctcagcaacctgtagcagtacctgcaactgagaataacaggtcggattgtagtgaagaaaagcattacagaggcgtccgccgtaggccgtggggaaaatacgcagcggagattcgagatcctaataagaaaggcgctcgtgtgtggctagggacattcaataccgctatagaagctgcaaaagcttatgatagtgctgcctttagattgcgtggaagcaaggccatactcaatttccctcttgaaattgggaatttggattccgatcattcccagcaagaatctgaattgacagataataacagtgactacgctaattgtaataataataataataataagaaaaggaagattgaggagacggagagcttggaaatcagcaataatattattaataataataagatgataaaaacagaaaatccttcaccggagagggatcaagcgacggatcccttaacgccgtcgagttggaaggggttttgggatggggaagtgaaggggatatttaatgtaccgccgttatcgccgttatcgccgcacccttcgatgggatattctaggctcatggttgtgtga（SEQID NO.3）；

HbERF105蛋白：

mapheastleliqqylltdsnldtfcnshnffktetqefdcfppqrpefkpqlvhkssslsqrkptmskisipppanlnpippqqpvavpatennrsdcseekhyrgvrrrpwgkyaaeirdpnkkgarvwlgtfntaieaakaydsaafrlrgskailnfpleignldsdhsqqeseltdnnsdyancnnnnnnkkrkieetesleisnniinnnkmiktenpsperdqatdpltpsswkgfwdgevkgifnvpplsplsphpsmgysrlmvv*（SEQ ID NO.4）。

实施例2 HbERF105亚细胞定位

将HbERF105基因亚克隆到植物表达载体pCAMBIA1300-GFP中，亚克隆过程如下：

设计带有Spe I 和 Kpn I 酶切位点的引物ERF105-LF和ERF105-LR，以橡胶树品种93114的基因组DNA为模板，克隆橡胶树基因HbERF105，将获得的基因序列和载体pCAMBIA1300-GFP质粒分别进行 Spe I 和 Kpn I 双酶切，回收酶切后的目的基因片段和载体片段，用T4 DNA ligase 将目的基因片段和载体片段进行连接，从而将HbERF105基因亚克隆到植物表达载体pCAMBIA1300-GFP中。将鉴定成功克隆的重组质粒命名为：pCAMBIA1300-HbERF105-GFP。

ERF105-LF：GGACTAGTATATGGCACCACACGAAGCTTCA（SEQ ID NO.5）；下划线处为酶切位点。

ERF105-LR：CGGGGTACCCACAACCATGAGCCTAGAA（SEQ ID NO.6）；下划线处为酶切位点。

酶切体系：模板DNA 20μL，10×FD Green Buffer 5μL，Spe I 和 Kpn I内切酶各2.5μL，无菌超纯水20μL。37℃水浴 5min 后终止反应，电泳检测，回收酶切片段。

连接体系：10×Buffer 1µL，pCAMBIA1300-GFP片段3μL，HbERF105片段 5μL，T4DNA连接酶1μL。混匀后16℃水浴16h后，终止反应，转化连接产物。

将带有HbERF105基因的重组质粒pCAMBIA1300-HbERF105-GFP转入农杆菌EHA105中，将其培养至OD₆₀₀约为0.8时，收集细菌，用重悬液（1/2MS，100μL乙酰丁香酮，0.0012% L-77，调pH=5.7）清洗两遍，并调节菌液OD₆₀₀为0.8，使用5mL无菌注射器吸取菌液，将其从叶片的下表面缓慢注入烟草叶片内部直至烟草叶片湿润。注射后的烟草先黑暗培养24h，再正常培养2天后，取注射位置烟草叶片经过DAPI（100ng/mL）细胞核染料浸泡1h后，用荧光显微镜观察绿色荧光信号，结果如图1所示，箭头所指位置为HbERF105蛋白，HbERF105蛋白定位在细胞核上。

实施例3 HbERF105响应低温胁迫分析

对具有两蓬稳定叶的橡胶树品种93114和热研73397的一年生袋装芽接苗进行低温胁迫处理，将袋装芽接苗转移至人工气候室（16h光照/8h黑暗，160μmol·m^-2·s^-1光照强度，80%相对湿度）中25℃培养两天，然后调低温度至4℃进行模拟低温胁迫处理，分别在处理后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h时取样，使用RNAprep pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN），按照说明书进行操作，提取总RNA，反转录合成cDNA后，以橡胶树HbActin基因为内参基因，分别设计内参引物对ACT-QF和ACT-QR，基因引物对ERF105-QF和ERF105-QR进行qRT-PCR，分析HbERF105响应低温胁迫的表达情况。

ERF105-QF：AAGATTGAGGAGACGGACAGC（SEQ ID NO.7）；

ERF105-QR：ATCCCAAAACCCCTTCCAACT（SEQ ID NO.8）；

ACT-QF：CAGTGGTCGTACAACTGGTAT（SEQ ID NO.9）；

ACT-QR：ATCCTCCAATCCAGACACTGT（SEQ ID NO.10）。

cDNA合成体系为：在200μL PCR管中加入3μg RNA，1μL随机引物，8μL无菌超纯水，混匀后，在65℃水浴变性5min，然后冰浴；再依次加入 5×Reaction buffer 4μL，20U/μLRNase Inhibitor 1μL，10mM dNTPs 2μL，200U/μL 反转录酶1μL，混匀后，在PCR仪上25℃保温5min，然后在42℃保温60min，70℃灭活5min。

qRT-PCR的反应体系为：cDNA 2μL，2×Premix Ex Taq 10μL，ERF105-QF（10μM）和ERF105-QR（10μM）各0.4μL，EASY Dilution 7.2μL。

反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共 45 个循环。

结果如图2所示，HbERF105基因受低温胁迫诱导表达，但在耐寒品种93114中的诱导表达程度比不耐寒品种热研73397强，而且其响应低温胁迫的速度也快，在胁迫0.5h后表达量就明显上升。

实施例4 HbERF105功能验证

将HbERF105基因亚克隆到植物表达载体pXCS-HAStrep中，克隆过程如实施例2。将成功克隆的重组质粒命名为：pXCS-HbERF105-HAStrep。然后将pXCS-HbERF105-HAStrep质粒转入农杆菌GV3101(MP90RK)，培养至OD₆₀₀约为0.8时，收集细菌，加入侵染液（4.4g/L MS、10μL/mL 6-BA、5% sucrase、0.03% MES和0.0012% L-77）使菌体悬浮。将调配好的含农杆菌的侵染液装入喷雾器中，对准生态型拟南芥植株（Col-0 型）的花序喷洒，当植株上不断滴下液珠时停止喷洒，将侵染后的植株暗培养1天后恢复光照正常培养，每2天侵染一次，共进行3次处理，处理完成后正常浇水培养至种子成熟，得到T1代种子。

将T1代种子播种于蛭石上，当拟南芥长出两片真叶后，喷洒10mg/L的草铵膦溶液，以筛选转基因拟南芥阳性植株，每3天进行一次处理，3次处理后存活下来的转基因拟南芥植株为阳性植株，单株收集阳性植株种子即为T2代。选择存活与死亡比例符合3:1分离比的T2代转基因拟南芥株系，编号为OE1-OE7，移栽到蛭石上，待植株生长2周后，进行PCR鉴定。PCR鉴定过程如下：

提取野生型和转基因拟南芥植株叶片基因组DNA，以转基因基因组DNA为待测模板，以野生型拟南芥植株叶片基因组DNA为对照模板（CK），采用引物对ERF105-F（SEQ IDNO.1）和ERF105-R（SEQ ID NO.2）进行PCR扩增，扩增体系和扩增程序同实施例1。将扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图3所示，在待测模板中检测到大小为825bp的特异条带时，判定植株为T2代阳性转基因拟南芥株系。

经鉴定合格的株系单株收获T3代种子。选择不再发生分离的T3代纯系株系，进行HbERF105基因功能分析，共得到L1、L2、L3 3个纯系株系。

待T3代拟南芥植株生长28天后，将所有材料和野生型（CK）拟南芥植株一起于-5℃处理2天进行低温胁迫，然后恢复正常环境培养，在第7天和第14天时统计植株存活率，并观察表型。植物存活率结果如表1所示，表型状态如图4-图7所示，可见，转基因株系不仅存活率高，而且恢复正常生长的速度较快，表现出了较强的耐寒性。

表1 拟南芥不同株系低温胁迫后的存活率

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其编码的蛋白质、含有橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因的重组载体或含有橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因的重组菌在调控植物耐寒性中的应用，其特征在于，所述调控植物耐寒性为通过过表达所述HbERF105基因，以提高植物耐寒性；

所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.4所示；

所述植物为橡胶树或拟南芥。

2.一种调控植物耐寒性的方法，其特征在于，包括利用遗传转化技术，将橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因转入植物体内，提高所述植物耐寒性的步骤；

所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为橡胶树或拟南芥。

3.橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因及其编码的蛋白质、含有橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因的重组载体或含有橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因的重组菌在培育耐寒植物品种中的应用，其特征在于，所述培育耐寒植物品种为构建所述HbERF105基因稳定过表达的转基因耐寒植物；

所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.4所示；

所述植物为橡胶树或拟南芥。

4.一种培育耐寒植物品种的方法，其特征在于，包括利用遗传转化技术，将橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因转入植物体内，构建所述HbERF105基因稳定过表达的转基因耐寒植物的步骤；

所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为橡胶树或拟南芥。

5.检测橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因表达量的试剂在耐寒性植物品种早期筛选中的应用，其特征在于，所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为橡胶树或拟南芥；

所述植物中HbERF105基因过表达。

6.检测橡胶树ERF类转录因子HbERF105基因的试剂在培育耐寒植物品种中的应用，其特征在于，所述HbERF105基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为橡胶树或拟南芥；

所述植物中HbERF105基因过表达。