CN1117861C

CN1117861C - 来自棒状杆菌属细菌的新基因及其用途

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Publication number: CN1117861C
Application number: CN95192671A
Authority: CN
Inventors: 木村英一郎; 阿部知津; 河原义雄; 吉原康彦; 中松亘
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 2003-08-13
Anticipated expiration: 2015-02-23
Also published as: MY113040A; BR9506883A; CN1146216A; DE69514914D1; US5929221A; DE69514914T2; PE38597A1; EP0752472B1; WO1995023224A1; EP0752472A4; JP2005323606A; JP3738449B2; ES2143617T3; EP0752472A1

Abstract

通过扩增来自棒状杆菌属细菌并参与L-谷氨酸生产的一种新基因，产L-赖氨酸棒状杆菌属细菌L-赖氨酸产力得到增强，同时通过抑制该基因功能，产L-谷氨酸棒状杆菌属细菌L-谷氨酸产力得到增强。

Description

来自棒状杆菌属细菌的新基因及其用途

发明领域

本发明涉及棒状杆菌属细菌的培育和利用及其用途，该菌用于L-氨基酸如L-谷氨酸和L-赖氨酸及其他物质的发酵生产。

现有技术说明

当棒状杆菌属细菌在含限量生物素的培养基中培养时，它们生产大量的L-谷氨酸。另一方面，当棒状杆菌属细菌在含过量生物素的培养基中培养时，它们不产生L-谷氨酸。然而，如果在此培养条件下向培养基中加入表面活性剂或青霉素时培养基中该菌生长受到抑制并且该菌在其中产生大量的L-谷氨酸。

为使棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸，以下任一方法均有效。

1.培养基中生物素浓度置于最适度以下。参见S.Okumura，T.Tsugawa，T.Tsunoda和A.Kitai，Nippon Nogeikagaku Kaishi， 36，197-203(1962)。

2.在足量生物素存在下，向培养基中加入一种表面活性剂。参见I.Shiio，H.Otsuka和N.Atsuya，，J.Biochem.， 53，333-340(1963)；K，Takinami，H.Okada和T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.， 27，853-863(1963)。

3.在足量生物素存在下，向培养基中加入青霉素。参见U.S.Patent 3,080,297；Japanese Patent Publication No.37-1695(1962)；M.Shibui，T.Kurima，S.Okabe和T.Osawa，Amino Acid and NucleicAcid， 17，61-65(1968)。

认为这些方法的机理如下。

由限量生物素生产L-谷氨酸，认为有关的主要因素如下：生物素成为脂肪酸合成中乙酰辅酶A(CoA)羧化酶的辅酶，以及，对于不饱和脂肪酸，如油酸及其衍生物具有生物素替代效应。因此，生物素会影响构成细胞膜的脂肪酸组成，从而改变L-谷氨酸穿过细胞膜的通透性(I.Shiio，S.Otsuka和M.Takahashi，J.Biochem.， 51，56-62(1962)；I.Shiio，K.Narui，N.Yahaba和M.Takahashi，J.Biochem.， 51，109-111(1962))。

由添加表面活性剂或青霉素生产L-谷氨酸也被认为与因细胞表面结构变化所致L-谷氨酸穿过细胞质膜的通透性变化有关(Shiio，S.Otsuka.和N，Katsuya，J.Biochem.， 53，333-340(1963))。

如上所述，L-谷氨酸生产与其穿过细胞膜的通透性有关，但尚未发现可以直接证实其间关系的论据。

也就是，关于限量生物素或者添加表面活性剂或青霉素由何机制提高棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸的能力，还有许多不明之处。

另外，尚无基因水平上的信息，这将是阐明这些机制的重要的关键因素。

发明内容

本发明的目的是要阐明棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸的机制，特别是添加的表面活性剂在棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸机制中的作用，并在如此得到的信息的基础上培育和改进棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸等。

具体地，本发明的目的是要在基因水平上阐明棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸的机制，分离棒状杆菌属细菌参与表面活性剂抗性的基因，并将如此得到的基因应用于产L-谷氨酸的棒状杆菌属细菌的培育和由棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸等。

为达成上述目的，本发明人深入研究，结果发现存在一种基因参与棒状杆菌属细菌的L-谷氨酸生产(该基因此后称为 dtsR基因，该基因编码的蛋白质称为DTSR蛋白)。另外，我们发现了该基因的很有价值的用途。基于这些发现，我们完成了本发明。

本发明包括以下内容：

(1)一种基因，来自棒状杆菌属细菌并编码赋予该菌对表面活性剂抗性的一种蛋白。

(2)根据(1)的基因，其中蛋白质包含序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，由序号37至543的一段氨基酸序列，或者其上含有替代、缺失或插入的一段氨基酸序列，而基本上不影响赋予棒状杆菌属细菌对表面活性剂抗性的活性。

(3)根据(1)所述的基因，含有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列第467至1987个的序列，或者基本具有与此相同的一段碱基序列。

(4)一种重组DNA，可通过将在棒状杆菌属细菌中起作用的一种载体与定义于(1)、(2)或(3)的基因连接而得到。

(5)一种棒状杆菌属细菌，含有上述(4)所述的重组DNA。

(6)一种生产L-赖氨酸的方法，包括培养一种棒状杆菌属细菌和收集L-赖氨酸，该菌含有定义于(4)的重组DNA且能在液体培养基中生产L-赖氨酸，从而在培养物中产生和积累L-赖氨酸。

(7)一种基因，包括含有定义于(1)、(2)或(3)基因的一段碱基序列上的一个或二个以上碱基替代、缺失、插入、增加或倒位的一段碱基序列，以致由该碱基序列编码的蛋白质就赋予棒状杆菌属对表面活性剂抗性的活性不能正常作用。

(8)一种重组DNA，可通过将在棒状杆菌属细菌中起作用的一种载体连接到定义于(7)的基因上而得到。

(9)一种棒状杆菌属细菌，通过存在于染色体上的含有定义于(1)、(2)或(3)的基因或者它的一个启动子的碱基序列中的一个或多个碱基替代、缺失、插入、增加或倒位，以致使具有赋予棒状杆菌属细菌对表面活性剂抗性之活性的蛋白质不能正常起作用。

(10)一种生产L-谷氨酸的方法，包括培养一种棒状杆菌属细菌和收集L-谷氨酸，通过存在于染色体上含有(1)、(2)或(3)所述基因或者它的一个启动子的碱基序列中的一个或多个碱基的替代、缺失、插入、增加或倒位，以致使具有赋予棒状杆菌属细菌对表面活性剂抗性之活性的蛋白质不能正常起作用，并能在液体培养基中生产L-谷氨酸，从而在培养物中产生和积累L-谷氨酸。

以下详细叙述本发明。

此处所指的棒状杆菌属细菌是定义于《伯杰氏细菌鉴定手册》，8thEd.，p.599(1974)的一类微生物。该菌是需氧，革兰氏阳性，非抗酸，不具孢子形成能力杆菌。包括以往归类于短杆菌属，但现在并入棒状杆菌属[见Int.J.Syst.Bacteriol.， 41，255(1981)]的细菌；还包括短杆菌属和微杆菌属中与棒状杆菌属密切相关的细菌。这些棒状杆菌属细菌中，以下提及的作为生产L-谷氨酸的已知细菌，最适用于本发明。

嗜乙酰乙酸棒状杆菌

醋谷棒状杆菌

美棒状杆菌

谷氨酸棒状杆菌

百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)

Corynebacterium melassecola

叉开短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)

乳酸发酵短杆菌

解糖短杆菌

Brevibacterium immariophilium

玫瑰色短杆菌

黄色短杆菌

生硫短杆菌

具体地，可以这此细菌的下列菌株为例：

嗜乙酰乙酸棒状杆菌 ATCC 13870

醋谷棒状杆菌 ATCC 15806

美棒状杆菌 ATCC 15991

谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032

谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13060

叉开短杆菌 ATCC 14020

乳酸发酵短杆菌 ATCC 13869

百合棒状杆菌 ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

解糖短杆菌 ATCC 14066

Brevibacterium immariophilium ATCC 14068

玫瑰色短杆菌 ATCC 13825

黄色短杆菌 ATCC 13826

生硫短杆菌 ATCC 19240

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到。每一菌株有一个登记号。根据登记号，任何人都能从ATCC得到相应的菌株。收藏于ATCC的菌株的登记号记述于ATCC目录中。

本发明中所指的表面活性剂在含足够量生物素的条件下与青霉素同样地，起到促进棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸的作用，这包括各种非离子表面活性剂，阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂[见K.Yamada，J.Takahashi和J.Nakamura，the Hakkokogaku kaishi， 20，348-350(1962)；K.Udagawa，S.Abe和I.Kinoshita，Hakkokogaku Kaishi， 40，614-619(1962)]。非离子表面活性剂中，Tween 60(聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯)和Tween 40(聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油单棕榈酸酯)具有类青霉素效应[见I.Shiio，S.Otsuka和N.Katsuya，J.Biochem.， 53，333-340(1963)]。另外，C₃至C₁₈的游离饱和脂肪酸本身就具有同样效应[见K.Takinami，H.Okada和T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.， 28，114-118(1964)]。Tween40用于本发明示例中。<1> 分离来自棒状杆菌属细菌中对表面活性剂抗性的基因

分离来自棒状杆菌属细菌中对参与表面活性剂抗性的基因，可采用以下方法。

(1)取得属于棒状杆菌属细菌的表面活性剂敏感突变株，该突变株对表面活性剂表现出较高的敏感性；

(2)将野生型棒状杆菌属细菌的染色体DNA的各种片段，连接到在棒状杆菌属细菌中起作用的一种载体上，作成各种重组DNA；

(3)将各重组DNA导入属于棒状杆菌属细菌的表面活性剂敏感突变株细胞中进行转化；

(4)从转化产物中，筛选丢失表面活性剂敏感性的菌株；

(5)从如此筛选的表面活性剂不敏感的转化产物中回收重组DNA；

(6)分析连接到载体上的棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA片段的结构。

如此得到的棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA片段含有来自棒状杆菌属细菌参与表面活性剂抗性的一种基因。该基因至少参与了在含表面活性剂的培养基中棒状杆菌属细菌累积L-谷氨酸的机制。另外，该基因还参与了在含青霉素或含限量生物素的培养基中L-谷氨酸的生产。

对表面活性剂表现出较高敏感性的棒状杆菌属细菌表面活性剂敏感突变株，是指棒状杆菌属细菌的一种突变株，它在含一定浓度表面活性剂的培养基中生长不良，而该浓度不影响在此培养基中棒状杆菌属细菌野生型菌株的生长。就表面活性剂聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油单棕榈酸酯而言，在含表面活性剂浓度为0.1至1mg/dl的培养基中，棒状杆菌属细菌表面活性剂敏感突变株比相应的野生型菌株生长较差。相反，棒状杆菌属细菌野生型菌株的生长不受培养基中浓度为0.1至1mg/dl的表面活性剂的影响。当这样一种突变株培养于含过量生物素的培养基中，通过添加表面活性剂来生产L-谷氨酸时，加入培养基中的表面活性剂的必需浓度可以低于通常情况。认为表面活性剂敏感突变株的细胞状态接近于野生株的细胞暴露于表面活性剂时的状态。

为得到棒状杆菌属细菌的表面活性剂敏感突变株，可采用记述于日本专利申请公开No.50-126877(1975)(日本专利申请No.52-24593(1977))的方法。

棒状杆菌属细菌表面活性剂敏感突变株之一例，是乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ 11060。该突变株保藏于the National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology，Ministry of International Trade and Industry，保藏号FERM P-3678。

制备棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA的各种片段，可采用以下方法，亦即，棒状杆菌属细菌野生型菌株培养于液体培养基，收集其中生长的细胞，根据Saito等[见H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.，Acta72，619(1963)]的方法从收集细胞中回收染色体DNA。如此回收的染色体DNA用限制酶部分裂解。识别四个碱基的酶用作限制酶，在DNA不完全分解的条件下进行裂解，制备各种DNA片段。

此处所指的在棒状杆菌属细菌中起作用的载体，例如在棒状杆菌属细菌中自主复制的一种质粒。下面列出载体的具体实例。pAM 330 参见日本专利申请公开No.58-67699(1983)pHM 1519 参见日本专利申请公开No.58-77895(1983)pAJ 655 参见日本专利申请公开No.58-192900(1983)pAJ 611 参见日本专利申请公开No.58-192900(1983)pAJ 1844 参见日本专利申请公开No.58-192900(1983)pCG 1 参见日本专利申请公开No.57-134500(1982)pCG 2 参见日本专利申请公开No.58-35197(1983)pCG 4 参见日本专利申请公开No.57-183799(1982)pCG 11 参见日本专利申请公开No.57-183799(1982)

通过连接在棒状杆菌属细菌中起作用的载体与棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA的各种片段来制备各种重组DNA时，可采用以下方法。载体首先以限制酶裂解。用于裂解载体的限制酶与用于裂解染色体DNA的相同，或者是裂解载体给出的末端与染色体DNA片段的末端互补。载体与DNA片段的连接通常由连接酶，如T4DNA连接酶等实现。

将各重组DNA导入棒状杆菌属细菌表面活性剂敏感突变株时，可采用任何已知的转化方法。例如，可采用的有报道于大肠杆菌K-12[见Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.， 53，159(1970)]，以氯化钙处理受体细胞来提高DNA通透性的方法；和报道于枯草芽孢杆菌[见Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yong，F.E.，Gene 1，153(1977)]，由向处于生长相的细胞导入DNA来制备感受态细胞的方法。除此以外，还可采用的方法是将DNA受体细胞制成易于吸收重组DNA的原生质体或原生质球，然后向细胞中导入重组DNA，该法已知应用于枯草芽孢杆菌，放线菌和酵母[见Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.， 168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature， 274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA， 75，1929(1978)]。

上述适于枯草芽孢杆菌的原生质体方法在本发明中用来得到足够高水平的频率。除此以外，还可采用的方法是向置于聚乙二醇或聚乙烯醇和二价金属离子的棒状杆菌属细菌细胞原生质体中导入DNA，该法记述于日本专利申请公开No.57-183799(1982)。羧甲基纤维素，葡聚糖，FicollPluronic F68(Serva公司产品)等还可用来代替聚乙二醇和聚乙烯醇，促进DNA导入原生质体细胞。在本发明实施例中，通过一种电脉冲方法(见日本专利申请公开2-207791(1990))进行转化。

下面叙述从转化株中筛选失去表面活性剂敏感性的菌株方法。

棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA限制酶Sau 3AI部分消化得到的大小约4至6kbp的DNA片段，连接到在大肠杆菌和棒状杆菌属细菌中均能自主复制的一种质粒载体上，构建重组DNA，这些重组DNA导入大肠杆菌DH5(Takara Shuzo公司产品)感受态细胞。培养转化产物，制备棒状杆菌属细菌野生型菌株的基因文库。

用该基因文库中的重组DNA转化乳酸发酵短杆菌AJ 11060。转化产物接种于无表面活性剂的M-CM2G琼脂平板上(每升水中含5g葡萄糖，10g多聚胨，(polypeptone)，10g酵母提取物，5g NaCl，0.2g DL-甲硫氨酸，15g琼脂和4mg氯霉素，pH7.2)，其上形成约40,000菌落。这些菌落复制到含30mg/L表面活性剂Tween 40的M-CM2G平板上，并收集在此含表面活性剂的M-CM2G平板上生长良好的菌落。于是，得到了失去表面活性剂敏感性的转化株。

从如此得到的丢失表面活性剂敏感性的转化株中回收重组DNA，可采用与制备棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA同样的方法。也就是，转化株在液体培养基中培养，从培养株中收集细胞，根据Saito等[见H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.，Acta 72.619(1963)]的方法从中回收重组DNA。

下面分析连接到载体上的棒状杆菌属细菌野生型菌株染色体DNA片段的结构。通过双脱氧法，一种常规的碱基序列测定法，测定染色体DNA片段的全部碱基序列，并分析该DNA的结构，确定增强子，启动子，操纵基因，SD序列，前导肽，衰减子，起始密码子，终止密码子，开放阅读框等的位置。

从棒状杆菌属细菌得到的参与表面活性剂抗性的基因为 dts R基因，它含有序列表中SEQ ID NO：1所示位于第467至第469碱基(ATG)和第1985至第1987碱基(CTG)之间的一段序列。可能由该基因编码的氨基酸序列示于序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。另一个ATG(核苷酸序号359-361)存在于同一阅读框第467至第469核苷酸ATG的上游，不能排除该ATG为起始密码子的可能性。然而，由该基因上游区同源序列的解析，推测第467至第469 ATG为起始密码子。即，推测SEQ ID NO：2所示序号37至543的氨基酸序列为DTSR蛋白的氨基酸序列。当DTSR蛋白的氨基酸序列和 dts R基因的碱基序列出现于本说明和权利要求中时，这是将第467至第469的ATG作为起始密码子。然而，应当考虑第359至第361的ATG为起始密码子的可能性。例如，如果 dts R基因导入棒状杆菌属细菌来增强表达，SEQ ID NO：1所示核苷酸序号467至1987的序列的表达就被认为是足够的了。然而，本领域的技术人员易于理解，当SEQ ID NO：1所示核苷酸序列包含核苷酸序号359-466的编码区和上游区导入棒状杆菌属细菌时，不管哪一个ATG是起始密码子，DTSR蛋白均能正确表达。无论哪一种情形，起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸均能被细胞内 dts R基因表达的氨肽酶裂解。

根据数据库检索，确证含SEQ ID NO：1所示碱基序列的 dts R基因和该序列编码的DTSR蛋白质都是新发现。发现该蛋白与记述于Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 83，8049-8053(1986)； Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，4864-4869(1986)；和Gene， 122，199-202(1992)的蛋白质，丙酰辅酶A羧化酶(PCC)β亚基蛋白同源。然而，这些文献并没暗示该蛋白参与谷氨酸生产。

丙酰辅酶A羧化酶是将α-酮戊二酸通过2-羟戊二酸，丙酰辅酶A，D-甲基丙二酰辅酶A和L-甲基丙二酰辅酶A转变为琥珀酰辅酶A的代谢途径中的一个反应催化酶，似乎该代谢途径是TCA循环中α-酮戊二酸脱氢酶催化反应的旁路。在此通路中，特别应当指出，丙酰辅酶A羧化酶需要生物素为辅酶，表明添加表面活性剂方法中的谷氨酸生产与限量生物素方法中的谷氨酸生产有关。<2>制备含重组DNA的棒状杆菌属细菌

含前项<1>中得到的，来自棒状杆菌属细菌参与表面活性剂抗性的 dts R基因的重组DNA，体外制备，导入棒状杆菌属细菌。通过导入，就能制备DTSR蛋白细胞内浓度提高的棒状杆菌属细菌。达此目的的一般方法是增强 dts R基因的细胞内表达或增加细胞内 dts R基因的拷贝数。

为增强细胞内 dts R基因的表达， dts R基因被连接于一个强启动子的下游。作为 dts R基因可举出由编码SEQ ID NO：2所示序号37至543的氨基酸序列的一段碱基序列。特别是所示碱基序列中核苷酸号467～1987构成的碱基序列或基本上与此相同的一段碱基序列。在此所述的“基本相同的碱基序列”意指编码的蛋白质与用序号467至1987的核苷酸序列编码的蛋白质就赋予棒状杆菌属细菌表面活性剂抗性之活性基本相同。这些碱基序列中编码的DTSR蛋白质可以含氨基酸的替代、缺失或插入，而基本上不影响赋予棒状杆菌属细菌对表面活性剂抗性之活性。

棒状杆菌属细菌细胞内起作用的强启动子，已知有来自大肠杆菌的乳糖启动子，tac启动子和色氨酸启动子[见Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa和K.Sano，J.Biotech.， 5，305-312(1987)]。另外，优选的是来自棒状杆菌属细菌的色氨酸启动子(见日本专利申请公开No.62-195294(1987))。

分别制备含 dts R基因的DNA和含启动子的DNA，并于体外连接。裂解和连接DNA，分别使用限制酶和连接酶。连接得到的重组DNA再导入棒状杆菌属细菌细胞。导入方法可采用前项<1>所引用的同样方法。

为将含强启动子和 dts R基因的重组DNA导入棒状杆菌属细菌细胞，必须使用在棒状杆菌属细菌细胞内起作用的一种载体。当<1>项中的载体用于此步时，重组DNA驻留于染色体外。为使重组DNA驻留在染色体DNA上，如记述于日本专利申请公开No.5-7491(1993)的一种温度敏感质粒被用作载体，在非许可温度下培养细胞来形成同源重组。

如此得到了携含强启动子和 dts R基因的重组DNA的棒状杆菌属细菌，其 dts R基因表达得到增强，且细胞内DTSR蛋白浓度得到提高。

为使含 dts R基因的拷贝数上升，将含该基因的DNA连接在多拷贝的质粒上后，并将其导入棒状杆菌属细菌细胞中。这种多拷贝质粒的例子，可参见<1>项所述。

形成同源重组还可以采用的方法是用大量存在于棒状杆菌属细菌染色体DNA上的一段序列作为靶标。大量存在于棒状杆菌属细菌染色体DNA上的序列的一例，是位于棒状杆菌属细菌转位因子两端的一段插入序列。该序列和由该序列形成同源重组的方法公开于国际公开No.WO93/18151。

如此得到的其中 dts R基因拷贝数增加了的棒状杆菌属细菌细胞， dtsR基因表达得到增强，DTSR蛋白细胞内浓度得到提高。<3>由含重组DNA的棒状杆菌属细菌生产L-赖氨酸

迄今多种人工突变株已被用作产L-赖氨酸细菌。以这些为宿主，通过保有本发明的重组DNA来改进其L-赖氨酸产力。这些人工突变株如下：S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(此后称为“AEC”)-抗性突变株；生长需要氨基酸如L-高丝氨酸的突变株(见日本专利公开Nos.48-28078(1973)和56-6499(1981))；抗AEC且需要L-亮氨酸，L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的突变株(见美国专利Nos.3,708,395和3,825,472)；对DL-α-氨基-∈-己内酰胺，α-氨基-月桂基-内酰胺，天冬氨酸类似物，磺胺类药物，醌及N-月桂酰-亮氨酸显示抗性的L-赖氨酸的生产的突变株，和对草酰乙酸脱羧酶抑制剂或呼吸系统酶抑制剂显示抗性的L-赖氨酸生产的突变株(见日本专利申请公开Nos.50-53588(1975)，50-31093(1975)，52-102498(1977)，53-9394(1978)，53-86089(1978)，55-9783(1980)，55-9759(1980)，56-32995(1981)，56-39778(1981)，日本专利公开Nos.53-43591(1978)和53-1833(1978)；生产L-赖氨酸需肌醇或乙酸的突变株(见日本专利申请公开Nos.55-9784(1980)和56-8692(1981))；对氟丙酮酸或者34℃或更高温度敏感的L-赖氨酸生产突变株(见日本专利申请公开No.53-86090(1978))：生产L-赖氨酸的短杆菌属或棒状杆菌属抗1，2-亚乙基二醇的突变株(见U.S.Patent No.4,411,997)。

具体例子参见下列菌株。

乳酸发酵短杆菌AJ12031(FERM BP-277)；参见日本专利申请公开No.60-62994(1985)。

乳酸发酵短杆菌ATCC 39134；参见日本专利申请公开No.60-62994(1985)。

谷氨酸棒状杆菌AJ3463(FERM P-1987)：参见日本专利公开No.51-34477(1976)。

乳酸发酵短杆菌AJ 12435(FERM BP-2294)；参见美国专利No.5,304,476。

乳酸发酵短杆菌AJ 12592(FERM BP-3239)；参见美国专利No.5,304,476。

谷氨酸棒状杆菌AJ 12596(FERM BP-3242)；参见美国专利No.5,304,476。

根据前项<2>的方法，由将本发明的重组DNA导入产L-赖氨酸细菌得到的棒状杆菌属细菌，细胞内DTSR蛋白的浓度提高，产物菌具有生产大量L-赖氨酸的能力。

用于L-赖氨酸生产的培养基可以是含碳源，氮源和无机离子的普通培养基，必要时添加其他次要的有机微量营养素。

可使用淀粉水解物等的糖类；醇类如乙醇，肌醇等；有机酸如乙酸，富马酸，柠檬酸，琥珀酸等。

可用的氮源有无机铵盐如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵等；有机氮化合物如大豆水解物等；还有氨气，氨水等。

添加的无机离子有少量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等。合适量的有机微量营养素更好，必要时含有如维生素B1等或酵母提取物等。

建议在有氧条件下，30至45℃培养16至72小时，其间培养基pH控制于5到7。调节pH，可用无机的或有机的，酸性或碱性物质，氨气等。

从发酵液中收集L-赖氨酸可组合使用常规的离子交换法，沉淀法和其他已知方法。<4>制备DTSR蛋白不正常起作用的棒状杆菌属细菌

如前项<1>所述，所得dts R基因是赋予棒状杆菌属细菌对表面活性剂抗性的一种基因。因此，预期携此扩增dts R基因的菌株在加入一定浓度表面活性剂的培养基中不再生产L-谷氨酸，即使在此浓度，有过量生物素存在下，棒状杆菌属细菌野生型菌株却能生产L-谷氨酸。考虑及此，根据以下实施例的方法，调查了dts R基因扩增在由添加表面活性剂生产L-谷氨酸中的作用，并如期观测到对L-谷氨酸生产的明显抑制。另外，确认了dts R基因扩增还导致在生物素限量方法中和在过量生物素存在下添加青霉素方法中，L-谷氨酸生产的抑制。这些结果表明，dts R基因不仅付与该菌株对表面活性剂的抗性，而且在L-谷氨酸生产中发挥重要作用。

由此，与上相反，由于dts R基因引起突变，且细胞内DTSR蛋白浓度或活性降低，生产L-谷氨酸的能力可能会提高，尤其在过量生物素存在条件下，而不加任何抑制生物素活性物质如表面活性剂或抗生素类物质，可以生产L-谷氨酸。考虑及此，制备了一种菌株，其中野生型菌株的 dts R基因已被破坏，并检查了如此修饰的菌株生产L-谷氨酸的能力，确认该 dts R基因破裂的突变菌株即使在高浓度生物素存在下也生产大量的L-谷氨酸，而此浓度下野生型菌株几乎不生产L-谷氨酸，如以下实施例所示。

dts R基因突变菌株可由使用化学试剂的诱变方法或由使用重组DNA技术的杂交方法得到。当该基因已得到时，可用重组DNA技术，从而该基因易被同源重组破裂。由同源重组破裂基因的方法业已建立。为此，可采用使用线型DNA的方法和使用温度敏感质粒的方法。

具体地，通过位点特异突变[见Kramer，W.和Faits，H.J.，Methods inEnzymology， 154，350(1987)]或用化学物质如连二亚硫酸钠，羟胺等处理[见Shorthe，D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 75，270(1978)]，在dts R基因编码区或启动子区碱基序列上制造一个或多个碱基的替换，缺失，插入，增加或倒位。如此修饰或破裂的基因替代染色体上的正常基因，从而降低或消除遗传产物DTSR蛋白活性，或者降低或消除基因转录。

在位点特异诱变法中，在使用合成的低聚核糖核苷酸，根据此法，可能只对任意限定的碱基对上引入任何期望的替代、缺失、插入、增加或倒位。利用此方法，首先克隆化将含目的基因的质粒变性来制备单链DNA，接着，制备与突变位点互补的合成低聚核苷酸。合成低聚核苷酸不应含有完全互补序列，但可能含有任何期望的核苷酸替代，缺失，插入，增加或倒位。此后，将具有与单链DNA任意的碱基替代，缺失，插入，增加或倒位的合成低聚核苷酸退火。进而，使用DNA聚合酶I的Klenow片段和T4连接酶形成完整的双链质粒。产物质粒然后导入大肠杆菌感受态细胞。如此得到的一些转化产物具有一种质粒，其所含基因具有固定的期望核苷酸替代，缺失，插入，增加或倒位。类似的由引入突变修饰或破裂基因(genedisrupting)的方法，已知有重组PCR方法[见PCR Technology，StocktonPress(1989)]。

另外化学处理法直接以连二亚硫酸钠，羟胺等处理含目的基因的DNA片段，从而随机引入碱基替代，缺失，插入，增如或倒位突变。

期望突变是否引入，可通过已经突变处理的DNA片段转化表面活化剂敏感突变株和测定转化产物对表面活性剂抗性来确认。此时，通过检查棒状杆菌属细菌通常生长温度范围内高温和低温下表面活性剂存在下的生长，筛选能在低温生长而在高温生长被抑制的转化产物，就能得到温度敏感的突变基因。

以如此得到的已被引入突变修饰或破裂的基因替代棒状杆菌属细菌染色体上的正常基因的方法，可采用同源重组的方法[见Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.， 162，1196(1985)]。根据同源重组，当所含序列与染色体序列同源的质粒等导入细胞时，在同源序列位点以一定频率发生重组，从而导入的完整质粒整合进染色体。此后，当染色体上同源序列位点发生进一步突变时，质粒被从染色体移除。通过后一种重组，引入突变的基因固定在染色体上，原来的正常基因可能与质粒一起被从染色体移除。筛选这种菌株，可能得到经引入突变修饰或破裂的基因替代了染色体上正常基因的一种菌株，该突变含核苷酸替代，缺失，插入，增加或倒位。<5>由DTSR蛋白不能正常作用的棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸。

如上所述，生产L-谷氨酸棒状杆菌属细菌且其中细胞内DTSR蛋白浓度或活性降低的菌株，即DTSR蛋白不正常起作用的菌株，L-谷氨酸产力提高了。尤其是，即使存在过量生物素而不添加生物素活性抑制物如表面活性剂或抗生素，该菌株也能生产L-谷氨酸。

为通过培育有生产L-谷氨酸能力的棒状杆菌属细菌来得到DTSR蛋白不正常起作用的菌株时，作为起始菌株可以举出，棒状杆菌属细菌生产L-谷氨酸野生型菌株及其突变株。突变株的例子列于下：

乳酸发酵短杆菌AJ1 2745(FERM-BP 2922)参见美国专利No.5,272,067，

乳酸发酵短杆菌AJ 12746(FERM-BP 2923)参见美国专利No.5,272,067，

黄色短杆菌AJ 12747(FERM-BP 2924)参见美国专利No.5,272,067，

谷氨酸棒状杆菌AJ12478(FERM-BP 2925)参见美国专利No.5,272,067，

谷氨酸棒状杆菌ATCC 21492。

用于L-谷氨酸生产的培养基可以是含碳源，氮源和无机离子的普通培养基，必要时添加其他次要的有机微量营养素。

供用的碳源有糖类如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，淀粉水解物等；醇类如乙醇，肌醇等；有机酸如乙酸，富马酸，柠檬酸，琥珀酸等。

供用的氮源有无机铵盐如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵等；有机氮化合物如大豆水解物等；还有氨气，氨水等。

作为无机离子，可添加少量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等。含有有机微量营养素更好，如维生素B1等；还有酵母提取物等。

建议在有氧条件下，30至45℃培养1 6至72小时，其间培养基pH保持在5到8。可用无机的或有机的，酸性或碱性物质，氨气等调节pH。

表面活性剂或青霉素可添加到dtsR基因-受干扰的菌株的培养基中，或限制培养基中生物素浓度。这样可以进一步提高培养基中生产的L-谷氨酸的产量。

从发酵液中收集L-谷氨酸可组合使用常规离子交换法，沉淀法和其他已知方法。

附图简述

图1表示在无表面活性剂或有表面活性剂培养基中AJ11060/pDTR6( dtsR基因扩增菌株)和AJ 11060/pSAC4(对照)的生长。○：pDTR6导入菌株，无表面活性剂□：pSAC4导入菌株，无表面活性剂●：pDTR6导入菌株，有表面活性剂■：pSAC4导入菌株，有表面活性剂

图2表示改变添加的培养基中表面活性剂浓度时，ATCC13869/pHSGX-KΔE(缺失突变型 dts R基因扩增菌株)，ATCC13869/pDTR6( dts R基因扩增菌株)和ATCC 13869/pSAC4(对照)的生长状况。○：pSAC4导入菌株△：pHSGX-KΔE导入菌株▲：pDTR6导入菌株

图3表示在含300或3μg/L生物素的培养其中AJ11060/DTR6和AJ11060/pSAC4的生长曲线。AJ 11060/pDTR6(dtsR基因扩增株)的生物素要求量下降。○：pDTR6导入菌株，300μg/liter生物素□：pSAC4导入菌株，300μg/liter生物素●：pDTR6导入菌株，3μg/liter生物素■：pSAC4导入菌株，3μg/liter生物素

优选实施方案说明

本发明将在下列中详细说明实施例1 (制备乳酸发酵短杆菌ATCC 13869(一种棒状杆菌属细菌野生

型菌株)的染色体DNA

乳酸发酵短杆菌ATCC 13869接种于100ml T-Y培养基[含1％细菌胰蛋白胨(Difco产品)，0.5％细菌酵母提取物(Difco产品)和0.5％ NaCl；pH 7.2]，31.5℃培养8小时，得到培养物。该培养物3,000r.p.m.离心15分钟，得到0.5g湿细胞。根据Saito & Miura方法(见Biochem.Biophys。Acta. 72，619，(1963))从湿细胞中得到染色体DNA。接着，60μg染色体DNA和3单位限制 Sau 3AI混合于10mM Tris-HCl缓冲液(含50mMNaCl，10mM MgSO₄和1mM二硫苏糖醇；pH 7.4)，37℃反应30分钟。反应后，反应混合物经常规苯酚抽提和乙醇沉淀，得到50μg以 Sau 3AI消化的乳酸发酵短杆菌ATCC 13869染色体DNA片段。实施例2 (用质粒载体DNA制备乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的基因文

库)

在大肠杆菌和棒状杆菌属细菌均能自主复制的质粒载体DNA(pSAC4)20μg与200单位限制酶 Bam HI混合于50mM Tris-HCl缓冲液(含100mM NaCl和10mM硫酸镁；pH 7.4)，37℃反应2小时得到消化液，消化液经常规酚抽提和乙醇沉淀。此后，根据记述于MolecularCloning，2nd Edition[J.Sambrook.E.F.Fritsch和T.Maniatis，ColdSpring Harbor Laboratory Press，p.1.56(1989)]的方法，DNA片段以细菌碱性磷酸酶脱磷酸化以防止来自质粒载体的DNA片段重新结合，然后脱磷酸化的DNA片段经常规酚抽提和乙醇沉淀。

以 BamHI消化的pSAC41μg，在实施例1中得到的以 Sau 3AI消化的乳酸发酵短杆菌ATCC 13869染色体DNA片段，和2单位T4 DNA连接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.产品)加入含66mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的66mM Tris-HCl缓中液(pH 7.5)中，16℃反应16小时进行DNA连接。接着，由常规方法以该DNA混合物转化大肠杆菌DH5细胞，转化产物细胞接种于含170μg/ml氯霉素的L-琼脂培养基，得到约20,000菌落构成的基因文库。实施例3 (转化乳酸发酵短杆菌AJ 11060)

从上述约20,000菌落中，根据上述Saito和Miura方法回收重组DNA。

重组DNA混合物分成50份，通过常规的电脉中转化法(见日本专利申请公开No.2-207791(1990))，导入AJ 11060菌株，该菌株是一种对表面活性剂敏感的突变株细胞。转化产物细胞接种于添加葡萄糖的L-琼脂培养基，31.5℃静置培养，从而在培养基上形成约20,000转化菌落。接着，这些转化菌落复制到同样的但含30mg/liter表面活性剂的平板培养基上，从中得到一些抗表面活性剂且能生长于该平板培养基上的菌株。实施例4 (测量含多拷贝dts R基因菌株的表面活性剂抗性)

从长出的若干菌株中分别提取重组DNA，以此DNA再转化乳酸发酵短杆菌AJ 11060。从转化产物中筛选对表面活性剂抗性菌株。该菌株的重组DNA命名为pDTR6，该质粒携载的且有能力使菌株抗表面活性剂的基因命名为 dts R。导入该质粒的AJ 11060菌，在添加表面活性剂(3g/liter)的液体培养基中，生长抑制被削弱了(见图1)实施例5 (制备DNA)

由常规方法，从上面得到的含重组DNA的A111060/pDTR6中制备质粒，并导入大肠杆菌JM 109。得到的大肠杆菌JM 109/pDTR6在含1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和0.5％ NaCl的20ml培养基中，37℃培养24小时，将得到的20ml培养物接种于一升组成同上的培养基11中，37℃培养3小时。然后加入0.2g氯霉素，进而，同样温度下继续培养20小时。接着，得到的培养物以3,000r.p.m.离心10分钟，得到2g湿细胞。得到的细胞悬浮于含25％蔗糖的20ml 350mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)然后加入10mg溶菌酶(Sigma Co.产品)8ml 0.25M EDTA溶液(pH 8.0)和8ml 20％十二烷基硫酸钠溶液。然后得到的悬浮液于60℃加热30分钟，得到溶菌产物。将13ml 5M NaCl溶液加入溶菌产物中，然后4℃处理16小时。处理后，15,000r.p.m.离心30分钟。如此得到的上清液经常规酚抽提和乙醇沉淀，得到DNA沉淀物。

沉淀物减压干燥，然后溶解于含1mM EDTA的6ml 10mM Tris-HCl缓中液(pH 7.5)，进而加入6g氯化铯和0.2ml溴化乙锭(19mg/ml)。然后用39000 r.p.m.超速离心机进行平衡密度梯度分离42小时，分离DNA。接着，用正丁醇除去溴化乙锭，此后经含1mM EDTA的10mMTris-HCl(pH 7.5)透析，得到约500μg纯化的重组DNA，pDTR6。对大肠杆菌JM 109/pDTR6付与专用编号AJ 12967。该菌株于1994年2月22日保藏于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Ageney of Industrial Science and Technology，Ministryof Interntional Trade and Industry，保藏号FERM P-14168，并于1995年2月9日按照布达佩斯条约转至国际保藏，保藏号为FERM BP-4994。实施例6 (分析含dts R基因的DNA的碱基序列)

测定例5得到的重组DNA的碱基序列。测序依据Sanger方法，使用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(AppliedBiochemical Co.产品)。如此得到的DNA的碱基序列表示于序列表中SEQID NO：1。尽管该序列最长的开放阅读框是SEQ ID NO：1所示第359A至第1987 G的碱基序列，由分析该基因上游区同源序列推断，第467至第469的ATG为起始密码子。由开放阅读框第359A至第1987G编码的氨基酸序列与该核苷酸序列一同示于序列表中SEQ ID NO：1。另外，氨基酸序列单独示于序列表中SEQ ID NO：2。由第467至第1987碱基序列编码的蛋白质命名为DTSR蛋白。

众所周知，蛋白质N-末端甲硫氨酸残基翻译后经肽酶作用缺失。这是因为N-末端甲硫氨酸来自翻译起始密码子ATG，因此大多数情况下与蛋白质固有功能无关。本发明的DTSR蛋白，也有可能甲硫氨酸残基被缺失。

碱基序列和氨基酸序列就同源性方面与已知序列比较。用于比较的数据库是EMBL和SWISS-PROT。结果确认，序列表中SEQ ID NO：1所示基因与其编码的蛋白质都是新发现。实施例7 (确认dts R基因参与表面活性剂抗性)

由核苷酸测序鉴定开放阅读框，暗示存在DTSR蛋白。为进一步确证赋予棒状杆菌属细菌表面活性剂抗性的基因位于此区，开放阅读框此区基因的一部分以框内方式从序列表中SEQ ID NO：1所示基因片段中缺失，并调查该基因片段是否具有赋予棒状杆菌属细菌表面活性剂抗性之活性。

具体地，以 XbaI和 KpnI消化pDTR6得到含 dts R基因的片段。用T4DNA连接酶(Takara Shuzo公司产品)将该基因片段连接到经 XbaI和KpnI处理过的质粒pHSG398片段上(Takara Shuzo公司产品)，制备质粒pHSGX-K。以 Eco52I消化的 dts R基因有两个位点，在SEQ ID NO：1的766和1366核苷酸处。pHSGX-K以 Eco52I完全消化，然后自我连接制备质粒pHSGX-KΔE，从中缺失600碱基对的 Eco52I片段。在此pHSGX-KΔE上 dts R基因的结构使中心部分被以框内方式缺失。

接着，为使pHSGX-KΔE能在棒状杆菌属细菌自主复制，将来自能在棒状杆菌属细菌自我扩增(见Miwa，K.等Agic.Biol.Chem. 48，2901-2903(1984)；日本专利申请公开No.5-7491 1993))的一种已知质粒pHM1519的复制起点，引入存在于pHSGX-KΔE上的唯一 KpnI裂解位点。具体地，以限制酶 BamHI和 KpnI消化pHM1519，得到含复制起点的基因片段，用Takara Shuzo公司生产的致钝试剂盒将产物片段制成平滑端，然后用 KpnI接头(Takara Shuzo公司产品)插入pHSGX-KΔE的KpnI位点，得到pKCX-KΔE。作为对照，pHM1519的复制起点用 SalI接头(Takara Shuzo公司产品)插入pHSG399的 Sal I位点，制备pSAC4。使用上述电脉冲方法，此处制备的pKCX-KΔE和pSAC4分别导入棒状杆菌属细菌野生型菌株和乳酸发酵短杆菌ATCC 13869细胞，并检查转化产物的表面活性剂抗性程度。检查时，细胞培养于加入0至10mg/dl聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油单棕榈酸酯的M-CM2G液体培养基，测量培养物中细胞生长状况。

结果证明，缺失型 dts R基因丢失了赋予表面活性剂抗性的功能。实施例8 (由生物素限量方法用dts R基因扩增菌株生产L-谷氨酸)

如下所述，根据生物素限量方法，培养菌株AJ 11060/pDTR6来生产L-谷氨酸。具体地，菌株AJ 11060/pDTR6分别培养于含4mg/liter氯霉素的M-CM2G平板培养基上。然后，生长细胞接种于一升纯水中含80g葡萄糖，1gKH₂PO₄，0.4g MgSO₄·7H₂O，30g(NH₄)₂SO₄，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.01g MnSO₄·7H₂O，15ml大豆水解物溶液，200μg酸硫胺素，60μg生物素，4mg氯霉素和50g CaCl₃的培养基(培养基pH用KOH调至7.0)并于31.5℃培养20小时。培养物接种于同样但不合生物素的培养基(该培养基此后称为“生物素限量培养基”)，体积浓度为5％，31.5℃培养20小时。

在生物素限量培养基中培养菌株AJ 11060/pDTR6时，测量培养基中生长的单位重量细胞所需生物素的量(见图3)。作为对照，同上培养菌株AJ 11060/pSAC4。

菌株AJ 11060/pDTR6生长细胞的量大于对照。因此，菌株AJ11060/pDTR6单位重量生长细胞所需生物素低于菌株AJ 11060/pSAC4。实施例9 (由dts R基因扩增菌株生产L-赖氨酸)

通过电脉冲方法，将pDTR6导入棒状杆菌属细菌产L-赖氨酸菌株，乳酸发酵短杆菌AJ 12435(FERM BP-2294)。下述培养基培养，来生产L-赖氨酸。

具体地，用含有4mg/liter氯霉素的M-CM2G平板培养基上培养将如此得到的细胞接种一升纯水中含100g葡萄糖，1g KH₂PO₄，0.4gMgSO₄，30g(NH₄)₂SO₄，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.01g MnSO₄·7H₂O，15ml大豆水解物溶液，200μg盐酸硫胺素，300μg生物素，4mg氯霉素和50g CaCO₃的培养基中(培养基pH用KOH调至7.0)培养32℃ 40小时。作为对照，使用以同样方式导入pSAC4而不是pDTR6的菌株。结果表示于表5。

表5

菌株 L-赖氨酸(g/L)

AJ 12435/pSAC4 15

AJ 12435/pDTR6 25参考例1 (由添加表面活性剂方法用dts R基因扩增菌株生产L-谷氨酸)

通过添加表面活性剂作为生物素活性抑制剂，即使在高浓度生物素存在下，菌株AJ 11060也能生产大量的L-谷氨酸。然而，因为 dts R基因扩增菌株提高了表面活性剂抗性，认为即使添加表面活性剂，这些菌株的谷氨酸生成也会被抑制。因此，根据下述添加表面活性剂的方法，使用菌株AJ 11060/pSAC4和AJ 11060/pDTR6来生产L-谷氨酸。具体地，菌株分别培养于含4mg/liter氯霉素的M-CM2G平板培养基上。然后，菌株接种于1升纯水中含80g葡萄糖，1g KH₂PO₄，0.4g MgSO₄·7H₂O，30g(NH₄)₂SO₄，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.01g MnSO₂·7H₂O，15ml大豆水解物溶液，200μg盐酸硫胺素，300μg生物素，4mg氯霉素，3.0g聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油单棕榈酸酯和50g CaCO₃的培养基中(培养基pH用KOH调至8.0)并于31.5℃培养20小时。

培养后，测定培养物中生产和积累的L-谷氨酸的量。得到的产量示于表2。

表2

菌株 L-谷氨酸产量(％)

AJ 11060/pSAC4 29.6

AJ 11060/pDTR6 9.0

通过扩增 dts R基因，L-谷氨酸产量显著减少。这表明DTSR蛋白密切参与了由添加表面活性剂方法的L-谷氨酸生产。参考例2 (由添加青霉素方法用dts R基因扩增菌株生产L-谷氨酸)

除了培养基中加入30单位青霉素G替代聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油单棕榈酸酯以外，与参考例1同样方式使用AJ 11060pSAC4和AJ11060/pDTR6进行由添加青霉素方法培养菌株来生产L-谷氨酸。结果示于表3。

表3

菌株 L-谷氨酸产量(％)

AJ 11060/pSAC4 27.6

AJ 11060/pDTR6 12.8

通过扩增 dts R基因，L-谷氨酸产量显著减少。这表明DTSR蛋白除参与由添加表面活性剂方法的L-谷氨酸生产外，还参与了由添加青霉素方法的L-谷氨酸生产。实施例10 (生产dts R基因破裂(dts Rene-disrupted)菌株)

因为发现L-谷氨酸生产被 dts R基因扩增降低，预期 dts R基因破裂(dtsR gene-disrupted)将导致L-谷氨酸产量增加。通过公开于日本专利申请公开No.5-7491(1993)的同源重组方法，用温度敏感质粒得到基因破裂(dtsR gene-disrupted)菌株。

具体地，从能在棒状杆菌属细菌自主复制且自主复制已变为温度敏感的一种质粒中得到复制起点，引入例7中pHSGX-KΔE的 KpnI识别位点，形成质粒pKTCX-KΔE。

通过电脉冲方法，将pKTCX-KΔE导入野生型菌株乳酸发酵短杆菌ATCC 13869中，使用日本专利申请公开No.5-7491(1993)的方法，将染色体上 dts R基因替换成缺失型，具体地ATCC 13869/pKTCX-KΔE在含50μg/ml油酸的M-CMZG液体培养基中25℃振荡培养6小时，培养物接种于含5μg/ml氯霉素和50μg/ml油酸的M-CM2G培养基。插入质粒的菌株于34℃形成菌落，收集起来。从如此得到的菌株中，由复制方法筛选那些34℃对氯霉素敏感的菌株。由常规方法得到这些敏感菌株的染色体，由Southern杂交方法分析每一染色体的 dts R基因。这样，确认了 dts R基因缺失型 dts R基因替代的菌株，并命名为菌株ΔE。实施例11 (评估菌株ΔE的L-谷氨酸生产力)

以下述方式培养菌株ATCC 13869，AJ 11060和ΔE来生产L-谷氨酸。这些菌株各自培养于M-CM2G平板培养基上复壮。复壮的菌株接种于一升纯水中含80g葡萄糖，1g KH₂PO₄，0.4g MgSO₄，30g(NH₄)₂SO₄，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.01g MnSO₄·7H₂O，15ml大豆水解物，20μg盐酸硫胺素，300μg生物素，1g Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸盐)和50gCaCO₃(培养基pH用KOH调至8.0)的培养基中，31.5℃培养20小时。结果示于表4。

表4

菌株 L-谷氨酸(g/L)

ATCC13869 0

AJ11060 0

ΔE 34

由于培养基中存在过量生物素，未观测到野生型菌株和菌株AJ 11060累积L-谷氨酸。相反，菌株ΔE生产和积累L-谷氨酸良好。

产业应用性

本发明的 dts R基因是在棒状杆菌属细菌的L-谷氨酸生产中发挥重要作用的一种基因，该菌用于L-谷氨酸的发酵生产。当该基因扩增于产L-赖氨酸棒状杆菌属细菌时，L-赖氨酸产力提高。当该基因在产L-谷氨酸棒状杆菌属细菌中被干扰时，L-谷氨酸产力提高。

序列表SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2855

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线型

(ii)分子类别：基因组DNA

(ix)特点：

(A)命名/检索：CDS

(B)位置：359..1987

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1GATCTTGGAA CTCGACAGTT TTCACCGTCC AGTTTGGAGC GCCTGAGCTT GCAAGCTCCA 60GCAAGTCAGC ATTAGTGGAG CCTGTCACTT TTTCGTAAAT GACCTGGCCA AAGTCACCGT 120TTTGGAGCAA TTTTTCCTTC AGGAGCTCAA CGTTTAGCGG CTCTCTGGAT CGTGAAATGT 180CAACGTTCAT GGAAGCCAAT GTAGTGGGGT CGCGTCGAAA AGCGCGCTTT AAGGGCGACA 240CGCCCAAAAA GTTTTACCTT TAAAAACTAC CCGCACGCAG CACGAACCTG TTCAGTGATG 300TAAATCACCG CGGAAATATT GTGGACGTTA CCCCCGCCTA CCGCTACGAT TTCAAAAC 358ATG ACC ATT TCC TCA CCT TTG ATT GAC GTC GCC AAC CTT CCA GAC ATC 406Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile1 5 10 15AAC ACC ACT GCC GGC AAG ATC GCC GAC CTT AAG GCT CGC CGC GCG GAA 454Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Alg Arg Arg Ala Glu

20 25 30GCC CAT TTC CCC ATG GGT GAA AAG GCA GTA GAG AAG GTC CAC GCT GCT 502Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala

35 40 45GGA CGC CTC ACT GCC CGT GAG CGC TTG GAT TAC TTA CTC GAT GAG GGC 550Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly

50 55 60TCC TTC ATC GAG ACC GAT CAG CTG GCT CGC CAC CGC ACC ACC GCT TTC 598Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65 70 75 80GGC CTG GGC GCT AAG CGT CCT GCA ACC GAC GGC ATC GTG ACC GGC TGG 646Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp

85 90 95GGC ACC ATT GAT GGA CGC GAA GTC TGC ATC TTC TCG CAG GAC GGC ACC 694Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr

100 105 110GTA TTC GGT GGC GCG CTT GGT GAG GTG TAC GGC GAA AAG ATG ATC AAG 742Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys

115 120 125ATC ATG GAG CTG GCA ATC GAC ACC GGC CGC CCA TTG ATC GGT CTT TAC 790Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr

130 135 140GAA GGC GCT GGC GCT CGC ATT CAG GAC GGC GCT GTC TCC CTG GAC TTC 838Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145 150 155 160ATT TCC CAG ACC TTC TAC CAA AAC ATT CAG GCT TCT GGC GTT ATC CCA 886Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro

165 170 175CAG ATC TCC GTC ATC ATG GGC GCA TGT GCA GGT GGC AAC GCT TAC GGC 934Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly

180 185 190CCA GCC CTG ACC GAC TTC GTG GTC ATG GTG GAC AAG ACC TCC AAG ATG 982Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met

195 200 205TTC GTT ACC GGC CCA GAC GTG ATC AAG ACC GTC ACC GGC GAG GAA ATC 1030Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile

210 215 220ACC CAG GAA GAG CTT GGC GGA GCA ACC ACC CAC ATG GTG ACC GCT GGC 1078Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225 230 235 240AAC TCC CAC TAC ACC GCT GCG ACC GAT GAG GAA GCA CTG GAT TGG GTA 1126Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val

245 250 255CAG GAC CTG GTG TCC TTC CTC CCA TCC AAC AAT CGC TCT TAC ACA CCA 1174Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro

260 265 270CTG GAA GAC TTC GAC GAG GAA GAA GGC GGC GTT GAA GAA AAC ATC ACC 1222Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr

275 280 285GCT GAC GAT CTG AAG CTC GAC GAG ATC ATC CCA GAT TCC GCG ACC GTT 1270Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val

290 295 300CCT TAC GAC GTC CGC GAT GTC ATC GAA TGC CTC ACC GAC GAT GGC GAA 1318Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305 310 315 320TAC CTG GAA ATC CAG GCA GAC CGC GCA GAA AAC GTT GTT ATT GCA TTC 1366Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe

325 330 335GGC CGC ATC GAA GGC CAG TCC GTT GGA TTT GTT GCC AAC CAG CCA ACC 1414Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr

340 345 350CAG TTC GCT GGC TGC CTG GAC ATC GAC TCC TCT GAG AAG GCA GCT CGC 1462Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg

355 360 365TTC GTC CGC ACC TGC GAC GCG TTT AAC ATC CCA ATC GTC ATG CTT GTC 1510Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val

370 375 380GAC GTC CCC GGC TTC CTT CCA GGC GCA GGC CAG GAG TAT GGT GGC ATC 1558Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385 390 395 400CTG CGT CGT GGC GCA AAG CTG CTC TAC GCA TAC GGC GAA GCA ACC GTT 1606Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val

405 410 415CCA AAG ATT ACC GTC ACC ATG CGT AAG GCT TAC GGC GGA GCG TAC TGC 1654Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys

420 425 430GTG ATG GGT TCC AAG GGC TTG GGC TCT GAC ATC AAC CTT GCA TGG CCA 1702Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro

435 440 445ACC GCA CAG ATC GCC GTC ATG GGC GCT GCT GGC GCA GTC GGA TTC ATC 1750Thr Ala Gln ILe Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile

450 455 460TAC CGC AAG GAG CTC ATG GCA GCT GAT GCC AAG GGC CTC GAT ACC GTA 1798Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465 470 475 480GCT CTG GCT AAG TCC TTC GAG CGC GAG TAC GAA GAC CAC ATG CTC AAC 1846Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn

485 490 495CCG TAC CAC GCT GCA GAA CGT GGC CTG ATC GAC GCC GTG ATC CTG CCA 1894Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro

500 505 510AGC GAA ACC CGC GGA CAG ATT TCC CGC AAC CTT CGC CTG CTC AAG CAC 1942Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His

515 520 525AAG AAC GTC ACT CGC CCT GCT CGC AAG CAC GGC AAC ATG CCA CTG 1987Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu

530 535 540TAAATCGGCG AATCCATAAA GGTTCAAAAG AATTCAATAA GGATTCGATA AGGGTTCGAT 2047AAGGGTTCGA TAAGGGCCGA CTTAAATAGT TGGATGTAAA GAAATACCAA TGAAAATTGG 2107CAACTCTTTA CACCCAATCT TTAAGACATG GGGGGTGGCG CTGGGCTAAT ATAACCGGTT 2167AGCGAAACGA TTAGTCCCTT GTTAGGGGGA TTAACCCTCG AAGTGGGTCG TATTTTGGCG 2227TTTGTATGTT CACACAAGAA CCCTGCACAA CGCCTTCAAA GTACGTCGAC CACGACCAAG 2287CGCATTATTC ACTCTCACCC TTCAGGATTT AGACTAAGAA ACCATGACTG CAGCACAGAC 2347CAAACCTGAC CTCACCACCA CGGCTGGAAA GCTGTCCGAT CTTCGCTCCC GTCTTGCAGA 2407AGCTCAAGCT CCAATGGGCG AAGCAACTGT AGAAAAAGTG CACGCTGCTG GCAGGAAGAC 2467TGCCCGCGAA CGTATCGAGT ATTTGCTCGA TGAGGGCTCT TTCGTAGAGA TCGATGCTCT 2527TGCTCGTCAC CGTTCCAAGA ACTTCGGCCT GGATGCCAAG CGTCCAGCTA CTGACGGTGT 2587TGTGACTGGT TACGGCACCA TCGATGGCCG TAAGGTCTGT GTGTTCTCCC AGGACGGCGC 2647TGTATTCGGT GGCGCTTTGG GTGAAGTTTA TGGTGAAAAG ATCGTTAAGG TTATGGATCT 2707TGCGATCAAG ACCGGTGTGC CTTTGATCGG AATCAATGAG GGTGCTGGTG CGCGTATCCA 2767GGAAGGTGTT GTGTCTCTGG GTCTGTACTC ACAGATTTTC TACCGCAACA CCCAGGCGTC 2827TGGCGTTATC CCACAGATCT CTTTGATC 2855SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

(A)长度：543

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线型

(ii)分子类别：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile

1 5 10 15

Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu

20 25 30

Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala

35 40 45

Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly

50 55 60

ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe

65 70 75 80

Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp

85 90 95

Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe ser Gln Asp Gly Thr

100 105 110

Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Vai tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys

115 120 125

Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr

130 135 140

Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe

145 150 155 160

Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro

165 170 175

Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly

180 185 190

Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met

195 200 205

Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly

225 230 235 240

Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val

245 250 255

Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro

260 265 270

Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr

275 280 285

Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val

290 295 300

Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu

305 310 315 320

Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe

325 330 335

Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr

340 345 350

Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg

355 360 365

Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val

370 375 380

Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile

385 390 395 400

Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val

405 410 415

Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys

420 425 430

Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro

435 440 445

Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile

450 455 460

Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val

465 470 475 480

Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn

485 490 495

Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro

500 505 510

Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His

515 520 525

Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu

530 535 540

Claims

1.一种生产L-谷氨酸的棒状杆菌属细菌，

所述棒状杆菌属细菌在染色体上，于下述编码的基因或其启动子的核苷酸序列中，具有一个或两个以上核苷酸的替代、缺失、插入、增加或倒位，以使由该核苷酸序列编码的蛋白质的赋予棒状杆菌属细菌表面活性剂抗性的活性降低，

所述基因编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸残基第37至543位的氨基酸序列。

2.一种DNA片段，它由棒状杆菌属细菌的基因组获得，而且，它编码包含序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸残基第37至543的氨基酸序列的蛋白质，当所述蛋白质在棒状杆菌属细菌中表达时，该蛋白质赋予棒状杆菌属细菌对表面活性剂的抗性。

3.根据权利要求2所述的DNA，它包含序列表中SEQ ID NO：1所示第467至第1987位的核苷酸。

4.一种重组DNA，它含有权利要求2所述的DNA。

5.一种棒状杆菌属细菌，它用权利要求4所述重组DNA转化。

6.一种生产L-赖氨酸的方法，它包括

在液体培养基中培养权利要求5所述的棒状杆菌属细菌，以便在所述培养基中生产L-赖氨酸；

接着，对所述L-赖氨酸进行分离。

7.一种编码蛋白质的DNA，所述蛋白质是一种包含SEQ ID NO：2序列中的第37至543位残基的氨基酸的突变体，其中，

所述序列中的至少一个残基被替代或缺失，或者，

至少一个氨基酸残基被插入所述序列中的两个相邻的氨基酸残基中，或者，

至少一个氨基酸残基被加至所述序列中；以及，

当所述蛋白质在棒状杆菌属细菌中表达时，该蛋白质赋予该菌对表面活性剂的抗性。

8.根据权利要求7所述的DNA，其中，所述包含序列表中SEQ IDNO：2所示氨基酸残基37至543的氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO：1所示第467至1987位的核苷酸编码。

9.一种重组DNA，它含有权利要求7所述DNA。

10.一种棒状杆菌细菌，它是用权利要求9所述重组DNA转化的。

11.一种生产L-赖氨酸的方法，它包括

在液体培养基中培养权利要求10所述的棒状杆菌属细菌，以便在所述培养基中生产L-赖氨酸；

接着，对所述L-赖氨酸进行分离。

12.一种编码蛋白质的DNA，所述蛋白质是一种包含SEQ ID NO：2序列中的第37至543位残基的氨基酸序列的突变体，其中，

所述序列中的至少一个氨基酸残基被替代或缺失，或者，

至少一个氨基酸残基被插入所述序列中的两个相邻的氨基酸残基中，

当所述蛋白质在棒状杆菌细菌中表达时，该蛋白质对该菌不赋予对表面活性剂的抗性，

所述DNA可以通过同源重组，在棒状杆菌属细菌的染色体上取代一种DNA，所述DNA编码一种包含序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸残基第37至第543位的氨基酸序列。

13.根据权利要求12所述的DNA，它包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列的突变体，其中，SEQ ID NO：1中至少766至1366号的核苷酸缺失。

14.根据权利要求12所述的DNA，它包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列的突变体，其中，SEQ ID NO：1中的766至1366位核苷酸缺失。

15.一种重组DNA，它含有权利要求12所述的DNA。

16.一种棒状杆菌属细菌，它是用权利要求15所述重组DNA转化的。

17.一种生产L-谷氨酸的方法，它包括

在液体培养基中培养权利要求16所述的棒状杆菌属细菌，以便在所述培养基中生产L-谷氨酸；

接着，对所述L-谷氨酸进行分离。