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WO1995023224A1 - Nouveau gene tire de corynebacterium et son utilisation - Google Patents

Nouveau gene tire de corynebacterium et son utilisation Download PDF

Info

Publication number
WO1995023224A1
WO1995023224A1 PCT/JP1995/000269 JP9500269W WO9523224A1 WO 1995023224 A1 WO1995023224 A1 WO 1995023224A1 JP 9500269 W JP9500269 W JP 9500269W WO 9523224 A1 WO9523224 A1 WO 9523224A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
corynebacterium
gene
genus
surfactant
ala
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/000269
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eiichiro Kimura
Chizu Abe
Yoshio Kawahara
Yasuhiko Yoshihara
Tsuyoshi Nakamatsu
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to JP52225895A priority Critical patent/JP3738449B2/ja
Priority to EP95909970A priority patent/EP0752472B1/en
Priority to BR9506883A priority patent/BR9506883A/pt
Priority to US08/693,228 priority patent/US5929221A/en
Priority to DE69514914T priority patent/DE69514914T2/de
Publication of WO1995023224A1 publication Critical patent/WO1995023224A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to a corynebacterium used for fermentative production of L-amino acids and the like represented by L-glutamic acid and L-lysine. Breeding and utilization of genus bacteria. 2. Description of the Related Art When Corynebacterium bacteria are cultured in a medium with a limited amount of biotin, the bacteria produce significant amounts of L-glutamic acid. On the other hand, when a Corynebacterium bacterium is cultured in a medium containing excess biotin, the bacterium does not produce L-glutamic acid. It is known that growth is suppressed and the bacterium produces significant amounts of L-glutamic acid.
  • any of the following means is effective for producing L-glutamic acid using Corynebacterium bacteria.
  • L-glutamic acid by the addition of a surfactant or benicillin has also been considered in connection with a change in permeability of the cytoplasmic membrane due to a change in the structure of the cell surface (I. Shiio, S. Otsuka, N. Katsuya: J. Biochem., 53, 333-340 (1963)).
  • the object of the present invention is to provide a mechanism for the production of L-glutamic acid possessed by a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, more specifically, the surface activity of a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, which possesses a mechanism for producing L-glutamic acid.
  • the purpose is to elucidate the mechanism of action of the additive and to breed and improve L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Corynebacterium based on the knowledge obtained.o
  • a specific object of the present invention is to elucidate the L-glutamic acid production mechanism of Corynebacterium bacteria at the gene level, and isolate a gene involved in surfactant resistance derived from Corynebacterium bacteria, The purpose is to apply the obtained gene to breeding of L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Corynebacterium and to production of L-glutamic acid and the like.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found the presence of a gene that is thought to be involved in L-glutamic acid production of Corynebacterium bacteria (hereinafter, this gene is referred to as the _ ⁇ _ LiR gene, The protein encoded by this gene is referred to as DTSR protein.) Furthermore, the present inventors have completed the present invention by finding useful uses of this gene.
  • the present invention is as follows.
  • the amino acid sequence of the protein is an amino acid sequence consisting of amino acids Nos. 37 to 543 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing or Corynebacterium genus in this amino acid sequence;
  • the gene according to the above (1) which contains an amino acid sequence having a substitution, deletion, or insertion of an amino acid residue that does not substantially affect the activity of imparting resistance to a surfactant to bacteria.
  • Corynebacterium bacteria having the recombinant DNA according to (4) and capable of producing L-lysine are cultured in a liquid medium, and L-lysine is produced and accumulated in the culture medium, and collected.
  • a method for producing L-lysine characterized in that:
  • nucleotide sequence of the gene according to the above (1), (2) or (3) a protein encoded by this nucleotide sequence confers on Corynebacterium bacteria resistance to a surfactant.
  • the genus Corynebacterium according to the present invention is defined in Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, pp. 599 (1974). A group of microorganisms that are aerobic, gram-positive, nonacid-fast, and have no spore-forming ability.They were previously classified into the genus Brevibacterium, but are now integrated as Corynebacterium bacteria. Brevibacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (198 1)), and closely related to corynebacterium brevibacterium and microbate Including Lium bacterium. Among such bacteria of the genus Corynebacterium, those known as L-glutamic acid-producing bacteria described below are the most preferred in the present invention. Corynepa's tertiary acetate filam
  • Brevipacterium Divaricatam Corynenocterium glutamicum
  • Cterium lactofermentum Corynenocterium glutamicum
  • Brevibacterium 'Furanokumu' (Corynepa 'Cterium kuno-kuno, Noreno ⁇ ⁇ , Kam Brevipa' Cterium 'Chyogeitaris) Specifically, the following strains can be exemplified.
  • the surfactant according to the present invention has a function of promoting the production of L-glutamic acid in Corynebacterium bacteria, similarly to penicillin, in the presence of a sufficient amount of biotin, and various nonionic surfactants , Cationic surfactant, anionic Surfactants exist (Kouichi Yamada, Joji Takahashi, Junni Nakamura: Journal of Fermentation Engineering, 2fi, 348-350 (1962), Kiyoshi Udagawa, Shigeo Abe, Shuro Kinoshita: Journal of Fermentation Engineering, 40, 614-619 ( 19 62)).
  • Tween60 polyoxyethylene sorbitan monostearate
  • Tween40 polyoxyethylene sorbitan monostearate
  • Polyoxyethylene sorbitan monoleate. monopalmitate has a penicillin-like effect (I. Shiio, S. Otsuka, N. Katsuya: J. Biochem., 53, 333-340 (1963)). Further, the same effect can be of free saturated fatty their from C 3 C 8! (L Takinami , H. Okada, T Ts oda:.... Agr Biol Chem, 28, 114-118 (1964)) .
  • the one used in the examples of the present invention is Tween40.
  • the chromosomal DNA fragment of the wild-type Corynebacterium genus bacterium thus obtained contains a gene related to surfactant resistance derived from Corynebacterium genus bacterium.
  • This gene is at least involved in the mechanism by which Corynebacterium bacteria accumulate L-glutamic acid in a culture medium containing a surfactant. ⁇ It is also commonly involved in the accumulation of L-glutamic acid in the medium due to the addition of nicillin and restriction of biotin.
  • Detergent-sensitive mutants belonging to the genus Corynepacterium with improved sensitivity to detergents are defined as those in a medium containing a concentration of detergent that does not affect the growth of wild-type Corynepterium bacteria.
  • the surfactant is polyoxyethylene sorbitan monopalmitate
  • the surfactant-sensitive mutant belonging to the genus Corynebacterium is added to the culture medium at a concentration of 0.1 to 1 mg / dl. Then, the growth will be worse than the wild strain.
  • the mutant is cultured and a surfactant is added to produce L-glutamic acid, the required concentration of the surfactant is lower than usual.
  • the state of the cells of the detergent-sensitive mutant seems to be similar to the state when the wild-type cells were exposed to the detergent.
  • a method for obtaining a surfactant-sensitive mutant belonging to the genus Corynebacterium is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 50-128687 (Japanese Patent Publication No. 52-24593). Can be used.
  • the surfactant-sensitive mutant belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium glutamicum AJ11060.
  • the strain has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and has accession number F ERM
  • the methods for preparing various fragments of chromosome DNA of wild-type Corynebacterium bacteria are as follows.
  • wild-type Corynebacterium bacteria are cultured in a liquid medium, and chromosomal DNA is collected from the collected cells according to the method of Saito et al. (H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)). to recover.
  • Various DNA fragments can be prepared by using a 4-base recognition type enzyme as a restriction enzyme and conducting the reaction under the condition that the DNA is incompletely degraded.
  • a vector that functions in Corynebacterium bacteria is, for example, a plasmid that can autonomously replicate in Corynebacterium bacteria. Specific examples include the following. p AM 330 See JP-A-58-67699.
  • p CG 11 Same as above.
  • restriction enzymes must be used in advance.
  • Cleavage is performed using the same restriction enzyme used to cut chromosomal DNA, or using a restriction enzyme that generates a cut surface complementary to the cross section of various fragments of chromosomal DNA.
  • Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase.
  • Various recombinant DNAs can be introduced into a surfactant-sensitive mutant belonging to the genus Corynepacterium by following the transformation method reported so far.
  • a method to increase the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), and a method for preparing DNA from a cell at the growth stage and introducing DNA as described in Bacillus subtilis (uncan, CH, Wilson, GA). and Young, FE, Gene, 1, 153 (1977)).
  • the DNA of the recipient DNA may be transformed into protoplasts or sperm plasts that readily incorporate the recombinant DNA, as is known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast.
  • Bacillus subtilis actinomycetes
  • yeast yeast
  • Bibb MJ, Ward, JM and Hopwood, 0. A., Nature, 274, 398 (1978) Hinnen, A., Hicks, JB and Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)
  • a sufficiently high transformation frequency can be obtained by the method used in Bacillus subtilis as described above.
  • bacteria of the genus Corynebacterium are A method of incorporating DNA in a state in which the protoplast is brought into contact with one of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol and a divalent metal ion can also be used.
  • polyethylene glycol or polyvinyl alcohol addition of carboxymethylcellulose, dextran, ficoll, or Bulkonik F68 (Selva) can also promote DNA uptake.
  • the transformation method used in Examples of the present invention is the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791).
  • Approximately 4 to 6 Kbp of DNA fragment obtained by partially digesting the chromosomal DNA of a wild strain of Corynebacterium with the restriction enzyme ⁇ 3AI was used to transform Escherichia coli and Corynebacterium.
  • a recombinant DNA is produced by ligating with an autonomously replicable plasmid vector, and the recombinant DNA is introduced into Escherichia coli DH5 competent senor (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the transformed strain is cultured to obtain a gene library of a wild strain of Corynebacterium bacterium.
  • Brevibacterium lactofermentum AJ11060 is transformed using the recombinant DNA contained in the gene library, and the resulting transformant is once transformed into a surfactant-free M-CM2G agar plate.
  • (1 g of pure water containing 5 g of glucose, 10 g of polypeptone, 10 g of yeast extract, 15 g of NaC, 0.2 g of DL-methionine, 15 g of agar and 4 mg of chloramphenicol, pH 7.2) Apply to form tens of thousands of colonies.
  • the colonies were replicated on a M-CM2G plate containing 3 OmgZL of a surfactant (Tween40), and those showing good growth on a surfactant-containing M-CM2G plate were obtained.
  • Activator A strain that has lost sensitivity can be obtained.
  • the method for recovering recombinant DNA from a transformant that has lost surfactant sensitivity is the same as the method for preparing chromosome DNA of wild-type Corynebacterium bacteria.
  • the transformed strain was cultured in a liquid medium, and the collected cells were used for the method of Saito et al. and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)).
  • Structural analysis of a chromosomal DNA fragment of a wild-type Corynebacterium genus linked to a vector is performed as follows.
  • the entire nucleotide sequence of the chromosomal DNA fragment is determined by the dideoxy method, which is a conventional method for nucleotide sequence determination, and the DNA is subjected to structural analysis, and the enhancer, promoter, operator, SD sequence, leader peptide, and peptide are analyzed. Position, start codon, stop codon, open reading frame, etc.
  • the gene involved in surfactant resistance derived from Corynebacterium sp. Is the _L ⁇ R gene, and the CTG from the 467-469th ATG to 1985-1987 the ATG of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. At least. The amino acid sequences that can be encoded by this gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing.
  • An ATG (nucleotide numbers 359 to 361) further exists in the same frame upstream of the ATG at positions 467 to 469, and the possibility that this ATG is the initiation codon cannot be denied.
  • the ATG at positions 467 to 469 is presumed to be the start codon. That is, among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence consisting of amino acids 37 to 543 is presumed to be the amino acid sequence of the DTSR protein.
  • the amino acid sequence of the DTSR protein and the nucleotide sequence of the gene these may be described with ATG at positions 467 to 469 as the start codon, but 359 to 361. Also consider that the second ATG may be the start codon.
  • ⁇ _ R gene For example, if the expression of the ⁇ _ R gene is to be enhanced by introducing the gene into Corynebacterium, it is considered that the sequence consisting of nucleotides 467 to 1987 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 should be expressed. However, if the coding region and the upstream region of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 including nucleotide numbers 359 to 466 are introduced into Corynebacterium bacteria, DTSR can be obtained even if the shifted ATG is the initiation codon. It will be readily understood by those skilled in the art that the protein can be correctly expressed.
  • the N-terminal Met encoded by the initiation codon may be cleaved by aminopeptidase.
  • a database search confirmed that the _LAR gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the DTSR protein encoded by it were novel. Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 83, 8049-8053 (1986), Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 83. 4864-4868 (1986). And Gene, 122, 199-202 (1992), a propionyl CoA carboxylase (PC C) protein; a protein described as 3 subunits. However, none of these documents suggests that the protein is involved in glutamate productivity.
  • PC C propionyl CoA carboxylase
  • Propionyl C0A carboxylase metabolizes ⁇ -ketoglutarate to succinyl COA through 2-hydroxyglutarate, propionyl COA, D-methylmalonyl COA, and L-methylmalonyl COA.
  • An enzyme that catalyzes one of the pathways a metabolic pathway that appears to bypass the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase-catalyzed reaction in the TCA cycle.
  • propionyl C0 carboxylase is an enzyme using biotin as a coenzyme, which also links the production of glutamic acid by the surfactant addition method with the production of glutamic acid by the biotin restriction method.
  • the DTSR protein is obtained.
  • Corynebacterium bacterium having an increased intracellular concentration can be prepared. The usual means is to enhance the expression of the JLR gene in the cell or to increase the copy number of the dtsR gene.
  • the _LAR gene includes a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence consisting of amino acids 37 to 543 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. More specifically, of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence consisting of nucleotides 467 to 1987 and a nucleotide substantially identical thereto Sequences.
  • substantially the same nucleotide sequence means that the encoded protein imparts resistance to a surfactant to a bacterium belonging to the genus Corynepa cteridium, to the protein encoded by the nucleotide sequence consisting of the nucleotide numbers 467 to 1987. It means that they are substantially the same in activity.
  • the encoded DTSR protein has amino acid residue substitutions, deletions or insertions that do not substantially affect the activity of conferring Corynebacterium bacterium resistance to detergents. May be.
  • the Escherichia coli Iac promoter, the tac promoter, and the Trp promoter exist (Y. Morinaga, M. Tsuchiya, K. Miwa and K. Sano, J. Biotech., 5, 305-312 (1987)).
  • a trp promoter of a bacterium belonging to the genus Corynebacterium is a suitable promoter (Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-195294).
  • DNA containing the dtsR gene and DNA containing the promoter are respectively prepared, and both are ligated in vitro. Cleavage and ligation of DNA use restriction enzymes and ligases, respectively. The recombinant DNA obtained by the ligation is introduced into cells of the genus Corynebacterium. For the introduction method, the same method as described in ⁇ 1> above can be used.
  • the Corynebacterium bacterium thus obtained into which the recombinant DNA comprising the strong promoter and the ⁇ _ ⁇ _R gene has been introduced, has enhanced expression of the _ ⁇ __ LR gene, and the concentration of the DTSR protein in the cell is reduced. It is rising.
  • the DNA containing the gene is ligated into a multi-copy plasmid and introduced into a Corynebacterium bacterial cell.
  • An example of a multicopy plasmid is described in Section 1).
  • homologous recombination is caused by utilizing a sequence that is abundantly present on the chromosome DNA of the genus Corynepacterium.
  • sequences that are abundant on chromosomal DNA of Corynebacterium include insertion sequences that are present at both ends of the transposable element of Corynebacterium.
  • the same sequence and a method for performing homologous recombination using the same sequence are disclosed in International Publication Pamphlet W093 / 18151.
  • the Corynebacterium bacterium having an increased copy number of the dtsR gene thus obtained has an enhanced expression of the ____4R gene and an increased intracellular DTSR protein concentration.
  • L-lysine-producing bacteria Conventionally, various artificial mutants have been used as L-lysine-producing bacteria, and the L-lysine-producing ability can be improved by retaining the recombinant DNA of the present invention using these as hosts.
  • Such artificial mutants include the following. S- (2-aminoethyl) -cystine (hereinafter abbreviated as "AEC") resistant mutant, mutant that requires an amino acid such as L-homoserine for its growth
  • JP-A-52-102498 JP-A-53-9394, JP-A-53-86089, JP-A-55-9983, JP-A-55-9759, JP-A-56-32995, No. 56-39778, No. 53-43591, No. 53-1833 , Inositol or L one lysine-producing mutant strain (JP 55- 9784 No. requesting acetate, JP 56 No. 8869), an L-lysine-producing mutant which is sensitive to fluoropyruvic acid or a temperature of 34 or more (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 55-9783 and 53-86090), and resistant to ethylene glycol.
  • Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (FERM BP-3242, U.S. Pat. No. 5,304,476)
  • the recombinant DNA of the present invention was introduced into these L-lysine-producing bacteria according to the method described in 2> above.
  • the resulting Corynebacterium bacterium has an increased intracellular DTSR protein concentration and is capable of producing significant amounts of L-lysine.
  • the medium used for L-lysine production is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and other organic micronutrients as required.
  • Saccharides such as powdered hydrolysates, alcohols such as ethanol and inositol, and organic acids such as acetic acid, fumaric acid, citric acid, and succinic acid can be used.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, ammonia water and the like
  • Potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manga A small amount of ion or the like is added.
  • organic trace nutrients it is desirable to include required substances such as vitamins, yeast extract and the like in appropriate amounts.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 72 hours, and the culture temperature is controlled to 30 to 45, and the pH is controlled to 5 to 7 during the culture.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used.
  • the collection of L-lysine from the fermentation broth can usually be carried out by combining an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • the _L ⁇ R gene was obtained as a gene that confers on Corynebacterium bacteria resistance to detergents. Therefore, even in the presence of an excessive amount of biotin, the gene can be amplified even if a concentration of a surfactant at which a wild-type strain of Corynebacterium having L-glutamic acid-producing ability produces L-glutamic acid is added. It was predicted that L-glutamic acid would not be produced in the resulting strain. Then, the effect of _LR gene amplification on the production of L-glutamic acid to which a surfactant was added was examined by the method described in the Examples described below.
  • Strains in which the _4_LAR gene has a mutation can be obtained by the method of inducing mutation using a chemical agent or by breeding by genetic recombination. However, when a gene has been obtained, the gene can be easily disrupted by homologous recombination using the gene recombination method. Gene disruption by homologous recombination has already been established, and methods using linear DNA and methods using temperature-sensitive plasmid can be used. Specifically, site-directed mutagenesis (Kramer, W.
  • DTSR protein which is a gene product, is reduced or eliminated by replacing, modifying or disrupting the gene with a normal gene on the chromosome. Or it can reduce or eliminate transcription of the _LR gene.
  • the site-directed mutagenesis method is a method using a synthetic oligonucleotide, and is a technique capable of introducing an arbitrary substitution, deletion, insertion, addition or inversion into only an arbitrary limited base pair.
  • a single strand is prepared by denaturing a clone containing the target gene whose DNA base sequence has been determined.
  • synthesize a synthetic oligonucleotide complementary to the part to be mutated At this time, the synthetic oligonucleotide is not completely complemented, and any base substitution, deletion, insertion, addition or reverse Have a place.
  • a DNA fragment containing the target gene is directly treated with sodium hyposulfite, hydroxylamine, etc., so that random substitution, deletion, insertion, addition or inversion of bases in the DNA fragment is performed.
  • This is a method to introduce a mutation with Whether or not the desired mutation has been introduced may be determined by transforming a surfactant mutant with the mutated DNA fragment and confirming whether or not the resulting transformant has resistance to a surfactant.
  • a strain of Corynebacterium having the ability to produce L-glutamic acid and having a reduced intracellular concentration or activity of the DTSR protein that is, a strain in which the DTSR protein does not function normally, is a strain of L-glutamic acid.
  • Increased productivity, especially in Pio L-glutamic acid can be produced without the addition of biotin-inhibiting substances such as surfactants and antibiotics even in the presence of excessive amounts of tin.
  • the starting material is a glutamate-producing wild strain of Corynebacterium or a mutant strain derived therefrom.
  • mutants include, for example,
  • the medium used for the production of L-glutamic acid is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and, if necessary, other organic micronutrients.
  • sugars such as glucose, lactose, galactose, fructose / starch hydrolyzate, alcohols such as ethanol and inositol, and organic acids such as acetic acid, fumaric acid, citric acid, and succinic acid can be used.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, ammonia water and the like
  • inorganic ions small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added.
  • organic trace nutrients it is desirable to include required substances such as vitamins, yeast extract and the like in appropriate amounts.
  • the cultivation is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 72 hours, and the culture temperature is 30 to Adjust the pH to 5-8 during the culture.
  • the culture temperature is 30 to Adjust the pH to 5-8 during the culture.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas, etc. can be used.
  • a surfactant or benicillin may be added to the obtained _LR gene-disrupted strain,
  • the yield of glutamic acid can be further improved by limiting the amount of glutamic acid.
  • FIG. 1 shows the growth of AJ1106 OZpD TR6 ( ⁇ AR gene amplified strain) and AJ1106 OZp SAC4 (control) in a medium without or with a surfactant. It is.
  • Fig. 2 shows ATCC 1386 9 / pHSGX-KAE (deletion mutant type long gene amplification strain) and ATCC 13869 / pDTR6 (in the medium supplemented with a different concentration of surfactant). 1 shows the growth of dts R gene amplified strain) and ATCC 13869 / p SAC 4 (control).
  • FIG. 3 shows the growth curves of AJ11060 / pDTR6 and AJ11060 / pSAC4 in a medium containing 300 g / L or 3 g / L of biotin.
  • AJ 1 This indicates that the requirement for biotin of 106 / p DTR 6 (dtsR gene amplified strain) was reduced.
  • the reaction-finished solution was subjected to phenol extraction by a conventional method, ethanol precipitation, and 50 g of the chromosomal DNA fragment of Brevibacterium lactobacterium ATC C13869 digested with y3AI. Obtained.
  • Example 2 Plasmid Vector Preparation of Gene Library of Brevibacterium lactofermentum ATC C13869 Using DNA Plasmid vector capable of autonomous replication in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria
  • DNA Plasmid vector capable of autonomous replication in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria
  • pSAC4 DNA Plasmid vector capable of autonomous replication in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria
  • 50 mM Tris-HCl buffer containing 100 mM NaC1 and 10 mM magnesium sulfate (PH7.4)
  • the mixture was reacted for 2 hours to obtain a digested solution, and the solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation by a conventional method.
  • Transformation of AJ11060 Recombinant DNA was recovered from about 20,000 colonies described above. The method of recovery was based on the method of Saito and Miura shown above.
  • the recombinant DNA mixture was divided into 50 batches using the electric pulse method.
  • the strain was introduced into a mutant strain AJ11060 with increased sensitivity to a surfactant.
  • Transformants were inoculated on agar L medium supplemented with glucose, and statically cultured at 31.5 to produce about 20,000 transformants. Next, these transformants were replicated on the same plate containing 30 Omg / 1 of the detergent, and several strains which were resistant to the detergent and could grow on the plate were obtained.
  • the 060 strain was retransformed.
  • a strain showing resistance to the surfactant was obtained.
  • the recombinant DNA retained by this strain was named pDTR6, and the gene that confers resistance to the surfactant carried by those plasmids was named _L ⁇ R.
  • AJ11060 cells transfected with this plasmid are inhibited from growing in a liquid medium supplemented with 3 g / L surfactant (Fig. 1).
  • Example 5 Preparation of DNA Plasmid was prepared from AJ1106 OZpDTR6 containing the recombinant DNA obtained above according to a conventional method, and introduced into Escherichia coli JM109.
  • the obtained Escherichia coli JM109 pDTR6 was precultured for 24 hours at a temperature of 37 for 24 hours in a medium 2 Om1 comprising 1% tryptone, 0.5% yeast yeast and 0.5% NaC1 at a temperature of 37 hours.
  • Solution 2 Om1 was inoculated into medium 11 having the same composition as above, cultured for 3 hours at a temperature of 37, 0.2 g of chloramphenicol was added, and further cultured for 20 hours at the same temperature. A liquid was obtained. Then, this culture solution was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to obtain 2 g of each wet cell, and this was mixed with 2 Oml of 35 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 25% sucrose.
  • Escherichia coli JM109ZpDTR6 is given a private number AJ12967.
  • the strain was deposited on February 22, 1994 with the Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute of the Ministry of International Trade and Industry under the accession number F ERM P-14168, and on February 9, 1995, was deposited internationally under the Budapest Treaty. Transferred and assigned accession number FERM BP-4994.
  • Example 6 Analysis of Nucleotide Sequence of DNA Containing dtsR Gene The nucleotide sequence was determined using the recombinant DNA obtained in Example 5. The nucleotide sequence was determined using Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Upright Noki Chemical) according to the method of Sanger.
  • the nucleotide sequence of the resulting DNA containing the dtsR gene is as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the longest open reading frame present in this sequence was the nucleotide sequence from the 359th A to the 1987th G of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, but the upstream region of this gene From the analysis of the consensus sequence existing in ATG, ATG at positions 467 to 469 was estimated to be the start codon.
  • the amino acid sequence that can be encoded by the open reading and frame from A at position 359 to G at position 1987 is shown in SEQ ID NO: 1 together with the nucleotide sequence. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. 467- The protein encoded by the 1987 nucleotide sequence was designated as DTSR protein.
  • methionine residues at the N-terminus of a protein is removed by the action of post-translational beptidase. This is because the N-terminal methionine is derived from the translation initiation codon, ATG, and is often unrelated to the original function of the protein. In the case of the DTSR protein of the present invention, methionine residues may be removed.
  • pDTR6 was digested with I and II to obtain a fragment containing the _LR gene, and this gene fragment was treated with lQ and BQI to produce plasmid PHSG398 (Takara Shuzo Co., Ltd.) And T4DNA ligase (manufactured by Takara Shui Co., Ltd.) to obtain plasmid pHSGX-K.
  • PHSG398 Tekara Shuzo Co., Ltd.
  • T4DNA ligase manufactured by Takara Shui Co., Ltd.
  • pHSGX-K is completely digested with ⁇ 521 and self-ligated.
  • pHSGX- ⁇ ⁇ containing a ⁇ AR gene in which 600 base pairs of the 1 ⁇ 521 fragment were deleted was prepared. That is, the gene on pHSGX- ⁇ has a structure in which the central part is deleted in frame.
  • pHSGX- ⁇ It was inserted into the BQI site of pHSGX- ⁇ using I linker I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to obtain pKC X- ⁇ .
  • pHSG399 was used as a control
  • pSAC4 in which a replication origin of pHM519 was inserted at the SalI site by using a Sail linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was also prepared.
  • pKCX— ⁇ and pSAC4 were each introduced into a wild strain of Corynebacterium bacterium Brevipacterium lactophamentum ATCC 13869 using the above-mentioned electropulse method, and the degree of resistance to surfactants was introduced. Were examined. As a method, 0 to 1 OmgZd1 of polyoxyethylene sorbitan monopalmitate was added to the M-CM2G liquid medium, and the growth of each was examined.
  • the cells were cultured at 5 for 20 hours.
  • the obtained culture was inoculated into a medium having the same composition except that no biotin was added (hereinafter, referred to as “Piotin-restricted medium”) in an amount of 5%, and cultured at 31.5 for about 20 hours.
  • the AJ111060 strain produces a significant amount of L-glutamic acid even in the presence of high concentrations of biotin by adding a surfactant that is a biotin inhibitor, whereas the dtsR gene-amplified strain is resistant to surfactants. It was considered that the production of glutamic acid could be suppressed even when a surfactant was added, because the degree of increase was increased. Therefore, L-glutamic acid production culture was performed by the surfactant addition method using the AJ111060 / p SAC4 strain and the AJ111060pDTR6 strain as follows.
  • the replication origin of a mutant in which the self-renewal ability obtained from a plasmid capable of self-replication by a corynebacterium-type bacterium becomes temperature-sensitive at the pHSGX— ⁇ ] ⁇ recognition site described in Example 7 is described. And introduced the plasmid pKTCX— ⁇ .
  • This pKTCX- ⁇ was introduced into a wild strain, Brevibacterium cultivar cultimentum ATCC 13869, using the electric pulse method.
  • the gene on A on the chromosome was replaced with a defective type by the method described in Japanese Patent Publication No. Specifically, ATCC 13869 / pKTCX-KAE was cultured in M-CM2G liquid medium containing 50 ⁇ g Zml of oleic acid at 50; shaking at 25 for 6 hours, and 5 ⁇ g / ml The strain was seeded on M-CM2G medium containing mufenicol and 50 g / 1 oleic acid, and the strain that formed a colony at 34 was obtained as a plasmid-incorporated strain. Next, 34 strains that became susceptible to chloramphenicol in 34 were obtained by the replica method. The chromosome of this susceptible strain was obtained by a conventional method, and the structure of the gene on the chromosome was examined by the Southern hybridization method. .
  • Production culture of L-glutamic acid of ATCC 13869, AJ 11060 and ⁇ strain was performed as follows.
  • 50 GZm comprises one Orein acid M- CM 2 G and cultured in Plate medium was refreshed, the same strain was refreshed, glucose 80 g, KH 2 PO 4 lg , Mg S0 4 0. 4 g , (NH 4) 2 S0 4 30 g, F e S 04 7 H 2 0 0. 0 1 g, Mn SO 4 7 H 2 0 0.
  • the wild-type strain and AJ11060 strain did not accumulate L-glutamic acid due to the presence of excessive amount of biotin in the medium, whereas the ⁇ ⁇ strain favored L-glutamic acid. Generated and accumulated.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The dtsR gene of the present invention is a gene having an important function in the production of L-glutamic acid in Corynebacterium bacteria used for fermentative production of L-glutamic acid, and has an L-lysine-producing ability. The ability to produce L-lysine can be improved by amplifying the same gene in Corynebacterium bacteria. In addition, in a bacterium belonging to the genus Corynebacterium having a glutamic acid-producing ability, the glutamic acid-producing ability can be improved by disrupting the gene. Sequence Listing SEQ ID NO: 1
  • Sequence type nucleic acid
  • GCC CAT TTC CCC ATG GGT GAA AAG GCA GTA GAG AAG GTC CAC
  • GCT GCT 502 Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala
  • Gly Thr lie Asp Gly Arg Glu Val Cys lie Phe Ser Gin Asp Gly Thr
  • ATC ATG GAG CTG GCA ATC GAC ACC GGC CGC CCA TTG ATC GGT CTT TAC 790 lie Met Glu Leu Ala lie Asp Thr Gly Arg Pro Leu lie Gly Leu Tyr
  • CAACTCTTTA CACCCAATCT TTAAGACATG GGGGGTGGCG CTGGGCTAAT ATAACCGGTT 2167
  • Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr

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Description

コリネパクテリゥム属細菌由来の新規遺伝子及びその利用 産業上の利用分野 本発明は、 L—グルタミン酸及び L—リジンに代表される L—アミノ酸等の物 質の発酵生産に用いられるコリネバクテリゥム属細菌の育種と利用に関する。 従来の技術 コリネバクテリゥム属細菌をビォチン量を制限した培地で培養すると同細菌は 著量の L一グルタミン酸を生産する。 一方、 コリネパクテリゥム属細菌をビォチ ンが過剰量存在する培地中で培養すると同細菌は L一グルタミン酸を生産しない 力^ この培養条件でも培地に界面活性剤またはペニシリンを添加すると、 同細菌 の生育は抑制され、 同細菌は著量の L—グルタミン酸を生成するようになること が知られている。
すなわち、 コリネバクテリゥム属細菌を用いて L一グルタミン酸を生産するに は次のいずれかの手段が有効である。
1 . 培地中のピオチン濃度を最適以下 （suboptimal) にする。
奥村真二、 都河竜一郎、 角田俊直、 北井淳夫： 日本農芸化学会誌， ， 197-20 3 (1962)参照。
2 . ビォチンが十分量存在する条件で培地に界面活性剤を添加する。
I. Shiio, H. Otsuka, N. Atsuya： J. Biochem. , 53, 333-340 (1963)及び K. Taki nami, H. Okada, T. Tsunoda： Agr. Biol. Chem. , 27. 853-863 (1963)参照。
3 . ビォチンが十分量存在する条件で培地にぺニシリンを添加する。
米国特許第 3, 080, 297号、 特公昭 37- 1695号及び渋川満、 栗間理夫、 岡部節三、 大沢岳義： Amino Acid and Nucleic Acid, 17, 61-65 (1968)参照。 それらの作用機作については、 以下の通り考察されている。
ピオチン制限による L—グルタミン酸生成の場合、 ピオチンが脂肪酸合成系の ァセチル C o Aカルボキシラーゼの補酵素になっていること、 及び、 ォレイン酸 を初めとする不飽和脂肪酸及びその誘導体にはピオチン代替作用が認められるこ となどの事実より、 細胞膜の脂肪酸組成に影響を与えることで L—グルタミン酸 の細胞膜透過性が変化する事が主要因であろうと考えられている（ I . Shiio, S. Ots uka, . Takahashi :J. Biochem. , 51, 56-62(1962), I. Shiio, K. Narui, N. Yahaba, M. Tak ahashi :J. Biochem. , 51, 109-111(1962))。
また、 界面活性剤又はべニシリン添加による L—グルタミン酸生成の場合も、 細胞表層の構造変化による細胞質膜透過性の変化と結び付けて考えられてきた（I. Shiio, S. Otsuka, N. Katsuya:J. Biochem.， 53, 333-340(1963))。
上記のように L一グルタミン酸生成は細胞膜透過性と結び付けて議論されてき たが、 しかしながらその関連性を直接的に証明する知見は得られていなかった。 すなわち、 ピオチンの制限または界面活性剤もしくはベニシリンの添加がどの 様な作用機作を通じてコリネバクテリウム属細菌の L一グルタミン酸の生産性を 改善することにつながるのか不明な点が多かった。
さらに、 これら作用機作を解明する上で重要な鍵となると思われる遺伝子レべ ルの情報もなかった。 発明の詳細な説明 本発明の課題は、 コリネバクテリゥム属細菌が有する L—グルタミン酸の生成 機構、 具体的には、 コリネパクテリゥム属細菌力、'有する L一グルタミン酸の生成 機構における界面活性剤添加の作用機作を解明し、 得られた知見を基にしてコリ ネバクテリゥム属に属する L—グルタミン酸等の生産菌を育種改良することであ る o
そこで本発明の具体的課題は、 コリネバクテリゥム属細菌の L—グルタミン酸 生成機構を遺伝子レベルで解明することにあり、 コリネバクテリウム属細菌由来 の界面活性剤耐性に関与する遺伝子を単離し、 得られた遺伝子をコリネバクテリ ゥム属に属する L—グルタミン酸等の生産菌の育種及び L—グルタミン酸等の生 産に応用することである。 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 コリネバクテ リゥム属細菌の L—グルタミン酸生産に関与すると思われる遺伝子の存在を突き 止め （以下、 この遺伝子を _^_LiR遺伝子、 同遺伝子がコードする蛋白質を D T S R蛋白と称する。 ） 、 さらに本遺伝子の有用な用途を見いだすことより、 本発 明を完成するに至らしめた。
本発明は以下の通りである。
(1)コリネパクテリゥム属細菌に由来し、 該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与 する蛋白質をコードする遺伝子。
(2)前記蛋白質のァミノ酸配列が、 配列表配列番号 2で示されるアミノ酸配列のう ちァミノ酸番号 3 7 ~ 5 4 3からなるァミノ酸配列またはこのアミノ酸配列にお いてコリネバクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に実質 的に影響を与えなぃァミノ酸残基の置換、 欠失ある 、は挿入を有するァミノ酸配 列を含む上記（1)記載の遺伝子。
(3)配列表配列番号 1に示される塩基配列の 467番目から 1987番目に至る配列また はこれと実質的に同一の塩基配列を有する上記（1 )記載の遺伝子。
(4)上記 (1)、 （2)又は (3)記載の遺伝子とコリネバクテリゥム属細菌で機能するべ クタ一が連結されて得られる組換え D N A。
(5)上記 (4)記載の組換え D N Aを保有するコリネバクテリゥム属細菌。
(6)上記 (4)記載の組換え D N Aを保有し、 かつ Lーリジン生産能を有するコリネ バクテリゥム属細菌を液体培地に培養し、 培養液中に L—リジンを生成蓄積させ、 これを採取することを特徴とする L—リジンの製造法。
(7)上記（1)、 （2)又は (3)記載の遺伝子の塩基配列中に、 この塩基配列によってコ 一ドされる蛋白質がコリネバクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与 する活性が正常に機能しないような 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付 加または逆位が生じた遺伝子。
(8)上記 (7)記載の遺伝子とコリネパクテリゥム属細菌で機能するベクターが連結 されて得られる組換え D N A。
(9)染色体上に存在する上記 (1)、 （2)又は (3)記載の遺伝子またはそのプロモータ 一の塩基配列中に 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が生 じたことにより、 コリネバクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与す る活性を有する蛋白質が正常に機能していないコリネバクテリゥム属細菌。
(10)染色体上に存在する上記（1)、 （2)又は（3)記載の遺伝子またはそのプロモータ 一の塩基配列中に 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が生 じたことにより、 コリネパクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与す る活性を有する蛋白質が正常に機能しておらず、 かつ L一グルタミン酸生産能を 有するコリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、 培養液中に L -グルタミ ン酸を生成蓄積させ、 これを採取することを特徴とする Lーグルタミン酸の製造 法。
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明にいうコリネバクテリゥム属細菌とは、 バージーズ ·マニュアル ·ォブ •ァターミ不ィティブ.ノ クテリオロジ— (Bargeys Manual of Determinative Bacteriology) 第 8版 5 9 9頁 （1 9 7 4 ) に定義されている一群の微生物であ り、 好気性、 グラム陽性、 非抗酸性、 胞子形成能を有しない桿菌であり、 従来ブ レビバクテリゥム属に分類されていたが現在コリネパクテリゥム属細菌として統 合されたブレビパクテリゥム属細菌 （Int. J. Syst. Bacteriol. , 41, 255 (198 1)) を含み、 またコリネパクテリゥム属細菌と非常に近縁なブレビパクテリゥム 属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。 このようなコリネバクテリウム属細 菌のうち、 以下に述べるような Lーグルタミン酸生産性細菌として知られている ものが本発明においては、 最も好ましいものである。 コリネパ 'クテリゥム ァセトァシドフィラム
コリネバクテリゥム ァセトグルタミカム
コリネパ 'クテリゥム カルナェ
コリネバクテリゥム グルタミカム
コリネノくクテリゥム リリウム （コリネパ'クテリウム ·グルタミカム） コリネバクテリゥム メラセコーラ
ブレビパクテリゥム ディバリカタム （コリネノ クテリゥム ·グルタミカム） ブレビパ、クテリゥム ラクトフエルメンタム （コリネノくクテリゥム ·グルタミ カム） ブレビバ'クテリゥム ·サッカロリティカム
ブレビパクテリゥム 'ィンマリオフィルム
ブレビパクテリゥム · ロゼゥム
ブレビバクテリゥム 'フラノくム （コリネパ 'クテリゥム •クノ、、ノレノ々 ^、カム ブレビパ'クテリゥム 'チォゲ二タリス 具体的には、 下記の菌株を例示することができる。
コリネバクテリゥム 'ァセトァシドフィラム ATC C 1 3870 コリネバクテリゥム 'ァセトグルタミカム AT C C 15806 コリネバクテリゥム ' カルナェ ATC C 1 5991 コリネノくクテリゥム グルタミカム ATC C 1 3032 コリネパ'クテリゥム 'グルタミカム ATC C 1 3060 ブレビバ'クテリゥム •ディバリカタム ATC C 14020 ブレビパ'クテリゥム ■ラクトフエノレメンタム ATC C 13869 コリネパ'クテリゥム • リリゥム ATC C 1 5990 コリネバ 'クテリゥム •メラセコーラ ATC C 17965 ブレビバクテリゥム 'サッカロリティクム ATC C 14066 ブレビパクテリゥム •ィンマリオフィルム ATC C 14068 ブレビノくクテリゥム •ロゼゥム ATC C 1 3825 ブレビパクテリゥム •フラバム ATC C 1 3826 ブレビパ'クテリゥム •チォゲ二タリス ATC C 19240 これらを入手するには、 例えばァメリカン 'タイプ'カルチヤ一 'コレクショ ンより分譲を受けることができる。 すなわち、 各微生物ごとに対応する登録番号 が付与されており、 この登録番号を引用して分譲を受けることができる。 各微生 物に対応する登録番号はァメリカン 'タイプ'カルチャー 'コレクションのカタ ログに記載されている。
本発明に関する界面活性剤は、 ピオチンが十分量存在する条件で、 ペニシリン と同様にコリネバクテリゥム属細菌に L一グルタミン酸の生成を促す作用を持つ ものであり、 各種の非イオン性界面活性剤、 陽イオン性界面活性剤、 陰イオン性 界面活性剤が存在する （山田浩一、 高橋穣二、 中村淳ニ：発酵工学会誌， 2fi，348 -350 (1962)、 宇田川清、 阿部重雄、 木下祝郎：発酵工学会誌， 40, 614-619 (19 62)) 。 また、 非イオン性界面活性剤の中でも、 Tween60 (ポリオキシエチレンソ ノレヒタンモノステアレ一ト (polyoxyethylene sorbitan monostearate)) 及び Twe en40 (ポリォキシェチレンソノレビ夕ンモノノヽ。ノレミテート（polyoxyethylene sorbi tan monopalmitate)) にはペニシリン様効果がある (I. Shiio, S. Otsuka, N. Katsu ya :J. Biochem. , 53, 333-340 (1963)) 。 また、 C 3から C ! 8の遊離飽和脂肪酸そ のものでも同様の効果がある （L Takinami, H. Okada，T. Ts oda:Agr. Biol. Chem. , 28, 114-118(1964)) 。 本発明の実施例で使用したものは Tween40である。
< 1〉コリネパクテリゥム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子の単離 コリネパクテリゥム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子を単離する には、 例えば下記の操作により行うことができる。
(1)界面活性剤に対する感受性が向上したコリネパクテリゥム属に属する界面活性 剤感受性変異株を取得し、
(2)野生型コリネバクテリゥム属細菌の染色体 D N Aの各種断片を、 コリネバクテ リゥム属細菌で機能するべクタ一と連結して各種組換え D N Aを作成し、
(3)各種組換え D N Aをコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株に 導入して形質転換を行い、
(4)形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択し、
(5)界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換え D N Aを回収し、
(6)ベクターに連結されている野生型コリネバクテリゥム属細菌の染色体 D N A断 片の構造を解析する。
こうして得られる野生型コリネパクテリゥム属細菌の染色体 D N A断片には、 コリネバクテリゥム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子が含まれてい る。 同遺伝子は、 少なくとも、 界面活性剤を含む培地でコリネバクテリウム属細 菌が L—グルタミ ン酸を培地中に蓄積する機構に関与するものである。 また、 ぺ ニシリン添加やピオチン制限による培地中の L一グルタミン酸の蓄積にも共通に 関与する。 界面活性剤に対する感受性が向上したコリネパクテリゥム属に属する界面活性 剤感受性変異株とは、 野生型のコリネパクテリゥ厶属細菌の生育に影響を与えな い濃度の界面活性剤が存在する培地中で生育が悪くなるコリネバクテリゥム属に 属する変異株をいう。 例えば界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノパ ルミテートの場合、 コリネバクテリゥム属に属する界面活性剤感受性変異株は 0. 1〜 1 mg/dlの濃度の上記界面活性剤が培地中に添加されると生育が野生株と比較 して悪くなる。 一方、 野生型のコリネバクテリゥム属細菌は 0 . l〜 l mg/dlの濃 度の上記界面活性剤が添加された培地中でも生育に大きな変化はみられな 、。 本 変異株を培養し界面活性剤を添加して L一グルタミン酸を生産する場合において、 必要とされる界面活性剤の濃度は通常の場合より低下している。 界面活性剤感受 性変異株の細胞の状態は、 野生株の細胞が界面活性剤にさらされているときの状 態に近いものと思われる。
コリネバクテリゥム属に属する界面活性剤感受性変異株を取得するには、 特開 昭 5 0— 1 2 6 8 7 7号公報 （特公昭 5 2 - 2 4 5 9 3号公報） に記載される方 法を用いることができる。
コリネパクテリゥム属に属する界面活性剤感受性変異株としては、 具体的には、 コリネバクテリウム ·グルタミカム A J 1 1 0 6 0が挙げられる。 同株は通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、 受託番号 F E RM
P— 3 6 7 8が付与されている。
野生型コリネバクテリゥム属細菌の染色体 D N Aの各種断片の調製法は以下の 通りである。 すなわち、 野生型コリネパクテリゥム属細菌を液体培地に培養し、 集めた細胞から斎藤らの方法 （H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 7 2, 619 (1963)) に従い染色体 D N Aを回収する。 回収した染色体 D N Aを制限酵 素を用いて切断する。 制限酵素として 4塩基認識型の酵素を用いて D N Aを不完 全分解する条件で反応を行うことによって多様な D N A断片が調製できる。
コリネバクテリゥム属細菌で機能するベクターとは、 例えばコリネバクテリゥ ム属細菌で自律複製できるプラスミ ドである。 具体的に例示すれば、 以下のもの が挙げられる。 p AM 330 特開昭 58 - 67699号公報参照
p HM 1519 特開昭 58— 77895号公報参照
p A J 655 特開昭 58— 192900号公報参照
P A J 61 1 同 上
P A J 1844 同 上
p CG 特開昭 57 - 134500号公報参照
p CG 2 特開昭 58 - 35197号公報参照
p CG 4 特開昭 57— 183799号公報参照
p CG 11 同 上 コリネパ'クテリゥム属細菌で機能するベクターと、 野生型コリネバクテリゥム 属細菌の染色体 D N Aの各種断片とを連結して各種組換え D N Aを調製するには、 あらかじめ制限酵素を用いてベクタ一を切断する。 染色体 DN Aを切断するとき に用いる制限酵素と同じものにより切断し、 または染色体 DN Aの各種断片の切 断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用いて切断する。 連結は、 T4DNA リガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
各種組換え DN Aをコリネパクテリゥム属に属する界面活性剤感受性変異株に 導入するには、 これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。 例え ば、 ェシヱリヒア ·コリ K— 12について報告されているような、 受容菌細胞 を塩化カルシウムで処理して DN Aの透過性を増す方法 （Mandel， M. and Higa, A. , J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970)) があり、 バチルス ·ズブチリスについて報告さ れているような、 増殖段階の細胞からコンビテントセルを調製して D N Aを導入 する方法 ( uncan, C. H.， Wilson, G. A. and Young, F. E. , Gene, 1, 153 (1977))が ある。 あるいは、 バチルス 'ズブチリス、 放線菌類及び酵母について知られてい るような、 DNA受容菌の細胞を、 組換え DNAを容易に取り込むプロトプラス トまたはスフヱ口プラストの状態にして組換え D N Aを D N A受容菌に導入する 方法 （ Chang, S. and Choen, S. N. , Mole Gen. Genet. , 168. Ill (1979); Bibb, M. J.， Ward, J. M. and Hopwood, 0. A.， Nature, 274, 398 (1978) ;Hinnen, A. , Hicks, J. B. and Fink, G. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)) も応用できる。 プロトプラスト法では上記のバチルス ·ズブチリスにおいて使用されている方 法でも充分高い形質転換頻度を得ることができるが、 特開昭 57 - 183799 号公報に開示されるように、 コリネバクテリゥム属細菌細胞のプロトプラストを ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオン に接触させた状態で D N Aをとり込ませる方法も利用できる。 ポリエチレングリ コールまたはポリビニルアルコールの代りに、 カルボキシメチルセルロース、 デ キストラン、 フイコール、 ブル口ニック F 68 (セルバ社） などの添加によって も D N Aのとり込みを促進させることができる。 本発明の実施例で用いた形質転 換の方法は、 電気パルス法 （特開平 2 - 207791号公報参照） である。
形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択する方法を以下に例 示する。
コリネバクテリゥム属細菌の野生株の染色体 D N Aを制限酵素^ 3A Iで部分消 化して得られる約 4〜6 Kb pの大きさの DN A断片を、 ェシヱリヒア 'コリと コリネバクテリゥム属細菌の双方で自立複製可能なプラスミ ドベクターと連結し て組換え DN Aを製造し、 これをェシヱリヒア 'コリ DH 5のコンビテントセ ノレ （宝酒造 （株） 製） に導入する。 形質転換株を培養して、 コリネパ'クテリゥム 属細菌野生株の遺伝子ライブラリーとする。
当該遺伝子ラィブラリ一に含まれる組換え D N Aを用い、 ブレビバクテリゥム •ラクトファーメンタム A J 11060を形質転換し、 得られる形質転換体を、 一旦、 界面活性剤を含まない M— CM 2 G寒天プレート （グルコース 5 g、 ポリ ペプトン 10 g、 酵母エキス 10 g、 NaC 1 5 g、 DL—メチォニン 0. 2 g、 寒天 15 g及びクロラムフ 二コール 4 m gを純水 1 Lに含む。 pH7. 2) に 塗布して数万個のコロニーを形成させる。 当該コロニーを 3 OmgZLの界面活 性剤 （Tween40) を含む M— CM 2 Gプレートにレプリカし、 界面活性剤含有 M— CM 2 Gプレート上で良好な生育を示すものを取得することにより、 界面活性剤 感受性を失つた株を取得できる。
界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換え D N Aを回収する方法は、 野生型コリネバクテリゥム属細菌の染色体 DN Aの調製方法と同じである。 すな わち、 形質転換株を液体培地に培養し、 集めた細胞から斎藤らの方法 （ H.Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)) に従い組換え DN Aを 回収できる。
ベクターに連結されている野生型コリネバクテリゥム属細菌の染色体 DN A断 片の構造解析は以下のようにして行う。 塩基配列決定の常法であるダイデォキシ 法により染色体 DN A断片の全塩基配列を決定し、 DN Aの構造解析を行い、 ェ ンハンサー、 プロモータ一、 オペレーター、 SD配列、 リーダーペプチド、 ァテ 二ユエ一ター、 開始コドン、 終始コドン、 オープン リーディング 'フレームな どの存在位置を決定する。
コリネパクテリゥム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子は _L^R 遺伝子であり、 配列表の配列番号 1に示される塩基配列の 467〜469番目の AT G から 1985〜1987番目の CTGにいたる配列を少なくとも有する。 この遺伝子によ りコードされ得るアミノ酸配列を、 配列表の配列番号 1及び 2に示す。 前記 467〜 469番目の ATGの上流にさらに ATG (ヌクレオチド番号 359〜361) が同一フレ ームで存在し、 この ATGが開始コドンである可能性は否定できないが、 この遺 伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から前記 467〜469番目の A T Gが開始コドンであると推定される。 すなわち、 配列番号 2に示されるアミノ酸 配列のうちァミノ酸番号 37〜543からなるアミノ酸配列が、 DT SR蛋白の アミノ酸配列であると推定される。 本願明細書及び請求の範囲において DTSR 蛋白のァミノ酸配列及び 遺伝子の塩基配列について言及している場合、 これらは 467〜469番目の ATGを開始コドンとして記載されていることがあるが、 359〜361番目の ATGが開始コドンである可能性も考慮されたい。 例えば、 コリ ネバクテリゥ厶属細菌に ±^_R遺伝子を導入してその発現を強化しょうとする 場合、 配列番号 1に示す塩基配列のうちヌクレオチド番号 467〜1987からなる配列 を発現させればよいと考えられるが、 ヌクレオチド番号 359〜466を含めて配列番 号 1に示す塩基配列のコード領域及び上流領域をコリネバクテリゥム属細菌に導 入すれば、 、ずれの A T Gが開始コドンであっても D T S R蛋白を正しく発現さ せることができることは当業者に容易に理解されるであろう。 尚、 d t s R遺伝 子が菌体内で発現する際、 開始コドンによってコードされる N末端の Me tはァ ミノべプチダーゼによって切断される場合もある。 データベースの検索により、 配列番号 1に示される塩基配列を有する _LAR 遺伝子及びそれにコ一ドされる D T S R蛋白は新規であることが確認された。 D T S R蛋白と相同性がある蛋白質としては、 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 83, 8049-8053 (1986)、 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 83. 4864-4868 (1986)及び Gene, 122, 199-202 (1992)において、 プロピオニル C o Aカルボキシラーゼ (PC C)蛋白質 ;3サブユニットとして記載されている蛋白質がある。 しかしながら、 こ れらの文献のいずれにも当該蛋白質がグルタミン酸生産性に関与することを示唆 する記載はない。
プロピオニル C 0 Aカルボキシラーゼは、 α—ケトグルタル酸を 2—ハイドロ キシグルタル酸、 プロピオニル C o A、 D—メチルマロニル C o A、 L—メチル マロニル C o Aを経てスクシ二ル C o Aに変換する代謝経路のうちの一反応を触 媒する酵素であり、 同代謝経路は T C Aサイクルにおいて α—ケトグルタル酸デ ヒドロゲナ一ゼに触媒される反応をバイパスする経路のようである。 また、 特筆 すべきはプロピオニル C 0 Αカルボキシラーゼはピオチンを補酵素とする酵素で あり、 このことも界面活性剤添加法によるグルタミン酸生成とピオチン制限法に おけるグルタミン酸生成とを結び付けるものである。
< 2 >組換え D N Aを保有するコリネパクテリゥム属細菌の調製
上記く 1 >で得られるコリネパクテリゥム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与 する ±AR遺伝子を含む組換え D N Aをインビトロで調製し、 これをコリネバ クテリゥム属細菌に導入することにより、 D T S R蛋白の細胞内濃度が上昇して いるコリネバクテリゥム属細菌を調製することができる。 通常行われる手段は、 細胞内の JL R遺伝子の発現の強化あるいは d t s R遺伝子のコピー数の上昇 である。
細胞内の _ _R遺伝子の発現を強化するには、 強力なプロモーターの下流に ± R遺伝子を連結すればよい。 _LAR遺伝子としては、 配列番号 2に示す アミノ酸配列のうちアミノ酸番号 3 7〜5 4 3からなるアミノ酸配列をコ一ドす る塩基配列が挙げられる。 さらに具体的には、 配列番号 1に示される塩基配列の うちヌクレオチド番号 467〜1987からなる塩基配列及びこれと実質的に同一の塩基 配列が挙げられる。 ここで実質的に同一な塩基配列とは、 コードされるタンパク が、 前記ヌクレオチド番号 467〜1987からなる塩基配列によってコードされるタン パクと、 コリネパ'クテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に おいて実質的に同一であることをいう。 これらの塩基配列において、 コードされ る D T S R蛋白は、 コリネバクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与 する活性に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、 欠失あるいは挿入を有 していてもよい。
コリネバクテリゥム属細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なもの としては、 ェシェリヒア ·コリの I a cプロモーター、 t a cプロモータ一、 T r pプロモーターが存在する (Y. Morinaga, M. Tsuchiya, K. Miwa and K. Sano, J. B iotech. , 5, 305-312(1987)) 。 また、 コリネバクテリゥム属細菌の t r pプロモ —ターも好適なプロモータ一である （特開昭 6 2 - 1 9 5 2 9 4号公報） 。
d t s R遺伝子を含む D N Aとプロモータ一を含む D N Aをそれぞれ調製し、 両者をインビトロで連結する。 D N Aの切断及び連結はそれぞれ制限酵素及びリ ガーゼを用いる。 連結して得られる組換え D N Aはコリネバクテリゥム属細菌の 細胞に導入される。 導入方法は上記 < 1〉に記したものと同様の方法が利用可能 である。
コリネバクテリゥム属細菌細胞内に、 強力なプロモーターと JL R遺伝子か らなる組換え D N Aを導入するには、 コリネバクテリゥム属細菌細胞内で機能す るべクタ一を用いる必要がある。 ベクターとしてく 1 >に記したものを用いると、 組換え D N Aは染色体外に保持される。 組換え D N Aを染色体 D N A上に保持さ せる場合には、 特開平 5— 7 4 9 1号公報に開示される温度感受性プラスミ ドを ベクターとして利用し、 非許容温度で細胞を培養して相同組換えを起こさせる。 こうして得られた、 強力なプロモーターと ±_§_R遺伝子からなる組換え D N Aが導入されたコリネバクテリゥム属細菌は、 _^__L R遺伝子の発現が強化され、 細胞内の D T S R蛋白の濃度が上昇している。
d t s R遺伝子のコピー数を上昇させるには、 同遺伝子を含む D N Aを多コピ 一のプラスミ ドに連結してこれをコリネパクテリゥム属細菌細胞に導入する。 多 コピーのプラスミ ドの例はく 1〉に記したものである。 あるいは、 コリネパクテリゥム属細菌染色体 DN A上に多く存在する配列を標 的に利用して相同組換えを生じせしめる方法もある。 コリネバクテリウム属細菌 染色体 D N A上に多く存在する配列の例は、 コリネバクテリウム属細菌の転移因 子の両端に存在するインサーシヨン配列がある。 同配列と同配列を利用して相同 組換えを行う方法は国際公開パンフレツト W093/181 51号に開示されて いる。
こうして得られた、 d t s R遺伝子のコピー数が上昇したコリネバクテリゥム 属細菌は、 _4丄 R遺伝子の発現が強化され、 細胞内の DTSR蛋白の濃度が上 昇している。
< 3〉組換え DN Aを保有するコリネバクテリゥム属細菌を用いた L—リジンの 生産
従来より種々の人工変異株が L—リジン生産菌として用いられており、 これら を宿主として本発明の組換え DN Aを保有させることによりその Lーリジン生産 能を向上させることができる。 このような人工変異株としては次のようなものが ある。 S— （2—アミノエチル） —システィン （以下、 「AEC」 と略記する） 耐性変異株、 その生育に L一ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株
(特公昭 48 - 28078号、 特公昭 56— 6499号） 、 AECに耐性を示し、 更に L—ロイシン、 L—ホモセリン、 L—プロリン、 L—セリン、 L—アルギニ ン、 Lーァラニン、 L一パリン等のアミノ酸を要求する変異株 （米国特許第 37 08395号及び第 3825472号） 、 DL— α—ァミノ— ε力プロラクタム、 α—アミノーラウリルラクタム、 ァスパラギン酸アナログ、 サルファ剤、 キノィ ド、 Ν—ラウロイルロイシンに耐性を示す L—リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸 脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示す Lーリジン生産変異株 （特開昭 50— 53588号、 特開昭 50— 31093号、 特開昭 52— 102498号、 特開昭 53 - 9394号、 特開昭 53 - 86089号、 特開昭 55 - 9783号、 特開昭 55— 9759号、 特開昭 56— 32995号、 特開昭 56— 39778 号、 特公昭 53— 43591号、 特公昭 53— 1833号） 、 イノシトールまた は酢酸を要求する L一リジン生産変異株 （特開昭 55— 9784号、 特開昭 56 —8692号） 、 フルォロピルビン酸または 34 以上の温度に対して感受性を 示す L—リジン生産変異株 （特開昭 55— 9783号、 特開昭 53— 86090 号） 、 エチレングリコールに耐性を示し、 L—リジンを生産するブレビパ'クテリ ゥムまたはコリネバクテリゥムの変異株 （米国特許第 44 1 1 997号参照） 等 c 具体的には、 以下のような株を例示することができる。 ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 12031 (FERM-B P 277、 特開昭 60— 62994号公報）
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム ATCC 391 34 (特開昭 6 0-62994号公報）
コリネバクテリゥム .グルタミカム AJ 3463 (FERM-P 1 987, 特公昭 51 -34477号公報）
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 12435 (FERM B P— 2294、 米国特許第 5， 304, 476号）
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 12592 (FERM B P— 3239、 米国特許第 5, 304, 476号）
コリネバクテリウム ·グルタミカム AJ 12596 (FERM BP— 32 42、 米国特許第 5， 304, 476号) 上記く 2 >の方法に従い、 これらの Lーリジン生産菌に本発明の組換え DN A を導入して得られるコリネバクテリゥム属細菌は、 細胞内の DTSR蛋白の濃度 が上昇しており、 著量の L—リジンを生産する能力を有する。
使用する L—リジン生産用の培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に 応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
粉加水分解物などの糖類、 エタノールやイノシトールなどのアルコール類、 酢酸、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム 等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 ァ ンモニァ水等を用いることができる。
無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガ ンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン などの要求 物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で 1 6〜7 2時間実施するのがよく、 培養温度は 3 0 〜 4 5 に、 培養中 p Hは 5〜7に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有機 の酸性あるいはアルカリ性物質、 更にアンモニアガス等を使用することができる。 発酵液からの Lーリジンの採取は通常イオン交換樹脂法、 沈澱法その他の公知 の方法を組み合わせることにより実施できる。
< 4 > D T S R蛋白が正常に機能しないコリネバクテリゥム属細菌の調製
上記く 1〉に示した通り、 _L^R遺伝子はコリネバクテリゥム属細菌に界面 活性剤に対する耐性を付与する遺伝子として取得された。 従って、 過剰量のピオ チンの存在下において L一グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細 菌野生株が L—グルタミン酸を生成するようになる濃度の界面活性剤を添加して も 遺伝子を増幅させた株では L—グルタミン酸を生成しなくなることが 予測された。 そこで、 界面活性剤を添加する L—グルタミン酸生産において _L R遺伝子増幅の効果を後述の実施例に示す方法で調べた結果、 予想通り Lーグ ル夕ミン酸生成の著しい抑制が観察された。 また、 同様にピオチン制限法及び過 剰量のピオチン存在下でのベニシリン添加法による L一グルタミン酸生産におい ても、 ± R遺伝子の増幅は生産の抑制につながることが確認された。 これら の結果は、 _LAR遺伝子が界面活性剤に対する耐性を付与するだけでなく、 L 一グルタミン酸生成に重要な働きを持つ遺伝子であることを示す。
そこで、 逆に細胞内の 1_^R遺伝子に変異を起とし、 D T S R蛋白の細胞内 濃度または活性を低下させることにより、 Lーグルタミン酸の生産能を向上させ、 特にビォチンが過剰に存在する条件においても界面活性剤や抗生物質のようなビ ォチン作用抑制物質の添加なしに L -グルタミン酸を生成することができるもの と期待された。 そこで、 野生株の _L^R遺伝子が破壊された株を作成し、 L一 グルタミン生産能を評価した結果、 後述の実施例に示す通り、 d t s R遺伝子破 壊株は野生株がほとんど L—グルタミン酸を生成しない量のピオチンが存在する 条件においても著量の L—グル夕ミン酸を生成することが確認された。 _4_LAR遺伝子に変異が起こった株は、 化学薬剤を用いて変異を誘導する方法 でも、 遺伝子組換えによる育種方法でも取得可能である。 しかし、 遺伝子の取得 がなされている場合は、 遺伝子組換え法を用 t、相同組換え法により当該遺伝子の 破壊力容易に実現される。 相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており直鎖 D N Aを用いる方法や温度感受性プラスミ ドを用いる方法などが利用できる。 具体的には、 部位特異的変異法 （Kramer, W. and Frits, H. J. , Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) や次亜硫酸ナトリウム、 ヒドロキシルァミン等の 化学薬剤による処理 (Shortle, D. and Nathans, D. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 75, 270(1978)) によって、 _L R遺伝子のコーディング領域またはプ 口モータ一領域の塩基配列の中に 1つまたは複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を起こさせ、 このようにして改変または破壊した遺伝子を染色体 上の正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物である D T S R蛋白の活性を 低下ないし消失させるか _L R遺伝子の転写を低下ないし消失させることがで きる。
部位特異的変異法は、 合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、 任意の限 定された塩基対だけに、 任意の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を導入できる 手法である。 この方法を利用するには、 まず、 クローン化され、 D N A塩基配列 が決定されている目的遺伝子を持つブラスミ ドを変性させて一本鎖を調製する。 次に、 変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するカ、 この時合成ォリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、 任意の塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つようにしておく。 この後一本鎖 D N Aと任意 の塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをァニ —ルさせ、 さらに D N Aポリメラーゼ Iのクレノウフラグメントと T 4リガーゼ を用いて完全な 2本鎖プラスミ ドを合成し、 これをエシュリヒア ·コリのコンビ テントセルに導入する。 このようにして得られた形質転換体の幾つかは、 任意の 塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミ ドを 持っている。 遺伝子の変異を導入し、 改変または破壊することができる同様な手 法には、 リコンビナント P C R法 （PCR Technology, Stockton press (1989)) が のる。 また、 化学薬剤処理を用いる方法は、 目的の遺伝子を含む D N A断片を直接次 亜硫酸ナトリウム、 ヒドロキシルアミン等で処理することにより D N A断片中に ランダムに塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ変異を導入する方法 である。 所望の変異が導入されているかどうかは、 変異処理した D N A断片で界 面活性剤変異株を形質転換し、 得られた形質転換体の界面活性剤に対する耐性の 有無を確認すればよい。 この際、 コリネパクテリゥム属細菌が通常生育可能な温 度範囲で高温と低温の両方で界面活性剤存在下での生育を調べ、 低温では生育可 能だが高温では生育が抑制されるような形質転換体を選択することにより、 温度 感受性となつた変異型遺伝子を取得することもできる。
このようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子をコリ ネバクテリゥム属細菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては、 相同 性組換えを利用した方法 （Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring H arbor Laboratory press (1972) ; atsuyama, S. and Mizushima, S. , J. Bacte riol. , 162, 1196(1985)) がある。 相同性組換えは、 染色体上の配列と相同性を 有する配列を持つプラスミ ド等が菌体内に導入されると、 ある頻度で相同性を有 する配列の箇所で組換えを起こし、 導入されたプラスミ ド全体を染色体上に組み 込む。 この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、 再びプラスミ ドが染色体上から抜け落ちるが、 この時組換えを起こす位置により 変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、 元の正常な遺伝子がブラス ミ ドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。 このような菌株を選択するこ とにより、 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ変異が導入されて改 変または破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得す ることができる。
< 5 > D T S R蛋白が正常に機能しないコリネバクテリゥム属細菌を用いた L— グルタミン酸の生産
上述したように、 L一グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリゥム属細菌 であって、 D T S R蛋白の細胞内濃度または活性が低下した株、 すなわち D T S R蛋白が正常に機能しない株は、 L一グルタミン酸の生産能が向上し、 特にピオ チンが過剰に存在する条件においても界面活性剤や抗生物質のようなビォチン作 用抑制物質の添加なしに L—グルタミン酸を生成することができる。
L -グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を育種して D T S R蛋白が正常に機能しない変異株を得る場合、 出発材料としてはコリネパクテリ ゥム属のグルタミン酸生産性野生株またはこれから誘導された変異株が挙げられ る。 このような変異株としては、 例えば、
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 12475 (FERM-B P 2922、 米国特許第 5, 272, 067号公報）
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 1 2476 (F ERM-B P 2923、 米国特許第 5， 272, 067号公報）
ブレビバクテリウム ·フラバム AJ 12477 (FERM— B P 2924、 米国特許第 5, 272, 067号公報）
コリネバクテリウム ·グルタミカム AJ 12478 (FERM-B P 292 5、 米国特許第 5, 272, 067号公報）
コリネノ クテリゥム ·グルタミカム ATCC 21492
等がある。
Lーグルタミン酸の生産に使用する培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び 必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としては、 グルコース、 ラクトース、 ガラクトース、 フラクトースゃ澱 粉加水分解物などの糖類、 エタノールやイノシトールなどのアルコール類、 酢酸、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム 等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 ァ ンモニァ水等を用いることができる。
無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガ ンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン などの要求 物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で 16〜 72時間実施するのがよく、 培養温度は 30 〜 45 に、 培養中 pHは 5〜8に制御する。 尚、 pH調整には無機あるいは有機 の酸性あるいはアル力リ性物質、 更にァンモニァガス等を使用することができる また、 得られた _L R遺伝子破壊株に界面活性剤やべニシリンを添加したり、 ピオチンを制限したりすることによりグルタミン酸収率を更に向上させることも 出来る場合がある。
発酵液からの Lーグルタミン酸の採取は通常イオン交換樹脂法、 沈澱法その他 の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 界面活性剤無添加あるいは添加培地における、 A J 1106 OZpD TR 6 ( ±AR遺伝子増幅株） 及び A J 1 1 06 OZp S AC 4 (コントロー ル） の生育を示したものである。
PDTR6導入株では界面活性剤存在下においても生育可能になつていること が示される。
〇： p D T R 6導入株、 界面活性剤無添加
□： p SAC4導入株、 界面活性剤無添加
PDTR6導入株、 界面活性剤添加
PSAC4導入株、 界面活性剤添加 図 2は、 界面活性剤の濃度を変えて添加した培地における、 ATCC 1386 9/pHSGX-KAE (欠失変異型 丄 尺遺伝子増幅株） 、 ATCC 138 69/pDTR6 (d t s R遺伝子増幅株) 、 及び ATCC 13869/p S A C 4 (コントロール） の生育を示したものである。
O： p S AC 4導入株
△： pHSGX - ΚΔΕ導入株
▲： pDTR6導入株 図 3は、 ピオチンを 300 g/L又は 3 g/L含む培地における A J 11 060/pDTR 6及び A J 11060 /p S A C 4の生育曲線を示す。 A J 1 1 0 6 0/p DTR 6 (d t s R遺伝子増幅株) のピオチン要求量が低下したこ とを示すものである。
〇： pDTR 6導入株、 ピオチン 3 0 0〃 gZ l
□： p S AC 4導入株、 ピオチン 3 0 0 ^ g 1
P DTR 6導入株、 ピオチン 3〃 g/ l
P SAC 4導入株、 ピオチン 3 ^ gZ l 好適な実施例の説明 以下、 実施例により本発明を更に詳細に説明する。 実施例 1
ブレビパクテリゥム，ラクトフアーメンタム ATC C 1 3 8 6 9
(コリネバクテリゥム属細菌の野生株） の染色体 D N Aの調製 ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム ATC C 1 3 8 6 9を T— Y培 地 （B a c t o— t r y p t o n (D i f c o) 1 %、 B a c t o - y e a s t e x t r a c t (D i f c o) 0. 5 N a C 1 0. 5% (pH 7. 2) ) 1 0 0m lに接種し、 温度 3 1. 5てで 8時間培養し、 培養物を得た。 この培養 物を 3, OOOr. p. m.で 1 5分間、 遠心分離処理し湿潤菌体 0. 5 gを得た後、 該菌体 から斎藤、 三浦の方法 (Biochem. Biophys. Acta. , 72, 619 (1963)) により染色 体 DNAを得た。 次いで、 この染色体 DN A 6 0 β g 及び制限酵素 ^y3A I、 3ユニッ トを 1 OmMトリス—塩酸緩衝液 （5 OmM N a C 1、 1 0 mM M g S 04及び I mM ジチオスレィトール含有 （pH 7. 4) ) におのおの混合 し、 温度 3 7 で 30分間反応させた。 反応終了液を常法により、 フヱノール抽 出処理し、 エタノール沈澱処理して §§y3AIで消化されたブレビバ'クテリゥム ·ラ クトファ一メンタム ATC C 1 3 8 6 9の染色体 DNA断片 5 0〃 g を得た。 実施例 2 プラスミ ドベクター DNAを利用したブレビバ'クテリゥム， ラクトファ一メンタム ATC C 13869の遺伝子ライブラリーの作製 エシ リヒア ·コリとコリネバクテリゥム属細菌の双方の菌体内で自律複製可 能なプラスミ ドベクタ一 DNA (pSAC4) 20〃g 及び制限酵素 lHI 20 0ュニッ トを 50 mMトリス—塩酸緩衝液 （ 100 mM N a C 1及び 10 mM 硫酸マグネシウム含有 （PH7. 4) ) に混合し、 温度 37 で 2時間反応させ て消化液を得、 該液を常法によりフエノ一ル抽出及びエタノール沈澱処理した。 この後、 プラスミ ドベクタ一由来の DNAフラグメントが再結合することを防止 するため、 Molecular Cloning 2nd editon (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T.Man iatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi.56 (1989)) の方法でノくク テリアルアルカリホスファタ一ゼ （Bacterial Alkaline Phosphatase)処理によ り、 DN A断片の脱リン酸化を行い、 常法によりフエノール抽出処理し、 更にェ 夕ノール沈澱処理を行った。
この BamH Iで消化された pSAC4を l〃g、 実施例 1で得られた^ 3A Iで消 化されたブレビパクテリゥム .ラクトファーメンタム ATCC 13869の染 色体 DNA断片を 1 fig、及び 2ュニットの T4DNAリガーゼ （宝酒造 （株） 製） を、 66 mM塩化マグネシウム、 1 OmMジチオスレィトール及び 1 OmM AT Pを含有する 66mMトリス—塩酸緩衝液 （pH7. 5) に添加し、 温度 16 で 16時間反応し、 DNAを連結させた。 次いで該 DNA混合物で、 常法により ェシヱリヒア 'コリ DH 5を形質転換し、 これを 170 gZm 1のクロラム フエニコ一ルを含む L寒天培地上にまき、 約 20， 000個のコロニーを得、 遺伝子ラ イブラリーとした。 実施例 3 ブレビバ、クテリゥム ·ラクトフアーメンタム
A J 11060の形質転換 上記で述べた約 20， 000個のコロニーより、 組換え DNAの回収を行なった。 回 収の方法は上記に示した斎藤、 三浦の方法に従った。
50のバッチに分けた組換え D N A混合物を電気パルス法を用 L、た形質転換の 常法 （特開平 2 - 207791号公報） に従い、 界面活性剤に対する感受性が上 昇した変異株 A J 1 1060株に導入した。 形質転換体をグルコース添加寒天 L 培地上に接種し、 31. 5 で静置培養を行ない、 約 20， 000個の形質転換体を出 現させた。 次にこれらの形質転換体を界面活性剤 3 Omg/ 1を含む同プレート にレプリカし、 この中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で生育可 能であった株を数株得た。 実施例 4 d t s R遺伝子を多コピーで保持する株の
界面活性剤に対する耐性化の検定 生育した数株からそれぞれ組換え DN Aを抽出し、 同DNAを用ぃてA J 1 1
060株を再形質転換した。 ここでも界面活性剤に対して耐性を示した株を得た。 この株が保持していた組換え DN Aを pDTR 6と命名し、 それらのプラスミ ド が運ぶ界面活性剤に耐性を与える遺伝子を _L^Rと命名した。 このプラスミ ド を導入した A J 1 1060菌は、 3 g/Lの界面活性剤を添加した液体培地での 生育阻害が抑制されている （図 1) 。 実施例 5 DNAの調製 上記で得られた組換え DN Aを含有する A J 1 106 OZpDTR6から常法 に従いプラスミ ドを調製し、 ェシエリヒア ·コリ JM109に導入した。 得ら れたェシヱリヒア .コリ JM109 pDTR6をトリプトン 1 %、 酵母ェキ ス 0. 5%及びNa C 1 0. 5%からなる培地 2 Om 1に温度 37 で 24時間 前培養し、 得られた培養液 2 Om 1を上記と同じ組成の培地 1 1に接種し、 温度 37てで 3時間培養したのち、 0. 2 gのクロラムフヱニコ一ルを添加し、 更に 同一温度で 20時間培養を行い、 培養液を得た。 次いで、 この培養液を 3，000r.p. m.で 10分間遠心処理して湿潤菌体各 2 gを得、 これを 2 Om lの 25%ショ糖 を含有する 35 OmMトリスー塩酸緩衝液 （pH8. 0) に懸濁したのち、 更に これにリゾチーム （シグマ社製） 10mg、 0. 25M EDTA溶液 （pH8. 0) 8m 1及び 20%ドデシル硫酸ナトリゥム溶液 8m 1を各々添加し、 温度 6 0てで 30分間保温処理し、 溶菌液を得た。 この溶菌液に、 5M NaC l溶液 1 3m lを添加し、 温度 4 で 16時間処理した後、 15,000r.p.m.で 30分間遠心 分離した。 得られた上清液を、 常法によりフエノール抽出処理及びエタノール沈 澱処理を行い DN Aを沈澱させた。
この沈澱物を減圧乾燥処理した後、 ImM EDTAを含有する 1 OmMトリス —塩酸緩衝液 （PH7. 5) 6mlに溶解し、 さらにこれに塩化セシウム 6 g及 びェチジゥムブロマイド （ 1 gmgZm 1 ) 0. 2 m 1を添加し、 39, OOOr. p. m. で 42時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、 DNAを単 離した。 又更に、 n—ブタノールを使用してェチジゥムブロマイドを除去した後、 ImM EDTAを含有する 1 OmMトリスー塩酸緩衝液 （pH7. 5) に対して 透析を行い純化された組換え DN A pDTR6を約 500 gを得た。 なお、 ェシエリヒア .コリ JM109ZpDTR6には、 プライべ一トナンバー A J 12967が付与されている。 同株は 1994年 2月 22日に通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM P— 14168として寄託さ れ、 1995年 2月 9日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番 号 FERM B P— 4994が付与されている。 実施例 6 d t s R遺伝子を含有する D N Aの塩基配列の解析 実施例 5で得られた組換え DN Aを用い塩基配列の決定を行った。 塩基配列の 決定は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (アプライトノくィオケ ミカル社製） を用い Sangerの方法に従って行った。 得られた d t s R遺伝子を含 む DNAの塩基配列は配列表の配列番号 1に示す通りである。 この配列中に存在 する最も長いオープン · リ一ディング ·フレームは、 配列番号 1に示す塩基配列 のうち 359番目の Aから 1987番目の Gまでの塩基配列であつたが、 この遺伝子の上 流領域に存在するコンセンサス配列の解析から 467〜469番目の A T Gが開始コド ンであると推定された。 359番目の Aから 1987番目の Gまでのオープン · リーディ ング，フレームによりコードされ得るアミノ酸配列を塩基配列とともに配列表配 列番号 1に示した。 さらに、 アミノ酸配列のみを配列表配列番号 2に示す。 467〜 1987番目の塩基配列によりコードされる蛋白質を DTSR蛋白とした。
蛋白質の N末端にあるメチォニン残基は翻訳後べプチダ一ゼの働きにより除去 されることがよく知られている。 これは、 N末端のメチォニンは翻訳開始コドン である AT Gに由来するため、 蛋白質本来の機能とは無関係であることが多いた めである。 本願発明の DTSR蛋白の場合にもメチォニン残基の除去が生じてい る可能性がある。
塩基配列、 アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。 用いたデータベースは EMBL及び SWI S S— PROTである。 その結果、 配 列表配列番号 1に示される遺伝子及びそれにコ一ドされる蛋白質は新規であるこ とが確認された。 実施例 Ί d t s R遺伝子が界面活性剤耐性に関与することの確認 _L^R遺伝子の塩基配列の決定によりオープン · リ一ディング ·フレームが 確認され DT SR蛋白の存在が示唆されたが、 この領域に真に界面活性剤に耐性 を与える遺伝子が存在していることを確かめるために、 このオープン · リ一ディ ング ·フレーム内の遺伝子の一部をィンフレームで欠失させた配列表配列番号 1 記載の遺伝子断片がコリネパクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与 する活性を持つかどうかを調べた。
具体的には、 p D T R 6を I及ひ¾0 Iで消化し _L R遺伝子を含む断片 を取得し、 この遺伝子断片を l及ひ BQIで処理したプラスミ ド PHSG 39 8 (宝酒造 （株） 製） と T4DNAリガーゼ （宝酒 i (株） 製） を用いて結合さ せ、 プラスミ ド pHSGX— Kを取得した。 _l_§_R遺伝子内には配列表配列番 号 1の 766番目と 1366番目の 2箇所に^ 521で消化される部位が存在する < そこで、 pHSGX— Kを^ 521で完全消化した後自己結合させ、 1^521断片 の 600塩基対を欠失した ±AR遺伝子を含むプラスミ ド pHSGX— ΚΔΕ を作成した。 すなわち、 pHSGX - ΚΔΕ上の 遺伝子は中央部分をィ ンフレームで欠失した構造になっている。
次に、 p H S G X— ΚΔ Eをコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能にする ために、 既に取得されているコリネバクテリゥム属細菌内で自律複製可能なブラ スミ ド pHMl 519 (K. iwa et. al. , Agric. Biol. Chem. , 48, 2901-2903 (1984)) 由来の複製開始点 （特界平 5 - 007491号公報） を pHSGX— K △ E上にただ一つ存在する] [匹 I切断部位に導入した。 具体的には、 pHMl 51 9を制限酵素^ HI及び K Iで消化し、 複製起点を含む遺伝子断片を取得し、 得 られた断片を宝酒造 （株） 製 Blunting kitを用い平滑末端化した後、 Kpn Iリンカ 一 （宝酒造 （株） 製） を用いて pHSGX— ΚΔΕの BQI部位に挿入し、 pKC X— ΚΔΕを取得した。 また、 対照として pHSG 399を用い、 その Sal I部位 に同様に Sailリンカー （宝酒造 （株） 製） を用い pHMl 519の複製起点を挿 入した p SAC 4も作製した。 pKCX— ΚΔΕと p S AC4とを上記の電気パ ルス法を用いてそれぞれコリネバクテリゥム属細菌野生株であるブレビパクテリ ゥム ·ラクトファ一メンタム ATCC 13869に導入し、 界面活性剤に対す る耐性度をそれぞれ調べた。 方法としては、 M— CM2 G液体培地にポリオキシ エチレンソルビタンモノパルミテートを 0〜 1 OmgZd 1添加しそれぞれの生 育度を調べた。
その結果、 この欠失型 _LAR遺伝子は界面活性剤に対する耐性を付与する機 能を失っていることが示された （図 2)。 実施例 8 d t s R遺伝子増幅株を用いたピオチン制限法による
L—グルタミン酸の生産
A J 1106 OZpDTR 6株を用いてピオチン制限法による L一グルタミン 酸生産のための培養を以下の様に行った。 4mgZLのクロラムフヱニコールを 含む M—CM2Gプレート培地にて培養して得た A J 11060ZPDTR6株 の菌体を、 グルコース 80g、 KH2PO4 1 Mg S 04 · 7 H20 0. 4 g、 (NH 2S 04 30 g、 F e S04 · 7 H20 0. 01 g、 Mn S 04 · 7 H2 O 0. 01 g、 大豆加水分解液 15m 1、 サイァミン塩酸塩 200 g、 ピオ チン 60 g、 クロラムフエ二コール 4mg及び CaC03 50 を純水 1 L中に含む培地 （KOHを用いて pH7. 0に調整されている） に接種し 31. 5 にて 20時間培養した。 得られた培養物を、 ピオチンを添加していないこと 以外は同じ組成の培地 （以下、 「ピオチン制限培地」 という） に 5%量接種し、 31. 5 にて約 20時間培養した。
A J 11060ZpDTR6株をピオチン制限培地で培養した際、 形成される 菌体量当たりのピオチンの要求量を観察した （図 3)。 コントロールとして AJ 1106 OZp SAC 4株を上記と同様にして培養した。
A J 11060ZPDTR6株は、 形成される菌体量がコントロールに比べて 上昇しており、 菌体量当たりのピオチンの要求量が A J 11060/p S AC 4 株に比較して低減されていた。 実施例 9 d t s R遺伝子増幅株による Lーリジン生産 コリネバクテリゥム属細菌に属する Lーリジン生成菌ブレビバクテリゥム ·ラ クトフアーメンタム AJ 12435 (FERM B P— 2294 ) に p D T R 6を電気パルス法により導入し、 以下に示す培地で培養し L—リジンを生成させ た。
4 mgZLのクロラムフエ二コールを含む M— CM 2 Gプレート培地にて培養 して得た菌体を、 グルコース 100 g、 KH2PO4 l g、 MgS04 0. 4 g、 (NH4) 2 S O4 30 g、 F e S 04 7 H2O 0. 01 g、 MnSO4 7 H20
0. 01 g、 大豆加水分解液 15ml、 サイアミン塩酸塩 200〃 g、 ビォチ ン 300 g、 クロラムフエ二コール 4mg及び CaC03 50 g を純水 1 L中に含む培地 （KOHを用いて pHは 7. 0に調整されている） において 32 にて 40時間培養した。 なお、 pDTR 6の代わりに p SAC 4を同様にして 導入した株を比較として用いた。 その結果を表 5に示す。 表 5 休 Tし—一 1リ1 、ノ、 、ノ C gr/ / λ 1 )
A J 1 2435/p S AC4 1 5
A J 1 2435/pDTR6 25
PDTR6を導入した株では Lーリジン生産性が明らかに向上していた。 参考例 1 d t s R遺伝子増幅株の界面活性剤添加法による
L一グルタミン酸の生産
A J 1 1 060株はピオチン作用抑制物質である界面活性剤を添加することに より、 高濃度のピオチン存在下でも L一グルタミン酸を著量生成するが、 d t s R遺伝子増幅株は界面活性剤に対する耐性度が上昇しているため、 界面活性剤を 添加してもグルタミン酸の生成が抑制されることが考えられた。 そこで A J 1 1 060/p SAC 4株及び A J 1 1 060ノ p D T R 6株を用いて界面活性剤添 加法による L—グルタミン酸の生産培養を以下の様に行った。 4 mgZ 1のクロ ラムフヱニコールを含む M_ CM 2 Gプレート培地にて培養して得た菌体を、 グ ルコース 80 g、 KH2PO4 1 , Mg S04 · 7H200. 4 g、 (ΝΗ4) 2 S O4 30 F e S O4 · 7H20 0. 0 1 g, Mn S04 · 7 H20 0. 0 1 g、 大豆加水分解液 1 5m l、 サイアミン塩酸塩 2 0 0 g、 ピオチン 3 0 0 β g、 クロラムフエ二コール 4mg、 ポリオキシエチレンソルビタンモノパル ミテート 3. 0 g及び C a COs 5 0 g を純水 1 1中に含む培地 （KOHを用い て pHは 8. 0に調整されている） において 3 1. 5 にて 20時間培養した。 培養終了後、 培養液中に生成蓄積した L—グルタミン酸の量を測定した。 得ら れた収率を表 1に示す。 表 1 菌 株 L一グルタミン酸収率 （％)
A J 11060/p S AC 4 29. 6
A J 11060/pDTR 6 9. 0 ± R遺伝子を増幅することにより L—グルタミン酸の収率は大きく低下し た。 このことは、 DTSR蛋白が界面活性剤添加法による L一グルタミン酸の生 産に深く関与することを示すものである。 参考例 2 d t s R遺伝子増幅株を用いたぺニシリン添加法による
L—グル夕ミン酸の生産 参考例 1の培地においてポリオキシエチレンソルビタンンモノノ ルミテートの 代わりにベニシリン Gを 30ュニット添加した培地を使用したこと以外は参考例 1と同様にして、 A J 11060 p SAC 4株及び A J 11060/p DTR 6株を用いてベニシリン添加法による L一グルタミン酸の生産培養を行った。 そ の結果を表 2に示す。 表 2 囷 抹 L—グルタミン酸収率 （％)
A J 11060/p SAC 4 27. 6
A J 11060/pDTR6 12. 8 _L R遺伝子を増幅することにより L一グルタミン酸の収率は大きく低下し た。 このことは、 DTSR蛋白が、 界面活性剤添加法による L一グルタミン酸の 生産と同様、 ベニシリン添加法による L—グル夕ミン酸の生産にも関与すること を示している。 実施例 1 0 d t s R遺伝子破壊の作成 ± R遺伝子の増幅によりしーグルタミン酸生成が抑制されたことから、 逆 に X^R遺伝子を破壊することにより L—グルタミン酸収率を向上させること が期待された。 遺伝子破壊株は、 特開平 5— 7 4 9 1号に示される温度感受性プ ラスミ ドを用いた相同組換え法により取得した。
具体的には、 実施例 7記載の pHSGX— ΚΔΕの]ρπΐ認識部位に、 コリネバ クテリゥム型細菌で自己複製可能なプラスミ ドから 得した自己複製能が温度感 受性になった変異型の複製起点を導入し、 プラスミ ド pKTCX— ΚΔΕを作成 した。
この pKTCX— ΚΔΕを野生株であるブレビバ'クテリゥム ·ラク卜ファーメ ンタム ATCC 1 3869に電気パルス法を用いて導入し、 特開平 5— 749
1号公報記載の方法で染色体上の A上 遺伝子を欠損型に置換した。 具体的に は ATCC 1 3869/pKTCX— KAEを 50 ;u gZm lのォレイン酸を含 む M— CM2 G液体培地で 25 にて 6時間振とう培養した後、 5 μ. g/m 1の クロラムフヱニコール及び 50 g/ 1のォレイン酸を含む M— CM 2 G培地 上に撒き、 34 でコロニーを形成した株をプラスミ ド組み込み株として取得し た。 次にこの株から 34 でクロラムフエ二コールに対して感受性になった株を レプリカ法により取得した。 この感受性株の染色体を常法により取得し、 サザン ハイブリダィゼーシヨン法により染色体上の 遺伝子の構造を調べ、 d t iR遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し ΔΕ株と命名した。 実施例 1 1 ΔΕ株の L—グルタミン酸生産能の評価
ATCC 1 3869株、 A J 1 1 060株及び ΔΕ株の L一グルタミン酸の生 産培養を以下の様に行った。 50 gZm 1のォレイン酸を含む M— CM 2 Gプ レート培地にて培養してリフレッシュを行い、 リフレッシュされた同株を、 グル コース 80 g、 KH2PO4 l g、 Mg S04 0. 4 g、 （NH4) 2S04 30 g、 F e S 04 7 H20 0. 0 1 g、 Mn SO4 7 H20 0. 0 1 g、 大豆加 水分解液 1 5 m 1、 サイアミン塩酸塩 200 /z g、 ピオチン 300 /z g、 Twee n 80 (ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート（polyoxyethylene sorbita n monooleate)) 1 g及び C a COs 5 0 を純水 1 L中に含む培地 （KOHを 用いて p Hは 8. 0に調整されている） において 3 1. 5 にて 2 0時間培養し た。 その結果を表 3に示す。 表 3 菌 株 L一グルタミン酸 (gZ 1 )
ATC C 1 3869 0
A J 1 1 0 6 0 0
ΔΕ 34
野生株及び A J 1 1 0 6 0株は、 培地中に存在する過剰量のピオチンの存在に より Lーグルタミン酸の蓄積が認められなかったのに対し、 ΔΕ株は L一グルタ ミン酸を良好に生成蓄積した。 産業上の利用可能性 本発明の d t s R遺伝子は、 L一グルタミン酸の発酵生産に用いられるコリネ バクテリゥム属細菌において、 L一グルタミン酸の生産に重要な働きを持つ遺伝 子であり、 Lーリジン生産能を有するコリネバクテリウム属細菌において同遺伝 子を増幅することにより L—リジンの生産能を向上させることができる。 また、 グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリゥム属細菌においては、 同遺伝子を 破壊することによりグルタミン酸生産能が向上させることができる。 配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 2855
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： GenomicDM
配列の特徴
特徴を表わす記号： CDS
存在位置： 359. . 1987
配列
GATCTTGGAA CTCGACAGTT TTCACCGTCC AGTTTGGAGC GCCTGAGCTT GCAAGCTCCA 60 GCAAGTCAGC ATTAGTGGAG CCTGTCACTT TTTCGTAAAT GACCTGGCCA AAGTCACCGT 120 HTGGAGCAA TTTTTCCTTC AGGAGCTCAA CGTTTAGCGG CTCTCTGGAT CGTGAAATGT 180 CAACGTTCAT GGAAGCCAAT GTAGTGGGGT CGCGTCGAAA AGCGCGCTTT AAGGGCGACA 240 CGCCCAAAAA GTTTTACCTT TAAAAACTAC CCGCACGCAG CACGAACCTG TTCAGTGATG 300 TAAATCACCG CGGAAATATT GTGGACGTTA CCCCCGCCTA CCGCTACGAT TTCAAAAC 358 ATG ACC ATT TCC TCA CCT TTG ATT GAC GTC GCC AAC CTT CCA GAC ATC 406 Met Thr lie Ser Ser Pro Leu lie Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp lie
1 5 10 15
AAC ACC ACT GCC GGC AAG ATC GCC GAC CTT AAG GCT CGC CGC GCG GAA 454 Asn Thr Thr Ala Gly Lys lie Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu
20 25 30
GCC CAT TTC CCC ATG GGT GAA AAG GCA GTA GAG AAG GTC CAC GCT GCT 502 Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala
35 40 45
GGA CGC CTC ACT GCC CGT GAG CGC TTG GAT TAC TTA CTC GAT GAG GGC 550 Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly 50 55 60
TCC TTC ATC GAG ACC GAT CAG CTG GCT CGC CAC CGC ACC ACC GCT TTC 598
Ser Phe lie Glu Thr Asp Gin Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe
65 70 75 80
GGC CTG GGC GCT AAG CGT CCT GCA ACC GAC GGC ATC GTG ACC GGC TGG 646
Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly lie Val Thr Gly Trp
85 90 95
GGC ACC ATT GAT GGA CGC GAA GTC TGC ATC TTC TCG CAG GAC GGC ACC 694
Gly Thr lie Asp Gly Arg Glu Val Cys lie Phe Ser Gin Asp Gly Thr
100 105 110
GTA TTC GGT GGC GCG CTT GGT GAG GTG TAC GGC GAA AAG ATG ATC AAG 742
Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met lie Lys
115 120 125
ATC ATG GAG CTG GCA ATC GAC ACC GGC CGC CCA TTG ATC GGT CTT TAC 790 lie Met Glu Leu Ala lie Asp Thr Gly Arg Pro Leu lie Gly Leu Tyr
130 135 140
GAA GGC GCT GGC GCT CGC ATT CAG GAC GGC GCT GTC TCC CTG GAC TTC 838
Glu Gly Ala Gly Ala Arg lie Gin Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe
145 150 155 160
ATT TCC CAG ACC TTC TAC CAA AAC ΑΠ CAG GCT TCT GGC GTT ATC CCA 886
He Ser Gin Thr Phe Tyr Gin Asn lie Gin Ala Ser Gly Val lie Pro
165 170 175
CAG ATC TCC GTC ATC ATG GGC GCA TGT GCA GGT GGC AAC GCT TAC GGC 934
Gin lie Ser Val lie Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly
180 185 190
CCA GCC CTG ACC GAC TTC GTG GTC ATG GTG GAC AAG ACC TCC AAG ATG 982
Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met
195 200 205
TTC GTT ACC GGC CCA GAC GTG ATC AAG ACC GTC ACC GGC GAG GAA ATC 1030 Phe Val Thr Gly Pro Asp Val lie Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu l ie
210 215 220
ACC CAG GAA GAG CTT GGC GGA GCA ACC ACC CAC ATG GTG ACC GCT GGC 1078 Thr Gin Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly
225 230 235 240
AAC TCC CAC TAC ACC GCT GCG ACC GAT GAG GAA GCA CTG GAT TGG GTA 1126 Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val
245 250 255
CAG GAC CTG GTG TCC TTC CTC CCA TCC AAC AAT CGC TCT TAC ACA CCA 1174 Gin Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro
260 265 270
CTG GAA GAC TTC GAC GAG GAA GAA GGC GGC GTT GAA GAA AAC ATC ACC 1222 Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn lie Thr
275 280 285
GCT GAC GAT CTG AAG CTC GAC GAG ATC ATC CCA GAT TCC GCG ACC GH 1270 Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu lie lie Pro Asp Ser Ala Thr Val
290 295 300
CCT TAC GAC GTC CGC GAT GTC ATC GAA TGC CTC ACC GAC GAT GGC GAA 1318 Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val lie Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu
305 310 315 320
TAC CTG GAA ATC CAG GCA GAC CGC GCA GAA AAC GTT GTT ATT GCA TTC 1366 Tyr Leu Glu lie Gin Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val He Ala Phe
325 330 335
GGC CGC ATC GAA GGC CAG TCC GTT GGA TTT GTT GCC AAC CAG CCA ACC 1414 Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr
340 345 350
CAG TTC GCT GGC TGC CTG GAC ATC GAC TCC TCT GAG AAG GCA GCT CGC 1462 Gin Phe Ala Gly Cys Leu Asp lie Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg
355 360 365 TTC GTC CGC ACC TGC GAC GCG TTT AAC ATC CCA ATC GTC ATG CTT GTC 1510
Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn l ie Pro lie Val Met Leu Val
370 375 380
GAC GTC CCC GGC TTC CTT CCA GGC GCA GGC CAG GAG TAT GGT GGC ATC 1558
Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gin Glu Tyr Gly Gly lie
385 390 395 400
CTG CGT CGT GGC GCA AAG CTG CTC TAC GCA TAC GGC GAA GCA ACC GTT 1606
Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val
405 410 415
CCA AAG ATT ACC GTC ACC ATG CGT AAG GCT TAC GGC GGA GCG TAC TGC 1654
Pro Lys lie Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys
420 425 430
GTG ATG GGT TCC AAG GGC TTG GGC TCT GAC ATC AAC CTT GCA TGG CCA 1702
Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp lie Asn Leu Ala Trp Pro
435 440 445
ACC GCA CAG ATC GCC GTC ATG GGC GCT GCT GGC GCA GTC GGA TTC ATC 1750
Thr Ala Gin lie Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe lie
450 455 460
TAC CGC AAG GAG CTC ATG GCA GCT GAT GCC AAG GGC CTC GAT ACC GTA 1798
Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val
465 470 475 480
GCT CTG GCT AAG TCC TTC GAG CGC GAG TAC GAA GAC CAC ATG CTC AAC 1846
Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn
485 490 495
CCG TAC CAC GCT GCA GAA CGT GGC CTG ATC GAC GGC GTG ATC CTG CCA 1894
Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu lie Asp Ala Val He Leu Pro
500 505 510
AGC GAA ACC CGC GGA CAG ATT TCC CGC AAC CTT CGC CTG CTC AAG CAC 1942
Ser Glu Thr Arg Gly Gin lie Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His 515 520 525
AAG AAC GTC ACT CGC CCT GCT CGC AAG CAC GGC AAC ATG CCA CTG 1987 Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu
530 535 540
TAAATCGGCG AATCCATAAA GGTTCAAAAG AATTCAATAA GGATTCGATA AGGGTTCGAT 2047
AAGGGTTCGA TAAGGGCCGA CTTAAATGAT TGGATGTAAA GAAATACCAA TGAAAATTGG 2107
CAACTCTTTA CACCCAATCT TTAAGACATG GGGGGTGGCG CTGGGCTAAT ATAACCGGTT 2167
AGCGAAACGA TTAGTCCCTT GHAGGGGGA TTAACCCTCG AAGTGGGTCG TATTTTGGCG 2227
TTTGTATGTT CACACAAGAA CCCTGCACAA CGCCTTCAAA GTACGTCGAC CACGACCAAG 2287
CGCATTATTC ACTCTCACCC TTCAGGATTT AGACTAAGAA ACCATGACTG CAGCACAGAC 2347
CAAACCTGAC CTCACCACCA CGGCTGGAAA GCTGTCCGAT CTTCGCTCCC GTCHGCAGA 2407
AGCTCAAGCT CCAATGGGCG AAGCAACTGT AGAAAAAGTG CACGCTGCTG GCAGGAAGAC 2467
TGCCCGCGAA CGTATCGAGT ATTTGCTCGA TGAGGGCTCT TTCGTAGAGA TCGATGCTCT 2527
TGCTCGTCAC CGTTCCAAGA ACTTCGGCCT GGATGCCAAG CGTCCAGCTA CTGACGGTGT 2587
TGTGACTGGT TACGGCACCA TCGATGGCCG TAAGGTCTGT GTGTTCTCCC AGGACGGCGC 2647
TGTATTCGGT GGCGCTTTGG GTGAAGTTTA TGGTGAAAAG ATCGTTAAGG TTATGGATCT 2707
TGCGATCAAG ACCGGTGTGC CTTTGATCGG AATCAATGAG GGTGCTGGTG CGCGTATCCA 2767
GGAAGGTGTT GTGTCTCTGG GTCTGTACTC ACAGATTTTC TACCGCAACA CCCAGGCGTC 2827
TGGCGTTATC CCACAGATCT CTTTGATC 2855 配列番号： 2
配列の長さ ： 543
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Met Thr lie Ser Ser Pro Leu lie Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp lie
1 5 10 15
Asn Thr Thr Ala Gly Lys lie Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu 99Z OSZ 9^
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260 265 270
Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn lie Thr
275 280 285
Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu lie lie Pro Asp Ser Ala Thr Val
290 295 300
Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val lie Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu 305 310 315 320
Tyr Leu Glu lie Gin Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val lie Ala Phe
325 330 335
Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr
340 345 350
Gin Phe Ala Gly Cys Leu Asp lie Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg
355 360 365
Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn lie Pro lie Val Met Leu Val
370 375 380
Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gin Glu Tyr Gly Gly lie 385 390 395 400
Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val
405 410 415
Pro Lys l ie Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys
420 425 430
Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp lie Asn Leu Ala Trp Pro
435 440 445
Thr Ala Gin lie Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe lie
450 455 460
Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val 465 470 475 480
Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn 485 490 495
Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu lie Asp Ala Val lie Leu Pro
500 505 510
Ser Glu Thr Arg Gly Gin lie Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His
515 520 525
Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu 530 535 540

Claims

請求の範囲
1 . コリネパクテリゥム属細菌に由来し、 該細菌に界面活性剤に対する耐性を 付与する蛋白質をコードする遺伝子。
2 . 前記蛋白質のアミノ酸配列が、 配列表配列番号 2で示されるアミノ酸配列 のうちアミノ酸番号 3 7〜5 4 3からなるアミノ酸配列またはこのァミノ酸配列 においてコリネバクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に 実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、 欠失 るいは挿入を有するァミノ 酸配列を含む請求項 1記載の遺伝子。
3 . 配列表配列番号 1に示される塩基配列の 467番目から 1987番目に至る配列ま たはこれと実質的に同一の塩基配列を有する請求項 1記載の遺伝子。
4 . 請求項 1記載の遺伝子とコリネバクテリゥム属細菌で機能するべクタ一が 連結されて得られる組換え D N A。
5 . 請求項 4記載の組換え D N Aを保有するコリネバクテリウム属細菌。
6 . 請求項 4記載の組換え D N Aを保有し、 かつ L—リジン生産能を有するコ リネパクテリゥム属細菌を液体培地に培養し、 培養液中に Lーリジンを生成蓄積 させ、 これを採取することを特徴とする L—リジンの製造法。
7 . 請求項 1記載の遺伝子の塩基配列中に、 この塩基配列によってコードされ る蛋白質がコリネパクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性 が正常に機能しないような 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または 逆位が生じた遺伝子。
8 . 請求項 7記載の遺伝子とコリネバクテリゥム属細菌で機能するべクタ一が 連結されて得られる組換え D N A。
9 . 染色体上に存在する請求項 1記載の遺伝子またはそのプロモーターの塩基 配列中に 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が生じたこと により、 コリネパクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を 有する蛋白質が正常に機能していないコリネパクテリゥム属細菌。
1 0 . 染色体上に存在する請求項 1記載の遺伝子またはそのプロモーターの塩基 配列中に 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が生じたこと により、 コリネパクテリゥム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を 有する蛋白質が正常に機能しておらず、 かつ L一グルタミン酸生産能を有するコ リネパクテリゥム属細菌を液体培地に培養し、 培養液中に Lーグルタミン酸を生 成蓄積させ、 これを採取することを特徴とする L—ダルタミン酸の製造法。
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