KR100671785B1 - 신규한 탈감작형 아스파르토키나아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코리네형 세균유래의 신규한 아스파르토키나아제, 전기 효소를 암호화하는 DNA, 전기 DNA를 함유하는 재조합체 DNA, 전기 재조합체 DNA를 보유하는 코리네형 세균, 또는 전기 DNA를 염색체상에서 보유하는 코리네형 세균 및 전기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 L-리신의 제조방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속 세균 유래이고, 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째의 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산인 아미노산 서열을 가지며, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동 피드백저해를 받지 않는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA를 합성할 수 있다.
L-리신
Description
본발명은 코리네형(Coryneform) 세균으로부터 유래된 신규한 아스파르토키나아제, 전기 효소를 암호화하는 DNA, 전기 DNA를 함유하는 재조합체 DNA, 전기 재조합체 DNA를 보유하는 코리네형 세균, 또는 전기 DNA를 염색체에 보유하는 코리네형 세균, 및 전기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 L-리신의 제조방법에 관한 것이다.
코리네박테리움속에 속하는 미생물을 이용한 발효법에 따라 L-리신의 제조방법은 다음의 방법이 알려져 있다.
(1) L-리신 생산변이주를 이용하는 방법으로는, 예를 들면, S-(2-아미노에틸)-시스테인(이하에서는, 'AEC'라 칭함) 내성변이주(참조: 아미노산 발효, 1986년, 273페이지, 학회출판센터), L-호모세린요구변이주(참조: 아미노산발효 1986년, 273페이지, 학회출판센터), 호흡계 저해제 내성변이주(참조: 특공평 5-55114), 피리미딘 아날로그 내성변이주(특개소 59-88094), 퓨린 아날로그 내성변이주(특공소 63-062199) 등이 알려져 있다.
(2) 유전자 조작 기술을 이용한 재조합 균에 의한 방법으로는, 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서 자가복제하고, 선택가능한 표현형을 만드는 마커유전자 를 가지는 벡터플라스미드 및 이들을 효율적으로 전기 세균에 도입하는 방법이 개시되어 있고, 이들을 이용하여 L-리신을 포함하는 각종 L-아미노산의 합성에 관여하는 유전자의 세포내 복제수를 증가시키고, 전기 아미노산을 효율적으로 제조하는 방법이 개시되어 있다(참조: 특공평 5-11959, 특공평 7-55155).
L-리신의 생합성제어로는 L-아스파라긴산으로부터 아스파라틸인산의 생합성을 촉매하는 아스파르토키나아제(이하, 'AK'라 약함)에 대한 L-리신과 L-트레오닌에 의한 협동(concerted) 피드백저해가 가장 우수하다고 알려져 있다. 이 피드백저해를 받지 않는 변이형 AK[이하에서는, '탈감작형(desensitized) AK'라 약함]를 암호화하는 유전자(이하에서는 '탈감작형 AK유전자'라 약함)를 가지는 코리네박테리움속에 속하는 미생물에는 L-리신을 균체외로 분비하는 것이 알려져 있다(참조: 아미노산핫꼬, 1986년, 273페이지, 학회출판센터). 변이의 염기 서열정보가 있으면, 시험관내에서 염기서열을 원하는대로 변환하는 기법(예를 들면, Stratagene사 QuickChange site-directed mutagenesis 키트를 이용하는 방법)으로 야생형 유전자를 변이형으로 변환시킬 수 있다. 최근에는 상기 탈감작형 AK유전자의 염기서열 수준에서의 해석이 보고되어 졌다(참조: Journal of Bacteriology, 175:4096, 1993; Molecular Microbiology 5:1197, 1991; 특개평 6-62866).
본발명의 과제는 코리네형 세균에 있어서 L-리신 생합성의 핵심효소인 AK를 L-리신 및 L-트레오닌 협동피드백저해 및 리신 단독의 피드백저해를 받지 않는 탈 감작형으로 만들어, L-리신의 생산에 유리하도록 만드는 것이다.
본발명의 발명자들은 코리네형 세균에 의한 효율적인 L-리신의 생산방법에 관하여 예의 연구한 결과, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동 피드백저해를 받지 않는 성질 외에 L-리신 단독의 피드백저해도 받지 않는 탈감작형의 AK를 가지는 균주가 우수한 L-리신생산능을 가지는 것을 알아내고, 본발명을 완성하게 되었다.
즉, 본발명은 이하 (1) 내지 (12)에 관한 것이다.
(1) 코리네형 세균으로부터 유래되었으며, 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산에 치환된 아미노산서열을 가지고, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동(synergistic) 피드백저해를 받지 않는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA.
(2) DNA는 서열번호 17에 기재된 염기서열을 가지는 DNA로 상기 (1)의 DNA.
(3) 코리네형 세균은 코리네박테리움속 및 브레비박테리움속으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 속에 속하는 코리네형 세균인 상기 (1)의 DNA.
(4) 상기 (1) 내지 (3)의 어느 하나의 DNA를 벡터에 삽입하여 수득되는 코리네형 세균으로 복제가능한 재조합체 DNA.
(5) 상기 (1) 내지 (3)의 어느 하나의 DNA를 염색체에서 가지는 코리네형 세균.
(6) 상기 (4)의 재조합체 DNA를 보유하는 코리네형 세균에 속하는 형질전환체.
(7) 형질전환체가 코리네박테리움 글루타미컴 Tf-5(FERM BP-6689)인 상기 (6)의 형질전환체.
(8) 상기 (5)의 코리네형 세균, 상기 (6) 및 (7)의 형질전환체로부터 선택되는 미생물 또는 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에서 L-리신을 생성, 축적시키고, 전기 배양물로부터 L-리신을 수득하는 것을 특징으로 하는 L-리신의 제조방법.
(9) 상기 (1) 내지 (3)의 어느 하나에서 DNA로 암호화되는 아스파르토키나아제.
(10) 코리네형 세균으로부터 유래되었으며, 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째의 아미노산 잔기가 Thr인 아미노산 서열을 가지는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA.
(11) 서열번호 17에 기재된 932번째의 염기가 시토신으로 치환된 염기서열을 가지는 상기 (10)의 DNA.
(12) 상기 (10) 또는 (11)의 DNA에 의해 암호화된 아스파르토키나아제.
이하에서는, 본발명을 좀 더 상세하게 설명한다.
AK를 암호화하는 유전자(이하에서는, 'AK유전자'라 약함)을 포함하는 DNA의 공급균으로는 코리네형 세균에 속하고 AK활성을 가지는 미생물이면 어느 미생물이든 무방하다.
본발명에 있어서 코리네형 세균으로는 애그로코커스(Agrococcus)속, 애그로마이세스(Agromyces)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 오레오박테리움(Aureo -bacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속, 클레비박터(Clavibacter)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 래타이박터(Rathayibacter)속, 테라박터(Terrabacter)속, 투리셀라(Turicella)속에 속하는 세균을 예로 들 수 있다. 구체적으로 예를 들면 하기의 균주가 이용될 수 있다.
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13870, 코리네박테리움 카르나에 ATCC15991, 코리네박테리운 아세토글루타미컴 ATCC15806.
야생형주에서는 L-리신, 또는 L-리신과 L-트레오닌으로부터 피드백저해를 받고, 야생형의 AK유전자가 공급된다. 전기 야생형의 AK유전자에 의한 피드백저해를 받지 않는 탈감작형 AK유전자를 수득하는 방법으로는, 예를 들면, 야생형주로부터 변이 조작[예를 들면, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니신(NTG)를 이용하는 방법(참조: 미생물 실험 매뉴얼, 1986, 131페이지 코단사 사이언티픽사)]를 수행한 후, AEC 내성을 표지로 선택되고, L-리신 생산성의 변이주로부터 수득하는 방법을 예로 들 수 있다. 바람직한 변이주로는, 코리네박테리움 글루타미컴 야생형주 ATCC13032에서 변이처리로 유도된 L-리신생산균, 또는 야생형 AK유전자를 수득한 후, 상기 NTG법 또는 시험관 내 변이법[예를 들면, 히드록실아민을 이용하는 방법 (참조: Molecular and General Genetics, 145:101, 1978)]에 의하여 전기 유전자에 변이를 유도하고, AEC내성과 L-리신 생산성을 표지로 탈감작된 탈감작형 AK유전자를 포함하는 주 들을 예로 들 수 있다.
AK유전자는 AK유전자를 포함한 주에서, 예를 들면, 사이토 등의 방법(Biochimica et Biophysica Acta 72:619, 1963)에 의해 분리하여 수득할 수 있다. 즉, 염색체 DNA를 제조하고, 이것을 적당한 제한효소로 절단한다. 절단후, 수득된 절단 단편을 미생물 내에서 자가복제가능한 벡터(예를 들면 플라스미드)에 연결하고, 이것을 AK활성이 결손된 숙주미생물에 도입한다. 전기 미생물에 의해 AK활성을 발현하게 된 형질전환체를 분리하고, 전기 형질전환체에서 전기 유전자를 분리하여 수득할 수 있다.
전기 숙주미생물로는 코리네형 세균의 AK유전자가 발현가능한 미생물이면 어느 것이든 이용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균의 AK결손주를 예로 들 수 있다.
자가복제 가능한 벡터로는 전기 벡터를 도입한 미생물 중 자가복제가 가능한 것이면 어느 것이든 무방하다. 예를 들면, pUC18(타카라슈조 사제), pBluescriptSK(-)(토요보 사제) 등의 대장균 중에서 자가복제 가능한 벡터, pCE54(참조: 특개소58-105999) 등의 대장균과 코리네형 세균의 양방으로 자가복제 가능한 셔틀벡터 등을 예로 들 수 있다.
벡터와 AK유전자를 포함하는 DNA 단편과의 연결은 T4 DNA 리가제 등을 이용하여 통상의 방법으로 행할 수 있다.
숙주에의 도입은 예를 들면 대장균의 경우, 하나한 등의 방법(참조: Journal of Molecular Biology, 166:557, 1983) 등으로 행할 수 있다.
또한, 이하의 방법에 의해 AK유전자를 분리, 수득할 수 있다.
이미 공지된 코리네박테리움 글루타미컴 유래 AK유전자의 염기 서열정보[예 를 들면, 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 E06825]를 기초로 올리고머 DNA를 합성하고, 전기 DNA를 프라미어로 이용하여 PCR법에 의해 전기 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하여 분리한다. 전기 DNA 단편을 선택 마커 유전자를 가지는 벡터에 연결하여 대장균, 코리네형 세균 등의 적당한 숙주미생물에 도입한다. 전기 미생물에 의해 도입된 벡터를 분리하여 AK유전자를 수득할 수 있다. 숙주 미생물은 AK결손주를 이용할 필요는 없다.
본발명에서 「코리네형 세균에서 복제 가능한 재조합체 DNA」를 제작하게 위하여 이용될 수 있는 벡터로는, 코리네형 세균 중에서 자가복제할 수 있으면 어느 것이든 무방하다. 구체적으로, pCG1(참조: 특개소 57-134500), pCG2(참조: 특개소 58-35197), pCG4(참조: 특개소 57-183799), pCG11(참조: 특개소 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101(참조: 모두 특개소 58-105999), pCE51, pCE52, pCE53(참조: Molecular and General Genetics, 196:175, 1984) 및 본발명에 있어서 제작과정을 나타낸 pCS299P 등을 예로 들 수 있다. 바람직하게는, pCG116, pCS299P 등과 같이 사이즈가 비교적 작고, 클로닝 부위를 많이 가지며, 약제 내성유전자 등의 선택가능한 마커 유전자를 가지는 것이 이용된다.
상기 재조합체 DNA를 코리네형 세균에 도입하기 위한 방법으로는, 프로토플라스트법(참조: 특개소 57-186492 및 특개소 57-18649), 전기천공법(참조: Journal of Bacteriology, 175:4096, 1993) 등을 예로 들 수 있다.
본발명의 신규 AK를 암호화하는 DNA를 염색체에 가지는 코리네형 세균은 전기 AK유전자를 염색체에 포함하는 코리네형 세균이면 어느 것이든 무방하다. 예를 들면 변이조작에 의하여 수득된 주, 상동조작법(Bio/Technology, 9:84, 1991), 파지나 트랜스포존을 이용하는 방법(Escherichia coli and Salmonella typhymurium 2325, 2339, 1996, American Society for Microbiology 발간) 등에 의해 전기 DNA 단편을 염색체 내에 인위적으로 삽입한 미생물 등을 예로 들 수 있다.
이상과 같이 수득된 신규 AK유전자를 포함하는 DNA를 가지는 코리네형 세균에 속하는 형질전환체를 배양하여, 배양액 중에서 L-리신을 생성축적시킬 수 있다.
배양배지로는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 포함하는 통상의 영양배지를 이용할 수 있다.
탄소원으로는 예를 들면 글루코스, 과당, 슈크로스, 말토스, 전분가수분해물 등의 당류, 에탄올 등의 알콜류, 초산, 유산, 숙신산, 등의 유기산류를 이용할 수 있다.
질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 초산암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄염류, 요소, 그외 질소함유 화합물 및 고기엑기스, 효모엑기스, 콘스팁리커, 대두가수분해물 등의 질소함유 유기물을 이용할 수 있다.
무기염으로는 인산제일수소칼륨, 인산제이수소칼륨, 황산암모늄, 염화나트륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘 등을 이용할 수 있다.
그 외, 필요에 따라 비오틴, 티아민 등의 미량영양원을 첨가할 수 있다. 이들 미량영양원은 고기엑기스, 효모엑기스, 콘 스팁리커, 카자미노산 등의 배지첨가물로 대용할 수 있다.
배양은 진탕배양, 심부통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양 온도는 일반적으로 20 내지 40℃가 바람직하며, 배양중의 pH는 중성부근에서 유지하는 것이 바람직하다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 행하고, 배양기간은 통상 1 내지 6일간이다.
배양종료 후, 균체를 제거하여, 수득된 배양액로 부터 활성탄처리, 이온교환수지처리 등의 공지된 방법에 의해 L-리신을 회수할 수 있다.
이하에서는 본발명의 실시예를 나타내었지만, 본발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 pCS299P의 조성과정을 나타낸 그림이다.
실시예 1: 플라스미드 pCS299P의 조성
대장균과 코리네형 세균 쌍방으로 자가복제가 가능한 셔틀플라스미드 pCS299P를 이하의 방법으로 제작하였다.
pCG116(참조: Bio/Technology, 11:921, 1993)을 BglII(타카라슈조 사제)로 절단하고, BglII절단단편을 수득하였다.
pHSG299(타카라슈조 사제)를 BamHI(타카라슈조 사제)로 절단 후, 수득된 BamHI절단단편을 통상적인 방법에 따라 에탄올 침전법에 의해 농축하고, 전기 단편 을 알칼리포스파타제로 처리하였다. 수득된 상기 2종류의 단편을 혼합하고, 라이게이션키트 ver. 1(타카라슈조 사제)를 이용하여 리가제로 반응시켰다. 반응산물을 이용하여 통상적인 방법[참조: Molecular Cloning 제 2판, 1989년, Cold Spring Harber Laboratory Press(이하에서는, 'Molecular Cloning 제 2판'으로 약함)]에 따라 대장균 NM522주를 형질전환하였다. 전기 균주를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 한천배지[박토트립톤(DIFCO 사제) 10g, 효모엑기스(DIFCO 사제) 5g, 염화나트륨 10g, 박토아가(DIFCO 사제) 16g을 물 1L에 넣고, pH 7.0에 조정한 배지]에서 배양하고, 형질전환체를 선택하였다. 전기 형질전환체를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 배지를 이용하여 하루밤 배양하고, 수득된 배양액으로부터 알칼리 SDS법(참조: Molecular Cloning 제 2판)에 따라 플라스미드를 제조하고, pCS116-299Bgl1 DNA를 수득하였다.
전기 pCS116-299Bgl1 DNA의 제한효소 절단 부위를 통상적인 방법에 따라 확인하였다. pCS116-299Bgl1 DNA를 이용하여 전기천공법(참고: FEMS Microbiology Letters, 65:299, 1989)으로 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872를 형질전환하였다. 전기 균주를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 CM한천배지[폴리펩톤 S(니혼세이야쿠 사제) 10g, 효모엑기스 S(니혼세이야쿠 사제) 5g, 엘리히(Ehrlich) 고기엑기스(쿄쿠토세이야쿠코교 사제) 10g, 염화나트륨 3g, 비오틴 30㎍을 물 1L에 넣어 pH 7.2에 조정한 배지]상에서 배양하고, 형질전환체를 선택하였다. 전기 형질전환체에서 통상적인 방법을 따라 플라스미드를 추출하고, 전기 플라스미드를 제한효소로 절단하여, 전기 플라스미드가 pCS116-299Bgl1인것을 확인하였다.
pCS116-299Bgl1 DNA를 PstI(타카라슈조 사제) 및 BamHI으로 절단한 후, 에탄올침전법으로 정제하였다. 수득된 DNA에서 킬로시퀀싱 딜리션 키트(Kilo-Sequencing Deletion Kit, 타카라슈조 사제)를 이용하여 부분결실 플라스미드를 수득하였다. 전기 플라스미드를 이용하여 통상적인 방법을 따라 대장균 NM522주를 형질전환하였다. 전기 균주를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 한천배지 상에서 배양하고, 형질전환체를 선택하였다. 전기 형질전환체를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 배지를 이용하여 하루밤 배양하고, 수득된 배양액에서 알칼리 SDS법으로 플라스미드를 제조하였다. 통상적인 방법에 따라 수득된 각 플라스미드의 제한효소 지도를 작성하고, 부분결실된 길이가 다른 플라스미드를 선택하였다.
선택된 플라스미드를 이용하여 전기천공법으로 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872를 형질전환하였다. 수득된 형질전환체를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 CM한천배지 위에 도포한 후, 30℃에서 2일간 배양하고 카나마이신 내성 콜로니의 출현유무를 표지로 하여, 코리네박테리움 암모니아게네스 중에서 자가 복제능을 가지는 플라스미드를 선택하였다.
자가복제능을 가지는 플라스미드 중에서 가장 긴 결실영역을 가지는 플라스미드를 선택하고, 이 플라스미드를 pCS299de16으로 하였다.
pCS299de16 DNA를 통상적인 방법에 따라 형질전환체로부터 제조한 후, 제한효소 DraI 및 PvuII(모두 타카라슈조 사제)를 이용하여 절단하였다. 전기 절단 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동하여 분획 후, pCG116유래의 DNA를 가지는 약 2.7kb의 DNA 단편을 분리하고, DNA prep(아사히가라스 사제)를 이용하여 추출정제 하였다.
pBluescript SK(+)(토요보우세키 사제) DNA를 통상적인 방법에 따라 EcoRV(타카라슈조 사제)로 절단하였다. 수득된 절단 DNA 단편을 에탄올 침전법으로 농축 후, 알칼리포스파타제를 처리하였다. 전기 처리 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동으로 분획 후 DNA prep을 이용하여 추출정제하였다.
상기 2.7kb 단편과 pBluescript SK(+) 단편을 라이게이션 키트 ver. 1을 이용하여 연결한 후, 전기 연결된 DNA를 이용하여 통상적인 방법을 따라 대장균 NM522주를 형질전환하였다. 전기 균주를 100㎍/ml의 암피실린, 50㎍/ml의 X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside), 1mmol/l의 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside)를 포함하는 LB 한천배지상에 배양하고, 형질전환체를 선택하였다. 전기 형질전환체를 100㎍/ml의 암피실린을 포함하는 LB 배지를 이용하여 하루밤 배양하고, 수득된 배양액에서 알칼리 SDS법으로 플라스미드를 제조하였다. 통상적인 방법에 따라 수득된 각 플라스미드의 제한효소 지도를 작성하였다. EcoRI 으로 절단하여 3.4kb와 2kb의 단편이 생성되는 플라스미드를 pCSSK21이라 하였다.
서열번호 1, 2에 표시된 DNA를 합성하고, 이들 DNA를 프라이머로 하여 pHSG299 DNA를 주형으로 하여, Taq DNA 폴리머라제(타카라슈조 사제)를 이용하여 첨부반응 조건에 따라 PCR을 행하였다. 반응산물을 통상적인 방법에 따라 에탄올 침전한 후, 제한효소 PstI 및 XhoI(타카라슈조 사제)를 이용하여 절단하였다. 전기 절단 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동하여 분획하고, 수득된 약 1.3kb의 DNA 단 편을 DNA prep을 이용하여 추출정제하였다.
서열번호 3, 4에 표시된 DNA를 합성하고, 이들 DNA를 프라이머로 하여 pHSG299 DNA를 주형으로 하여 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 첨부의 반응조건에 따라 PCR을 행하였다. 반응 산물을 통상적인 방법에 따라 에탄올 침전한 후, 제한 효소 PstI 및 BglII를 이용하여 절단하였다. 전기 절단 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동으로 분획하고, 수득된 약 1.3kb의 DNA 단편을 DNA prep으로 추출정제하였다.
상기에서 수득된 플라스미드 pCSSK21을 SalI(타카라슈조 사제) 및 BamHI을 이용하여 절단하였다. 전기 절단 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동으로 분획하고, 수득된 2.7kb의 DNA 단편을 DNA prep으로 추출정제하였다. 추출정제된 상기 3종류의 DNA 단편을 혼합한 후, 라이게이션 키트 ver. 1로 연결하였다.
전기 연결된 DNA 단편으로 통상적인 방법으로 대장균 NM522주를 형질전환하였다. 전기 균주를 20㎍/ml의 카나마이신, 50㎍/ml의 X-Gal, 1mmol/l의 IPTG를 포함하는 LB 한천배지 상에 배양하고, 형질전환체를 선택하였다.
전기 형질전환체를 20㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 배지를 이용하여 하루밤 배양하고 수득된 배양액으로 알칼리 SDS법으로 플라스미드를 조제하였다. 통상적인 방법에 따라 수득된 각 플라스미드의 제한효소지도를 작성하고 도 1에 기재된 구조를 가지는 플라스미드를 pCS299P라 하였다.
실시예 2: L-리신 생산변이주의 제작과 전기 주 유래 AK유전자의 염기서열
결정
코리네박테리움 글루타미컴 야생형주(ATCC13032)에 NTG로 변이처리(참조: 미생물 실험 매뉴얼 1986년 131페이지 코단사 사이언티픽사)한 후, 1mg/ml의 AEC 및 1mg/ml의 L-트레오닌을 포함하는 최소한천배지[글루코스 5g, 인산일수소이칼륨 0.75g, 인산이수소일칼륨 0.75g, 황산암모늄 1g, 황산마그네슘7수화물 0.5g, 염화나트륨 0.1g, 황산제일철7수화물 10mg, 황산망간7수화물 8mg, 염화칼슘 1mg, 티아민염산염 1mg, 비오틴 0.03mg, 한천(DIFCO 사제) 16g을 물 1L에 넣고 pH 7.2에 조정한 배지]에 도포하고, 30℃에서 2일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 분리하고 실시예 5에 나타낸 방법으로 L-리신을 생산하여, 생산성이 향상된 콜로니를 선별하였다.
이 중, 한 주(AEC11주)와 야생형주 ATCC13032를 이하의 PCR 방법으로 AK유전자를 증폭하고, 염기서열을 결정하였다.
각각의 주에서 사이토 등의 방법(참조: Biochimica et Biophysica Acta, 72:619, 1963)에 의해 염색체 DNA를 제조하였다. 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869주에 공지된 AK유전자의 염기서열(GenBank 수탁 번호 E06825)를 토대로하여 증폭용 DNA 프라이머를 설계하였다. 전기 DNA 프라이머를 서열번호 5 및 6에 나타내었다. 상기에서 제조한 염색체 DNA, DNA 프라이머, 퍼킨엘머사제 Thermal Cycler(GeneAmp PCR system 9600), Phyrococcus sp. KOD주 유래 DNA 폴리머라제(토요보 사제) 및 이에 첨부된 완충용액을 이용하여 PCR을 행하였다. PCR은 94℃-30 초, 60℃-30초, 74℃-60초의 반응을 한 사이클로 하여 30사이클 수행하였다. 증폭된 약 1.5kb의 DNA를 PCR 산물 프리시퀀싱 키트(Perkin-Elmer 사제)를 이용하여 96℃-10초, 50℃-5초, 60℃-4분의 반응을 한 사이클로 하여 25사이클시퀀스 반응을 행하고, ABI프리즘 377 DNA 시퀀싱 시스템(Perkin-Elmer 사제)로 염기서열을 결정하였다.
AEC11주 유래의 변이형 AK유전자의 염기서열 및 반응하는 ORF(open reading frame)의 아미노산서열을 서열번호 17 및 18에 나타내었다. 서열번호 17에 표시된 변이형 AK유전자의 염기서열의 932번째 티민이 야생형 AK유전자에서는 시토신이었다. 전기 염기치환에 의하여 야생형 AK의 311번째의 L-트레오닌잔기(코돈 ACC)가 ACC11주 유래 AK유전자에서는 이소류신잔기(코돈 ATC)으로 치환되어 있다. 코리네박테리움 글루타미컴의 AK유전자의 탈감작변이로는 Ala279의 Ala이외의 아미노산에의 변이(특개평 6-62866, 특개평 6-261766), Gly345Asp(참조: Journal of Bacteriology, 175:4096, 1993), Ser301Tyr(참조: Molecular Microbiology 5:1197, 1991), Ser301Phe, Thr308IIe(모두 특개평 6-261766) 등의 보고가 있지만, 본 변이는 그 어느 것에도 해당되지 않는다.
실시예 3: 변이형 AK유전자의 클로닝과 코리네형 세균에의 도입
상기 변이의 L-리신 생산성에의 영향을 이하의 방법으로 평가하였다.
코리네박테리움 글루타미컴 야생형주(ATCC13032) 및 L-리신 생산균 AEC11주 를 PCR법으로 AK유전자를 클로닝하였다. 실시에 2와 마찬가지 방법으로 수득된 ATCC13032주 유래 또는 AEC11주 유래 AK유전자를 포함하는 약 1.5kb의 유전자 단편을 SalI, BamHI(타카라슈조 사제)으로 처리한 후, 아가로스 전기영동으로 확인하고, 겔로부터 분리하여 Gene Clean Kit(BIO 101 사제)로 정제하였다.
실시예 1에서 표시된 Escherichia coli와 코리네형 세균 중 쌍방으로 자율 증식이 가능한 셔틀벡터 PcS299P를 SalI, BamHI으로 절단하고, 라이게이션 키트 ver. 1(타카라슈조 사제)를 이용하여 Escherichia coli DH5α주(토요보 사제)를 첨부된 매뉴얼에 따라서 형질전환한 후, 암피실린 100㎍/ml을 포함하는 LB 한천배지에서 생육하는 콜로니를 분리하였다. 이들 콜로니를 배양하고, 실시예 1과 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 제작하였다. 실시예 2에 나타낸 방법으로 염기서열을 결정하고, PCR과정에서의 변이를 포함하지 않는 클론을 선정하였다. 전기 선정하여 수득된 ATCC13032주 유래 AK유전자를 포함하는 플라스미드 중 하나를 pAK1, AEC11주 유래 AK유전자를 포함하는 플라스미드를 pAK2라 명명하였다.
실시예 4: 코리네박테리움 글루타미컴의 야생형 AK와 변이형 AK의 효소해석
코리네박테리움 글루타미컴 야생형주 ATCC13032에 플라스미드 pAK1, pAK2 및 pCS299P를 전기천공법(참조: FEMS Microbiology Letters, 65:299, 1989)으로 각각 도입하였다. 수득된 플라스미드 pAK1을 가지고 있는 주를 Tf-14, pAK2를 가지고 있는 주를 Tf-5, pCS299P를 가지고 있는 주를 Tf-21로 명명하였다. 이들 형질전환 체의 AK활성을 포레티 등의 방법으로(참조: Journal of Bacteriology, 175:4096, 1993) 측정하였다.
표 1에 형질전환체의 일차 추출액의 AK비활성을 나타내었다.
AK유전자를 포함하는 플라스미드의 도입주(Tf-14 및 Tf-5)에서는 벡터 도입주(Tf-21)에 비교하여 AK비활성이 약 6배로 증대하는 것이 나타났다. Tf-5는 L-리신과 L-트레오닌에 의한 협동저해를 받지 않을 뿐 아니라, L-리신에 의한 피드백저해도 거의 받지 않는다.
Tf-5는 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 평성 11년 4월 2일자로 수탁번호: FERM BP-6689로 기탁되어져 있다.
표 1
| 균주 | AK비활성(nmol Aspartyl-Hydroxamate/mg-protein/min) | ||||||
| L-Lys | L-Thr | L-Lys+L-Thr | |||||
| 무첨가 | 1mM | 10mM | 1mM | 10mM | 각 1mM | 각 10mM | |
| Tf-21 | 2.8 | ||||||
| Tf-14 | 17.3 (100) | 16.5 (96) | 9.7 (56) | 23.1 (133) | 24.3 (140) | 4.8 (28) | 1.2 (7) |
| Tf-5 | 16.7 (100) | 16.7 (100) | 15 (89) | 30.9 (185) | 35.8 (215) | 18.2 (109) | 18.4 (110) |
괄호안은 무첨가시의 비활성을 100으로 하여 상대적인 활성치(%)를 나타낸다.
실시예 5: 코리네박테리움 글루타미컴에서 변이형 AK의 L-리신생산능의 효과
실시예 4에서 만들어진 Tf-5, Tf-14 및 Tf-21의 L-리신 생산능을 배양평가하 였다. 각 균주를 종배지(슈크로스 50g, 대두가수분해물 30g, 요소 3g, 펩톤 20g, 카자미노산 20g, 고기엑기스 20g, 황산마그네슘7수화물 0.5g, 인산이수소일칼륨 2g, 황산암모늄 8g, 티아민염산염 1mg, 비오틴 0.1mg, 판토텐산칼슘 10mg, 황산제일철7수화물 10mg, 황산아연7수화물 1mg, 니코틴산 20mg 및 탄산칼슘 10g을 물 1L에 넣는고, pH를 7.2로 조정) 5ml에 접종하고, 30℃에서 16시간 진탕배양하였다.
전기 배양으로 수득된 종배양액 1ml을 본배양배지(폐당밀 200g, 황산암모늄 45g, 요소 1g, 인산이수소칼륨 0.5g, 황산마그네슘7수화물 0.5g, 비오틴 0.3mg 및 탄산칼슘 30g을 물 1L에 넣고, pH는 7.0로 조정) 10ml에 접종하고, 30℃에서 72시간 진탕배양하였다. 배양종료시의 플라스미드 보유율을 플라스미드의 약제내성 마커인 카나마이신의 내성을 표지로 측정한 결과, 모두 거의 100%의 높은 안정성을 나타내었다.
고속액체 크로마토그래피로 배지 중에서 축적된 L-리신을 정량하고, 그 결과는 표 2에 나타내었다. 표 2에서 보듯이, 본발명의 변이형 AK유전자의 도입하여 L-리신 생산능이 현저하게 향상되었다.
표 2
| 균주 | L-리신 생산성(g/L) |
| Tf-21 | 0.1 |
| Tf-14 | 0.1 |
| Tf-5 | 8.1 |
본발명에 의하면, 코리네형 세균에 있어서 L-리신 생합성의 핵심 효소인 AK 를 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동 피드백저해 및 리신 단독의 피드백저해를 받지 않는 탈감작형으로 만들어, L-리신의 생산에 유리하게 만들 수 있다.
서열표 프리텍스트
서열번호 1: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 2: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 3: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 4: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 5: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 6: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 7: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 8: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 9: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 10: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 11: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 12: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 13: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 14: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 15: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
서열번호 16: 인공서열의 설명 - 합성 DNA
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
<120> Novel Desensitized Aspartokinase
<130> FP0147/SIKs/JP
<150> JP 99/110437
<151> 1999-04-19
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<213> Corynebacterium glutamicum
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Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
Claims (24)
- 코리네형 세균으로부터 유래되었으며, 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가지고, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동(concerted) 피드백저해를 받지 않는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA.
- 삭제
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- 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 가지는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA.
- 제 13항에 있어서,서열번호 17에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는DNA.
- 제 1항에 있어서,코리네형 세균은 코리네박테리움속 및 브레비박테리움속으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 속에 속하는 것을 특징으로 하는DNA.
- 제 1항 및 제 13항 내지 제 15항의 어느 한 항의 DNA를 벡터에 삽입하여 수득되는 코리네형 세균으로 복제가능한 재조합 DNA.
- 제 1항 및 제 13항 내지 제 15항의 어느 한 항의 DNA를 염색체 상에서 가지는 코리네형 세균.
- 제 16항의 재조합 DNA를 포함하는 코리네형 세균에 속하는 형질전환체.
- 제 18항에 있어서,코리네박테리움 글루타미컴 Tf-5(FERM BP-6689)인 것을 특징으로 하는형질전환체.
- 제 17항의 코리네형 세균, 제 18항 및 제 19항의 형질전환체로부터 선택되는 미생물 또는 형질전환체를 배지에서 배양하고, 배양물 중에서 L-리신을 생성, 축적시키며, 전기 배양물로부터 L-리신을 수득하는 것을 특징으로 하는 L-리신의 제조방법.
- 제 1항, 제 13항 내지 제 15항의 어느 한 항의 DNA로 암호화되는 아스파르토키나아제.
- 제 21항에 있어서,서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는아스파르토키나아제.
- (1) 코리네형 세균에 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 가지는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA 또는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가지고, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동(concerted) 피드백저해를 받지 않는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA를 도입하는 단계;(2) 상기 (1)의 DNA와 코리네형 세균의 염색체 DNA와의 사이에서 상동재조합을 일으키는 단계; 및,(3) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 가지는 아스파르토키나아제, 또는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가지고, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동 피드백저해를 받지 않는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA를 그 염색체 상에서 가지는 코리네형 세균을 선택하는 단계를 포함하는, 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 가지는 아스파르토키나아제, 또는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열의 311번째 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가지고, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 협동 피드백저해를 받지 않는 아스파르토키나아제를 암호화하는 DNA를 그 염색체 상에서 가지는 코리네형 세균의 제조방법.
- 제 23항의 방법에 의하여 제조된 코리네형 세균을 배지에 배양하고, 배양물 중에서 L-리신을 생성, 축적시키고, 전기 배양물로부터 L-리신을 수득하는 것을 특징으로 하는 L-리신의 제조방법.
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