DE10210527A1

DE10210527A1 - Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien

Info

Publication number: DE10210527A1
Application number: DE10210527A
Authority: DE
Inventors: Brigitte Bathe; Caroline Kreutzer; Stephan Hans
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-03-09
Filing date: 2002-03-09
Publication date: 2003-09-18
Also published as: KR20040094771A; EP1483382A1; BR0308255A; CN1633497A; AU2003210415A1; US7083942B2; WO2003076611A1; US20030228678A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Allele aceA-Gens aus coryneformen Bakterien, kodierend für Isocitrat-Lyasen, und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.

Description

Gegenstand der Erfindung sind Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien kodierend für Varianten der Isocitrat-Lyase und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.

Stand der Technik

Die Aminosäure L-Lysin findet in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S-(2-Aminoethyl)-L-Cystein (AEC).

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure- Produktion untersucht.

Die Nukleotidsequenz des für die Isocitrat-Lyase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung WO 01/00844 als Sequenz Nr. 591 und als Sequenz Nr. 589 sowie der Patentanmeldung US-A-5,439,822 als Sequenz Nr. 3 entnommen werden.

Weiterhin kann die Nukleotidsequenz des für die Isocitrat- Lyase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens der Patentanmeldung EP-A-1108790 als Sequenz Nr. 3489 und als Sequenz Nr. 7067 sowie der Patentanmeldung US-A-5,700,661 als Sequenz Nr. 3 entnommen werden.

Die Nukleotidsequenz ist ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummern (accession number) X75504, AX065465, AX065463, I86191, I13693, AX127151, AX123573 und L28760 hinterlegt.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Lysin bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Gegenstand der Erfindung sind aus coryneformen Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum stammende für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenzen (DNA), wobei die zugehörigen Aminosäuresequenzen in der SEQ ID No. 2 an Position 332 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine aus coryneformen Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum stammende für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz (DNA), wobei die zugehörige Aminosäuresequenz an Position 332 L-Threonin enthält, dargestellt in der SEQ ID No. 4.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine aus coryneformen Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum stammende für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz (DNA), deren Basensequenz an der Position 994 Adenin enthält, dargestellt in SEQ ID No. 3.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Plasmide (Vektoren), die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien replizieren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin coryneforme Bakterien, die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten und in denen die für die Isocitrat-Lyase kodierenden Nukleotidsequenzen gegebenenfalls überexprimiert vorliegen, wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen an Position 332 von SEQ ID No. 2 eine andere proteinogene Aminosäure Enthalten ist.

Unter Überexpression versteht man eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität der erfindungsgemäßen Isocitrat-Lyasen.

Durch die Maßnahmen der Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 50%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Zur Erhöhung der Kopienzahl der erfindungsgemäßen aceA- Allele eignen sich Plasmide, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold- Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.

Weiterhin kann zur Erhöhung der Kopienzahl das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation angewendet werden, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen bzw. Allel in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994); US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., Journal of Bac teriology 173: 4510-4516 (1991)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen bzw. Allel enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens bzw. Allels.

Gegenstand der Erfindung sind aus coryneformen Bakterien stammende, für das Enzym Glucokinase kodierende, replizierbare, bevorzugt endogene Nukleotidsequenzen (DNA), wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an Position 332 von SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt wird, insbesondere L- Threonin, dargestellt in SEQ ID No 4. Gegenstand der Erfindung sind ebenso aus coryneformen Bakterien stammende, für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare, bevorzugt endogene Nukleotidsequenzen (DNA), deren zugehörige Basensequenz an der Position 994 Adenin enthält, dargestellt in SEQ ID No. 3.

Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen oder Allele.

Die Erfindung betrifft ebenso Vektoren (Plasmide) die die genannten Nukleotidsequenzen enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien replizieren.

Beansprucht werden auch coryneforme Bakterien, in denen die genannten Nukleotidsequenz(en) gemäß Enzym Isocitrat-Lyase kodierenden Nukleotidsequenzen, bevorzugt überexprimiert vorliegen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditive, bei dem man im allgemeinen folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation coryneformer Bakterien, die für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende endogene Nukleotidsequenzen enthalten, wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an der Position 332 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist, bevorzugt L-Threonin.
Gegebenenfalls werden die Allele des endogenen Isocitrat-Lyase-Gens werden unter Bedingungen überexprimiert, die für die Bildung des Enzyms Glucokinase geeignet sind.
b) Anreicherung des L-Lysins in der Fermentationsbrühe,
c) Isolierung des L-Lysins oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls
d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%).

Unter proteinogenen Aminosäuren sind sämtliche Aminosäuren zu verstehen, die Bestandteile von Proteinen beziehungsweise Polypeptiden sind. Insbesondere sind dies: L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L- Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L- Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin.

Die Wildform des aceA-Gens ist in Wildtypstämmen coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium enthalten. Die Sequenz des Wildtypgens von Corynebacterium glutamicum ist in der SEQ ID No. 1 dargestellt. Das Wildtyp-Protein ist in der SEQ ID No. 2 dargestellt.

Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die in der Fachwelt bekannte Art Corynebacterium glutamicum zu nennen. Bekannte Wildtypstämme der Art Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutainicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERN BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen aceA-Allele, die für Varianten der Isocitrat-Lyase, gekennzeichnet durch einen Aminosäureaustausch an Position 332 der SEQ ID No. 2, kodieren, werden im Stand der Technik beschriebene Mutagenesemethoden verwendet.

Für die Mutagenese können klassische in-vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht verwendet werden.

Weiterhin können für die Mutagenese in-vitro Methoden wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet werden.

Weitere Anleitungen zur Erzeugung von Mutationen können dem Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Bei Verwendung von in-vitro Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene aceA-Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, gegebenenfalls in geeignete Plasmidvektoren kloniert, und die DNA anschließend dem Mutageneseverfahren unterworfen.

Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). Geeignete aceA- Allele werden anschließend mit den oben beschriebenen Verfahren ausgelesen und untersucht.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues für eine Variante der Isocitrat-Lyase kodierendes aceA-Allel, das in SEQ ID No. 3 dargestellt ist.

Die erfindungsgemäßen aceA-Allele können durch das Verfahren des Genaustausches ("gene replacement"), wie es bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) beschrieben ist, in geeignete Stämme überführt werden. Das entsprechende aceA Allel wird hierbei in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor wie beispielsweise pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)) oder pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"- Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verwendung der erfindungsgemäßen aceA-Allele gleichzeitig eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

So kann für die Herstellung von L-Lysin zusätzlich zur Verwendung der erfindungsgemäßen Allele des aceA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- das für die Enolase kodierende Gen eno (DE: 199 47 791.4),
- das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661, EP-A-1108790),
- das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609, EP-A-1108790),
- das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- das für das Lysin-Export-Protein kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
- das für die 6-Phosphogluconate Dehydrogenase kodierende Gen gnd (WO 01/71012),
- das für eine Untereinheit der Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen opcA (Sequenz Nr. 79 aus WO 01/00844; WO 01/04322),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Die Verstärkung der 6-Phosphogluconate Dehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Prolin gegen L- Serin, L-Leucin, L-Isoleucin oder L-Threonin an Position 158 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L- Serin durch L-Phenylalanin oder L-Tyrosin an Position 361 des Enzymproteins erreicht werden.

Die Verstärkung der Untereinheit der Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase, für welche das Gen opcA kodiert, kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Serin gegen L-Phenylalanin oder L-Tyrosin an Position 312 des Enzymproteins erreicht werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Allele des aceA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09ß96,478, DSM 12969),
- das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
- das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113),
- das für die Fructose-1,6-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda (Accession No. X17313; von der Osten et al., Molecular Microbiology 3 (11), 1625-1637 (1989)),
- das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A-0131171),
- das für die Homoserin-Kinase kodierende Gen thrB (Peoples, O. W., et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72) und
- das für die Phosphofruktokinase kodierende Gen pfkB (Sequenz Nr. 57 aus WO 01/00844),

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Die Abschwächung der Phosphofruktokinase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Leucin gegen L-Alanin, L-Glycin oder L- Prolin an Position 109 des Enzymproteins erreicht werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.

Die Konzentration von L-Lysin kann gegebenenfalls durch den Zusatz von L-Lysin auf den gewünschten Wert eingestellt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Aus coryneformen Bakterien stammende für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenzen (DNA), wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an Position 332 von SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt wird.

2. Aus coryneformen Bakterien stammende für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz (DNA) gemäß Anspruch 1, wobei die zugehörige Aminosäuresequenz an Position 332 L-Threonin enthält, dargestellt in der SEQ ID No. 4.

3. Aus coryneformen Bakterien stammende für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz (DNA) gemäß Anspruch 1, deren Basensequenz an der Position 994 Adenin enthält, dargestellt in SEQ ID No. 3.

4. Plasmide (Vektoren), die die Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien replizieren.

5. Coryneforme Bakterien, die Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 enthalten und in denen die für die Isocitrat-Lyase kodierenden Nukleotidsequenzen bevorzugt überexprimiert vorliegen.

6. Coryneforme Bakterien, die für Isocitrat-Lyase kodierende Nukleotidsequenzen enthalten, wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an der Position 332 von SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist.

7. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditiven, bei dem man folgende Schritte durchführt (comprising):

a) Fermentation coryneformer Bakterien, in denen Allele des endogenen aceA-Gens überexprimiert werden unter Bedingungen, die für die Bildung des aceA-Genprodukts Isocitrat-Lyase geeignet sind, und

b) Isolieren des L-Lysins oder des L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, wobei die coryneformen Bakterien das L-Lysin bilden, gegebenenfalls

c) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> bis 100%).

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, die Allele des aceA-Gens enthalten, wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an Position 332 von SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges des L- Lysins überexprimiert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Lysins verringern.

11. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditiven, bei dem man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation coryneformer Bakterien, die für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende endogene Nukleotidsequenzen enthalten, wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an der Position 332 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist, bevorzugt L-Threonin,

b) gegebenenfalls Anreicherung des L-Lysins in der Fermentationsbrühe,

c) Isolieren des L-Lysins oder des L-Lysin enthaltenden Futtermitaeladditivs aus der Fermentationsbrühe, wobei die coryneformen Bakterien das L-Lysin bilden, gegebenenfalls

d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%).

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende endogene Nukleotidsequenzen überexprimiert unter Bedingungen, die für die Bildung des aceA-Genprodukts Isocitrat-Lyase geeignet sind.