JP3473042B2

JP3473042B2 - 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP3473042B2
Application number: JP10145093A
Authority: JP
Inventors: 雅一杉本; 由理尾川; 智子鈴木; 朗子田中; 裕松井
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-04-28
Filing date: 1993-04-27
Publication date: 2003-12-02
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: DE69332805D1; DE69332805T2; JPH0662866A; US5688671A; ES2191680T3; WO1994025605A1; EP0699759A1; DK0699759T3; EP0699759B1; EP0699759A4; ATE235555T1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アミノ酸などの発酵生
産に用いられているコリネバクテリウム属細菌由来の新
規なアスパルトキナーゼ及び該酵素をコードするＤＮＡ
断片に関し、また、該ＤＮＡ断片を含有する組み換えＤ
ＮＡに関する。さらに本発明は、該組み換えＤＮＡを保
有するコリネバクテリウム属細菌に関し、該微生物を培
養することを特徴とするＬ−リジンの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】飼料添加物として用いられているＬ−リ
ジンは通常、コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使
って発酵法により生産されている。現在知られている種
々のＬ−リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変
異により作られている。この様な人工変異株としては次
の様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システ
イン（以下、AECと略記する）耐性変異株、その成長に
Ｌ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公
昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、
更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ
−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン
等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号
及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラ
クタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン
酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイル
ロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ
酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵
素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50
-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特
開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、
特開昭55-9759号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778
号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イノシト
ールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開
昭55-9784号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸
または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン
生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、
エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産す
るブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の
生産変異株（米国特許出願第333455号）。

【０００３】さらに、先行技術には組み換えベクターを
用いて形質転換されたエシェリヒア・コリ株が開示さ
れ、この株はアミノ酸の生産を増加する（米国特許第42
78765号参照）。

【０００４】一方、ブレビバクテリウム属及びコリネバ
クテリウム属においては菌体内で自律増殖可能でかつ、
薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラスミド
（米国特許願第386980号参照）、遺伝子の菌体への導入
方法（特開平2-207791号等）が開示されており、これら
の技術を用いたＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシン
生産菌育成の可能性が開示されている（米国特許願3763
96号、及び第392145号参照）。また、Ｌ−リジン生産菌
育成に関しても、ベクタープラスミドにＬ−リジン生合
成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅させる技
術（特開昭56-160997号などがある）があるが、遺伝子
をアスパルトキナーゼ（以下ＡＫと記す）と特定し、か
つ、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンによるフィードバ
ック阻害が実質的に解除するようなＡＫ遺伝子上の変異
点を明示し、かつその変異がＬ−リジンの生産性と直接
に関与することを明示した例はない。また、変異型ＡＫ
遺伝子の記載がある例でも、変異型ＡＫ遺伝子を安定な
プラスミドとして保持させることができていない（Crem
er,J. et al;Applied and Environmental Microbiolog
y,June 1991,p.1746-1752参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、コリ
ネバクテリウム属細菌の微生物中のリジン生合成の重要
な酵素であるＡＫをＬ−リジン及びＬ−スレオニンによ
るフィードバック阻害、さらにリジン単独によるフィー
ドバック阻害を解除した性質のものに改質し、かつその
活性を上昇させることにより、Ｌ−リジンの生成・分泌
速度が高まったものに改良することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、コリネバクテリウム属細菌より変異型ＡＫ遺伝子
を取得することに成功し、本発明を完成させた。すなわ
ち本願発明は、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列
あるいは配列番号４記載アミノ酸配列の 279番目のThr
残基が Ala以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に
変化した配列を有する、コリネバクテリウム属細菌由来
でありＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフ
ィードバック阻害が実質的に解除されるアスパルトキナ
ーゼαサブユニット蛋白質及び該蛋白質をコードするＤ
ＮＡ断片である。また本願発明は、配列表の配列番号６
記載のアミノ酸配列あるいは配列番号６記載アミノ酸配
列の 30番目のThr残基が Ala以外かつ酸性アミノ酸以外
のアミノ酸残基に変化した配列を有する、コリネバクテ
リウム属細菌由来でありＬ−リジン及びＬ−スレオニン
による相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除され
るアスパルトキナーゼβサブユニット蛋白質及び該蛋白
質をコードするＤＮＡ断片である。さらに本願発明は、
上記ＤＮＡ断片を含有し、コリネバクテリウム属の微生
物中で複製可能な組み換えＤＮＡ、及び該組み換えＤＮ
Ａが、コリネバクテリウム属の微生物に導入されて得ら
れるアスパルトキナーゼ比活性が親株の２−２０倍に上
昇し、かつアスパルトキナーゼ活性のＬ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害あるい
はＬ−リジン単独によるフィードバック阻害が実質的に
解除された形質転換体である。本願発明は、上記形質転
換体を好適な培地にて培養し、生じたＬ−リジンを分離
することを特徴とするＬ−リジンの製造法である。

【０００７】本発明にいうコリネバクテリウム属の微生
物とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイ
ティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determ
inative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗
酸性，胞子形成能を有しない桿菌である。また本発明に
いうコリネバクテリウム属の微生物とは、従来ブレビバ
クテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウ
ム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌を
含み、またコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブ
レビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネバク
テリウム属（ブレビバクテリウム属）の微生物のうち特
に以下に述べるようなコリネバクテリウム属（ブレビバ
クテリウム属）のグルタミン酸生産性細菌が本発明にお
いては、最も好ましいものである。さらに、ミクロバク
テリウム属細菌の中にもグルタミン酸を蓄積するものが
知られており、これらも本願発明において使用可能であ
る。

【０００８】コリネバクテリウム属（ブレビバクテリウ
ム属）のグルタミン酸生産性細菌の野性株の例としては
次のようなものがあげられる。コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５８０６コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０（ブレビバクテリウム・ディバリカタム）ＡＴＣＣ１４０２０（ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５ブレビバクテリウム・サッカロリティクムＡＴＣＣ１４０６６ブレビバクテリウム・インマリオフィルムＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１３８２６ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４

【０００９】本発明のコリネバクテリウム属（ブレビバ
クテリウム属）のグルタミン酸生産性細菌には上記のよ
うなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタ
ミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失っ
た変異株も含まれる。

【００１０】ＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片の供与菌とし
て野生株を用いた場合、野生型のＡＫ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が取得できる。また、Ｌ−リジン及びＬ−スレオ
ニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除
されたＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得するには、Ａ
Ｋ活性に対するＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相
乗的なフィードバック阻害が実質的に解除された変異株
を用いることによって取得することができる。該変異株
は、例えば、通常の変異処理法、紫外線照射またはＮ−
メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴ
Ｇ）等の変異剤処理を施した細胞群の中から取得するこ
とができる。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The
Journal of Biochemistry(1968)63(2),139-148に記載
される方法を用いることができる。

【００１１】ＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片の供与菌とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム）野生株ATCC13869及
びATCC13869株より変異処理により誘導されたＬ−リジ
ン生産菌AJ3463（FERMP-1987）が最も好ましい供与菌で
ある。これらの菌の染色体ＤＮＡより野生型ＡＫ遺伝
子、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的な
フィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキ
ナーゼをコードする遺伝子（以下変異型ＡＫ遺伝子と記
す）を分離し、コリネバクテリウム属（ブレビバクテリ
ウム属）細菌中で自律増殖可能なベクターに連結し、コ
リネバクテリウム属（ブレビバクテリウム属）細菌細胞
に導入する。

【００１２】ＡＫ遺伝子を単離する方法は、コリネバク
テリウム属細菌のＡＫ遺伝子を有している株より、まず
染色体遺伝子を抽出し（例えば H.Saito and K.Miura B
iochem.Biophys.Acta 72,619,(1963)の方法が使用でき
る。）、これを適当な制限酵素で切断する。ついで、コ
リネバクテリウム属細菌細胞内で増殖し得るベクターに
接続し、得られた組み換えベクターを用いてコリネバク
テリウム属の微生物のＡＫ欠損変異株を形質転換せし
め、ＡＫ生成活性を保有するにいたった菌株を単離し、
これよりＡＫ遺伝子を分離できる。ＡＫ欠損変異株の誘
導方法は、上記ＡＫ活性に対するＬ−リジン及びＬ−ス
レオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に
解除された変異株の誘導方法と同様にして行うことがで
きる。

【００１３】染色体遺伝子を切断するために、切断反応
時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類
の制限酵素が使用できる。

【００１４】本発明にて使用されうるベクターは、コリ
ネバクテリウム属細菌細胞内において増殖し得るもので
あればどのようなものでも良い。具体的に例示すれば、
以下のものがあげられる。（１）ｐＡＭ３３０特開昭５８−６７６９９参照（２）ｐＨＭ１５１９特開昭５８−７７８９５参照（３）ｐＡＪ６５５特開昭５８−１９２９００参照（４）ｐＡＪ６１１同上（５）ｐＡＪ１８４４同上（６）ｐＣＧ１特開昭５７−１３４５００参照（７）ｐＣＧ２特開昭５８−３５１９７参照（８）ｐＣＧ４特開昭５７−１８３７９９参照（９）ｐＣＧ１１同上

【００１５】ベクターの開裂は、当該ＤＮＡを一箇所で
切断する制限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断
する制限酵素を用いて部分的に切断することにより行
う。

【００１６】ベクターは、染色体遺伝子を切断した際に
用いられた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮ
Ａ切断フラグメント及び切断されたベクターのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでベクターと染色体ＤＮＡフラグ
メントとのライゲーション反応に付される。

【００１７】このようにして得られた、染色体ＤＮＡと
ベクターとが連結された組み換えＤＮＡをコリネバクテ
リウム属細菌に属する受容菌へ導入するには、エシェリ
ヒア・コリＫ−１２について報告されている様な（Mand
el,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法、またはバチルス・ズブチリスについて報告されてい
る様に（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gen
e,1,153(1977)）細胞がＤＮＡを取り込み得る様に増殖
段階（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法によ
り可能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線
菌類および酵母について知られている様に（Chang,S.an
d Choen,S.N.,Molec.Gen.,Genet.,168.111(1979);Bibb,
M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(197
8);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,75 1929(1978)）、ＤＮＡ受容菌を、組み換
えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストにして組み換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入
することも可能である。

【００１８】プロトプラスト法では上記のバチルス・ズ
ブチリスにおいて使用されている方法でも充分高い頻度
を得ることができるし、特開昭５７−１８３７９９に記
載されたコリネバクテリウム属のプロトプラストにポリ
エチレングリコールまたはポリビニルアルコールと二価
金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビニ
ルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、
デキストラン、フィコール、ブルロニックＦ６８（セル
バ社）などの添加によってＤＮＡのとり込みを促進させ
る方法でも同等の結果が得られる。

【００１９】あるいはＡＫ遺伝子の取得は、上記のよう
にして取得された染色体ＤＮＡよりPCR（polymerase ch
ain reaction；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,18
5(1989)参照）によりＡＫ遺伝子を増幅することによっ
ても行える。増幅に用いるＤＮＡプライマーはＡＫ遺伝
子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の
両3'末端に相補するものを用いる。ＡＫ遺伝子の一部領
域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマー
として全領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子ライブラリーよ
りスクリーニングする必要がある。全領域を増幅した場
合には、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し
た後、目的のバンドを切り出すことによってＡＫ遺伝子
を含有するＤＮＡ断片を回収できる。

【００２０】ＤＮＡプライマーとしては、例えば、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glut
amicum）において既知となっている配列（Molecular Mi
crobiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(199
0)224,317-324参照）を基にして、ＡＫ遺伝子をコード
する約1643bpの領域を増幅すべく、5'-TCGCGAAGTAGCACC
TGTCACTT-3'と5'-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3'という配列
の23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡが最適である。ＤＮＡ
の合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 38
0Bを使用し、ホスホアミダイド法を用いて（Tetrahedro
n Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成でき
る。 PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラ
ー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給
者により指定された方法に従って行うことができる。

【００２１】増幅されたＡＫ遺伝子は、上記したような
コリネバクテリウム属細菌細胞内において増殖し得るベ
クターに接続され、上記したような方法でコリネバクテ
リウム属細菌細胞に導入される。

【００２２】リジンを生産するために、取得されたＡＫ
遺伝子が導入され増幅される宿主としては、上記したコ
リネバクテリウム属グルタミン酸生産性細菌の野生株が
あげられるが、これ以外にも、ここで構築した組み換え
ＤＮＡの複製起点と変異型ＡＫ遺伝子が機能し、組み換
えＤＮＡが複製可能でかつ変異型ＡＫ活性の増強が可能
な菌なら、全て宿主として利用できる。最も好ましい宿
主は、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム）野生型株であるAJ12
036株（FERM-P7559）である。

【００２３】以上の方法で取得した、Ｌ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質
的に解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子
を含有する組み換えＤＮＡを保有する形質転換体を培養
し、培養液に目的のＬ−リジンを生成蓄積せしめ、これ
を採取した。

【００２４】使用するＬ−リジン生産用の培地は、炭素
源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成
分を含有する通常の培地である。

【００２５】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類を用いることができる。

【００２６】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００２７】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応
じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、
マンガンイオン等が少量添加される。

【００２８】培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施
するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐ
Ｈは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。発酵液からの芳香族アミ
ノ酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公
知の方法を組み合わせることにより実施できる。

【００２９】

【実施例】以下、実施例に基づき、発明の内容を詳細に
説明する。

【００３０】（実施例１野生型及び変異型ＡＫ遺伝子
の取得とコリネバクテリウム用プラスミドの作製）コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム）野生株ATCC13869株、及びそれ
より変異処理により得られたＬ−リジン生産性変異株AJ
3463（FERMP-1987）より常法に従い、染色体DNAを調製
した。染色体DNAよりPCR（polymerase chain reactio
n；White,T.J. et a l ;Trends Genet.5,185(1989)参
照）によりＡＫ遺伝子を増幅した。増幅に用いたDNAプ
ライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて
既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)
5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参
照）を基にしてＡＫ遺伝子をコードする約1643bpの領域
を増幅すべく、5'-TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT-3'（配列
番号１５）と5'-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3'（配列番号
１６）という配列の23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合
成した。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ
合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイド法を用
いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法
に従って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡ
サーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラ
ーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝
子増幅を行なった。増幅した1643kbの遺伝子断片をアガ
ロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出
した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造
（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し
た。遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（T
akeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参照）を用い
た。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び
制限酵素EcoRIにて切断し、増幅したＡＫ遺伝子断片と
接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なっ
た。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色体
より増幅されたＡＫ遺伝子断片の接続されたプラスミド
を作製した。野生株であるATCC13869由来のＡＫ遺伝子
を有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌であ
るAJ3463由来のＡＫ遺伝子を有するプラスミドをp399AK
9と命名した。

【００３１】p399AKY、p399AK9に、それぞれコリネバク
テリウム属細菌中でプラスミドを自律増殖可能にする能
力をもつＤＮＡ断片（以下Coryne.-oriと記す）を導入
し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なＡＫ
遺伝子を搭載したプラスミドを作製した。Coryne.-ori
を取得するために、エシェリヒア・コリと、コリネバク
テリウム属細菌の双方の菌体中で自律増殖可能なプラス
ミドベクターpHK4を作成した。エシェリヒア・コリとコ
リネバクテリウム属細菌中の双方で自律増殖可能なプラ
スミドベクターは、いくつか報告がある。ここでは、pA
J1844(特開昭58-216199参照)と、pHSG298(S.Takeshita
et al : Gene 61,63-74(1987)参照)から、新規のシャト
ルベクターpHK4を構築した。pAJ1844を制限酵素Sau3AI
で部分切断し、制限酵素BamHIで完全切断したpHSG298と
連結した。連結後のＤＮＡをコリネバクテリウム・グル
タミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム）AJ12036(FERM-P7559)に形質転換した。形質転換の
方法は、電気パルス法(特開平2-207791参照)を用いた。
形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM
2Gプレート(グルコース5g、ポリペプトン10g、酵母エキス
10g、NaCl5g、DL-メチオニン0.2g、寒天15gを純水1lに含
む。pH7.2)にて行った。形質転換体からプラスミドを調
製し、大きさの最も小さいものを選択し、pHK4と命名し
た。このプラスミドは、エシェリヒア・コリと、コリネ
バクテリウム属細菌中で自律増殖でき、宿主にカナマイ
シン耐性を付与する。

【００３２】pHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）に
て切断し、切断面を平滑末端化する。平滑末端化はDNA
Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方
法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリ
ンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりCoryne.-
ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り
出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切
断し、生じたCoryne.-oriＤＮＡ断片を同じくBamHIにて
切断したp399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウ
ム属細菌中で自律増殖可能でかつＡＫ遺伝子を含むプラ
スミドを作製した。p399AKY由来の野生型ＡＫ遺伝子を
含むプラスミドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変
異型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドをp399AK9Bと命名し
た。p399AK9B、p399AKYB構築の過程を図１に示す。コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム）野生型株であるAJ12036株（FER
M-P7559）に変異型ＡＫプラスミドp399AK9Bを導入した
株AJ12691は、受託番号(FERM-P12918)が付与され通産省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【００３３】（実施例２コリネバクテリウム・グルタ
ミカムの野生型ＡＫ及び変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列の
決定）野生型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドp399AKY及び
変異型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドp399AK9を調製し、
野生型及び変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列の決定を行なっ
た。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et
al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）に
よった。p399AKYにコードされている野生型ＡＫ遺伝子
の塩基配列を配列表の配列番号１に、p399AK9にコード
されている変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列を配列表の配列
番号２に記す。変異型ＡＫ遺伝子は野生型ＡＫと比べ、
１０５１番目のＧがＡに変化しているという１塩基の変
異のみを有する。ＡＫ遺伝子は、同一のＤＮＡ鎖にα、
βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレーム
でコードされていることが知られているが（Kalinowsk
i,Jet al;Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-120
4参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のＤＮＡ
鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディング
フレームでコードされていると考えられる。

【００３４】ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫ
蛋白質のαサブユニットのアミノ酸配列を配列表の配列
番号３に、のβサブユニットのアミノ酸配列を配列表の
配列番号５に示す。ＤＮＡ配列とアミノ酸配列を同時に
示したものは、αサブユニットは配列表の配列番号７
に、βサブユニットは配列表の配列番号９に示す。αβ
各サブユニットのオープンリーディングフレーム部の塩
基配列を配列表の配列番号１１、１３に示す。

【００３５】同様にＤＮＡ塩基配列より推定される変異
型ＡＫ蛋白質のαサブユニットのアミノ酸配列を配列表
の配列番号４に、βサブユニットのアミノ酸配列を配列
表の配列番号６に示す。ＤＮＡ配列とアミノ酸配列を同
時に示したものは、αサブユニットは配列表の配列番号
８に、βサブユニットは配列表の配列番号１０に示す。
αβ各サブユニットのオープンリーディングフレーム部
の塩基配列を配列表の配列番号１２、１４に示す。

【００３６】尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧ
ＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニン
と表記しているが、これは、メチオニン、バリン、また
はフォルミルメチオニンを表すものである。変異型ＡＫ
遺伝子の変異点は、変異型ＡＫ蛋白質がアミノ酸配列に
おいて、αサブユニットにおいて２７９番目のアラニン
がスレオニンに、βサブユニットにおいて３０番目のア
ラニンがスレオニンにというアミノ酸置換を起こしてい
ることを意味する。

【００３７】（実施例３コリネバクテリウム・グルタ
ミカム野生株における変異型ＡＫと野生型ＡＫプラスミ
ドの導入によるＬ−リジン生産能への効果）コリネバク
テリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム）野生型株であるAJ12036株（FERM-P755
9）に野生型ＡＫプラスミドp399AKYB及び変異型ＡＫプ
ラスミドp399AK9Bを各々導入した株を作製した。コリネ
バクテリウムへの遺伝子導入は、電気パルス法によっ
た。宿主のコリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム）AJ12036株、野
生型ＡＫプラスミドを保持するAJ12690株および、変異
型ＡＫプラスミドを保持するAJ12691(FERM-P12918)株の
アスパルトキナーゼ活性を測定した。活性測定は、常法
に従った（Miyajima,R et al;The Journal of Biochemi
stry(1968)63(2),139-148参照）。表１に示す様にＡＫ
プラスミド導入によりＡＫの比活性が約１０〜１５倍に
増大していること、及び変異型ＡＫプラスミド導入株に
ついてのみ、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗
阻害が解除していることを確認した。表１は、コリネバ
クテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム）野生型株AJ12036株、及びそれに野
生型ＡＫプラスミドを保持させたAJ12690株、変異型Ａ
Ｋプラスミドを保持させたAJ12691株の菌体破砕液のア
スパルトキナーゼ比活性、及びそのＬ−リジン及びＬ−
スレオニンによる相乗阻害の程度を表わしたものであ
る。阻害剤のＬ−リジン、及びＬ−スレオニンは各々最
終濃度１ｍＭとなるよう添加した。

【００３８】

【表１】

【００３９】野生株AJ12036、野生型ＡＫプラスミド保
持株AJ12690、変異型ＡＫプラスミド保持株AJ12691(FER
M-P12918)のリジン生産能を培養評価した。培養評価は
リジン生産培地(グルコース100g、(NH₄)₂SO₄55g、KH₂PO₄1
g、MgSO₄・7H₂O1g、大豆蛋白酸加水分解物「豆濃」50ml、Fe
SO₄・7H₂O10mg、MnSO₄・4H₂O 10mg、ニコチン酸アミド5mg、
及びCaCO₃50gを純水1lに含む。pH8.0 )に植菌し、31.5
℃にて72時間往復振とう培養しておこなった。培養後の
培養液中のリジン生成量は表2に示す通りである。変異
型ＡＫプラスミド導入株により、Ｌ−リジン生産能が著
しく向上していることがわかる。また、培養終了時のプ
ラスミド保持率をプラスミドの薬剤耐性マーカーである
クロラムフェニコールの耐性を指標にして測定したが、
ほぼ１００％と極めて高いプラスミドの安定性を示した
（表２）。表２は、コリネバクテリウム・グルタミカム
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）野生型
株AJ12036株、及びそれに野生型ＡＫプラスミドを保持
させたAJ12690株、変異型ＡＫプラスミドを保持させたA
J12691株のＬ−リジンの発酵生産能、及び培養終了時の
プラスミド保持率を測定した結果である。

【００４０】

【表２】

【００４１】（実施例４コリネバクテリウム・グルタ
ミカムの野生型ＡＫ及び変異型ＡＫの酵素解析）ＡＫの
酵素活性を測定、評価するにあたり、宿主としてエシェ
リヒア・コリのＡＫ完全欠損株 Gif106M1 を用いた（Bo
y, E and Patte, J.C., J. Bacteriol.112, 84-92 (197
2), Theze, J. et al., J. Bacteriol.117, 133-143 (1
974)）。コリネバクテリウム属細菌にはＡＫ欠損株が無
いために、宿主のＡＫとプラスミド由来のＡＫが混在し
てしまい、正確に測定できないと考えられたためであ
る。多くのコリネバクテリウム属細菌の遺伝子はエシェ
リヒア・コリ中で発現することが知られており、またこ
のＡＫ遺伝子は pHSG399 上の lac プロモーター下流に
連結されているため、エシェリヒア・コリ中で発現可能
であると予想された。

【００４２】まず Gif106M1 を実施例１で作製した p39
9AKY、p399AK9 で形質転換し、以下に示す最少培地 M9
での生育を相補することを確認した。これによりブコリ
ネバクテリウム属細菌のＡＫがエシェリヒア・コリ菌体
中で発現、機能することを確認した。最少培地 M9 Ａ 20×M9 (g/L) Na₂HPO₄12H₂O 303 KH₂PO₄ 60 NaCl 10 NH₄Cl 20 Ｂ 1M MgSO₄ Ｃ 50％ Glucose Ｄ 1g/L Thiamine 別々に滅菌し、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：水＝5:0.1:1:0.1:95
の割合で混合する。

【００４３】続いてこの菌体より無細胞抽出液を調製
し、ＡＫの酵素活性を測定した。

【００４４】ＡＫの酵素活性を測定する際、酵素反応液
中に種々の濃度のリジンやスレオニンを加え、阻害の度
合を調べた（図２）。その結果、変異型ＡＫは、リジン
単独の阻害は野生型に比べほとんど改善がみられない
が、スレオニンによる阻害は、100％解除され、さらに
若干活性化すること、このスレオニンによる阻害解除の
結果、リジン＋スレオニンの協奏阻害が緩和されている
ことがわかった（ Ki値 0.4mM → 5.0mM ）。

【００４５】（実施例５コリネバクテリウム・グルタ
ミカムの阻害解除型ＡＫ遺伝子の作製）実施例４より変
異型ＡＫはリジンによる単独阻害の解除が不十分である
ことが判明したため、変異を導入しこの性質の改良を行
うことにした。

【００４６】阻害解除型ＡＫ遺伝子の作製方法として
は、部位特異的変異を用い、実施例２で示した変異点（
²⁷⁹Ala→Thr）を他のアミノ酸に置換することにした。
目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法として
はＰＣＲを用いる方法(Higuchi,R.,61,in PCR technolo
gy (Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)))、ファー
ジを用いる方法(Kramer,W. and Frits,H.J.Meth. in En
zymol.,154,350(1987);Kunkel,T.A. et al.,Meth. in E
nzymol.,154,367(1987))などがある。

【００４７】変異によって導入するアミノ酸の種類とし
ては、20種類のアミノ酸を極性や分子構造などの各々の
性質により分類し、代表的なもの８種(Arg,Asp,Cys,Ph
e,Pro,Ser,Tyr,Val)を選んだ。各々の変異点のアミノ酸
変異、及び塩基置換を表３に示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】変異の導入方法としては、変異が導入され
る279番目のAla残基のコドンを目的のアミノ酸残基のコ
ドンに置換した23merの合成ＤＮＡ８種を考案し(Arg 導
入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3'：
配列番号１７、 Asp 導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG
GAT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１８、 Cys 導入用合成
ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TGT GCCAAGGTTT-3'：配列番号
１９、 Phe 導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TTT GCC
AAGGTTT-3'：配列番号２０、 Pro 導入用合成ＤＮＡは
5'-GCCAGGCGAG CCT GCCAAGGTTT-3'：配列番号２１、 Se
r 導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TCT GCCAAGGTTT-
3'：配列番号２２、 Tyr 導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGG
CGAG TAT GCCAAGGTTT-3'：配列番号２３、 Val 導入用
合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG GTT GCCAAGGTTT-3'：配列
番号２４である）、その相補配列と併せて１６種類の 2
3mer 一本鎖ＤＮＡを合成した。たとえばArg残基を導入
する場合、5'-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3'なる配列
を有する一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖一本鎖ＤＮＡ、配列
番号１５の配列を有する一本鎖ＤＮＡ、及び配列番号１
６の配列を有する一本鎖ＤＮＡをプライマーとし、p399
AKYを鋳型にしてPCR 法を行った。非特異的変異の導入
を除くため、作製されたＤＮＡから変異点を含む約280
塩基対を制限酵素（NaeI-AvaII）を用いて切り出し、p3
99AKY の該当部位と置換した。置換した領域については
塩基配列の確認を行った。

【００５０】（実施例６変異型ＡＫ遺伝子８種の酵素
解析）実施例４と同様の方法により、Gif106M1 を実施
例５で得られた各変異型ＡＫ遺伝子を含むプラスミド８
種で形質転換し、無細胞抽出液を調製し、酵素解析を行
った。表４にリジン 5mM、スレオニン 5mM、リジン 5mM
＋スレオニン 5mM 添加時の阻害解除度、比活性を示
す。図３、図４、図５にリジン、スレオニン各濃度添加
時の阻害解除度をグラフで示す。

【００５１】

【表４】

【００５２】Asp のような酸性アミノ酸に変化させた場
合はＡＫは失活したが、その他のいずれのアミノ酸に変
化させた場合もスレオニンによる阻害は解除された。そ
れ以外の性質についてはほぼ４つのグループに分けら
れ、実施例２の変異型（Thr）に類似した変異としては
Val 残基導入変異株、Arg 残基導入変異株がある。Cys
残基導入変異株、Ser 残基導入変異株はリジン単独の阻
害は野生型と同等であるが、協奏阻害になると阻害が強
化される結果となった。これはスレオニンに対する挙動
が、低濃度では活性化されるが、高濃度になると阻害を
受ける山型のグラフとなる特徴的な性質であるために協
奏阻害が強化したと考えられる。芳香族アミノ酸である
Phe 残基導入変異株、Tyr 残基導入変異株のリジン単
独の阻害は野生型よりも強化された。Pro は立体構造に
与える影響が大きいためかPro 残基導入変異株は比活性
が低いが（野生型の約 1/5 ）、リジンの単独阻害は緩
和しており、スレオニンによる活性化の度合も大きくな
っている（120％以上）。そのため協奏阻害も解除され
た。

【００５３】変異導入によってできた酵素の構造の安定
性の指標として、熱安定性の検討を行なった。処理条件
は野生型ＡＫの活性が約 80％になる 55℃ 1.5 時間に
設定した。Cys 残基導入変異株、Thr 残基導入変異株、
Phe 残基導入変異株、Tyr 残基導入変異株、Val 残基導
入変異株は野生型よりも安定性が高く、中でも最も安定
性の高いもは Val 残基導入変異株であった（図６）。

【００５４】（実施例７コリネバクテリウム・グルタ
ミカム野生株における変異型ＡＫ遺伝子８種と野生型Ａ
Ｋ遺伝子含有プラスミドの導入によるＬ−リジン生産能
への効果）実施例３と同様にコリネバクテリウム・グル
タミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム）野生株である AJ12036株（FERM-P7559）に表３に示
す８種のプラスミドを導入した株を作製し、それぞれの
株についてＡＫ活性を測定した。表５に示すように比活
性は宿主の約20〜80倍に増大した。リジン、スレオニン
による阻害解除度は実施例６と同様であり、もっとも阻
害解除度の高いものはPro であり、リジン単独、スレオ
ニン単独、両方による協奏阻害いずれにおいても Thr
の変異型を上回った。

【００５５】

【表５】

【００５６】さらにこれらの９種の株について実施例３
と同様の方法でリジン生産能を培養評価した。培養度の
培養液中のリジン生成量は表６に示す通りである。変異
型ＡＫプラスミド導入によりＬ−リジン生産能が著しく
向上していることがわかる。特に Cys 残基導入変異
株、Ser 残基導入変異株以外の変異では約 25g/lの高い
蓄積を示した。また培養終了時のプラスミド保持率もほ
ぼ 100％と高いプラスミドの安定性を示した。

【００５７】

【表６】

【００５８】

【発明の効果】ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムのＡＫ遺伝子であって、配列番号３のアミノ酸番号
にして 279 位または配列番号５のアミノ酸番号にして
３０位の Ala を酸性アミノ酸以外のアミノ酸に変化さ
せることにより、スレオニンによる阻害が完全に解除
し、その結果リジン＋スレオニンによる協奏阻害の解除
されたＡＫを取得した。特に Pro に変化させることに
より、リジンによる単独阻害が部分的に解除したＡＫを
取得した。同部位を Val、Tyr、Phe に変化させること
により、熱安定性が向上したＡＫを取得した。コリネ型
細菌細胞中でこれら変異型ＡＫの活性を増大させること
により、Ｌ−リジンの生産性を著しく上昇させることが
できた。

【００５９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1643 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC 13869 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号：2 配列の長さ：1643 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG ACTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号：3 配列の長さ：421 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC13869 配列 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 16 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 32 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 48 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 64 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 96 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 112 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 128 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 144 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 176 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 192 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 208 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 224 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 256 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 272 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 288 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 304 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 336 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 352 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 368 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 384 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 416 Ala Gly Thr Gly Arg 421 配列番号：4 配列の長さ：421 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 16 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 32 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 48 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 64 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 96 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 112 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 128 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 144 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 176 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 192 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 208 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 224 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 256 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 272 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 288 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 304 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 336 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 352 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 368 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 384 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 416 Ala Gly Thr Gly Arg 421 配列番号：5 配列の長さ：172 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC13869 配列ＭｅｔＧｌｕＧｌｕＡｌａＶａｌＬｅｕＴｈｒＧｌｙＶａ
ｌＡｌａＴｈｒＡｓｐＬｙｓＳｅｒＧｌｕＡｌａ１６ＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕＧｌｙＩｌｅＳｅｒＡｓ
ｐＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌｕＡｌａＡｌａＬｙｓ３２ＶａｌＰｈｅＡｒｇＡｌａＬｅｕＡｌａＡｓｐＡｌａＧｌ
ｕＩｌｅＡｓｎＩｌｅＡｓｐＭｅｔＶａｌＬｅｕ４８ＧｌｎＡｓｎＶａｌＳｅｒＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｓｐＧｌ
ｙＴｈｒＴｈｒＡｓｐＩｌｅＴｈｒＰｈｅＴｈｒ６４ＣｙｓＰｒｏＡｒｇＡｌａＡｓｐＧｌｙＡｒｇＡｒｇＡｌ
ａＭｅｔＧｌｕＩｌｅＬｅｕＬｙｓＬｙｓＬｅｕ８０ＧｌｎＶａｌＧｌｎＧｌｙＡｓｎＴｒｐＴｈｒＡｓｎＶａ
ｌＬｅｕＴｙｒＡｓｐＡｓｐＧｌｎＶａｌＧｌｙ９６ＬｙｓＶａｌＳｅｒＬｅｕＶａｌＧｌｙＡｌａＧｌｙＭｅ
ｔＬｙｓＳｅｒＨｉｓＰｒｏＧｌｙＶａｌＴｈｒ１１２ＡｌａＧｌｕＰｈｅＭｅｔＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｓ
ｐＶａｌＡｓｎＶａｌＡｓｎＩｌｅＧｌｕＬｅｕ１２８ＩｌｅＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｕＩｌｅＡｒｇＩｌｅＳｅ
ｒＶａｌＬｅｕＩｌｅＡｒｇＧｌｕＡｓｐＡｓｐ１４４ＬｅｕＡｓｐＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｌａＬｅｕＨｉ
ｓＧｌｕＧｌｎＰｈｅＧｌｎＬｅｕＧｌｙＧｌｙ１６０ＧｌｕＡｓｐＧｌｕＡｌａＶａｌＶａｌＴｙｒＡｌａＧｌ
ｙＴｈｒＧｌｙＡｒｇ１７２配列番号：６配列の長さ：172 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala 16 Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys 32 Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu 48 Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr 64 Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu 80 Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly 96 Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr 112 Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu 128 Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp 144 Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly 160 Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 172 配列番号：7 配列の長さ：1643 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ＡＴＣＣ１３８６９配列の特徴：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：217..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234 Met Ala Leu Val Val Gln 1 5 AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val 10 15 20 GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val 25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 285 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu 315 320 325 AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 330 335 340 CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 360 365 370 ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390 GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 421 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643 配列番号：8 配列の長さ：1643 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列の特徴：mat peptide 存在位置：217..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234 Met Ala Leu Val Val Gln 1 5 AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val 10 15 20 GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val 25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270 275 ACT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Thr Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 285 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu 315 320 325 AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 330 335 340 CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 360 365 370 ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390 GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 421 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643 配列番号：9 配列の長さ：1643 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウムク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC13869 配列の特徴：mat peptide 存在位置：964..1482 特徴を決定した方法：Ｓ配列ＴＣＧＣＧＡＡＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＡ
ＴＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＣＧＧＴＣ６０ＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＡＡＣＧＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧ
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ＴＧＣＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＴ３６０ＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＣ
ＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＡＴＧ４２０ＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＡＴＴＴＣＴＡＡＣＧＣＴ
ＣＴＣＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴ４８０ＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧ
ＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＣＧＣＣＡＣ５４０ＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＧＣＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧＴＣＡＣＡＣＣＧＧＧＴ
ＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＣ６００ＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＧＴＴ
ＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＡＣＧ６６０ＴＴＧＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴ
ＧＣＧＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＡＴ７２０ＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧ
ＴＡＴＡＣＣＧＣＴＧＡＣＣＣＧＣＧＣＡＴＣＧＴＴＣＣＴ７８０ＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡ
ＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣ８４０ＴＣＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣ
ＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＣ９００ＧＴＡＣＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＧＴＡＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＣＡＣＴ
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ＧｌｕＩｌｅＡｓｎＩｌｅＡｓｐＭｅｔＶａｌ３５４０
４５ＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＣ
ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＴＴＣ１１５２ＬｅｕＧｌｎＡｓｎＶａｌＳｅｒＳｅｒＶａｌＧｌｕＡｓｐ
ＧｌｙＴｈｒＴｈｒＡｓｐＩｌｅＴｈｒＰｈｅ５０５５
６０ＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＡＣＧＣＣＧＴ
ＧＣＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧ１２００ＴｈｒＣｙｓＰｒｏＡｒｇＡｌａＡｓｐＧｌｙＡｒｇＡｒｇ
ＡｌａＭｅｔＧｌｕＩｌｅＬｅｕＬｙｓＬｙｓ６５７０
７５ＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴ
ＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＧＧＴＣ１２４８ＬｅｕＧｌｎＶａｌＧｌｎＧｌｙＡｓｎＴｒｐＴｈｒＡｓｎ
ＶａｌＬｅｕＴｙｒＡｓｐＡｓｐＧｌｎＶａｌ８０８５
９０９５ＧＧＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＣ
ＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴ１２９６ＧｌｙＬｙｓＶａｌＳｅｒＬｅｕＶａｌＧｌｙＡｌａＧｌｙ
ＭｅｔＬｙｓＳｅｒＨｉｓＰｒｏＧｌｙＶａｌ１００
１０５１１０ＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣ
ＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＡ１３４４ＴｈｒＡｌａＧｌｕＰｈｅＭｅｔＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｒｇ
ＡｓｐＶａｌＡｓｎＶａｌＡｓｎＩｌｅＧｌｕ１１５１２０
１２５ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴ
ＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴ１３９２ＬｅｕＩｌｅＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｕＩｌｅＡｒｇＩｌｅ
ＳｅｒＶａｌＬｅｕＩｌｅＡｒｇＧｌｕＡｓｐ１３０１３５
１４０ＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＴＴＧ
ＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣ１４４０ＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｌａＬｅｕ
ＨｉｓＧｌｕＧｌｎＰｈｅＧｌｎＬｅｕＧｌｙ１４５１５０
１５５ＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＡＴＧＣＡ
ＧＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡ１４９０ＧｌｙＧｌｕＡｓｐＧｌｕＡｌａＶａｌＶａｌＴｙｒＡｌａ
ＧｌｙＴｈｒＧｌｙＡｒｇ１６０１６５
１７０１７２ＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＴ
ＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＧＧＣＣＡＧ１５５０ＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＡＡＴＴＴＣ
ＣＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴ１６１０ＴＣＣＣＣＧＣＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＣＣＧＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣ
１６４３配列番号：10 配列の長さ：1643 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウムク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列の特徴：mat peptide 存在位置：964..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 1 5 10 15 GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG ACT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala 20 25 30 AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val 35 40 45 CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe 50 55 60 ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys 65 70 75 CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val 80 85 90 95 GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val 100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu 115 120 125 TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly 145 150 155 GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 172 AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号：11 配列の長さ：1263 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウムク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC 13869 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTGGCCCTGG TCGTACAGAA ATATGGCGGT TCCTCGCTTG AGAGTGCGGA ACGCATTAGA 60 AACGTCGCTG AACGGATCGT TGCCACCAAG AAGGCTGGAA ATGATGTCGT GGTTGTCTGC 120 TCCGCAATGG GAGACACCAC GGATGAACTT CTAGAACTTG CAGCGGCAGT GAATCCCGTT 180 CCGCCAGCTC GTGAAATGGA TATGCTCCTG ACTGCTGGTG AGCGTATTTC TAACGCTCTC 240 GTCGCCATGG CTATTGAGTC CCTTGGCGCA GAAGCTCAAT CTTTCACTGG CTCTCAGGCT 300 GGTGTGCTCA CCACCGAGCG CCACGGAAAC GCACGCATTG TTGACGTCAC ACCGGGTCGT 360 GTGCGTGAAG CACTCGATGA GGGCAAGATC TGCATTGTTG CTGGTTTTCA GGGTGTTAAT 420 AAAGAAACCC GCGATGTCAC CACGTTGGGT CGTGGTGGTT CTGACACCAC TGCAGTTGCG 480 TTGGCAGCTG CTTTGAACGC TGATGTGTGT GAGATTTACT CGGACGTTGA CGGTGTGTAT 540 ACCGCTGACC CGCGCATCGT TCCTAATGCA CAGAAGCTGG AAAAGCTCAG CTTCGAAGAA 600 ATGCTGGAAC TTGCTGCTGT TGGCTCCAAG ATTTTGGTGC TGCGCAGTGT TGAATACGCT 660 CGTGCATTCA ATGTGCCACT TCGCGTACGC TCGTCTTATA GTAATGATCC CGGCACTTTG 720 ATTGCCGGCT CTATGGAGGA TATTCCTGTG GAAGAAGCAG TCCTTACCGG TGTCGCAACC 780 GACAAGTCCG AAGCCAAAGT AACCGTTCTG GGTATTTCCG ATAAGCCAGG CGAGGCTGCC 840 AAGGTTTTCC GTGCGTTGGC TGATGCAGAA ATCAACATTG ACATGGTTCT GCAGAACGTC 900 TCCTCTGTGG AAGACGGCAC CACCGACATC ACGTTCACCT GCCCTCGCGC TGACGGACGC 960 CGTGCGATGG AGATCTTGAA GAAGCTTCAG GTTCAGGGCA ACTGGACCAA TGTGCTTTAC 1020 GACGACCAGG TCGGCAAAGT CTCCCTCGTG GGTGCTGGCA TGAAGTCTCA CCCAGGTGTT 1080 ACCGCAGAGT TCATGGAAGC TCTGCGCGAT GTCAACGTGA ACATCGAATT GATTTCCACC 1140 TCTGAGATCC GCATTTCCGT GCTGATCCGT GAAGATGATC TGGATGCTGC TGCACGTGCA 1200 TTGCATGAGC AGTTCCAGCT GGGCGGCGAA GACGAAGCCG TCGTTTATGC AGGCACCGGA 1260 CGC 1263 配列番号：12 配列の長さ：1263 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウムク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTGGCCCTGG TCGTACAGAA ATATGGCGGT TCCTCGCTTG AGAGTGCGGA ACGCATTAGA 60 AACGTCGCTG AACGGATCGT TGCCACCAAG AAGGCTGGAA ATGATGTCGT GGTTGTCTGC 120 TCCGCAATGG GAGACACCAC GGATGAACTT CTAGAACTTG CAGCGGCAGT GAATCCCGTT 180 CCGCCAGCTC GTGAAATGGA TATGCTCCTG ACTGCTGGTG AGCGTATTTC TAACGCTCTC 240 GTCGCCATGG CTATTGAGTC CCTTGGCGCA GAAGCTCAAT CTTTCACTGG CTCTCAGGCT 300 GGTGTGCTCA CCACCGAGCG CCACGGAAAC GCACGCATTG TTGACGTCAC ACCGGGTCGT 360 GTGCGTGAAG CACTCGATGA GGGCAAGATC TGCATTGTTG CTGGTTTTCA GGGTGTTAAT 420 AAAGAAACCC GCGATGTCAC CACGTTGGGT CGTGGTGGTT CTGACACCAC TGCAGTTGCG 480 TTGGCAGCTG CTTTGAACGC TGATGTGTGT GAGATTTACT CGGACGTTGA CGGTGTGTAT 540 ACCGCTGACC CGCGCATCGT TCCTAATGCA CAGAAGCTGG AAAAGCTCAG CTTCGAAGAA 600 ATGCTGGAAC TTGCTGCTGT TGGCTCCAAG ATTTTGGTGC TGCGCAGTGT TGAATACGCT 660 CGTGCATTCA ATGTGCCACT TCGCGTACGC TCGTCTTATA GTAATGATCC CGGCACTTTG 720 ATTGCCGGCT CTATGGAGGA TATTCCTGTG GAAGAAGCAG TCCTTACCGG TGTCGCAACC 780 GACAAGTCCG AAGCCAAAGT AACCGTTCTG GGTATTTCCG ATAAGCCAGG CGAGACTGCC 840 AAGGTTTTCC GTGCGTTGGC TGATGCAGAA ATCAACATTG ACATGGTTCT GCAGAACGTC 900 TCCTCTGTGG AAGACGGCAC CACCGACATC ACGTTCACCT GCCCTCGCGC TGACGGACGC 960 CGTGCGATGG AGATCTTGAA GAAGCTTCAG GTTCAGGGCA ACTGGACCAA TGTGCTTTAC 1020 GACGACCAGG TCGGCAAAGT CTCCCTCGTG GGTGCTGGCA TGAAGTCTCA CCCAGGTGTT 1080 ACCGCAGAGT TCATGGAAGC TCTGCGCGAT GTCAACGTGA ACATCGAATT GATTTCCACC 1140 TCTGAGATCC GCATTTCCGT GCTGATCCGT GAAGATGATC TGGATGCTGC TGCACGTGCA 1200 TTGCATGAGC AGTTCCAGCT GGGCGGCGAA GACGAAGCCG TCGTTTATGC AGGCACCGGA 1260 CGC 1263 配列番号：13 配列の長さ：516 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウムク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC 13869 配列 GTGGAAGAAG CAGTCCTTAC CGGTGTCGCA ACCGACAAGT CCGAAGCCAA AGTAACCGTT 60 CTGGGTATTT CCGATAAGCC AGGCGAGGCT GCCAAGGTTT TCCGTGCGTT GGCTGATGCA 120 GAAATCAACA TTGACATGGT TCTGCAGAAC GTCTCCTCTG TGGAAGACGG CACCACCGAC 180 ATCACGTTCA CCTGCCCTCG CGCTGACGGA CGCCGTGCGA TGGAGATCTT GAAGAAGCTT 240 CAGGTTCAGG GCAACTGGAC CAATGTGCTT TACGACGACC AGGTCGGCAA AGTCTCCCTC 300 GTGGGTGCTG GCATGAAGTC TCACCCAGGT GTTACCGCAG AGTTCATGGA AGCTCTGCGC 360 GATGTCAACG TGAACATCGA ATTGATTTCC ACCTCTGAGA TCCGCATTTC CGTGCTGATC 420 CGTGAAGATG ATCTGGATGC TGCTGCACGT GCATTGCATG AGCAGTTCCA GCTGGGCGGC 480 GAAGACGAAG CCGTCGTTTA TGCAGGCACC GGACGC 516 配列番号：14 配列の長さ：516 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：コリネハ゛クテリウムク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：AJ3463 配列 GTGGAAGAAG CAGTCCTTAC CGGTGTCGCA ACCGACAAGT CCGAAGCCAA AGTAACCGTT 60 CTGGGTATTT CCGATAAGCC AGGCGAGACT GCCAAGGTTT TCCGTGCGTT GGCTGATGCA 120 GAAATCAACA TTGACATGGT TCTGCAGAAC GTCTCCTCTG TGGAAGACGG CACCACCGAC 180 ATCACGTTCA CCTGCCCTCG CGCTGACGGA CGCCGTGCGA TGGAGATCTT GAAGAAGCTT 240 CAGGTTCAGG GCAACTGGAC CAATGTGCTT TACGACGACC AGGTCGGCAA AGTCTCCCTC 300 GTGGGTGCTG GCATGAAGTC TCACCCAGGT GTTACCGCAG AGTTCATGGA AGCTCTGCGC 360 GATGTCAACG TGAACATCGA ATTGATTTCC ACCTCTGAGA TCCGCATTTC CGTGCTGATC 420 CGTGAAGATG ATCTGGATGC TGCTGCACGT GCATTGCATG AGCAGTTCCA GCTGGGCGGC 480 GAAGACGAAG CCGTCGTTTA TGCAGGCACC GGACGC 516 配列番号：15 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＴＣＧＣＧＡＡＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴ
２３配列番号：16 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 配列番号：17 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG CGTGCCAAGG TTT 23 配列番号：18 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG GATGCCAAGG TTT 23 配列番号：19 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG TGTGCCAAGG TTT 23 配列番号：20 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG TTTGCCAAGG TTT 23 配列番号：21 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG CCTGCCAAGG TTT 23 配列番号：22 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列ＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＧＧＴＴＴ
２３配列番号：２３配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG TATGCCAAGG TTT 23 配列番号：24 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 GCCAGGCGAG GTTGCCAAGG TTT 23

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、染色体よりＰＣＲにて増幅されたＡＫ
遺伝子断片よりp399AKY、p399AKY、更にBrevi.-oriを導
入してp399AKYB、p399AK9Bを構築する過程を示したもの
である。p399AK9Bはp399AKYBと一塩基の違いがある他は
全く同様な過程を経て構築されているので、一緒に（）
付きで示した。

【図２】図２は野生型と変異型（Thr）ＡＫのリジン、
スレオニン、リジン＋スレオニンによる阻害について調
べたものである。リジン、スレオニン無添加時の活性を
100％とし、添加時の活性を活性保持率（阻害解除度）
として表わした。

【図３】図３は野生型および変異型８種のＡＫのリジン
による阻害の解除度について調べたものである。

【図４】図４は野生型および変異型８種のＡＫのスレオ
ニンによる阻害の解除度について調べたものである。

【図５】図５は野生型および変異型８種のＡＫのリジン
＋スレオニンによる協奏阻害の解除度について調べたも
のである。

【図６】図６は野生型および変異型８種のＡＫの熱安定
性について調べたものである。55℃、90分処理後の活性
保持率を％で表わした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:15） (72)発明者松井裕神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (56)参考文献特開平３−219885（ＪＰ，Ａ) Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，1991, Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．５，ｐ．1197− 1204 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．， 1990，Ｖｏｌ．224，ｐ．317−324 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列
あるいは配列番号４記載アミノ酸配列の２７９番目のＴ
ｈｒ残基がＡｒｇ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ及びＶａｌ
からなる群から選ばれるアミノ酸残基に変化した配列か
らなる、コリネバクテリウム属細菌由来でありＬ−リジ
ン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻
害が実質的に解除されるアスパルトキナーゼαサブユニ
ット蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【請求項２】遺伝子が配列表の配列番号１２記載の塩
基配列からなるものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】請求項１または２に記載されたＤＮＡ断
片を含有し、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可
能な組み換えＤＮＡ。
【請求項４】請求項３に記載された組み換えＤＮＡ
が、コリネバクテリウム属の微生物に導入されて得られ
るアスパルトキナーゼ比活性が親株の２−２０倍に上昇
し、かつアスパルトキナーゼ活性のＬ−リジン及びＬ−
スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害あるいは
Ｌ−リジン単独によるフィードバック阻害が実質的に解
除された形質転換体。
【請求項５】請求項４に記載された形質転換体を好適
な培地にて培養し、生じたＬ−リジンを分離することを
特徴とするＬ−リジンの製造法。
【請求項６】配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列
あるいは配列番号４記載アミノ酸配列の２７９番目のＴ
ｈｒ残基がＡｒｇ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ及びＶａｌ
からなる群から選ばれるアミノ酸残基に変化した配列か
らなるαサブユニット、及び、配列表の配列番号６記載
のアミノ酸配列あるいは配列番号６記載アミノ酸配列の
３０番目のＴｈｒ残基がＡｒｇ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙ
ｒ及びＶａｌからなる群から選ばれるアミノ酸残基に変
化した配列からなるβサブユニットにより構成される、
コリネバクテリウム属細菌由来でありＬ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質
的に解除されるアスパルトキナーゼ蛋白質。