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CN119391729A - 光皮桦ripk1基因在提高植物低磷胁迫耐受性中的用途和方法 - Google Patents

光皮桦ripk1基因在提高植物低磷胁迫耐受性中的用途和方法 Download PDF

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CN119391729A
CN119391729A CN202411599815.6A CN202411599815A CN119391729A CN 119391729 A CN119391729 A CN 119391729A CN 202411599815 A CN202411599815 A CN 202411599815A CN 119391729 A CN119391729 A CN 119391729A
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CN
China
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gene
betula
ripk1
plants
luminifera
Prior art date
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Pending
Application number
CN202411599815.6A
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English (en)
Inventor
张俊红
路龙俊
徐晓珊
张毓婷
童再康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiyang College of Zhejiang A&F University
Original Assignee
Jiyang College of Zhejiang A&F University
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Publication date
Application filed by Jiyang College of Zhejiang A&F University filed Critical Jiyang College of Zhejiang A&F University
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Abstract

本申请公开了一种光皮桦RIPK1基因，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对该序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。本发明还公开了光皮桦RIPK1基因的用途，用于提高植物对低磷胁迫的耐受性。本发明还公开了一种用于提高植物在低磷胁迫下的耐受性的方法。本领域技术人员通过基因编辑技术负调控光皮桦RIPK1基因的表达或者敲除光皮桦RIPK1，可提升光皮桦的的低磷耐性，有助于提高植物的磷利用效率。

Description

光皮桦RIPK1基因在提高植物低磷胁迫耐受性中的用途和 方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，涉及光皮桦RIPK1基因在提高植物低磷胁迫耐受性中的用途和方法。
背景技术
随着全球农业生产需求的增加，农作物面临着多种环境压力，其中低磷胁迫已成为制约植物生长和产量的重要因素之一。磷是植物生长发育过程中必需的营养元素，尤其在能量代谢、核酸合成和细胞膜结构等方面发挥着至关重要的作用。然而，磷资源在自然界中的分布极为有限，且土壤中的可利用磷通常不足，导致植物在自然环境中常常面临低磷胁迫的困境。为了提高植物在低磷环境下的生长能力，学者们已经开展了大量的研究。当前，植物对低磷胁迫的响应机制主要包括磷吸收、转运以及磷利用效率的调节。在这些机制中，植物的根系在低磷环境下的形态变化和生理反应尤为重要。许多植物通过增加根系分泌的有机酸，促进土壤中磷的溶解与吸收，或者通过改变根系结构来增加根系的吸收面积，从而应对低磷胁迫。然而，这些自然适应性的调节能力受到基因控制，且不同植物种类和不同环境条件下的应答机制存在显著差异。
近年来，科学家们通过基因组学和分子生物学的研究，发现某些植物基因在低磷胁迫的响应中发挥着重要作用。RIPK1基因(Receptor-interacting Protein Kinase 1)作为一种重要的信号转导基因，在植物的免疫反应和胁迫响应中起着至关重要的作用。光皮桦(Betula luminifera)作为一种耐瘠薄的植物，其RIPK1基因在低磷环境中的功能尚未被深入研究。已有研究表明，RIPK1基因在植物的病理反应和生理调节中发挥关键作用，但其在植物低磷胁迫下的功能尚未被明确揭示。
目前，虽然一些作物品种如水稻、玉米和大豆等，已通过转基因技术或常规育种提高了低磷胁迫耐性，但对光皮桦等特定植物种类的低磷耐受性基因研究仍处于初步阶段。因此，深入研究光皮桦RIPK1基因的功能及其在低磷胁迫下的作用机制，对于提高植物的低磷耐受性，特别是在提高重要经济植物的生长和产量方面，具有重要的理论价值和应用前景。尽管现有技术已提出了一些基因改良方法，但如何通过基因工程手段有效地提高植物的磷吸收和利用效率，仍是当前农业生物技术领域亟待解决的问题。因此，开发新的低磷胁迫耐受性调控基因及其应用成为了植物生物技术研究中的一个重要方向。
发明内容
本发明目的在于提供了光皮桦RIPK1基因在提高植物低磷胁迫耐受性中的用途和方法，以揭晓光皮桦RIPK1基因在低磷胁迫下的功能。
本发明提供了一种光皮桦RIPK1基因，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对该序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。优选情况下，该光皮桦RIPK1基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1。本发明通过特异性引物设计，利用RT-PCR技术从光皮桦叶片中提取总RNA，逆转录成cDNA后，扩增出RIPK1基因的完整编码序列。经基因组比对与序列分析，确认该基因为RIPK1基因。
本发明还提供了光皮桦RIPK1基因的用途，用于提高植物对低磷胁迫的耐受性，通过基因编辑技术负调控所述光皮桦RIPK1基因的表达或者敲除所述光皮桦RIPK1基因，其中光皮桦RIPK1基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1。
在一个实施方案中，上述植物为光皮桦。
本发明还提供了一种用于提高植物在低磷胁迫下的耐受性的方法，该方法包括：
a)通过敲除所述光皮桦RIPK1基因，获得基因敲除植物；
b)在低磷胁迫条件下培养所述植物，从而提高其对低磷胁迫的耐受性。
在一个实施方案中，上述植物为光皮桦。
在一个实施方案中，上述方法进一步包括通过筛选敲除了光皮桦RIPK1基因的植物，确定具有较强耐受性的基因敲除植物。
为揭晓光皮桦RIPK1基因在低磷胁迫下的功能，本申请通过转基因技术在光皮桦中过表达光皮桦RIPK1基因，并对比观察低磷胁迫转基因植株和野生型的表型发现，野生型对照的根系(根长、表面积、体积、分叉数)生长好于转基因植株，说明过表达光皮桦RIPK1基因的转基因植株株系在低磷胁迫下生长发育受到影响更大，表明光皮桦RIPK1基因在植物耐低磷胁迫中具有负调控的作用。因此，本领域技术人员通过基因编辑技术负调控光皮桦RIPK1基因的表达或者敲除光皮桦RIPK1，可提升光皮桦的的低磷耐性，有助于提高植物的磷利用效率。
附图说明
以下说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明的光皮桦叶片的总RNA电泳检测图。
图2为本发明的光皮桦RIPK1基因的过表达载体的构建电泳图；图2A第1个泳道为阴性对照，第2泳道为光皮桦RIPK1基因扩增产物；图2B第1个泳道为阴性对照，第2至第4泳道(标记为1,2,3)为单克隆1-3号菌液模板扩增产物。
图3为本发明的合子胚诱导转化光皮桦荧光图，a和b分别为诱导丛生苗时明场观察和GFP检测，c和d为生根培养时明场观察和GFP检测，e和f为基质培养时明场观察和GFP检测，GFP检测使用手持荧光灯(LUYOR-3415RG Hand-held Lamp)。
图4为本发明的光皮桦RIPK1基因过表达植株鉴定,EV为野生型，OE为光皮桦RIPK1基因过表达植株。
图5为本发明的光皮桦RIPK1基因过表达植株低磷胁迫下的表型观测图，A为低磷胁迫35天后的表型图，B为株高，C为根长。
图6为本发明的光皮桦RIPK1基因过表达植株在低磷胁迫下的无机磷(Pi)含量。
图7为本发明的光皮桦RIPK1基因过表达植株在低磷胁迫下的过氧化氢含量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.材料
1.1实验材料
光皮桦种子采自浙江农林大学平山试验基地，选择晴朗的天气，用高枝剪将带有成熟种子的枝条剪下，种子装于50ml离心管，37度烘干后放置-20冰箱保存，通过组培获取得到后续实验所需的合子胚。
光皮桦5年生成熟叶片采自浙江农林大学平山实验基地，采样后立即置于液氮中运输，直至提取RNA。剩余叶片样本可放置于-80℃保存备用。
1.2实验试剂与仪器
DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国PE9700 PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
1.3引物合成及测序
引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2.方法
2.1光皮桦总RNA的提取
光皮桦叶片的总RNA通过改良的CTAB+TRIzol法提取，步骤如下：
(1)在10mL离心管中加入3mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液(10％ CTAB，10％PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8.0)，5M NaCl，0.6M EDTA(pH 8.0))，加入200μLβ-巯基乙醇；
(2)取-70℃保存的叶片2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至百色粉末；
(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃水浴30min，期间振荡3-4次；
(4)在混合物中加入等体积的25:24:1(酸性饱和酚：氯仿：异戊醇)，约3ml。混合均匀后14000rpm离心10min(常温)；
(5)取上清转入新的10ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒混匀，12000rpm4℃离心10min后取上清；
(6)重复步骤4一次，直至中间层消失；
(7)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20℃冰箱冷冻30min。12000rpm4℃离心10min弃掉上清，沉淀加入65℃预热好的SSTE400μL溶液至全溶；
(8)溶液中加入1mLTRIzol试剂，室温静置5min。再加入200μL氯仿摇匀，室温静置2-3min；
(9)4℃12000rpm离心15min；
(10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置10min；
(11)4℃12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；
(12)加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm4℃离心5min，弃掉上清；
(13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min；加入适量DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备用。
2.2基因克隆
光皮桦的RNA(Total RNA)用适量DEPC ddH2O稀释后，参照PrimeScriptTM RTReagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)的说明书进行反转录cDNA第一链的合成。反转录分两步完成，体系如下：
(1)去除基因组DNA反应体系如下：
(2)反转录反应体系如下：
设计光皮桦RIPK1基因的过表达引物(表1)，基因克隆PCR体系如下(50μL)：
反应程序为：98℃10s，52℃5s，72℃1min40s，循环35次，72℃5min。
表1基因克隆所用引物
2.3目的片段回收
利用AxyPrepTMDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)进行目的片段回收。
(1)在紫外灯下切含有基因目的片段的琼脂糖凝胶，称取凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL)。
(2)加入Buffer DE-A溶液，约3个凝胶体积，放入75℃水浴锅加热6-8min，期间每隔2-3min摇晃1次，至凝胶完全融化。
(3)加入Buffer DE-B溶液，约1/2的Buffer DE-A体积，混匀；当目的片段长度小于400bp时，再加入适量异丙醇，约1个凝胶体积。
(4)将上一步骤的混合液吸到DNA制备管(置于2ml离心管中)，12000rpm 1min，去滤液。
(5)加500μL Buffer W1于置备管中，12 000rpm 1min，弃滤液。
(6)加700μL Buffer W2于置备管中，12 000rpm 1min，弃滤液，重复1次。
(7)将置备管置于2mL离心管中，12 000rpm 1min，弃滤液。
(8)将置备管放入干净的1.5ml离心管，向置备管中央加25-30μL已预热至65℃的ddH2O，室温静置1-3min，12 000rpm 1min，洗脱DNA。
(9)取2-3μL DNA溶液用于琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余溶液放置-20℃保存。
2.4目的片段连接
混合下列溶液，轻轻混匀，短暂离心，PCR程序：25℃20min。
2.5目的片段转化
(1)将5μL连接产物，加入到50μL感受态TransT1中，冰浴25-30min。
(2)42℃水浴热激40sec。置于冰上2min。
(3)加入300-500μL无激素LB液体培养基，200rpm 37℃培养30-60min。
(4)4000rpm 2min，去部分上清，留50-100μL菌液，加入10μL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，100mg/mL)和8μL 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷(X-gal，100mg/ml)，混匀。
(5)将剩下的溶液涂于具有卡那霉素(Kan，50mg L-1)固体培养基中，37℃倒置培养过夜。
2.6目的片段PCR验证
(1)挑取上述的白色单菌落，置于相同浓度抗生素的液体LB培养基500μL中，37℃培养3-6h，取1μL，用于菌液PCR。
(2)用基因克隆引物进行菌液PCR检测，反应体系(10μL)如下：
(3)PCR程序为：94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃5min，循环35次；72℃10min。
(4)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选取阳性克隆送往浙江有康生物科技有限公司测序。
(5)提取质粒，使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(Transgene，北京)提取质粒，所得到的阳性质粒置于-20℃冰箱保存，以便用于下步反应。
2.7超表达载体的构建
(1)使用限制性内切酶Hind III及Nco I进行双酶切，酶切反应体系如下(50μL)：
37℃条件下酶切3-4h,反应结束后电泳检测并回收片段、测定浓度(详见2.3)。
将回收的目的片段和载体片段进行连接，体系如下：
(3)按2.5-2.6进行转化和菌检，得到正确的阳性克隆。
(4)提取测序结果正确的菌株质粒，待用。
2.8化学转化及菌检
(1)取出-80℃中保存的农杆菌，置冰上解冻；
(2)取1μL重组质粒，加至农杆菌感受态中，
枪头轻轻吹打搅动，稍微混匀后，分别置于冰上、液氮中、37℃水浴锅中、冰水中5min；
(3)向离心管中加入700μL-1mL不含任何抗性的新鲜YEP液体培养基，将菌液置于摇床中(28℃，200rpm)震荡培养2-3h；
(4)离心(6000rpm，2min)，小心倒掉部分上清，使管中剩余液体的体积在70-100μL左右，吹打均匀；
(5)将菌液均匀涂布于含有抗生素(50mg/L Kana及50mg/L Rif)的YEP固体培养基上，于28℃生化培养箱中倒置培养48-72h；
(6)挑取板上的单克隆菌检，对检测结果阳性的单克隆菌液进行-80℃保存。
2.9农杆菌介导光皮桦合子胚诱导转化法
(1)取RIPK1过表达载体和对照空载体(pK2GW7-eYGFP)的农杆菌菌液以1:30的比例加至30mL的LB液体培养基(50mg/L Spec+30mg/L Rif)中，于28℃摇床(200rpm)中过夜培养；
(2)第二天取上述所得菌液按1:30比例加至无抗LB液体培养基中继续培养直至OD600为0.5-0.6，所得即为侵染液；
(3)将提前流水冲泡发胀2d的光皮桦种子放入无菌超净台内，依次使用75％的酒精30s、30％双氧水13min、无菌水冲洗3次进行消毒，使用无菌手术刀对消毒完成的种子纵切胚，去种皮后，将胚放入菌液中浸泡10-15min；
(4)将侵染过的合子胚置于黑暗下进行共培养(WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)2～3d，期间根据农杆菌泛菌情况及时换板；
(5)然后进行选择培养(WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50mg/L Kana+200mg/L头孢霉素)，15d后陆续出现带抗性且发荧光的愈伤组织；
(6)20d后将抗性愈伤移入分化培养基上继续培养(WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+0.5mg/L GA3+50mg/L Kana+200mg/L头孢霉素)；待其长出不定芽后在组培瓶中进行继代培养(WPM+0.8mg/L 6-BA+50mg/L Kana)；20～30d后待从不定芽生长出的丛生苗长至3cm左右时，转入生根培养基(WPM+0.2mg/L NAA)中，并持续无性系扩繁以获得足量转基因苗。
将转基因株系瓶盖拧松，置于组培室和培养箱分别炼苗7d后，移至基质中(泥炭土：珍珠岩：蛭石＝2:1:1)培养长大，以备后续低磷处理。
2.10光皮桦低磷处理方法
经基质培养一个月后，空载及两个过表达株系随机分成两组，移至水培箱中培养，期间全程供氧并且定期更换水培营养液(5天/次)。先在正常磷浓度溶液中培养3周，再移入纯水中进行饥饿处理一周后，将苗随机移至正常磷浓度和低磷营养液(表2)中。磷饥饿试验：分别在处理前一天以及处理1天、3天、7天、14天、21天、28天、35天时测定生理指标、取样。每个时期至少3个生物学重复。取样后，立即进行RNA提取，剩余样品放于-80℃冰箱保存。
将上述处理后的转基因白桦拍照观察，利用直尺分别进行株高和根长的测量，使用万分之一天平对生物量称重。每个样品至少有3个重复，数据使用EXCEL 2019进行处理并用T检验或Turkey’s多重比较进行显著性分析。
对处理后的转基因白桦进行无机磷含量、ACP活性和H2O2含量测定。
处理期间选取1天、3天、7天、14天、21天、28天、35天节点进行光合参数测量，每个株系至少有3个生物重复，每个重复至少选3个位置测量。其中光合参数测量使用便携式光合作用系统Li-6800XTR(Li-Cor，美国)仪器。在室温25±2℃下早上8:00-11:00测量，光强设置为1000μmol m-2s-1，CO2浓度设置为400μmol/mol，流速设置为500μmol s-1，然后测定四个指标包括净光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)，并计算水分利用效率(WUE＝Pn/E)。
表2水培营养液配方
2.11数据分析
所有实验数据均进行至少三次生物学重复，并采用统计学分析(如t检验或ANOVA分析)。光合作用、无机磷含量等数据通过Excel 2019软件进行处理，并根据统计结果进行显著性分析。
3、实验结果
3.1光皮桦总RNA提取
光皮桦叶片采于浙江农林大学平山实验基地，用液氮运输，后立即用于RNA提取，剩余样品放入-80℃冰箱保存。对提取出的RNA进行电泳观察，发现条带清晰、无拖带(图1)，且OD260/OD280为1.8～2.1，表明RNA质量好，可用于下一步反转录和基因克隆。
3.2光皮桦RIPK1基因克隆与载体构建
以光皮桦cDNA为模板进行扩增，得到一条约1500bp条带(图2A)，切胶回收，连接转化并菌检测序正确后，进行光皮桦RIPK1基因过表达载体的构建，转化大肠杆菌后菌检正确(图2B)，提取阳性质粒并转化农杆菌，-80℃保菌。
3.3光皮桦RIPK1基因过表达植株的获得与鉴定
通过农杆菌介导光皮桦合子胚诱导转化法，共获得空载野生型一个株系(命名为EV)和过表达光皮桦两个株系(命名为OE1、OE3)，对这些植株进行荧光观察，发现全部发荧光(图3)。同时对转基因株系进行RNA提取、逆转录和半定量分析。发现OE1和OE3的光皮桦RIPK1基因表达水平显著高于EV(图4)，分别为EV的6.56和5.54倍，鉴定为阳性植株。
3.4光皮桦RIPK1基因过表达植株在低磷胁迫下的表型
表型观测发现植株生长都受低磷胁迫抑制，但是野生型EV相比转基因的OE1和OE3受低磷影响较小。在Pi充足的条件下，OE1、OE3和EV都生长良好；但在Pi缺乏条件下，OE1和OE3株高显著低于EV，且OE1和OE3总根长、根表面积、节点和分叉数显著低于EV(图5)，表明光皮桦RIPK1基因的过表达植株对低磷适应性降低。
3.5光皮桦RIPK1过表达植株无机磷含量分析
光皮桦RIPK1基因在低磷胁迫下EV和OE1和OE3的体内Pi含量均下降，但OE1和OE3中无机磷降幅显著低于EV降幅，OE受低磷影响更大(图6)。
3.6光皮桦RIPK1基因的过表达植株活性氧ROS积累检测
测定植物体内过氧化氢含量时，发现低磷胁迫下OE1和OE3体内H2O2含量明显高于EV(图7)。说明低磷胁迫下OE植物的氧化损伤显著高于EV，暗示其拥有更低的低磷耐受性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种光皮桦RIPK1基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述光皮桦RIPK1基因的核苷酸序列为SEQID No:1。
3.根据权利要求1所述的光皮桦RIPK1基因的用途，用于提高植物对低磷胁迫的耐受性，其特征在于，通过基因编辑技术负调控所述光皮桦RIPK1基因的表达或者敲除所述光皮桦RIPK1基因，其中所述光皮桦RIPK1基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述植物为光皮桦。
5.一种用于提高植物在低磷胁迫下的耐受性的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)通过敲除所述光皮桦RIPK1基因，获得基因敲除植物；
b)在低磷胁迫条件下培养所述植物，从而提高其对低磷胁迫的耐受性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物为光皮桦。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，进一步包括通过筛选敲除了光皮桦RIPK1基因的植物，确定具有较强耐受性的基因敲除植物。
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