JPH08196280A - コリネホルム細菌由来のシュクラーゼ遺伝子とその利用 - Google Patents
コリネホルム細菌由来のシュクラーゼ遺伝子とその利用Info
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 コリネホルム細菌に由来し、シュクラーゼ活
性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と
コリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターを連結
して得られる組換えＤＮＡを、Ｌ−アミノ酸又は核酸生
産能を有するコリネホルム細菌に導入し、該細菌をシュ
クロースを含む液体培地に培養し、培養液中に生成蓄積
したＬ−アミノ酸又は核酸を採取する。 【効果】 本発明の方法によれば、シュクロース系原料
から短時間に効率的にＬ−アミノ酸又は核酸を製造する
ことができる。
性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と
コリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターを連結
して得られる組換えＤＮＡを、Ｌ−アミノ酸又は核酸生
産能を有するコリネホルム細菌に導入し、該細菌をシュ
クロースを含む液体培地に培養し、培養液中に生成蓄積
したＬ−アミノ酸又は核酸を採取する。 【効果】 本発明の方法によれば、シュクロース系原料
から短時間に効率的にＬ−アミノ酸又は核酸を製造する
ことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−アミノ酸発酵や核
酸発酵に用いられるコリネホルム細菌に由来するシュク
ラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ断片とコリネホル
ム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターが連結して得られ
る組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有するコリネホル
ム細菌、及び該細菌を培養することによるＬ−アミノ酸
又は核酸の製造方法に関する。
酸発酵に用いられるコリネホルム細菌に由来するシュク
ラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ断片とコリネホル
ム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターが連結して得られ
る組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有するコリネホル
ム細菌、及び該細菌を培養することによるＬ−アミノ酸
又は核酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】遺伝子操作技術を用いたＬ−アミノ酸生産
菌の育種については従来より多くの研究がなされてお
り、報告例も多数ある（Biotechnology Letters, Vol.
2, pp.525-530 (1980)、Appl. Environ. Microbiol., V
ol.144, pp.181-190 (1979)、日本農芸化学会昭和56年
度大会講演要旨集, p.8 (1981)など）。しかしながら、
これらはいずれもＬ−アミノ酸生合成系の遺伝子を増強
することによって目的とするＬ−アミノ酸の菌体あたり
の生産性を高めるものであって、発酵原料である糖の資
化性を高めることによって生産効率を高めるものではな
かった。
菌の育種については従来より多くの研究がなされてお
り、報告例も多数ある（Biotechnology Letters, Vol.
2, pp.525-530 (1980)、Appl. Environ. Microbiol., V
ol.144, pp.181-190 (1979)、日本農芸化学会昭和56年
度大会講演要旨集, p.8 (1981)など）。しかしながら、
これらはいずれもＬ−アミノ酸生合成系の遺伝子を増強
することによって目的とするＬ−アミノ酸の菌体あたり
の生産性を高めるものであって、発酵原料である糖の資
化性を高めることによって生産効率を高めるものではな
かった。
【０００３】一方、遺伝子操作技術を用いてＬ−アミノ
酸生産菌の糖の資化性を変化させた報告としては、エシ
ェリヒア・コリにシュクロース資化能を与えた例がある
（特開昭61-119185号及び特開平2-171178号公報参
照）。すなわち、シュクロースを取り込み、それをグル
コース−６−リン酸とフラクトースに分解する活性をエ
シェリヒア・コリに与え、本来エシェリヒア・コリが資
化できないシュクロースを炭素源としてできるようにし
たものである。また、各種Ｌ−アミノ酸生産菌として有
用なコリネホルム細菌については、特開平5-244958号に
おいて、シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺
伝子を含む11.6 Kbpの大きさのＤＮＡ断片を取得したこ
とが記載されているが、コリネホルム細菌内での当該遺
伝子の発現については確認されておらず、シュクロース
を原料とするＬ−アミノ酸や核酸の生産における当該遺
伝子の増幅の効果は明らかでなかった。
酸生産菌の糖の資化性を変化させた報告としては、エシ
ェリヒア・コリにシュクロース資化能を与えた例がある
（特開昭61-119185号及び特開平2-171178号公報参
照）。すなわち、シュクロースを取り込み、それをグル
コース−６−リン酸とフラクトースに分解する活性をエ
シェリヒア・コリに与え、本来エシェリヒア・コリが資
化できないシュクロースを炭素源としてできるようにし
たものである。また、各種Ｌ−アミノ酸生産菌として有
用なコリネホルム細菌については、特開平5-244958号に
おいて、シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺
伝子を含む11.6 Kbpの大きさのＤＮＡ断片を取得したこ
とが記載されているが、コリネホルム細菌内での当該遺
伝子の発現については確認されておらず、シュクロース
を原料とするＬ−アミノ酸や核酸の生産における当該遺
伝子の増幅の効果は明らかでなかった。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コ
リネホルム細菌のシュクロースを資化する能力を増強す
ることによりシュクロースを含む原料から短時間に効率
よくＬ−アミノ酸又は核酸を製造する方法を提供するこ
とである。
リネホルム細菌のシュクロースを資化する能力を増強す
ることによりシュクロースを含む原料から短時間に効率
よくＬ−アミノ酸又は核酸を製造する方法を提供するこ
とである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、コリネホルム
細菌由来のシュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする
遺伝子の構造を明らかにし、当該遺伝子を含むＤＮＡ断
片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターと
の組換えＤＮＡを取得し、Ｌ−アミノ酸又は核酸の生産
能を有するコリネホルム細菌に該組換えＤＮＡを導入し
たところ、当該細菌がシュクロースを含む原料から従来
より短い時間で収率良くＬ−アミノ酸又は核酸を生産で
きることを見いだし、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、コリネホルム
細菌由来のシュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする
遺伝子の構造を明らかにし、当該遺伝子を含むＤＮＡ断
片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターと
の組換えＤＮＡを取得し、Ｌ−アミノ酸又は核酸の生産
能を有するコリネホルム細菌に該組換えＤＮＡを導入し
たところ、当該細菌がシュクロースを含む原料から従来
より短い時間で収率良くＬ−アミノ酸又は核酸を生産で
きることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、(1) コリネホルム細菌由
来で、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子、
(2) 配列表配列番号１に記載の塩基配列の２３３８番目
から３６０９番目に至る塩基配列を有する上記(1)記載
の遺伝子、(3) 上記(1)又は(2)に記載の遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベク
ターが連結されて得られる組換えＤＮＡ、(4) 上記(3)
記載の組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−アミノ酸又は核
酸の生産能を有するコリネホルム細菌、及び、(5) 上記
(4)記載のコリネホルム細菌をシュクロースを含む液体
培地に培養し、培養液中にＬ−アミノ酸又は核酸を生成
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−アミ
ノ酸又は核酸の製造方法、を提供するものである。
来で、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子、
(2) 配列表配列番号１に記載の塩基配列の２３３８番目
から３６０９番目に至る塩基配列を有する上記(1)記載
の遺伝子、(3) 上記(1)又は(2)に記載の遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベク
ターが連結されて得られる組換えＤＮＡ、(4) 上記(3)
記載の組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−アミノ酸又は核
酸の生産能を有するコリネホルム細菌、及び、(5) 上記
(4)記載のコリネホルム細菌をシュクロースを含む液体
培地に培養し、培養液中にＬ−アミノ酸又は核酸を生成
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−アミ
ノ酸又は核酸の製造方法、を提供するものである。
【０００７】本発明にいうコリネホルム細菌とは、Berg
ey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th E
d., p.599 (1974)に記載されているように、好気性のグ
ラム陽性桿菌であり、従来よりコリネバクテリウム属に
分類されている細菌、従来ブレビバクテリウム属に分類
されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合
された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (198
1)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビ
バクテリウム属細菌やミクロバクテリウム属細菌を含む
ものであり、一般にＬ−グルタミン酸生産菌として知ら
れている下記のような微生物である。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
ey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th E
d., p.599 (1974)に記載されているように、好気性のグ
ラム陽性桿菌であり、従来よりコリネバクテリウム属に
分類されている細菌、従来ブレビバクテリウム属に分類
されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合
された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (198
1)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビ
バクテリウム属細菌やミクロバクテリウム属細菌を含む
ものであり、一般にＬ−グルタミン酸生産菌として知ら
れている下記のような微生物である。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【０００８】具体的に例示すると、下記のようなＬ−グ
ルタミン酸生産性の野生株及びその変異株、並びにこれ
らから誘導されるＬ−アミノ酸又は核酸生産株が挙げら
れる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020 コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC14067 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
ルタミン酸生産性の野生株及びその変異株、並びにこれ
らから誘導されるＬ−アミノ酸又は核酸生産株が挙げら
れる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020 コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC14067 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【０００９】本発明においてシュクラーゼ活性を持つ蛋
白質をコードする遺伝子とは、シュクロースを加水分解
しグルコースとフラクトースを生成する活性を持つ蛋白
質をコードする遺伝子を指す。シュクラーゼ活性は菌体
がシュクロースを炭素源として利用する時に重要であ
る。シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子
を取得するには、特開平5-244958号公報記載の方法によ
り、まず、コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡより遺伝子
ライブラリーを作成し、次いで他の微生物について公知
となっているシュクラーゼ遺伝子の塩基配列における相
同性をもとに合成したプローブを用いてコロニーハイブ
リダイゼーションを行い、ハイブリダイズするコロニー
のうちシュクラーゼ活性を発現するものをシュクラーゼ
遺伝子導入株として選び出し、当該株の菌体からシュク
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片として取得すればよい。
白質をコードする遺伝子とは、シュクロースを加水分解
しグルコースとフラクトースを生成する活性を持つ蛋白
質をコードする遺伝子を指す。シュクラーゼ活性は菌体
がシュクロースを炭素源として利用する時に重要であ
る。シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子
を取得するには、特開平5-244958号公報記載の方法によ
り、まず、コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡより遺伝子
ライブラリーを作成し、次いで他の微生物について公知
となっているシュクラーゼ遺伝子の塩基配列における相
同性をもとに合成したプローブを用いてコロニーハイブ
リダイゼーションを行い、ハイブリダイズするコロニー
のうちシュクラーゼ活性を発現するものをシュクラーゼ
遺伝子導入株として選び出し、当該株の菌体からシュク
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片として取得すればよい。
【００１０】本発明において、シュクラーゼ活性を持つ
蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結する
ベクターとしては、コリネホルム細菌内で遺伝子増幅可
能なものであれば特に制限はないが、通常コリネホルム
細菌由来のプラスミドを用いればよい。具体的には、pH
M1519（Agric. Biol. Chem., Vol.48, pp.2901-2903(19
84)）、pAM330（Agric. Biol. Chem., Vol.48, pp.2901
-2903 (1984)）、及びこれらをベースとした薬剤耐性プ
ラスミド等である。また、相同組換えやインサーション
シークエンスを用いて上記遺伝子を染色体中に導入する
ことも可能である。相同組換えについては、温度感受性
複製起点を用いたコリネホルム細菌の染色体遺伝子組換
え法があり（特開平5-7491号公報参照）、また、コリネ
ホルム細菌由来のインサーションシクエンスとしては、
IS714、IS719、IS903等があり、これらを利用すればよ
い（WO93/18151号公報参照）。
蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結する
ベクターとしては、コリネホルム細菌内で遺伝子増幅可
能なものであれば特に制限はないが、通常コリネホルム
細菌由来のプラスミドを用いればよい。具体的には、pH
M1519（Agric. Biol. Chem., Vol.48, pp.2901-2903(19
84)）、pAM330（Agric. Biol. Chem., Vol.48, pp.2901
-2903 (1984)）、及びこれらをベースとした薬剤耐性プ
ラスミド等である。また、相同組換えやインサーション
シークエンスを用いて上記遺伝子を染色体中に導入する
ことも可能である。相同組換えについては、温度感受性
複製起点を用いたコリネホルム細菌の染色体遺伝子組換
え法があり（特開平5-7491号公報参照）、また、コリネ
ホルム細菌由来のインサーションシクエンスとしては、
IS714、IS719、IS903等があり、これらを利用すればよ
い（WO93/18151号公報参照）。
【００１１】シュクラーゼ活性を持つ蛋白質をコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換えＤＮＡ
を保有し、かつＬ−アミノ酸又は核酸の生産能を有する
コリネホルム細菌は、Ｌ−アミノ酸または核酸生産能を
有する株を宿主菌とし、これに当該組換えＤＮＡを導入
することにより取得することができる。宿主菌として使
用できるコリネホルム細菌の具体例としては、例えばＬ
−グルタミン酸生産菌の野生株及びその変異株、並びに
Ｌ−グルタミン酸生産菌より誘導される各種Ｌ−アミノ
酸生産株又は核酸生産株が挙げられる。Ｌ−グルタミン
酸以外のＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−
グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン等コリネホ
ルム細菌が生産可能なＬ−アミノ酸ならいずれでもよ
い。また、核酸としては５′−イノシン、５′−イノシ
ン酸、５′−グアノシン、５′−グアニル酸等が挙げら
れる。
る遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換えＤＮＡ
を保有し、かつＬ−アミノ酸又は核酸の生産能を有する
コリネホルム細菌は、Ｌ−アミノ酸または核酸生産能を
有する株を宿主菌とし、これに当該組換えＤＮＡを導入
することにより取得することができる。宿主菌として使
用できるコリネホルム細菌の具体例としては、例えばＬ
−グルタミン酸生産菌の野生株及びその変異株、並びに
Ｌ−グルタミン酸生産菌より誘導される各種Ｌ−アミノ
酸生産株又は核酸生産株が挙げられる。Ｌ−グルタミン
酸以外のＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−
グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン等コリネホ
ルム細菌が生産可能なＬ−アミノ酸ならいずれでもよ
い。また、核酸としては５′−イノシン、５′−イノシ
ン酸、５′−グアノシン、５′−グアニル酸等が挙げら
れる。
【００１２】以下、各Ｌ−アミノ酸及び核酸の生産に好
適な宿主の具体例を示す。 (1) Ｌ−グルタミン酸製造に好適な宿主 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020 コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC14067 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 上記の野生株に加えて、これらから誘導された下記のよ
うな変異株も宿主として使用できる。 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12475
(FERM BP-2922) （特開平3-49690号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12476
(FERM BP-2923) （特開平3-49690号) ブレビバクテリウム・フラバム AJ12477 (FERM BP-292
4) （特開平3-49690号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12478 (FERM BP-
2925) （特開平3-49690号）
適な宿主の具体例を示す。 (1) Ｌ−グルタミン酸製造に好適な宿主 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020 コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ATCC14067 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 上記の野生株に加えて、これらから誘導された下記のよ
うな変異株も宿主として使用できる。 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12475
(FERM BP-2922) （特開平3-49690号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12476
(FERM BP-2923) （特開平3-49690号) ブレビバクテリウム・フラバム AJ12477 (FERM BP-292
4) （特開平3-49690号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12478 (FERM BP-
2925) （特開平3-49690号）
【００１３】(2) Ｌ−リジン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12031
(FERM BP-277) （特開昭60ー62994号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ39134
(FERM BP-2923) （特開昭60ー62994号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3463 (FERM P-19
87) （特公昭51ー34477号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11082
(NRRL B-11470, FERM P-3840) （特公昭59ー4993号） コリネバクテリウム・アセトグルタミカム AJ11094 (NR
RL B-11472, FERM P-3856) （特公昭59ー4993号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12435
(FERM BP-2294) （特開平6-7182号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12592
(FERM BP-3239) （特開平6-7182号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12593
(FERM BP-3240) （特開平6-7182号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12596 (FERM BP-
3242) （特開平6-7182号）
(FERM BP-277) （特開昭60ー62994号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ39134
(FERM BP-2923) （特開昭60ー62994号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3463 (FERM P-19
87) （特公昭51ー34477号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11082
(NRRL B-11470, FERM P-3840) （特公昭59ー4993号） コリネバクテリウム・アセトグルタミカム AJ11094 (NR
RL B-11472, FERM P-3856) （特公昭59ー4993号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12435
(FERM BP-2294) （特開平6-7182号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12592
(FERM BP-3239) （特開平6-7182号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12593
(FERM BP-3240) （特開平6-7182号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12596 (FERM BP-
3242) （特開平6-7182号）
【００１４】(3) Ｌ−スレオニン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11188
(FERM P-4190) （特開昭60-87788号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ11682 (FERM BP-
118) （特公平2-31956号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11683 (FERM BP-119)
（特公平2-31956号）
(FERM P-4190) （特開昭60-87788号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ11682 (FERM BP-
118) （特公平2-31956号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11683 (FERM BP-119)
（特公平2-31956号）
【００１５】(4) Ｌ−アスパラギン酸製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・フラバム AJ3859 (FERM P-2799)
（特開昭51-61689号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3860 (F
ERM P-2800) （特開昭51-61689号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ3877 (F
ERM P-2803) （特開昭51-61689号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3876 (FERM P-28
02) （特開昭51-61689号）
（特開昭51-61689号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3860 (F
ERM P-2800) （特開昭51-61689号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ3877 (F
ERM P-2803) （特開昭51-61689号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3876 (FERM P-28
02) （特開昭51-61689号）
【００１６】(5) Ｌ−イソロイシン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12404
(FERM P-10141) （特開平2-42988号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ12405 (FERM P-1014
2) （特開平2-42988号）
(FERM P-10141) （特開平2-42988号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ12405 (FERM P-1014
2) （特開平2-42988号）
【００１７】(6) Ｌ−アルギニン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・フラバム AJ12144 (FERM P-7642)
（特公平5-27388号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12145 (FERM P-7
643) （特公平5-27388号） ブレビバクテリウム・フラバム ATCC21493 （特開平5-
3793号） コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC21659 （特開
平5-3793号）
（特公平5-27388号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12145 (FERM P-7
643) （特公平5-27388号） ブレビバクテリウム・フラバム ATCC21493 （特開平5-
3793号） コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC21659 （特開
平5-3793号）
【００１８】(7) Ｌ−プロリン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11225
(FERM P-4390) （特開昭60-87788号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11512 (FERM P-5332)
（特公昭62-36679号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11513 (FERM P-5333)
（特公昭62-36679号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11514 (FERM P-5334)
（特公昭62-36679号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ11522 (FERM P-5
342) （特公昭62-36679号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ11523(FERM P-53
43) （特公昭62-36679号）
(FERM P-4390) （特開昭60-87788号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11512 (FERM P-5332)
（特公昭62-36679号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11513 (FERM P-5333)
（特公昭62-36679号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11514 (FERM P-5334)
（特公昭62-36679号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ11522 (FERM P-5
342) （特公昭62-36679号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ11523(FERM P-53
43) （特公昭62-36679号）
【００１９】(8) Ｌ−ヒスチジン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・フラバム AJ3420 (FERM BP-2316)
（特開平2ー186994号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ12425 (FERM BP-221
2) （特開平2ー186994号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12092 (FERM P-7
273) （特開平2ー186994号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12426 (FERM BP-
2213) （特開平2ー186994号）
（特開平2ー186994号） ブレビバクテリウム・フラバム AJ12425 (FERM BP-221
2) （特開平2ー186994号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12092 (FERM P-7
273) （特開平2ー186994号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12426 (FERM BP-
2213) （特開平2ー186994号）
【００２０】(9) Ｌ−バリン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3434 (F
ERM P-1854) （特開昭63-258588号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12341
(FERM BP-1763) （特開昭63-258588号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3776 (FERM P-26
01) （特開昭63-258588号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12342 (FERM BP-
1764) （特開昭63-258588号）
ERM P-1854) （特開昭63-258588号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12341
(FERM BP-1763) （特開昭63-258588号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3776 (FERM P-26
01) （特開昭63-258588号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12342 (FERM BP-
1764) （特開昭63-258588号）
【００２１】(10) Ｌ−ロイシン製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3452 (F
ERM P-1965) （特開昭50-123877号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3719 (F
ERM P-2517) （特開昭50-123877号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3453 (FERM P-19
66) （特開昭50-123877号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3455 (FERM P-19
68) （特開昭50-123877号）
ERM P-1965) （特開昭50-123877号） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3719 (F
ERM P-2517) （特開昭50-123877号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3453 (FERM P-19
66) （特開昭50-123877号） コリネバクテリウム・グルタミカム AJ3455 (FERM P-19
68) （特開昭50-123877号）
【００２２】(11) Ｌ−フェニルアラニン製造に好適な
宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637
(FERM BP-4160) （特開平5-49489号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ11761
(FERM P-6286) （特公平2ー11235号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12638
(FERM P-12382) （特公平2ー11235号）
宿主 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637
(FERM BP-4160) （特開平5-49489号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ11761
(FERM P-6286) （特公平2ー11235号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12638
(FERM P-12382) （特公平2ー11235号）
【００２３】(12) Ｌ−グルタミンの製造に好適な宿主 ブレビバクテリウム・フラバム AJ12418 (FERM BP-220
5) （特開平2ー186994号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12419
(FERM BP-2206) （特開平2ー186994号）
5) （特開平2ー186994号） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12419
(FERM BP-2206) （特開平2ー186994号）
【００２４】(13) ５′−イノシン酸の製造に好適な宿
主 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ATCC6872 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） AJ12192 (FERM P-7949)
（特公平5ー998号） コリネバクテリウム・エクイ AJ11347 (FERM P-4968)
（特公平57ー22558号） コリネバクテリウム・エクイ AJ11350 (FERM P-4971)
（特公平57ー22558号） コリネバクテリウム・エクイ AJ11352 (FERM P-4973)
（特公平57ー22558号）
主 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ATCC6872 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） AJ12192 (FERM P-7949)
（特公平5ー998号） コリネバクテリウム・エクイ AJ11347 (FERM P-4968)
（特公平57ー22558号） コリネバクテリウム・エクイ AJ11350 (FERM P-4971)
（特公平57ー22558号） コリネバクテリウム・エクイ AJ11352 (FERM P-4973)
（特公平57ー22558号）
【００２５】(14) ５′−グアニル酸の製造に好適な宿
主 コリネバクテリウム・エクイ ATCC21280
主 コリネバクテリウム・エクイ ATCC21280
【００２６】組換えＤＮＡをコリネホルム細菌に導入す
る方法には特に制限はないが、通常よく用いられるプロ
トプラスト法（Gene, Vol.39, pp.281-286 (1985)）、
電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）等の方法を
用いればよい。
る方法には特に制限はないが、通常よく用いられるプロ
トプラスト法（Gene, Vol.39, pp.281-286 (1985)）、
電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）等の方法を
用いればよい。
【００２７】かくして得られる組換えＤＮＡを保有する
コリネホルム細菌を培養する方法は、従来のＬ−アミノ
酸生産菌又は核酸生産菌の培養方法と特に変わらない。
すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、
更に必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養
素を含有する通常のものが用いられる。炭素源として
は、グルコース、シュクロース及びこれを含有する澱粉
加水分解液、糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸類、エタノ
ール等のアルコール類、又はこれらの混合物など、従来
コリネホルム細菌の培養に用いられているものが使用で
きる。しかしながら、本発明の組換えＤＮＡを保有する
コリネホルム細菌は、シュクロースからＬ−アミノ酸又
は核酸を生産する能力が顕著に向上しているため、炭素
源としてシュクロースを含む培地で培養を行う際に本発
明の効果が特に顕著となる。すなわち、ケーンモラセ
ス、ビートモラセス等のシュクロースを含有する原料を
使用して発酵を行うと、従来のコリネホルム細菌に比べ
て目的とするＬ−アミノ酸又は核酸の生産速度が大いに
増大する。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩その他が使用できる。なお、アミ
ノ酸、ビタミン等の栄養要求性変異株を宿主に使用する
場合には、その株が要求する栄養素を培地に適宜加える
必要がある。
コリネホルム細菌を培養する方法は、従来のＬ−アミノ
酸生産菌又は核酸生産菌の培養方法と特に変わらない。
すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、
更に必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養
素を含有する通常のものが用いられる。炭素源として
は、グルコース、シュクロース及びこれを含有する澱粉
加水分解液、糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸類、エタノ
ール等のアルコール類、又はこれらの混合物など、従来
コリネホルム細菌の培養に用いられているものが使用で
きる。しかしながら、本発明の組換えＤＮＡを保有する
コリネホルム細菌は、シュクロースからＬ−アミノ酸又
は核酸を生産する能力が顕著に向上しているため、炭素
源としてシュクロースを含む培地で培養を行う際に本発
明の効果が特に顕著となる。すなわち、ケーンモラセ
ス、ビートモラセス等のシュクロースを含有する原料を
使用して発酵を行うと、従来のコリネホルム細菌に比べ
て目的とするＬ−アミノ酸又は核酸の生産速度が大いに
増大する。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩その他が使用できる。なお、アミ
ノ酸、ビタミン等の栄養要求性変異株を宿主に使用する
場合には、その株が要求する栄養素を培地に適宜加える
必要がある。
【００２８】培養は、好気的条件下で行うのがよく、培
養温度を24〜42℃、ｐＨを５〜９に制御しつつ、培養液
中へのＬ−アミノ酸又は核酸の生成蓄積が実質的に終了
するまで行われる。ｐＨの調整には、無機あるいは有機
の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿素、炭酸カル
シウム、アンモニアガス等が使用される。かくして培養
を行うことにより培養液中に著量のＬ−アミノ酸又は核
酸が生成蓄積される。蓄積されたＬ−アミノ酸又は核酸
は、晶析、イオン交換樹脂処理等公知の方法を組合せる
ことにより培養液中より適宜採取することができる。
養温度を24〜42℃、ｐＨを５〜９に制御しつつ、培養液
中へのＬ−アミノ酸又は核酸の生成蓄積が実質的に終了
するまで行われる。ｐＨの調整には、無機あるいは有機
の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿素、炭酸カル
シウム、アンモニアガス等が使用される。かくして培養
を行うことにより培養液中に著量のＬ−アミノ酸又は核
酸が生成蓄積される。蓄積されたＬ−アミノ酸又は核酸
は、晶析、イオン交換樹脂処理等公知の方法を組合せる
ことにより培養液中より適宜採取することができる。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明する。
説明する。
【００３０】実施例１（シュクラーゼ遺伝子のブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムへの導入と発現） 特開平5-244958号記載の方法により、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム由来のシュクラーゼ活性を持
つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し
たプラスミドpBS3-43を取得し、更に当該ＤＮＡ断片を
エシェリヒア・コリとコリネホルム細菌のシャトルベク
ターpSAC4に連結させたプラスミドpSSM30を構築した。p
SSM30を保有させたエシェリヒア・コリ JM109の菌体か
らpSSM30を調製し、電気パルス法（特開平2-207791号公
報参照）によってブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム ATCC13869を形質転換した。pSSM30を保持するAT
CC13869株（以下、ATCC13869/pSSM30と記す）を100mlの
CM2G培地（酵母エキス10g/l、ポリペプトン10g/l、グル
コース５g/l、NaCl５g/l、pH7.0）で培養し、菌体を遠
心分離により回収し洗浄後、超音波処理によって破砕
し、10万Ｇの遠心力で分画した上澄を得た。この上澄15
0μlと0.5 Mシュクロース溶液50μlを混合し、30℃にて
30分反応を行った。ついで100℃で３分間加熱して反応
を停止させ、反応液中に生成したグルコースをグルコー
スＣテストワコーによって定量することによりシュクラ
ーゼ活性を測定した。なお、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ATCC13869はもともと菌体内にシュク
ラーゼ活性を持っているため、比較のためpSSM30のベク
ター部分であるpSAC4のみを保持するATCC13869株（ATCC
13869/pSSM30）についても同様に測定を行った。
クテリウム・ラクトファーメンタムへの導入と発現） 特開平5-244958号記載の方法により、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム由来のシュクラーゼ活性を持
つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し
たプラスミドpBS3-43を取得し、更に当該ＤＮＡ断片を
エシェリヒア・コリとコリネホルム細菌のシャトルベク
ターpSAC4に連結させたプラスミドpSSM30を構築した。p
SSM30を保有させたエシェリヒア・コリ JM109の菌体か
らpSSM30を調製し、電気パルス法（特開平2-207791号公
報参照）によってブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム ATCC13869を形質転換した。pSSM30を保持するAT
CC13869株（以下、ATCC13869/pSSM30と記す）を100mlの
CM2G培地（酵母エキス10g/l、ポリペプトン10g/l、グル
コース５g/l、NaCl５g/l、pH7.0）で培養し、菌体を遠
心分離により回収し洗浄後、超音波処理によって破砕
し、10万Ｇの遠心力で分画した上澄を得た。この上澄15
0μlと0.5 Mシュクロース溶液50μlを混合し、30℃にて
30分反応を行った。ついで100℃で３分間加熱して反応
を停止させ、反応液中に生成したグルコースをグルコー
スＣテストワコーによって定量することによりシュクラ
ーゼ活性を測定した。なお、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ATCC13869はもともと菌体内にシュク
ラーゼ活性を持っているため、比較のためpSSM30のベク
ター部分であるpSAC4のみを保持するATCC13869株（ATCC
13869/pSSM30）についても同様に測定を行った。
【００３１】結果を表１に示す。シュクラーゼの活性の
単位は、１時間に１mgのグルコースを生成する活性を１
unitとし、粗酵素液中の蛋白質１mgあたりの活性として
表示した。表１から明らかなように、pSSM30を導入した
株は明らかにシュクラーゼ活性が増強されていることが
確認された。
単位は、１時間に１mgのグルコースを生成する活性を１
unitとし、粗酵素液中の蛋白質１mgあたりの活性として
表示した。表１から明らかなように、pSSM30を導入した
株は明らかにシュクラーゼ活性が増強されていることが
確認された。
【００３２】
【表１】
【００３３】なお、pSSM30を保有させたエシェリヒア・
コリ JM109は、AJ13047と命名され、平成６年９月14日
付で工業技術院生命工学工業技術研究所にブタペスト条
約に基づく寄託がなされており、受託番号FERM BP-4800
が付与されている。
コリ JM109は、AJ13047と命名され、平成６年９月14日
付で工業技術院生命工学工業技術研究所にブタペスト条
約に基づく寄託がなされており、受託番号FERM BP-4800
が付与されている。
【００３４】実施例２（シュクラーゼ遺伝子の塩基配列
の決定） pBS3-43に挿入されたＤＮＡ断片のうち、約6kbのSmaＩ
断片と、それに含まれるシュクラーゼ遺伝子の上流方向
に約１kbについて、蛍光標識法により塩基配列を決定し
た。この配列を配列表配列番号１に示す。本配列にはオ
ープン・リーディング・フレームが４個存在しているが
（ORF-F1：342〜1505、ORF-F2：2338〜3609、ORF-F3：4
438〜5358、ORF-F4：5570〜6577）、既知のシュクラー
ゼ遺伝子との相同性比較により、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムのシュクラーゼの構造遺伝子は、
配列番号１の2338番目から3609番目に至る塩基配列から
成るORF-F2であり、424個のアミノ酸残基から成る蛋白
質をコードするものと推定された。また、ORF-F1、ORF-
F3及びORF-F4について蛋白質のデーターベースＮＢＲＦ
により相同性検索を行ったところ、表２に示す結果を得
た。ORF-F3とORF-F4については既知の蛋白質と高い相同
性が見いだされ、それらの間に関係があると考えられ
る。
の決定） pBS3-43に挿入されたＤＮＡ断片のうち、約6kbのSmaＩ
断片と、それに含まれるシュクラーゼ遺伝子の上流方向
に約１kbについて、蛍光標識法により塩基配列を決定し
た。この配列を配列表配列番号１に示す。本配列にはオ
ープン・リーディング・フレームが４個存在しているが
（ORF-F1：342〜1505、ORF-F2：2338〜3609、ORF-F3：4
438〜5358、ORF-F4：5570〜6577）、既知のシュクラー
ゼ遺伝子との相同性比較により、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムのシュクラーゼの構造遺伝子は、
配列番号１の2338番目から3609番目に至る塩基配列から
成るORF-F2であり、424個のアミノ酸残基から成る蛋白
質をコードするものと推定された。また、ORF-F1、ORF-
F3及びORF-F4について蛋白質のデーターベースＮＢＲＦ
により相同性検索を行ったところ、表２に示す結果を得
た。ORF-F3とORF-F4については既知の蛋白質と高い相同
性が見いだされ、それらの間に関係があると考えられ
る。
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例３（シュクラーゼ遺伝子を含むプラ
スミドのＬ−リジン生産菌への導入とＬ−リジン生産へ
の影響） エシェリヒア・コリ AJ 13047の菌体からプラスミドpSS
M30を調製し、Ｌ−リジン生産菌であるブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ11082 (NRRL B-11470)
に電気パルス法を用いて導入した。形質転換体を５μg/
mlのクロラムフェニコールを含むM-CM2Gプレート（グル
コース５g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、N
aCl５g/l、DLーメチオニン0.2 g/l、寒天15 g/l、pH7.
2）上にて選択し、形質転換体を取得した。取得した形
質転換体をAJ11082/pSSM30と命名した。
スミドのＬ−リジン生産菌への導入とＬ−リジン生産へ
の影響） エシェリヒア・コリ AJ 13047の菌体からプラスミドpSS
M30を調製し、Ｌ−リジン生産菌であるブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ11082 (NRRL B-11470)
に電気パルス法を用いて導入した。形質転換体を５μg/
mlのクロラムフェニコールを含むM-CM2Gプレート（グル
コース５g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、N
aCl５g/l、DLーメチオニン0.2 g/l、寒天15 g/l、pH7.
2）上にて選択し、形質転換体を取得した。取得した形
質転換体をAJ11082/pSSM30と命名した。
【００３７】AJ11082及びAJ11082/pSSM30をシュクロー
スを含む培地にて培養し、Ｌ−リジンの発酵生産を行な
った。１ｌ容ジャーファーメンターに入れた表３に示す
組成のリジン生産用培地300 mlに各菌株を接種し、培養
温度31.5℃でアンモニアガスにてpHを7.0に調整しつつ
通気攪拌培養を行なった。初発に加えたシュクロースを
消費し尽くした後は、培養液中のシユークロース濃度が
１〜３g/dlの範囲にコントロールされるように別に殺菌
した60g/dlのシュクロースと８g/dlの硫酸アンモニウム
の混合溶液を連続的にフィードし、フィード液150mlを
消費し終わるまで培養を行なった。培養時間とＬ−リジ
ン蓄積量、及び培養終了後の菌体より常法に従って調製
した粗酵素液のシュクラーゼ活性を測定した結果を表４
に示す。シュクラーゼ遺伝子の導入により、シュクロー
スからのＬ−リジンの発酵生産速度が大幅に向上した。
また、遺伝子導入株では菌体内のシュクラーゼ活性が増
強されていることが確認された。
スを含む培地にて培養し、Ｌ−リジンの発酵生産を行な
った。１ｌ容ジャーファーメンターに入れた表３に示す
組成のリジン生産用培地300 mlに各菌株を接種し、培養
温度31.5℃でアンモニアガスにてpHを7.0に調整しつつ
通気攪拌培養を行なった。初発に加えたシュクロースを
消費し尽くした後は、培養液中のシユークロース濃度が
１〜３g/dlの範囲にコントロールされるように別に殺菌
した60g/dlのシュクロースと８g/dlの硫酸アンモニウム
の混合溶液を連続的にフィードし、フィード液150mlを
消費し終わるまで培養を行なった。培養時間とＬ−リジ
ン蓄積量、及び培養終了後の菌体より常法に従って調製
した粗酵素液のシュクラーゼ活性を測定した結果を表４
に示す。シュクラーゼ遺伝子の導入により、シュクロー
スからのＬ−リジンの発酵生産速度が大幅に向上した。
また、遺伝子導入株では菌体内のシュクラーゼ活性が増
強されていることが確認された。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】実施例４（シュクラーゼ遺伝子プラスミド
のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株へ
の導入とＬ−グルタミン酸生産への影響） 実施例３と同様にして、シュクラーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpSSM30をブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム ATCC13869に導入した。形質転換体を５μg/mlのク
ロラムフェニコールを含むM-CM2Gプレート上にて選択
し、形質転換体を取得した。取得した形質転換体をATCC
13869/pSSM30と命名した。
のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株へ
の導入とＬ−グルタミン酸生産への影響） 実施例３と同様にして、シュクラーゼ遺伝子を含むプラ
スミドpSSM30をブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム ATCC13869に導入した。形質転換体を５μg/mlのク
ロラムフェニコールを含むM-CM2Gプレート上にて選択
し、形質転換体を取得した。取得した形質転換体をATCC
13869/pSSM30と命名した。
【００４１】 ATCC13869及びATCC13869/pSSM30をシュ
クロースを含む培地にて培養し、Ｌ−グルタミン酸の発
酵生産を行なった。１ｌ容ジャーファーメンターに入れ
た表５に示す組成のグルタミン酸生産用培地300mlに各
菌株を接種し、培養温度31.5℃でアンモニアガスにてpH
を6.5に調整しつつ通気攪拌培養を行なった。初発に加
えたシュクロースを消費し尽くした後は、培養液中のシ
ユークロース濃度が１〜３ g/dlの範囲にコントロール
されるように別に殺菌した60g/dlのシュクロースと８ g
/dlの硫酸アンモニウムの混合溶液を連続的にフィード
し、フィード液150mlを消費し終わるまで培養を行なっ
た。培養時間とＬ−グルタミン酸蓄積量を表６に示す。
シュクラーゼ遺伝子を導入した株では、シュクロースか
らのＬ−グルタミン酸の発酵生産速度が大幅に向上し
た。
クロースを含む培地にて培養し、Ｌ−グルタミン酸の発
酵生産を行なった。１ｌ容ジャーファーメンターに入れ
た表５に示す組成のグルタミン酸生産用培地300mlに各
菌株を接種し、培養温度31.5℃でアンモニアガスにてpH
を6.5に調整しつつ通気攪拌培養を行なった。初発に加
えたシュクロースを消費し尽くした後は、培養液中のシ
ユークロース濃度が１〜３ g/dlの範囲にコントロール
されるように別に殺菌した60g/dlのシュクロースと８ g
/dlの硫酸アンモニウムの混合溶液を連続的にフィード
し、フィード液150mlを消費し終わるまで培養を行なっ
た。培養時間とＬ−グルタミン酸蓄積量を表６に示す。
シュクラーゼ遺伝子を導入した株では、シュクロースか
らのＬ−グルタミン酸の発酵生産速度が大幅に向上し
た。
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】実施例５（シュクラーゼ遺伝子断片の縮小
化） pSSM30中のシュクロース代謝速度向上に必須な領域を特
定するため、挿入ＤＮＡ断片の縮小化を行なった。遺伝
子配列よりシュクラーゼ遺伝子を含むと予想される配列
表の2157塩基目より存在するSacIIサイトより3724塩基
目より存在するBanＩサイトまでの領域を含む1.5kbのＤ
ＮＡ断片をpSSM30より抽出し、両端を平滑末端化した
後、エシェリヒア・コリ用ベクターpHSG399のSmaＩサイ
トに挿入した。更に、ブレビバクテリウム中で複製可能
なプラスミドとするため、ブレビバクテリウムのプラス
ミドの複製起点の導入を行なった。ブレビバクテリウム
の複製起点を有するプラスミドpHC4（特開平5-7491号参
照）より３kbの複製起点ＤＮＡ断片を抽出し、両端の制
限酵素部位をリンカーの連結によりBamＨＩサイトに改
変した後、1.5 kbの上記ＤＮＡ断片が連結されたpHSG39
9のBamＨＩサイトに挿入した。作製したプラスミドをpS
SM30BSと命名した。
化） pSSM30中のシュクロース代謝速度向上に必須な領域を特
定するため、挿入ＤＮＡ断片の縮小化を行なった。遺伝
子配列よりシュクラーゼ遺伝子を含むと予想される配列
表の2157塩基目より存在するSacIIサイトより3724塩基
目より存在するBanＩサイトまでの領域を含む1.5kbのＤ
ＮＡ断片をpSSM30より抽出し、両端を平滑末端化した
後、エシェリヒア・コリ用ベクターpHSG399のSmaＩサイ
トに挿入した。更に、ブレビバクテリウム中で複製可能
なプラスミドとするため、ブレビバクテリウムのプラス
ミドの複製起点の導入を行なった。ブレビバクテリウム
の複製起点を有するプラスミドpHC4（特開平5-7491号参
照）より３kbの複製起点ＤＮＡ断片を抽出し、両端の制
限酵素部位をリンカーの連結によりBamＨＩサイトに改
変した後、1.5 kbの上記ＤＮＡ断片が連結されたpHSG39
9のBamＨＩサイトに挿入した。作製したプラスミドをpS
SM30BSと命名した。
【００４５】実施例６（縮小型シュクラーゼ遺伝子プラ
スミドのＬ−リジン生産菌への導入とＬ−リジン生産へ
の影響） 縮小型シュクラーゼ遺伝子プラスミドpSSM30BSをＬ−リ
ジン生産菌であるブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム AJ11082 (NRRL B-11470)に電気パルス法を用い
て導入した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むM-C
M2Gプレート上にて形質転換体を取得し、AJ11082/pSSM3
0BSと命名した。
スミドのＬ−リジン生産菌への導入とＬ−リジン生産へ
の影響） 縮小型シュクラーゼ遺伝子プラスミドpSSM30BSをＬ−リ
ジン生産菌であるブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム AJ11082 (NRRL B-11470)に電気パルス法を用い
て導入した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むM-C
M2Gプレート上にて形質転換体を取得し、AJ11082/pSSM3
0BSと命名した。
【００４６】実施例３と同様にして、AJ11082及びAJ110
82/pSSM30BSをシュクロースを含む培地にて培養し、Ｌ
−リジンの発酵生産を行なった。培養時間とＬ−リジン
蓄積量、及び培養終了後の菌体より常法に従って調製し
た粗酵素液のシュクラーゼ活性を測定した結果を表７に
示す。シュクラーゼ遺伝子の導入により、シュクラーゼ
活性が増強され、シュクロースからのＬ−リジンの発酵
生産速度が大幅に向上した。
82/pSSM30BSをシュクロースを含む培地にて培養し、Ｌ
−リジンの発酵生産を行なった。培養時間とＬ−リジン
蓄積量、及び培養終了後の菌体より常法に従って調製し
た粗酵素液のシュクラーゼ活性を測定した結果を表７に
示す。シュクラーゼ遺伝子の導入により、シュクラーゼ
活性が増強され、シュクロースからのＬ−リジンの発酵
生産速度が大幅に向上した。
【００４７】
【表７】
【００４８】実施例７（縮小型シュクラーゼ遺伝子プラ
スミドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野
生株への導入とＬ−グルタミン酸生産への影響） 縮小型シュクラーゼ遺伝子プラスミドpSSM30BSをブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869に電気
パルス法を用いて導入した。５μg/mlのクロラムフェニ
コールを含むM-CM2Gプレート上にて形質転換体を取得
し、ATCC13869/pSSM30BSと命名した。
スミドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野
生株への導入とＬ−グルタミン酸生産への影響） 縮小型シュクラーゼ遺伝子プラスミドpSSM30BSをブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869に電気
パルス法を用いて導入した。５μg/mlのクロラムフェニ
コールを含むM-CM2Gプレート上にて形質転換体を取得
し、ATCC13869/pSSM30BSと命名した。
【００４９】 実施例４と同様にして、ATCC13869及び
ATCC13869/pSSM30BSをシュクロースを含む培地にて培養
し、Ｌ−グルタミン酸の発酵生産を行なった。培養時間
とＬ−グルタミン酸蓄積量を表８に示す。シュクラーゼ
遺伝子の導入により、シュクロースからのＬ−グルタミ
ン酸の発酵生産速度が大幅に向上した。
ATCC13869/pSSM30BSをシュクロースを含む培地にて培養
し、Ｌ−グルタミン酸の発酵生産を行なった。培養時間
とＬ−グルタミン酸蓄積量を表８に示す。シュクラーゼ
遺伝子の導入により、シュクロースからのＬ−グルタミ
ン酸の発酵生産速度が大幅に向上した。
【００５０】
【表８】
【００５１】
【発明の効果】コリネホルム細菌に由来し、シュクラー
ゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターを
連結して得られる組換えＤＮＡを、Ｌ−アミノ酸又は核
酸生産能を有するコリネホルム細菌に導入し、該細菌を
シュクロースを含む液体培地に培養する本発明の方法に
よれば、シュクロースから短時間に効率的にＬ−アミノ
酸又は核酸を製造することができる。
ゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベクターを
連結して得られる組換えＤＮＡを、Ｌ−アミノ酸又は核
酸生産能を有するコリネホルム細菌に導入し、該細菌を
シュクロースを含む液体培地に培養する本発明の方法に
よれば、シュクロースから短時間に効率的にＬ−アミノ
酸又は核酸を製造することができる。
【００５２】
配列番号：１ 配列の長さ：6911 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム 株名：ATCC13869 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：342..1505 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2338..3609 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：CDS 存在位置：4438..5358 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：CDS 存在位置：5570..6577 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 ＡＧＴＣＣＧＴＣＧＡ ＣＧＣＣＡＣＣＡＴＴ ＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧ ＴＣＡ
ＣＣＧＡＧＣＴ ＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴ ＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴ ６０ ＡＣＧＣＴＣＣＣＧＴ ＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧ ＴＧＧＧＧＴＣＡＴＴ ＡＣＧ
ＧＧＴＧＧＧＡ ＴＣＡＣＧＣＣＧＧＴ ＧＡＡＡＧＴＴＧＣＧ １２０ ＧＡＡＣＣＣＡＴＧＧ ＴＧＴＴＣＣＴＴＧＴ ＧＧＧＴＴＧＡＧＧＧ ＡＡＣ
ＧＡＧＴＧＣＧ ＧＧＴＧＡＧＡＡＧＴ ＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧ １８０ ＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴ ＴＴＡＡＧＴＴＡＴＧ ＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣ ＴＴＧ
ＧＡＡＧＧＣＴ ＧＡＧＧＴＡＡＴＴＣ ＡＧＴＡＧＡＣＣＴＧ ２４０ ＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧ ＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣ ＧＡＡＧＡＴＡＡＴＴ ＡＡＣ
ＣＴＡＧＡＴＣ ＣＧＴＡＧＡＣＡＴＡ ＡＧＡＣＡＴＣＡＴＡ ３００ ＣＧＴＣＣＴＡＴＧＣ ＴＴＧＣＴＧＧＡＡＧ ＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡ ＡＣＣ
ＴＣＡＧＡＡＡ ＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡ ＧＴＧＧＴＧＣＡＴＴ ３６０ ＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡ ＴＧＣＡＧＧＴＣＡＡ ＧＣＡＧＴＴＡＡＡＡ ＡＡＡ
ＴＴＧＡＧＧＧ ＡＡＧＡＡＴＴＧＴＴ ＣＣＣＣＣＣＣＴＣＧ ４２０ ＧＧＧＴＧＡＴＴＧＡ ＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣ ＣＡＡＣＴＣＧＡＡＡ ＡＣＧ
ＧＣＡＴＣＡＴ ＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣ ＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣ ４８０ ＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡ ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＡ ＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧ ＡＡＣ
ＴＣＣＣＣＡＣ ＧＡＴＴＧＴＴＣＣＣ ＧＧＴＴＴＴＡＴＴＧ ５４０ ＡＴＣＴＴＣＡＴＡＡ ＴＣＡＣＧＧＴＧＧＡ ＡＡＣＧＧＴＧＧＣＧ ＣＧＴ
ＴＴＣＣＴＡＣ ＧＧＧＡＡＣＧＣＡＧ ＧＡＣＣＡＧＧＣＧＡ ６００ ＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣ ＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣ ＣＧＣＧＡＡＣＡＴＧ ＧＣＡ
ＣＧＡＣＣＧＴ ＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡ ＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴ ６６０ ＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣ ＴＧＡＣＧＣＡＣＴＧ ＧＣＡＧＣＧＣＡＧＧ ＴＧＧ
ＡＡＡＡＣＣＴ ＴＡＴＴＣＣＣＴＴＧ ＴＧＴＧＡＡＧＡＧＧ ７２０ ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧ ＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣ ＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣ ＣＴＴ
ＴＣＡＴＣＡＡ ＣＧＣＡＴＧＣＣＧＴ ＴＧＴＧＧＴＧＣＴＣ ７８０ ＡＡＡＡＣＣＣＧＧＡ ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴ ＣＣＣＧＧＣＡＡＣＣ ＣＡＡ
ＣＡＧＡＴＣＴ ＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧ ＡＴＣＣＡＴＧＣＧＧ ８４０ ＧＡＡＡＡＧＧＴＴＧ ＧＡＴＣＡＡＡＴＣＧ ＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧ ＣＧＣ
ＣＧＧＡＡＡＣ ＴＧＡＣＡＡＴＣＴＴ ＴＣＴＧＡＧＣＴＴＣ ９００ ＴＣＧＡＴＣＴＣＴＧ ＣＧＣＡＧＣＧＣＡＣ ＣＡＣＡＴＣＡＴＴＧ ＣＴＴ
ＣＣＴＴＣＧＧ ＧＣＡＣＡＣＴＧＡＴ ＧＣＡＧＡＴＴＴＴＧ ９６０ ＡＴＡＣＣＡＣＴＡＣ ＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴ ＧＣＣＴＴＧＧＣＴＡ ＡＡＧ
ＡＧＡＡＡＡＡ ＴＧＴＧＡＣＧＧＴＣ ＡＣＧＧＣＴＡＣＧＣ １０２０ ＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡ ＴＧＣＧＡＴＧＣＣＴ ＣＣＧＣＴＧＣＡＴＣ ＡＴＡ
ＧＧＧＣＴＣＣ ＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧ ＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣ １０８０ ＴＴＧＣＴＧＣＧＧＣ ＡＣＧＴＧＣＣＧＧＧ ＧＡＣＧＣＡＴＡＴＧ ＴＴＧ
ＡＧＴＴＧＡＴ ＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣ ＧＴＧＣＡＴＴＴＧＧ １１４０ ＣＣＧＡＴＧＧＡＡＣ ＧＧＴＣＧＡＴＣＴＡ ＧＣＴＣＧＴＴＣＣＡ ＡＣＡ
ＡＣＧＣＣＴＴ ＴＴＴＣＡＴＣＡＣＧ ＧＡＣＧＣＣＡＴＧＧ １２００ ＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧ ＡＡＴＧＣＣＡＧＡＣ ＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡ ＴＴＴ
ＴＧＧＧＣＧＴ ＴＴＴＧＡＡＣＧＴＣ ＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧ １２６０ ＡＴＧＧＡＧＴＣＧＣ ＣＣＧＴＣＴＧＣＧＣ ＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧ ＣＣＡ
ＴＣＧＣＣＧＧ ＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣ ＡＣＡＣＴＡＧＣＧＡ １３２０ ＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴ ＧＣＡＣＣＡＣＧＴＧ ＣＧＣＡＧＧＧＧＴＡ ＴＧＡ
ＣＧＣＴＴＡＴ ＣＧＡＣＧＣＧＡＣＣ ＣＴＣＣＡＣＡＣＣＴ １３８０ ＣＡＡＣＣＧＴＣＧＣ ＣＧＣＴＡＡＡＡＴＴ ＣＴＣＧＧＴＣＴＴＧ ＧＣＧ
ＡＴＣＡＣＧＡ ＡＡＴＣＧＣＴＡＡＡ ＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧ １４４０ ＣＡＡＡＴＴＴＴＧＴ ＧＧＴＣＴＴＴＧＡＣ ＴＣＡＡＡＣＧＧＣＣ ＡＧＧ
ＴＧＣＡＡＡＡ ＧＧＴＣＣＡＴＴＴＡ ＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧ １５００ ＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴ ＡＣＧＡＧＴＡＡＡＡ ＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴ ＴＴＴ
ＡＡＡＧＧＡＧ ＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧ ＧＡＡＡＴＣＡＣＴＡ １５６０ ＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡ ＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡ ＧＴＣＧＧＣＡＡＡＧ ＣＡＧ
ＴＴＧＣＡＧＴ ＣＣＴＡＡＴＣＧＣＡ ＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡ １６２０ ＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧ ＡＡＣＣＴＴＧＧＧＧ ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧ ＧＡＴ
ＣＣＴＣＡＣＣ ＡＣＴＧＡＧＴＡＣＣ ＴＡＣＣＡＡＧＡＧＣ １６８０ ＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴ ＧＴＡＴＧＡＡＧＣＴ ＧＧＧＧＡＡＧＴＧＴ ＣＡＴ
ＴＣＡＡＧＡＡ ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡ ＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧ １７４０ ＡＴＧＡＡＴＡＣＧＴ ＧＧＧＡＣＴＡＡＣＣ ＣＧＴＧＡＣＧＡＴＧ ＡＡＡ
ＡＣＡＧＣＴＡ ＣＴＴＴＡＡＡＡＣＣ ＡＴＴＣＧＣＡＡＡＧ １８００ ＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡ ＣＣＡＣＡＴＣＧＡＣ ＡＴＣＧＴＴＧＡＴＧ ＡＡＧ
ＡＧＧＴＣＴＡ ＣＡＧＣＣＣＡＧＡＴ ＧＧＴＧＣＡＡＡＣＣ １８６０ ＣＴＧＡＴＣＣＡＴＡ ＣＧＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧ ＡＧＧ
ＣＡＡＡＧＡＴ ＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡ ＴＣＣＧＴＴＧＡＡＧ １９２０ ＴＴＣＡＡＡＴＣＣＴ ＴＧＧＣＡＴＣＧＧＣ ＧＧＡＡＡＣＧＧＣＡ ＣＡＴ
ＣＧＣＴＴＴＣ ＡＴＴＧＡＡＣＣＡＴ ＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴ １９８０ ＧＴＣＡＧＧＡＣＴＧ ＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣ ＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡ ＣＣＣ
ＴＡＡＡＡＣＴ ＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡ ＡＣＧＣＴＣＧＡＴＴ ２０４０ ＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣ ＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧ ＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡ ＣＧＣ
ＣＧＴＣＡＣＣ ＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧ ＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣ ２１００ ＣＣＧＣＧＣＧＣＡＡ ＡＡＣＡＴＣＧＴＧＴ ＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣ ＴＧＧ
ＴＧＡＡＧＧＡ ＡＡＡＧＣＣＧＡＣＧ ＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧ ２１６０ ＡＡＣＴＧＴＧＧＡＡ ＧＧＣＣＣＡＧＴＧＡ ＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧ ＣＣＣ
ＡＧＧＴＴＣＣ ＡＴＣＣＴＧＴＡＧＡ ＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴ ２２２０ ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡ ＴＣＧＴＴＧＧＡＴＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴ ＡＴＣ
ＣＡＡＧＣＴＧ ＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧ ＡＴＣＡＣＴＡＣＣＧ ２２８０ ＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧ ＣＡＡＴＴＡＡＡＧＣ ＴＧＣＧＣＴＡＧＡＡ ＡＣＡ
ＡＡＡＡＧＧＡ ＡＡＧＴＡＣＴＧＴＧ ＴＧＧＧＧＣＴＡＴＧ ２３４０ ＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣ ＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴ ＧＣＧＣＣＣＴＧＣＧ ＴＡＣ
ＣＡＴＧＴＧＡ ＣＴＣＣＴＣＣＧＣＡ ＧＧＧＣＡＧＧＣＴＣ ２４００ ＡＡＴＧＡＴＣＣＣＡ ＡＣＧＧＡＡＴＧＴＡ ＣＧＴＣＧＡＴＧＧＡ ＧＡＴ
ＡＣＣＣＴＣＣ ＡＣＧＴＣＴＡＣＴＡ ＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴ ２４６０ ＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣ ＣＣＴＴＣＧＣＡＣＣ ＡＡＡＧＣＧＣＡＣＣ ＧＧＣ
ＴＧＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣ ＧＣＣＧＴＴＧＡＣＣ ２５２０ ＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣ ＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧ ＧＡＣＧＣＡＣＣＴＧ ＣＣＣ
ＧＡＣＧＣＴＣ ＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡ ＴＧＣＡＴＣＣＴＡＴ ２５８０ ＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧ ＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣ ＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣ ＧＴＡ
ＴＴＴＡＣＴＧ ＡＣＧＧＣＡＣＡＣＴ ＴＡＡＡＣＴＴＴＴＣ ２６４０ ＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡ ＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴ ＴＧＡＣＧＧＡＡＡＧ ＣＧＣ
ＣＧＣＧＣＣＡ ＣＣＣＡＡＡＡＣＣＴ ＴＧＴＣＧＡＡＧＴＣ ２７００ ＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡ ＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴ ＧＧＧＣＧＧＣＡＴＴ ＣＡＴ
ＣＧＣＣＧＴＴ ＣＧＣＣＴＡＡＡＡＡ ＴＣＣＧＣＴＴＡＴＣ ２７６０ ＧＡＣＧＧＡＣＣＣＧ ＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴ ＣＡＣＡＣＣＣＣＡＴ ＴＡＣ
ＣＧＣＧＡＴＣ ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧ ＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴ ２８２０ ＧＡＴＧＧＴＴＧＧＡ ＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴ ＴＧＧＧＧＣＣＣＡＡ ＣＧＣ
ＧＡＡＡＡＣＣ ＴＣＡＣＣＧＧＴＧＣ ＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡ ２８８０ ＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡ ＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡ ＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡ ＴＴＣ
ＴＣＣＧＧＴＧ ＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴ ＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴ ２９４０ ＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣ ＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣ ＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣ ＧＴＴ
ＣＣＣＧＡＴＧ ＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧ ＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣ ３０００ ＡＡＣＣＴＴＴＴＴＡ ＣＧＣＴＴＣＧＣＧＡ ＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴ ＧＧＣ
ＧＡＡＧＡＴＣ ＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴ ＧＡＴＴＴＴＣＴＧＴ ３０６０ ＣＣＡＣＡＡＧＧＡＴ ＴＧＧＡＣＣＧＡＡＴ ＣＣＡＣＧＡＴＧＡＧ ＧＴＴ
ＡＣＴＣＡＣＴ ＡＣＧＣＡＡＧＣＴＣ ＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣ ３１２０ ＧＧＡＴＡＴＧＴＣＧ ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴ ＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧ ＡＣＣ
ＴＴＣＣＧＣＧ ＴＣＴＴＧＣＧＡＧＧ ＡＴＴＣＡＧＣＧＡＧ ３１８０ ＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧ ＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴ ＣＴＡＣＧＣＡＣＣＧ ＣＡＧ
ＧＴＴＧＣＡＧ ＴＡＡＡＣＧＧＴＴＣ ＴＧＡＴＧＣＣＴＧＧ ３２４０ ＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴ ＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴ ＧＣＣＣＧＣＧＣＡＧ ＧＡＴ
ＧＡＴＣＡＣＣ ＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣ ＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡ ３３００ ＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴ ＧＣＣＴＧＡＣＴＧＴ ＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧ ＣＴＴ
ＣＡＴＴＴＧＣ ＧＣＡＡＣＣＡＣＧＣ ＧＡＴＣＴＡＣＣＡＡ ３３６０ ＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣ ＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧ ＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧ ＧＴＡ
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ＧＡＧＴＧＧＧ ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧ ＴＴＴＧＴＣＴＧＴＧ ３４８０ ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧ ＧＴＧＡＴＣＧＴＣＧ ＣＧＴＡＧＣＴＧＡＧ ＧＴＡ
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ＧＧＡＣＡＧＧ ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＣ ＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣ ３６００ ＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴ ＧＡＣＡＣＴＡＴＴＧ ＡＧＡＧＡＴＡＡＧＴ ＣＡＴ
ＡＴＡＡＡＡＧ ＧＧＴＣＴＴＴＴＧＴ ＧＧＣＧＡＡＴＴＧＴ ３６６０ ＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴ ＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣ ＣＴＴＧＡＴＣＴＡＧ ＴＴＡ
ＴＴＧＴＣＡＣ ＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣ ＣＣＴＣＧＴＴＣＡＧ ３７２０ ＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣ ＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣ ＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡ ＣＴＧ
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ＡＣＣＧＣＧＡ ＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣ ＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡ ３９６０ ＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴ ＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡ ＣＴＴＣＣＣＣＴＴＡ ＣＴＡ
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ＴＴＧＧＡＧＧ ＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴ ＧＧＣＧＧＴＧＣＴＣ ４０８０ ＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣ ＧＣＴＴＧＴＧＡＧＣ ＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＡＴ
ＴＴＧＡＴＴＣ ＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣ ＡＣＡＣＣＧＧＧＴＧ ４１４０ ＧＣＴＴＧＴＴＴＴＴ ＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧ ＧＧＴＧＣＴＣＧＴＧ ＴＡＧ
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ＧＴＧＡＧＧＴ ＴＧＡＣＧＴＡＣＣＴ ＧＣＧＡＴＣＧＴＣＧ ４２６０ ＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴ ＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧ ＧＡＡＴＣＣＡＡＴＧ ＣＴＧ
ＡＣＡＴＴＴＡ ＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＣ ４３２０ ＡＴＧＧＣＧＣＧＧＣ ＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧ ＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴ ＣＧＧ
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ＴＴＴＧＴＣＧ ＣＣＣＧＧＡＴＧＧＣ ＴＣＣＡＣＧＣＡＣＴ ４８００ ＡＡＧＧＣＧＣＧＣＧ ＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴ ＴＡＣＣＡＣＣＧＡＴ ＧＣＡ
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ＧＡＧＣＡＣＣ ＡＧＧＴＴＧＣＴＡＡ ＴＧＣＡＣＴＴＧＣＴ ４９８０ ＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡ ＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＴＧＧＣＧＴＣ ＧＣＣ
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ＣＣＧＡＡＣＴ ＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧ ＣＴＧＣＣＴＡＡＡＴ ５２８０ ＡＣＡＡＴＧＴＴＣＡ ＡＧＡＡＣＴＴＧＴＣ ＧＣＡＧＴＧＧＧＧＧ ＡＧＡ
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ＴＴＴＴＡＴＣ ＴＡＣＧＴＴＧＴＧＧ ＴＣＡＧＣＧＣＧＴＧ ６１２０ ＧＴＣＧＡＡＴＧＣＣ ＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡ ＣＴＧＡＴＧＧＴＴＴ ＧＧＡ
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ＣＣＧＡＧＣＴ ＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴ ＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴ ６０ ＡＣＧＣＴＣＣＣＧＴ ＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧ ＴＧＧＧＧＴＣＡＴＴ ＡＣＧ
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ＣＣＴＴＣＧＧ ＧＣＡＣＡＣＴＧＡＴ ＧＣＡＧＡＴＴＴＴＧ ９６０ ＡＴＡＣＣＡＣＴＡＣ ＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴ ＧＣＣＴＴＧＧＣＴＡ ＡＡＧ
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ＴＴＴＡＣＴＧ ＡＣＧＧＣＡＣＡＣＴ ＴＡＡＡＣＴＴＴＴＣ ２６４０ ＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡ ＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴ ＴＧＡＣＧＧＡＡＡＧ ＣＧＣ
ＣＧＣＧＣＣＡ ＣＣＣＡＡＡＡＣＣＴ ＴＧＴＣＧＡＡＧＴＣ ２７００ ＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡ ＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴ ＧＧＧＣＧＧＣＡＴＴ ＣＡＴ
ＣＧＣＣＧＴＴ ＣＧＣＣＴＡＡＡＡＡ ＴＣＣＧＣＴＴＡＴＣ ２７６０ ＧＡＣＧＧＡＣＣＣＧ ＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴ ＣＡＣＡＣＣＣＣＡＴ ＴＡＣ
ＣＧＣＧＡＴＣ ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧ ＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴ ２８２０ ＧＡＴＧＧＴＴＧＧＡ ＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴ ＴＧＧＧＧＣＣＣＡＡ ＣＧＣ
ＧＡＡＡＡＣＣ ＴＣＡＣＣＧＧＴＧＣ ＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡ ２８８０ ＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡ ＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡ ＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡ ＴＴＣ
ＴＣＣＧＧＴＧ ＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴ ＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴ ２９４０ ＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣ ＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣ ＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣ ＧＴＴ
ＣＣＣＧＡＴＧ ＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧ ＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣ ３０００ ＡＡＣＣＴＴＴＴＴＡ ＣＧＣＴＴＣＧＣＧＡ ＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴ ＧＧＣ
ＧＡＡＧＡＴＣ ＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴ ＧＡＴＴＴＴＣＴＧＴ ３０６０ ＣＣＡＣＡＡＧＧＡＴ ＴＧＧＡＣＣＧＡＡＴ ＣＣＡＣＧＡＴＧＡＧ ＧＴＴ
ＡＣＴＣＡＣＴ ＡＣＧＣＡＡＧＣＴＣ ＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣ ３１２０ ＧＧＡＴＡＴＧＴＣＧ ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴ ＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧ ＡＣＣ
ＴＴＣＣＧＣＧ ＴＣＴＴＧＣＧＡＧＧ ＡＴＴＣＡＧＣＧＡＧ ３１８０ ＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧ ＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴ ＣＴＡＣＧＣＡＣＣＧ ＣＡＧ
ＧＴＴＧＣＡＧ ＴＡＡＡＣＧＧＴＴＣ ＴＧＡＴＧＣＣＴＧＧ ３２４０ ＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴ ＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴ ＧＣＣＣＧＣＧＣＡＧ ＧＡＴ
ＧＡＴＣＡＣＣ ＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣ ＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡ ３３００ ＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴ ＧＣＣＴＧＡＣＴＧＴ ＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧ ＣＴＴ
ＣＡＴＴＴＧＣ ＧＣＡＡＣＣＡＣＧＣ ＧＡＴＣＴＡＣＣＡＡ ３３６０ ＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣ ＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧ ＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧ ＧＴＡ
ＡＴＣＡＧＡＴ ＣＴＧＴＡＴＴＡＧＧ ＴＴＣＴＧＡＡＣＣＴ ３４２０ ＧＴＣＣＧＡＧＴＡＧ ＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧ ＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣ ＣＴＣ
ＧＡＧＴＧＧＧ ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧ ＴＴＴＧＴＣＴＧＴＧ ３４８０ ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧ ＧＴＧＡＴＣＧＴＣＧ ＣＧＴＡＧＣＴＧＡＧ ＧＴＡ
ＡＡＡＣＣＴＧ ＧＣＧＡＡＴＴＡＧＴ ＧＡＴＣＧＣＧＧＡＣ ３５４０ ＧＡＴＡＡＴＡＣＡＧ ＣＣＡＴＴＧＡＧＡＴ ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴ ＧＡＴ
ＧＧＡＣＡＧＧ ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＣ ＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣ ３６００ ＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴ ＧＡＣＡＣＴＡＴＴＧ ＡＧＡＧＡＴＡＡＧＴ ＣＡＴ
ＡＴＡＡＡＡＧ ＧＧＴＣＴＴＴＴＧＴ ＧＧＣＧＡＡＴＴＧＴ ３６６０ ＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴ ＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣ ＣＴＴＧＡＴＣＴＡＧ ＴＴＡ
ＴＴＧＴＣＡＣ ＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣ ＣＣＴＣＧＴＴＣＡＧ ３７２０ ＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣ ＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣ ＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡ ＣＴＧ
ＣＡＧＧＡＧＣ ＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴ ＧＣＴＴＣＡＧＡＧＴ ３７８０ ＣＣＧＡＡＣＧＡＣＣ ＧＧＴＧＧＡＡＧＴＣ ＣＴＡＧＡＡＡＴＴＧ ＧＴＧ
ＡＣＣＧＴＧＣ ＡＧＡＡＧＣＡＡＴＴ ＣＧＣＧＴＴＴＴＧＧ ３８４０ ＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣ ＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡ ＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧ ＴＡＧ
ＴＡＧＣＴＧＧ ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴ ＧＡＡＧＴＴＧＧＡＣ ３９００ ＡＡＣＴＡＧＴＴＧＣ ＴＧＧＴＧＴＣＡＣＣ ＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧ ＡＴＧ
ＡＣＣＧＣＧＡ ＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣ ＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡ ３９６０ ＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴ ＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡ ＣＴＴＣＣＣＣＴＴＡ ＣＴＡ
ＣＧＧＡＡＧＡ ＡＧＧＡＴＡＧＧＣＣ ＡＣＡＧＴＣＡＴＧＡ ４０２０ ＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣ ＣＣＴＴＧＧＧＧＡＡ ＡＴＣＧＣＴＧＡＣＡ ＴＣＧ
ＴＴＧＧＡＧＧ ＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴ ＧＧＣＧＧＴＧＣＴＣ ４０８０ ＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣ ＧＣＴＴＧＴＧＡＧＣ ＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＡＴ
ＴＴＧＡＴＴＣ ＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣ ＡＣＡＣＣＧＧＧＴＧ ４１４０ ＧＣＴＴＧＴＴＴＴＴ ＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧ ＧＧＴＧＣＴＣＧＴＧ ＴＡＧ
ＡＣＧＧＧＣＡ ＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴ ＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡ ４２００ ＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧ ＴＧＣＧＧＴＣＧＣＡ ＧＴＡＴＴＧＧＣＡＧ ＣＣＣ
ＧＴＧＡＧＧＴ ＴＧＡＣＧＴＡＣＣＴ ＧＣＧＡＴＣＧＴＣＧ ４２６０ ＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴ ＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧ ＧＡＡＴＣＣＡＡＴＧ ＣＴＧ
ＡＣＡＴＴＴＡ ＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＣ ４３２０ ＡＴＧＧＣＧＣＧＧＣ ＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧ ＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴ ＣＧＧ
ＴＴＧＧＣＴＣ ＧＣＣＡＣＧＴＧＧＴ ＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣ ４３８０ ＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣ ＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡ ＣＧＴＴＧＴＧＧＣＴ ＡＴＴ
ＡＣＴＧＧＴＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＡ ＧＡＣＴＴＣＴＡＴＧ ４４４０ ＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡ ＴＣＧＣＧＡＣＧＧＴ ＴＣＴＴＧＧＣＣＡＡ ＧＡＴ
ＧＧＧＣＣＡＡ ＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＧＣＴＣＧ ４５００ ＴＴＴＡＡＣＡＡＴＧ ＡＧＣＴＴＧＧＴＴＴ ＧＣＣＡＣＡＣＡＣＣ ＧＣＧ
ＣＴＣＣＧＣＴ ＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡ ＴＡＣＴＡＡＧＴＡＴ ４５６０ ＴＴＧＧＴＧＧＣＴＧ ＡＧＡＴＧＴＣＣＧＣ ＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴ ＧＧＡ
ＣＡＴＡＴＴＡ ＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣ ＡＧＡＧＡＴＴＧＣＴ ４６２０ ＣＣＧＣＣＡＣＧＧＡ ＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴ ＧＣＴＣＡＡＣＧＴＣ ＧＧＣ
ＣＡＴＧＣＧＣ ＡＣＣＴＧＧＧＴＧＡ ＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣ ４６８０ ＣＧＣＧＡＧＡＡＴＡ ＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣ ＡＡＡＡＧＧＣＧＡＧ ＡＴＣ
ＡＴＴＧＡＡＧ ＣＧＣＴＧＣＣＣＴＣ ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧ ４７４０ ＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧ ＣＡＧＴＣＣＴＴＡＡ ＣＧＣＴＧＡＣＧＡＴ ＣＣＴ
ＴＴＴＧＴＣＧ ＣＣＣＧＧＡＴＧＧＣ ＴＣＣＡＣＧＣＡＣＴ ４８００ ＡＡＧＧＣＧＣＧＣＧ ＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴ ＴＡＣＣＡＣＣＧＡＴ ＧＣＡ
ＧＧＴＣＡＡＧ ＣＡＡＡＡＡＡＧＴＣ ＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧ ４８６０ ＧＣＡＡＣＧＡＧＴＡ ＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡ ＣＧＣＴＧＴＴＧＣＧ ＣＧＧ
ＧＣＡＡＧＣＴ ＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡ ＣＡＣＧＡＡＧＧＡＣ ４９２０ ＧＧＧＴＣＴＴＧＧＣ ＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴ ＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴ ＧＧＴ
ＧＡＧＣＡＣＣ ＡＧＧＴＴＧＣＴＡＡ ＴＧＣＡＣＴＴＧＣＴ ４９８０ ＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡ ＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＴＧＧＣＧＴＣ ＧＣＣ
ＣＣＡＧＡＡＴ ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣ ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡ ５０４０ ＧＣＡＣＡＴＴＣＡＧ ＣＧＧＣＴＴＣＣＧＣ ＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧ ＧＡＴ
ＧＴＡＡＡＧＡ ＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡ ＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣ ５１００ ＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧ ＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡ ＣＧＣＧＡＡＴＣＣＴ ＧＡＴ
ＴＣＴＡＴＧＣ ＧＴＧＣＡＧＧＴＡＴ ＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴ ５１６０ ＧＣＧＴＡＣＡＣＡＧ ＣＴＡＧＴＧＧＴＣＧ ＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧ ＣＡＡ
ＣＡＡＧＣＴＧ ＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴ ＧＧＴＣＡＡＡＴＧＧ ５２２０ ＧＴＧＡＧＣＴＴＧＧ ＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣ ＴＣＧＧＡＡＧＣＣＣ ＡＴＧ
ＣＣＧＡＡＣＴ ＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧ ＣＴＧＣＣＴＡＡＡＴ ５２８０ ＡＣＡＡＴＧＴＴＣＡ ＡＧＡＡＣＴＴＧＴＣ ＧＣＡＧＴＧＧＧＧＧ ＡＧＡ
ＡＣＣＣＴＡＣ ＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡ ＣＴＴＧＣＡＧＡＧＴ ５３４０ ＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧ ＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧ ＡＧＴＡＣＴＣＡＣＧ ＴＡＧ
ＴＴＴＣＡＧＡ ＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡ ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴ ５４００ ＴＧＣＴＣＧＣＡＧＣ ＣＣＡＴＡＴＴＡＡＧ ＣＧＧＧＡＴＧＡＴＧ ＴＡＧ
ＴＧＣＴＧＧＴ ＴＡＡＧＧＣＴＴＣＡ ＡＡＴＧＣＴＧＡＴＣ ５４６０ ＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧ ＧＧＴＣＧＣＡＧＡＡ ＧＣＡＣＴＡＣＡＴＧ ＧＣＡ
ＴＧＧＴＧＣＣ ＧＧＣＣＴＣＡＡＡＡ ＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧ ５５２０ ＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣ ＧＡＣＧＡＴＴＣＴＣ ＧＴＣＧＧＡＡＣＧＴ ＧＧＡ
ＡＧＧＡＣＡＧ ＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡ ＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴ ５５８０ ＴＡＴＧＧＴＣＡＧＴ ＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧ ＣＧＴＴＣＣＴＣＧＴ ＣＴＣ
ＡＡＴＣＴＴＴ ＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧ ＴＧＴＴＧＡＴＣＣＧ ５６４０ ＴＴＡＴＴＴＣＡＣＴ ＡＡＣＣＧＣＣＡＧＴ ＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡ ＡＡＴ
ＣＣＧＴＧＡＡ ＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣ ＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴ ５７００ ＧＣＧＴＡＡＧＣＧＴ ＧＧＣＡＣＴＣＣＡＡ ＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧ ＣＡＴ
ＴＧＣＧＡＴＴ ＡＴＣＧＣＧＧＧＣＡ ＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣ ５７６０ ＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴ ＡＣＣＡＡＴＡＴＣＴ ＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴ ＣＣＡ
ＡＧＧＣＧＴＴ ＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡ ＣＡＧＴＣＴＣＣＧＧ ５８２０ ＣＴＴＧＣＴＣＧＴＧ ＴＴＧＧＧＴＣＴＧＡ ＣＣＴＴＧＧＧＣＣＴ ＴＧＧ
ＴＧＣＣＡＣＴ ＧＧＣＴＴＣＧＣＣＧ ＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴ ５８８０ ＣＡＡＧＣＴＧＴＡＣ ＡＴＧＡＡＣＣＧＡＡ ＡＣＣＴＴＧＧＴＴＴ ＧＡＡ
ＣＡＡＧＡＣＣ ＧＣＴＡＡＧＣＴＧＧ ＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴ ５９４０ ＧＧＣＣＡＴＴＧＣＧ ＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧ ＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴ ＡＣＴ
ＧＣＡＧＴＴＴ ＣＣＣＧＡＴＧＡＡＡ ＡＣＧＧＴＣＴＧＡＣ ６０００ ＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡ ＡＣＣＣＡＣＣＴＧＴ ＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧ ＣＧＡ
ＴＡＴＣＧＡＣ ＡＣＣＡＴＴＧＡＣＣ ＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧ ６０６０ ＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴ ＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡ ＴＣＧＴＧＴＴＣＣＴ ＣＡＴ
ＴＴＴＴＡＴＣ ＴＡＣＧＴＴＧＴＧＧ ＴＣＡＧＣＧＣＧＴＧ ６１２０ ＧＴＣＧＡＡＴＧＣＣ ＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡ ＣＴＧＡＴＧＧＴＴＴ ＧＧＡ
ＴＧＧＴＴＴＧ ＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡ ＣＣＡＣＡＧＣＡＴＴ ６１８０ ＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴ ＧＣＴＴＡＣＡＣＣＴ ＴＧＡＴＣＡＣＧＴＴ ＣＴＧ
ＧＣＡＧＴＴＣ ＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴ ＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣ ６２４０ ＡＧＴＧＧＡＡＧＣＧ ＧＧＴＴＧＣＡＡＴＡ ＣＧＧＴＧＣＧＴＧＡ ＴＣＣ
ＡＣＴＧＧＡＴ ＴＴＧＴＣＴＧＴＧＴ ＴＧＴＧＣＧＣＴＧＣ ６３００ ＴＧＧＴＣＴＧＧＣＧ ＣＣＡＣＣＴＴＧＧＧ ＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧ ＴＧＧ
ＡＡＴＧＣＧＧ ＣＡＣＣＧＡＣＡＡＡ ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧ ６３６０ ＧＧＣＧＡＴＡＣＴＧ ＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣ ＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴ ＴＴＧ
ＧＴＴＧＣＡＧ ＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴ ＧＧＴＴＡＧＣＣＧＣ ６４２０ ＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣ ＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴ ＣＡＴＣＧＧＣＧＣＧ ＣＴＧ
ＴＴＴＧＴＣＡ ＴＴＧＡＧＧＴＣＧＣ ＴＴＣＴＧＴＴＧＣＧ ６４８０ ＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧ ＧＣＧＴＧＴＴＴＡＡ ＧＡＣＣＣＧＣＧＧＴ ＡＡＧ
ＣＧＴＧＴＧＴ ＴＣＡＡＡＡＴＧＧＣ ＴＣＣＧＡＴＣＣＡＣ ６５４０ ＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧ ＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ ＧＴＧＧＡＣＴＧＡＡ ＡＣＴ
ＡＣＣＧＴＧＡ ＣＣＡＴＣＣＧＴＴＴ ＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ ６６００ ＡＣＧＡＴＣＡＴＧＡ ＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣ ＧＧＧＴＧＴＣＧＧＴ ＧＴＧ
ＴＴＴＡＡＣＡ ＧＣＧＡＣＴＧＧＣＴ ＣＣＡＣＴＴＡＧＣＧ ６６６０ ＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡ ＴＡＡＴＴＡＴＧＧＴ ＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣ ＣＡＴ
ＴＴＡＣＣＴＣ ＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡ ＧＧＧＣＣＧＴＡＴＴ ６７２０ ＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧ ＧＣＧＣＴＧＧＴＧＴ ＴＴＣＣＧＧＣＣＴＧ ＴＣＣ
ＡＴＡＧＣＡＡ ＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧ ＴＧＡＧＴＴＧＣＡＴ ６７８０ ＴＧＣＧＡＴＧＴＴＧ ＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡ ＣＧＡＧＡＡＣＧＡＡ ＡＣＴ
ＧＣＡＣＧＴＣ ＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴ ＴＧＡＡＧＴＡＧＴＡ ６８４０ ＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧ ＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣ ＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴ ＣＡＧ
ＧＡＡＣＡＧＣ ＴＧＧＡＴＴＣＴＴＴ ＣＴＣＣＡＴＴＧＴＧ ６９００ ＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣ Ｃ
【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：４２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ ２０ ２５
３０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ ３５ ４０
４５ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ５０ ５５
６０ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ ６５ ７０
７５ ８０ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ ８５
９０ ９５ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ １００ １０５
１１０ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ １０５ １１０
１１５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ １２０ １２５
１３０ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ １３５ １４０
１４５ １６０ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ １６５
１７０ １７５ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｐｈｅ １８０ １８５
１９０ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ １９５ ２００
２０５ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ２１０ ２１５
２２０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ ２４５
２５０ ２５５ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ２６０ ２６５
２７０ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ ２７５ ２８０
２８５ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ ２９０ ２９５
３００ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ ３２５
３３０ ３３５ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ ３４０ ３４５
３５０ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ ３５５ ３６０
３６５ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｐ ３７０ ３７５
３８０ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ ３８５ ３９０
３９５ ４００ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ ４０５
４１０ ４１５ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ
４２０
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ ２０ ２５
３０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ ３５ ４０
４５ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ５０ ５５
６０ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ ６５ ７０
７５ ８０ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ ８５
９０ ９５ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ １００ １０５
１１０ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ １０５ １１０
１１５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ １２０ １２５
１３０ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ １３５ １４０
１４５ １６０ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ １６５
１７０ １７５ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｐｈｅ １８０ １８５
１９０ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ １９５ ２００
２０５ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ２１０ ２１５
２２０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ ２４５
２５０ ２５５ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ２６０ ２６５
２７０ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ ２７５ ２８０
２８５ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ ２９０ ２９５
３００ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ ３２５
３３０ ３３５ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ ３４０ ３４５
３５０ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ ３５５ ３６０
３６５ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｐ ３７０ ３７５
３８０ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ ３８５ ３９０
３９５ ４００ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ ４０５
４１０ ４１５ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ
４２０
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 土屋 誠 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 松井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 吉原 康彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 コリネホルム細菌由来で、配列表配列番
号２に記載のアミノ酸配列を有するシュクラーゼ活性を
持つ蛋白質をコードする遺伝子。 - 【請求項２】 配列表配列番号１に記載の塩基配列の２
３３８番目から３６０９番目に至る塩基配列を有する請
求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とコリネホルム細菌内で遺伝子増幅可能なベク
ターが連結されて得られる組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換えＤＮＡを保有し、
かつＬ−アミノ酸又は核酸の生産能を有するコリネホル
ム細菌。 - 【請求項５】 請求項４記載のコリネホルム細菌をシュ
クロースを含む液体培地に培養し、培養液中にＬ−アミ
ノ酸又は核酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とするＬ−アミノ酸又は核酸の製造方法。 - 【請求項６】 Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−
リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−
プロリンより成る群、核酸が５′−イノシン、５′−イ
ノシン酸、５′−グアノシン、５′−グアニル酸より成
る群から選ばれる、請求項５記載のＬ−アミノ酸又は核
酸の製造方法。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP7012361A JPH08196280A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | コリネホルム細菌由来のシュクラーゼ遺伝子とその利用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001025447A1 (fr) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene enzymatique du systeme de biosynthese d'acide amine thermophile |
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- 1996-01-30 BR BR9600268A patent/BR9600268A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-30 FR FR9601064A patent/FR2729970B1/fr not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
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| US6893852B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-05-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Dna encoding sucrose pts enzyme II |
| WO2001025447A1 (fr) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene enzymatique du systeme de biosynthese d'acide amine thermophile |
| US6995250B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Thermophilic amino acid biosynthesis system enzyme gene of thermotolerant coryneform bacterium |
| US7125977B2 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
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| FR2729970A1 (fr) | 1996-08-02 |
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| SK11296A3 (en) | 1996-08-07 |
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050315 |
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