KR102035844B1

KR102035844B1 - L-트립토판을 생산하는 재조합 코리네형 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR102035844B1
Application number: KR1020180022057A
Authority: KR
Inventors: 서창일; 김태연; 김효진; 정무영; 김현아; 손성광; 정기용
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2018-02-23
Filing date: 2018-02-23
Publication date: 2019-10-23
Anticipated expiration: 2038-02-23
Also published as: WO2019164346A8; KR20180089329A; WO2019164346A1

Abstract

본 출원은 유전자 조작기법을 이용한 재조합 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-트립토판을 생산하는 재조합 코리네형 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판을 생산하는 방법 {Recombinant coryneform microorganism to produce L-tryptophan and method for producing L-tryptophan using the same}

L-트립토판은 필수 아미노산의 하나로 사료 첨가제, 또는 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 현재에는 미생물을 이용한 직접 발효법이 L-트립토판 생산에 주로 이용되고 있다.

L-트립토판 생산에 사용되는 미생물들은 초기에 화학적 또는 물리적 돌연변이를 통한 유사체 내성 선별 균주들이 주로 사용되어 왔으나, 1990년대 유전자 재조합 기술의 급격한 발전과 분자수준의 조절 기작들이 규명됨에 따라 유전자 조작 기법을 이용한 재조합 균주들이 주로 사용되고 있다.

한편, 대장균을 이용한 L-트립토판 생산 연구는 당유입, pentose phosphate pathway, 세린 생합성, aromatic/tryptophan 생합성에 걸쳐 다양한 연구가 진행되었고 현재 산업적 생산까지 이어지고 있다. GRAS(Generally Recognized as Safe) 균주인 코리네박테리움속 미생물은 Endotoxin-free와 같은 장점이 있어 글루탐산, 라이신, 발린 생산에 적용되고 있음에도 불구하고, 트립토판 경우 유전자 regulation에 대한 연구가 대장균에 비해 진행이 미비하여 산업적 생산까지는 적용되지 않은 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 출원에서는 대사공학적 관점에서 코리네박테리움속 미생물에 유전자 조작을 통하여 트립토판 생합성 경로를 강화시킴과 동시에 트립토판 생합성의 첫 기질인 에리스로즈 4-포스페이트가 증가되도록 함으로써, 트립토판 생산능이 획기적으로 향상됨을 확인하여 본 출원을 완성하였다.

JP 1985-176593 A

본 출원의 하나의 목적은, L-트립토판을 과생산할 수 있도록 유전자 재조합된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판 생산 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, N-말단이 서열번호 32의 아미노산 서열로 구성되고 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 트립토판 오페론 및 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자의 발현이 강화된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물에 대한 것이다.

또 하나의 일 실시 양태로, 상기 미생물에 추가적으로 N-말단이 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성된 피드백 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 대장균 유래 트립토판 오페론이 발현되도록 변형된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어, " L-트립토판(L-tryptophan)"은 α-아미노산의 하나로, 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식이 C₁₁H₁₂N₂O₂인 방향족 아미노산을 말한다.

본 출원에서 용어, “트립토판 오페론(tryptophan operon; Trp operon)”은 코리스민산(chorismic acid; chorismate)로부터 트립토판을 합성하는데 관여하는 효소를 암호화 하고 있는 유전자군을 의미한다. 구체적으로, 트립토판 오페론은 코리네박테리움 속 미생물 유래의 트립토판 오페론, 또는 에스케리키아 속 미생물 유래의 트립토판 오페론일 수 있다. 코리네박테리움 속 미생물에서는 trpE, trpG, trpD, trpC, trpB, trpA 유전자로, 에스케리키아속 미생물에서는 trpE, trpD, trpC, trpB, trpA 유전자가 촉진자와 작동인자 하부에 이 순서로 배열하여 오페론을 구성한다. 구체적으로 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있고, 에스케리키아속 미생물은 대장균일 수 있다. 상기 트립토판 오페론은 공지된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 당업자는 NCBI 또는 Kegg 등의 데이터베이스를 통해 트립토판 오페론의 뉴클레오티드 서열을 용이하게 수득할 수 있다. 통상의 트립토판 오페론은 세포가 요구하는 충분한 양의 트립토판을 생산할 수 있도록 활발히 전사하지만, 세포내 트립토판이 충분히 존재하는 경우에 억제인자(repressor)가 트립토판과 결합하여 트립토판 오페론이 불활성화되므로 전사가 억제된다. 이에 트립토판을 미생물에서 과량으로 생산하기 위해서는 트립토판 오페론의 억제인자가 작동하지 않도록 해야 하며, 트립토판에 의해 피드백 억제를 받지 않도록 유전자 조작이 필요하다.

상기 트립토판 오페론에 의해 코딩되는 단백질은 안스라닐산 합성효소(anthranilate synthase), 안스라닐산 포스포리보실 전이효소(anthranilate phosphoribosyltransferase), 포스포리보실 안트라닐산 이성화효소(phosphoribosylanthranilate isomerase), 인돌-3-글리세롤 인산합성 효소(indole-3-glycerol phosphate synthase) 및 트립토판 합성효소(tryptophan synthase)로 공지되어 있다. 구체적으로, 먼저 안스라닐산 합성효소가 코리스믹산에 작용하여 안스라닐산(anthranilic acid)을 합성한다. 이어서 안스라닐산 포스포리보실 전이효소가 작용하여 포스포리보실 안트라닐산 (N -(5'-phosphoribosyl)-anthranilate)을 합성한다. 이어서 포스포리보실 안트라닐산 이성화효소 와 인돌-3-글리세롤 인산합성 효소가 작용하여 인돌-3-글리세롤 인산 (indole-3-glycerol-phosphate)을 합성하고, 여기에 트립토판 합성효소가 작용하여 L-트립토판 합성을 완성한다(Bonggaerts　et al.,　Metab　Eng,　3, 289-300, 2001, Iris Brune et al., J.Bacteriol., 189(7):2720-33, 2007).

본 출원에서 상기 "안스라닐산 합성효소 (anthranilate synthase)"는 코리스믹산으로 부터 안스라닐산을 합성하는 효소를 의미한다. 본 출원의 상기 안스라닐산 합성효소는 코리네박테리움 속 미생물 유래의 안스라닐산 합성효소, 또는 에스케리키아 속 미생물 유래의 안스라닐산 합성효소일 수 있다. 코리네글루타미쿰의 경우 트립토판 오페론 내의 trpE와 trpG 유전자가 생성하는 단백질이, 대장균의 경우 trpE와 trpD 유전자가 생성하는 단백질이 중합체를 이뤄 안트라닐산 합성효소를 형성한다.

본 출원의 안스라닐산 합성효소는 이의 활성을 갖는 야생형 또는 천연형 단백질과 달리, 최종 산물인 트립토판, 이의 유도체 또는 유사체에 의한 피드백 저해가 해제되거나 탈감작된 특징을 가진다. 본 출원에서 용어, “피드백 저해 (feedback inhibition)”는 효소계의 종산물이 그 효소계의 초기 단계에 있는 반응을 저해하거나 억제하는 것을 의미한다. 따라서, 안스라닐산 합성효소의 피드백 저해를 해제하거나 탈감작하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 트립토판의 생산성을 높일 수 있다.

상기 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소는 트립토판에 의한 피드백 저해가 해제되거나 탈감작되기만 하면 본 출원에 포함되는 것은 자명하다. 구체적으로, 상기 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소는 N-말단이 서열번호 32의 아미노산 서열로 구성된 것이거나, N-말단이 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다. 상기 서열번호 32의 아미노산 서열은 38번 위치의 세린이 알지닌으로 치환된 서열이며, 상기 서열번호 33의 아미노산 서열은 21번 위치의 프롤린이 세린으로 치환된 서열이다. 상기 서열번호 32의 아미노산 서열 또는 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드는 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 32 또는 33의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드, 또는 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 안스라닐산 합성효소는 코리네박테리움속 미생물 유래의 공지된 아미노산 서열이나 에스케리키아속 미생물 유래의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 당업자는 NCBI 또는 Kegg 등의 데이터베이스를 통해 안스라닐산 합성효소의 아미노산 서열을 용이하게 수득할 수 있다. 다만, 피드백 저해 (feedback inhibition) 해소를 위해 코리네박테리움 속 미생물 유래의 경우 전체 아미노산 서열에서 N-말단이 서열번호 32의 아미노산을 포함하기만 하면, 그 이후는 공지된 아미노산 서열이거나 다른 피드백 저해 해제 변이를 포함한 아미노산 서열일 수 있다. 에스케리키아속 미생물 유래의 경우 피드백 저해 해소를 위해 전체 아미노산 서열로부터 N-말단이 서열번호 33의 아미노산을 포함하기만 하면, 그 이후는 공지된 아미노산 서열이거나 다른 피드백 저해 해제 변이를 포함한 아미노산 서열일 수 있다.

본 출원에서의 안스라닐산 합성효소는 비록 N-말단이 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드라고 정의하였지만, 38번 위치가 알지닌인 것을 제외한 서열번호 32, 또는 21번 아미노산이 세린인 것을 제외한 서열번호 33의 아미노산 서열 내에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 안스라닐산 합성효소에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본원의 코리네박테리움속 미생물 유래의 안스라닐산 합성효소는 38번 위치가 알지닌인 것을 포함하고, 서열번호 32의 아미노산 서열 또는 이와 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 본원의 에스케리키아속 미생물 유래의 안스라닐산 합성효소는 21번 위치가 세린인 것을 포함하고, 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 이와 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 상동성을 가지며 상기 폴리펩티드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

상기 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 안스라닐산 합성효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 상기 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 한편, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이와 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 실질적으로 상기 폴리펩티드와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, N-말단이 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동등 또는 유사한 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드의 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원에서 용어, “트랜스케토라제(transketolase)”는 프럭토스-6-포스페이트 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트의 자일룰로즈-5-포스페이트 및 에리스로즈 4-포스페이트(E4P, erythorse-4-phosphate)로의 전환을 촉진시키는 효소를 의미한다 (Kochetov, G. A. 1982, Transketolase from yeast, rat liver, and pig liver, Methods Enzymol., 90:209-23). 트립토판 생산은 방향족 아미노산 대사회로로부터 기인하며, 이 대사회로는 포스포엔올피루베이트 (Phosphoenolpyruvate)와 에리스로즈 4-포스페이트 (Erythrose 4-phosphate)의 축합 반응으로 시작된다. 따라서 두 가지 전구체의 원활한 공급은 트립토판 생산성 향상에 필수적이며 본 출원에서는 상대적으로 부족하다고 알려진 트립토판의 전구체로서 에리스로즈 4-포스페이트의 원활한 공급을 위해 tkt 유전자의 발현을 강화시키고자 한다.

본 출원의 트랜스케토라제는 상기 활성을 가지고 있으면 미생물의 유래에 관계없이 당업자가 이의 활성을 가지는 아미노산 서열을 자명하게 이용할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움속 미생물 유래의 공지된 아미노산 서열이나 에스케리키아속 미생물 유래의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 당업자는 NCBI 또는 Kegg 등의 데이터베이스를 통해 트랜스케토라제의 아미노산 서열을 용이하게 수득할 수 있다. 더욱 구체적으로, 트랜스케토라제는 코리네박테리움속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 더 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다.

본 출원에서 용어, 유전자의 “발현이 강화된/되도록”은 목적 유전자가 기능을 가진 단백질로의 합성이 내재적 또는 변형 전에 비하여 증가된 상태를 의미한다. 상기에서 “내재적”은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 상태를 의미한다.

구체적으로, 본 출원의 발현 강화는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질을 암호화하는 염색체상 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 단백질 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 출원의 발현 강화는 목적 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환한 것일 수 있다.

상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, P_L 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

본 출원에서 용어, 유전자의 “도입”은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 유전자가 그 미생물내에서 발현됨에 따라 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.

이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, “L-트립토판을 생산하는 미생물”은 배지 중의 탄소원으로부터 L-트립토판을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 의미한다. 또한, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 L-트립토판을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 에스케리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있다.

보다 더욱 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 트립토판 오페론 및 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자의 발현이 강화되어 L-트립토판 생산량이 증가될 수 있는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 또 다른 하나의 양태는, N-말단이 서열번호 32의 아미노산 서열로 구성되고 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 트립토판 오페론 및 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자의 발현이 강화된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판 생산 방법에 대한 것이다.

상기 N-말단이 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성되고 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소, 트립토판 오페론, 트랜스케톨라제, L-트립토판, 및 미생물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, “배지”는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

배지의 온도는 20℃ 내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 트립토판을 회수하는 단계는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 L-트립토판을 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 회수 단계는 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-트립토판을 정제할 수 있다.

본 출원에서 제공되는 L-트립토판 생산 미생물은 피드백 해제된 트립토판 오페론과 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자의 발현을 강화함으로써 발효 안정성이 뛰어난 코리네박테리움속 미생물에서 L-트립토판의 생산량을 향상시킬 수 있다. 추가로, 상기 코리네박테리움 속 미생물에 대장균 유래의 피드백 해제된 트립토판 오페론의 발현이 조합되면 L-트립토판의 생산량을 획기적으로 향상시킬 수 있다. 이에, 산업적으로 유용하게 사용할 수 있고, 발효 안정성이 강화되어 L-트립토판을 효과적으로 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : Trp 오페론 발현강화 및 피드백 저항성(Feedback-resistant) trpE 변이 적용

야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-트립토판을 생산하지 못하거나 생산하더라도 극미량으로 생산할 뿐이므로, 생산에 필수적인 생합성 경로를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에서 강화하고자 하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에서, L-트립토판 생합성 유전자의 오페론(operon)을 프로모터 강화를 통해 발현을 향상시켰다. 또한 추가적으로 L-트립토판 생산 향상에 따른 TrpE 폴리펩티드의 피드백 제한 (feedback inhibition) 해소를 위해 TrpE의 N-말단으로부터 38번 아미노산인 세린 (Serine)을 알지닌 (Arginine)으로 치환하였다 (서열번호 32) (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Nov. 1987, p. 5330-5332).

이러한 유전자 조작을 위해 우선 염색체상 상동재조합 (Homologous recombination)이 발생하는 trpE 프로모터 업스트림 (Upstream) 과 trpE 38번 변이 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 trpE 프로모터 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 3와 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 trpE 38번 변이 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

합성 제작한 프로모터 SPL7(서열번호 5, 대한민국 등록특허 제 10-1783170호)을 주형으로 서열번호 6과 서열번호 7 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

서열번호 5 (SPL7 promoter seq.)

GGCGCTTCATGTCAACAATCTTTAACGTTTTCAAGTTCACAAGTCGTGTTCAAATGGTGACAAGATTGGACACTGTGCTGAATTGGCACCAAGCCCTCATAAATGATAGATCTAAATCGAATATCAATATATGGTCTGTTTATTGGAACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATCCGCTAAAGCCCCAGGAACCCTGTGCAGAAAGAACAAATAATCGTGAATTTTGGCAGCAACAGCAATTCCTGCTACAATTGAAAACGTGCAAAAGCATAGATTATTGGAGGAGATCAAAACA

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 62℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 trpE 38번 변이 앞 부분 단편을 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 62℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 trpE 프로모터 업스트림과 trpE 38번 변이 다운스트림 지역, SPL7 프로모터와 trpE 38번 앞 부분 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ(특허등록 제10-0924065호) 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-PSPL7-trpE (S38R)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

제작된 pDZ-PSPL7-trpE (S38R) 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 trp 오페론의 프로모터를 보다 강한 프로모터인 SPL7 프로모터로 교체하고, TrpE의 38번 아미노산이 세린에서 알지닌으로 교체(서열번호 32)된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 10과 서열번호 11를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA04-8325 로 명명하였다.

추가적으로 trpE S38R 변이만을 도입하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 trpE(S38R) 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 3와 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 trpE 38번 변이 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.

상기의 방법으로 증폭된 trpE(S38R) 업스트림과 trpE(S38R) 다운스트림 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-trpE (S38R)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

상기의 과정으로 제작된 pDZ-trpE (S38R) 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 TrpE의 38번 아미노산이 세린에서 알지닌으로 교체된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 10과 서열번호 11를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA04-8312 로 명명하였다.

그리고 trp 오페론의 프로모터를 보다 강한 프로모터인 SPL7 프로모터로 교체하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1와 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 trpE 프로모터 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 8과 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 trpE 프로모터 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.

합성 제작한 프로모터 SPL7을 주형으로 서열번호 6과 서열번호 7 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

상기의 방법으로 증폭된 trpE 프로모터 업스트림, trpE 프로모터 다운스트림과 SPL7 프로모터 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-SPL7_trpE 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

상기의 과정으로 제작된 pDZ-SPL7_trpE 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 trp 오페론이 강한 프로모터인 SPL7 프로모터로 교체된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 10과 서열번호 11를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA04-8315 로 명명하였다.

본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

서열번호 1 (Pspl7-trpE(S38R)_L-1)	TCGAGCTCGGTACCCAAACAACTGCGACGTGTGTC
서열번호 2 (Pspl7-trpE(S38R)_L-2)	CATGAAGCGCCGGTACCTTAATCATTTTTGGGTTC
서열번호 3 (Pspl7-trpE(S38R)_R-1)	GCCCTGTTGGAACGCGCTGATATCACCACCAAGAA
서열번호 4 (Pspl7-trpE(S38R)_R-2)	CTCTAGAGGATCCCCAGATGTCACCGTTGTAAATG
서열번호 6 (Pspl7 - 1)	CCCAAAAATGATTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA
서열번호 7 (Pspl7 - 2)	GGGATTCGTGCTCATGATATCTGTTTTGATCTCCTCC
서열번호 8 (trpE (S38R) - 1)	ATCAAAACAGATATCATGAGCACGAATCCCCATGT
서열번호 9 (trpE (S38R) - 2)	GTGGTGATATCAGCGCGTTCCAACAGGGCTGCATC
서열번호 10 (Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 1)	GAAGAAGAGGCTGCAGATG
서열번호 11 (Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 2)	GATCAGCGCCATCATGTT

실시예 2 : tkt 유전자 발현 강화 (트랜스케토라제 발현 강화)

트립토판의 전구체로서 에리스로즈 4-포스페이트의 원활한 공급을 위해 tkt 유전자의 과발현을 진행하고자 하였다.

이러한 유전자 조작을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 서열번호 12와 서열번호 13를 이용하여 tkt 유전자를 추가 삽입할 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 14와 서열번호 15를 이용하여 tkt 유전자를 추가 삽입할 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

또한, tkt 유전자와 프로모터를 확보하기 위하여, 야생종의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 16와 서열번호 17를 이용하여 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 20초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 tkt 유전자를 추가 삽입할 업스트림과 tkt 유전자를 추가 삽입할 다운스트림 지역, tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-Pn-tkt 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

제작된 pDZ-Pn-tkt 벡터를 각각 ATCC13869와 CJ04-8325 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 18과 서열번호 19 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 각각 CA04-8321과 CA04-8352 로 명명하였다.

본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

서열번호 12 (Pn-tkt_L - 1 )	TCGAGCTCGGTACCCAAACTTTGAGTGGGTGCGTG
서열번호 13 (Pn-tkt_L - 2 )	TCGAGCTACGAGGGCGGTTCCCAGCCCTTCATTAG
서열번호 14(Pn-tkt_R - 1)	ATTAACGGTTAATTGATTCTGGACGTCATGACTAC
서열번호 15(Pn-tkt_R - 2)	CTCTAGAGGATCCCCGCCTCGATGATGCAGTCGTC
서열번호 16(Pn-tkt - 1)	GAAGGGCTGGGAACCGCCCTCGTAGCTCGAGAGTT
서열번호 17(Pn-tkt - 2)	CATGACGTCCAGAATCAATTAACCGTTAATGGAGTCC
서열번호 18(Confirm_Pn-tkt - 1)	ACCCAGAACCCCAAATTTTC
서열번호 19 (Confirm_Pn-tkt - 2)	TTGAGTTCGACAACTTTGG

실시예 3: 코리네박테리움속 미생물의 트립토판 생산

상기 실시예 1 및 2에서 제작된 균주들의 트립토판 생산량을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.

종배지 (pH 7.0)

포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

생산배지 (pH 7.0)

포도당 30g, (NH₄)₂SO₄ 15 g, MgSO₄ 7H₂O 1.2 g, KH₂PO₄ 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

코리네박테리움 글루타미쿰 유래 L-트립토판 생산균주의 생산량 확인

	형질	사용한 포도당(g/L)	트립토판 생산량 (g/L)	트립토판 수율 *(100 g/g, %)**
ATCC13869		30	0.00	0.00
CA04-8312	trpE::trpE(S38R)	30	0.00	0.00
CA04-8315	Pn::SPL7_trpE	30	0.00	0.00
CA04-8321	::Pn_tkt	30	0.00	0.00
CA04-8325	Pn::SPL7_trpE(S38R)	30	0.05	0.16
CA04-8352	SPL7_trpE(S38R) , ::Pn_tkt	30	0.27	0.90

야생형 코리네박테리움, CA04-8312, CA04-8315, CA04-8321, CA04-8325, CA04-8352에 대한 배양물 중의 L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 3과 같다.

야생형 코리네박테리움의 trpE에 피드백이 해제된 변이가 도입된 CA04-8312와 트립토판 오페론(operon)이 발현 강화된 CA04-8315, 그리고 tkt가 강화된 CA04-8321 균주는 트립토판 생산이 확인되지 않았다. 하지만 이들 개별 형질들이 조합된 CA04-8352 균주의 경우, CA04-8325에 비해 약 5배나 향상된 트립토판을 생산하였다. 이는 트립토판에 대한 피드백이 해제된 트립토판 오페론 강화와 tkt 발현 강화가 조합되어야 트립토판 생산을 향상시킴을 의미한다. 야생형의 코리네박테리움속 미생물은 트립토판을 생산하지 않거나 생산하더라도 극미량의 트립토판만 생산할 뿐이므로 이러한 생산량 증가는 매우 의미 있는 효과로 해석된다.

실시예 4 : 대장균 유래 트립토판 오페론 발현 강화

트립토판의 생산을 더 향상시키기 위하여, 추가적인 대장균 유래 트립토판 오페론을 도입 및 발현 강화시키고자 하였다. 대장균 유래 트립토판 오페론을 강화시키기 위해서 강한 프로모터로 알려진 SPL7 프로모터와 대장균 TrpE 단백질의 피드백 제한이 해소된 trpE의 21번 아미노산인 프롤린(Proline)이 세린(Serine)으로 치환된 trpE (서열번호 33) 및 대장균 trpDCBA 형태로 강화를 진행하였다(J. Biochem. Mol. Biol. 32, 20-24 (1999)).

이러한 유전자 조작을 위해 우선 염색체상 상동재조합 (Homologous recombination)이 발생하는 프로모터 업스트림 (Upstream)과 trpDCBA 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 20와 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 프로모터 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 22와 서열번호 23의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

합성 제작한 프로모터 SPL7을 주형으로 서열번호 24과 서열번호 25 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

대장균 trpE 유전자의 아미노산 1부터 변이형 21번까지를 코딩하는 뉴클레오타이드를 확보하기 위하여, 대장균 W3110 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 27을 이용하여 PCR을 수행하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

대장균 trpE 유전자의 변이형 아미노산 21번부터 말단을 포함한 trpE 및 trpDCBA 까지를 코딩하는 뉴클레오타이드를 확보하기 위하여, 대장균 W3110 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 28과 서열번호 29를 이용하여 PCR을 수행하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 7분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.

염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 증폭된 업스트림 지역과 다운스트림 지역, SPL7 프로모터, 대장균 trpE P21S 앞 단편, 대장균 trpE P21S 을 포함한 말단 및 trpDCBA 유전자, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-PSPL7-trpE(P21S)DCBA.eco 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

제작된 pDZ-PSPL7-trpE(P21S)DCBA.eco 벡터를 각각 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869, CJ04-8321과 CJ04-8352 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 강한 프로모터인 SPL7 형태로 대장균 trpE(P21S)DCBA 오페론이 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 30과 서열번호 31 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 각각 CA04-8316, CA04-8330와 CA04-8357 로 명명하였다.

본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

서열번호 20 (TY384)	ttcgagctcggtacccGATCGAGGCTAACAAGGCA
서열번호 21 (HR-sp R)	GGTACCACTAAACCGGAAGGGCCCTCCTGCTGTACTTTCGACA
서열번호 22(trpA-HR F)	AGTTAAACTAAACAGGAAGAGCCAGTTAAGGGAC
서열번호 23(HR-vector R)	gactctagaggatccccATCATGGGAATCCGGCCAT
서열번호 24(HR-sp F)	GGCCCTTCCGGTTTAGTGGTACCGGCGCTTCATGTCAACAATC
서열번호 25(spl7-trpE R)	TTTGCATGATATCTGTTTTGATCTCCTCCAATA
서열번호 26(spl7-trpE F)	CAAAACAGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC
서열번호 27(trpE P21S R)	GAAAAAGCGCGGTGGAATTGTCGCGATAAGCGC
서열번호 28 (trpE P21S F)	CAAAACAGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC
서열번호 29(trpA-HR R)	TCTTCCTGTTTAGTTTAACTGCGCGTCGCCGCTT
서열번호 30(Nested 1F)	CGTTGACCCAAACATGCTG
서열번호 31(Nested 1R)	CTTCTTCATTTCGGCTATCG

실시예 5 : 대장균 트립토판 오페론이 강화된 균주 평가

상기 실시예 4에서 제작된 CA04-8316, CA04-8330 및 CA04-8357 균주들과 실시예 2에서 제작된 CA04-8352 균주의 트립토판 생산량을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.

종배지 (pH 7.0)

생산배지 (pH 7.0)

대장균 트립토판 오페론이 강화된 균주의 트립토판 생산량 확인

	형질	사용한 포도당(g/L)	트립토판 생산량 (g/L)	트립토판 수율 *(100 g/g, %)**
ATCC13869		30	0.00	0.00
CA04-8316	::SPL7_trpE(P21S)DCBA.eco	30	0.03	0.10
CA04-8330	::Pn_tkt, ::SPL7_trpE(P21S)DCBA.eco	30	0.32	1.06
CA04-8352	SPL7_trpE(S38R) , ::Pn_tkt	30	0.27	0.90
CA04-8357	SPL7_trpE(S38R) , ::Pn_tkt, ::SPL7_trpE(P21S)DCBA.eco	30	2.72	9.06

야생형 코리네박테리움, CA04-8316, CA04-8330, CA04-8352, CA04-8357에 대한 배양물 중의 L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 5와 같다.

야생형 코리네박테리움에 대장균 유래의 피드백이 해제된 trpE를 포함하는 트립토판 오페론(operon)이 발현 강화된 CA04-8316 균주는 0.03 g/L로 L-트립토판을 생산하였고, tkt만 강화된 CA04-8321 균주에 상기의 대장균 유래의 피드백이 해제된 트립토판 오페론이 강화된 CA04-8330 균주의 트립토판 생산량은 0.32 g/L로 향상되었다. 모든 유전자 조작을 종합한 CA04-8357 균주의 경우, 약 0.3~0.6 g/L 정도의 트립토판 생산량이 예상되었으나, CA04-8352 에 비해 약 10배나 향상된 2.72 g/L를 생산하였다.

상기 결과로부터 대장균 유래 피드백 해제된 트립토판 오페론과 모균주인 코리네박테리움형의 TKT (트랜스케토라제) 및 피드백 해제된 트립토판 오페론 강화가 조합되는 경우 예상치 못한 수준으로 생산량이 대폭 증가됨을 확인하였다. 즉, 대장균 유래의 피드백 해제된 트립토판 오페론과 코리네박테리움 유래의 피드백 해제된 트립토판 오페론과 전구체 향상이 함께 할 때 트립토판 생산에 시너지 효과가 크다는 것을 알 수 있다.

상기 균주, CA04-8352는 2018년 2월 2일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12218P로 기탁번호를 부여 받았다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12218P

20180202

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Tryptophan operon-enhanced microorganism and method for producing L-tryptophan using the same <130> KPA180110-KR <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pspl7-trpE(S38R)_L-1 <400> 1 tcgagctcgg tacccaaaca actgcgacgt gtgtc 35 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pspl7-trpE(S38R)_L-2 <400> 2 catgaagcgc cggtacctta atcatttttg ggttc 35 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pspl7-trpE(S38R)_R-1 <400> 3 gccctgttgg aacgcgctga tatcaccacc aagaa 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pspl7-trpE(S38R)_R-2 <400> 4 ctctagagga tccccagatg tcaccgttgt aaatg 35 <210> 5 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spl7 promoter seq. <400> 5 ggcgcttcat gtcaacaatc tttaacgttt tcaagttcac aagtcgtgtt caaatggtga 60 caagattgga cactgtgctg aattggcacc aagccctcat aaatgataga tctaaatcga 120 atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc atccgctaaa 180 gccccaggaa ccctgtgcag aaagaacaaa taatcgtgaa ttttggcagc aacagcaatt 240 cctgctacaa ttgaaaacgt gcaaaagcat agattattgg aggagatcaa aaca 294 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pspl7 - 1 <400> 6 cccaaaaatg attaaggtac cggcgcttca tgtca 35 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pspl7 - 2 <400> 7 gggattcgtg ctcatgatat ctgttttgat ctcctcc 37 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trpE (S38R) - 1 <400> 8 atcaaaacag atatcatgag cacgaatccc catgt 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trpE (S38R) - 2 <400> 9 gtggtgatat cagcgcgttc caacagggct gcatc 35 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 1 <400> 10 gaagaagagg ctgcagatg 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 2 <400> 11 gatcagcgcc atcatgtt 18 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-tkt_L - 1 <400> 12 tcgagctcgg tacccaaact ttgagtgggt gcgtg 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-tkt_L - 2 <400> 13 tcgagctacg agggcggttc ccagcccttc attag 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-tkt_R - 1 <400> 14 attaacggtt aattgattct ggacgtcatg actac 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-tkt_R - 2 <400> 15 ctctagagga tccccgcctc gatgatgcag tcgtc 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-tkt - 1 <400> 16 gaagggctgg gaaccgccct cgtagctcga gagtt 35 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-tkt - 2 <400> 17 catgacgtcc agaatcaatt aaccgttaat ggagtcc 37 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Confirm_Pn-tkt - 1 <400> 18 acccagaacc ccaaattttc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Confirm_Pn-tkt - 2 <400> 19 ttgagttcga caactttgg 19 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TY384 <400> 20 ttcgagctcg gtacccgatc gaggctaaca aggca 35 <210> 21 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-sp R <400> 21 ggtaccacta aaccggaagg gccctcctgc tgtactttcg aca 43 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trpA-HR F <400> 22 caaaacagat atcatgcaaa cacaaaaacc gac 33 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-vector R <400> 23 gactctagag gatccccatc atgggaatcc ggccat 36 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR-sp F <400> 24 ggcccttccg gtttagtggt accggcgctt catgtcaaca atc 43 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spl7-trpE R <400> 25 tttgcatgat atctgttttg atctcctcca ata 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spl7-trpE F <400> 26 caaaacagat atcatgcaaa cacaaaaacc gac 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trpE P21S R <400> 27 gaaaaagcgc ggtggaattg tcgcgataag cgc 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trpE P21S F <400> 28 caaaacagat atcatgcaaa cacaaaaacc gac 33 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trpA-HR R <400> 29 tcttcctgtt tagtttaact gcgcgtcgcc gctt 34 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested 1F <400> 30 cgttgaccca aacatgctg 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested 1R <400> 31 cttcttcatt tcggctatcg 20 <210> 32 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cgl trpE S38R <400> 32 Met Ser Thr Asn Pro His Val Phe Ser Leu Asp Val Arg Tyr His Glu 1 5 10 15 Asp Ala Ser Ala Leu Phe Ala His Leu Gly Gly Thr Thr Ala Asp Asp 20 25 30 Ala Ala Leu Leu Glu Arg Ala Asp 35 40 <210> 33 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eco trpE P21S <400> 33 Met Gln Thr Gln Lys Pro Thr Leu Glu Leu Leu Thr Cys Glu Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Arg Asp Asn Ser Thr Ala Leu Phe His Gln Leu Cys Gly Asp Arg 20 25 30 Pro Ala Thr Leu Leu Leu Glu Ser 35 40 <210> 34 <211> 6770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of tryptophan operon - Corynebacterium glutamicum <400> 34 atgagcacga atccccatgt tttctcccta gatgtccgct atcacgagga tgcttctgcg 60 ttgtttgccc acttgggtgg cacaaccgca gatgatgcag ccctgttgga acgcgctgat 120 atcaccacca agaatggtat ttcttccctc gcggtgttga agagttcggt gcgcattacg 180 tgcacgggca acacggtggt aacgcagccg ctgacggact cgggtagggc agtggttgcg 240 cgcctaacac agcagcttgg ccagtacaac accgcagaga acacctttag cttccccgcc 300 tccgatgcgg ttgatgagcg cgagcgcctc accgcaccaa gcaccatcga agtgctgcgc 360 aagttgcagt tcgagtccgg ctacagcgac gcgtccctgc cactgctcat gggcggtttc 420 gcctttgatt tcttagaaac ctttgaaacg ctccccgcag tcgaggaaag cgtcaacact 480 taccccgatt accagttcgt cctcgcggaa atcgtcctgg acatcaatca ccaggaccag 540 accgccaaac tcaccggcgt ctccaacgcc ccaggcgagc tcgaggccga gctcaacaag 600 ctttcattgc ttatcgacgc cgccctcccc gcaaccgaac acgcctacca aaccacccct 660 cacgacggcg acactcttcg cgttgtggct gatattcccg atgctcagtt ccgcactcag 720 atcaatgagc tgaaagaaaa catttacaac ggtgacatct accaagttgt cccggcgcgc 780 actttcaccg caccatgtcc tgatgcattc gctgcttatc tgcagctgcg tgccaccaac 840 ccgtcgccgt acatgttcta tatccgtgga ctcaacgaag gtcgctccta tgaacttttt 900 ggcgcatccc ctgagtccaa cctcaagttc accgctgcta accgtgagct gcagctgtac 960 ccaatcgcag gtacccgccc ccgtggactc aacccagatg gctccatcaa cgatgagcta 1020 gatatccgca atgagttgga tatgcgcact gatgccaaag agatcgcgga gcacaccatg 1080 cttgtcgatc tcgcccgcaa cgacctcgcc cgcgtctcgg tcccagcgtc gcgccgggtt 1140 gcggatcttt tgcaggtgga tcgctattcc cgcgtgatgc acttggtgtc ccgtgtgacg 1200 gcgacgttgg acccagagct tgatgctttg gacgcctatc gggcgtgcat gaatatgggc 1260 acgttgaccg gcgctccgaa gttgcgcgct atggagctgt tgcgcggcgt cgaaaagcgc 1320 aggcgtggtt cttatggtgg ggcagtgggg tacctgcgcg gcaatggcga tatggataat 1380 tgcattgtta ttcgttcggc gtttgtccag gatggtgtgg ctgctgtgca ggctggtgct 1440 ggtgtggtcc gcgattctaa tcctcaatct gaagccgatg agacgttgca caaggcgtat 1500 gccgtgttga atgccattgc gcttgctgct ggttccactt tggaggtcat ccgatgacac 1560 acgttgttct cattgataat cacgattctt ttgtctacaa cctggtggat gcgttcgccg 1620 tggccggtta taagtgcacg gtgttccgca atacggtgcc agttgaaacc attttggcag 1680 ccaacccgga cctgatctgc ctttcacctg gacctggtta ccctgccgat gcgggcaaca 1740 tgatggcgct gatcgagcgc acactcggcc agattccttt actgggtatt tgcctcggct 1800 accaggcact catcgaatac cacggcggca aggttgagcc ttgtggccct gtgcacggca 1860 ccaccgacaa catgatcctt actgatgcag gtgtgcagag ccctgttttt gcaggtcttg 1920 ccactgatgt tgagcctgat catccagaag tcccaggccg caaggttcca attggccgtt 1980 atcactcact gggctgcgtg gttgccccag acggtattga atcattgggc acctgttcct 2040 ctgagattgg tgatgtcatc atggcggcac gcaccaccga tggaaaggcc attggcctgc 2100 agtttcaccc tgagtcagtg ctgagcccaa cgggtcctat cattttgtcc cgctgtgtcg 2160 aacaacttct cgcgaactaa taaaaaggat ttgattcatg acttctccag caacactgaa 2220 agttctcaac gcctacttgg ataaccccac tccaaccctg gaggaggcaa ttgaggtgtt 2280 caccccgctg accgtgggtg aatacgatga cgtgcacatc gcagcgctgc ttgcgaccat 2340 ccgtactcgc ggtgagcagt tcgctgatat tgccggcgct gccaaggcat tcctcgcggc 2400 ggctcgtccg ttcccgatta ctggcgcagg tttgctagat tccgctggca ctggtggcga 2460 cggtgccaac accatcaaca tcaccaccgg cgcatccctg atcgcagcat ccggtggagt 2520 gaagctggtt aagcacggca accgttcggt gagctccaag tccggctccg ccgatgtgct 2580 ggaagcgctg aatattcctt tgggccttga tgtggatcgt gctgtgaagt ggttcgaagc 2640 gtccaacttc accttcctgt tcgcacctgc gtacaaccct gaaattgcgc atgtgcagcc 2700 ggttcgccag gcgctgaaat tccccaccat cttcaacacg cttggaccat tgctgtcccc 2760 ggcgcgcccg gagcgtcaga tcatgggcgt ggccaatgcc aatcatggac agctcatcgc 2820 cgaggtcttc cgcgagttgg gccgtacacg cgcgcttgtt gtgcatggcg caggcaccga 2880 tgagatcgca gtccacggca ccaccttggt gtgggagctt aaagaagacg gcaccatcga 2940 gcattacacc atcgagcctg aggaccttgg ccttggccgc tacacccttg aggatctcgt 3000 gggtggcctc ggcactgaga acgccgaagc tatgcgcgct actttcgcgg gcaccggccc 3060 tgatgcacac cgtgatgcgt tggctgcgtc cgcaggtgcg atgttctatc tcaacggcga 3120 tgtcgactcc ttgaaggatg gtgcacaaaa ggcgctttcc ttgcttgccg acggcaccac 3180 ccaggcatgg ttggccaagc acgaagagat cgattactca gaaaaggagt cttccaatga 3240 ctagtaataa tctgcccacg gtgttggaaa gcatcgtgga gggtcgtcgc ggacacctgg 3300 aggaaattcg cgctcgcatc gctcacgtgg atgtggatgc gcttccaaaa tccacccgct 3360 ctctgttcga ttccctcaac cagggtaggg gaggggcgcg tttcatcatg gagtgcaagt 3420 ccgcatcgcc ttctttggga atgattcgtg agcactacca gccgggtgaa atcgctcgcg 3480 tgtactctcg ctacgccagc ggcatttccg tgctgtgcga gccggatcgt tttggtggcg 3540 attacgatca cctcgctacc gttgccgcta cctctcatct tccggtgctg tgcaaagact 3600 tcatcattga tcctgtccag gtacacgcgg cgcgttactt tggtgctgat gccatcctgc 3660 tcatgctctc tgtgcttgat gatgaagagt acgcagcact cgctgccgag gctgcgcgtt 3720 ttgatctgga tatcctcacc gaggttattg atgaggagga agtcgcccgc gccatcaagc 3780 tgggtgcgaa gatctttggc gtcaaccacc gcaacctgca tgatctgtcc attgatttgg 3840 atcgttcacg tcgcctgtcc aagctcattc cagcagatgc cgtgctcgtg tctgagtctg 3900 gcgtgcgcga taccgaaacc gtccgccagc taggtgggca ctccaatgca ttcctcgttg 3960 gctcccagct gaccagccag gaaaacgtcg atctggcagc ccgcgaattg gtctacggcc 4020 ccaacaaagt ctgcggactc acctcaccaa gtgcagcaca aaccgctcgc gcagcgggtg 4080 cggtctacgg cgggctcatc 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Gln Gly Ser 85 90 95 Phe Asn Phe Leu Pro Ile Val Ser Gln Ile Ala Pro Gln Pro Ile Leu 100 105 110 Cys Lys Asp Phe Ile Ile Asp Pro Tyr Gln Ile Tyr Leu Ala Arg Tyr 115 120 125 Tyr Gln Ala Asp Ala Cys Leu Leu Met Leu Ser Val Leu Asp Asp Asp 130 135 140 Gln Tyr Arg Gln Leu Ala Ala Val Ala His Ser Leu Glu Met Gly Val 145 150 155 160 Leu Thr Glu Val Ser Asn Glu Glu Glu Gln Glu Arg Ala Ile Ala Leu 165 170 175 Gly Ala Lys Val Val Gly Ile Asn Asn Arg Asp Leu Arg Asp Leu Ser 180 185 190 Ile Asp Leu Asn Arg Thr Arg Glu Leu Ala Pro Lys Leu Gly His Asn 195 200 205 Val Thr Val Ile Ser Glu Ser Gly Ile Asn Thr Tyr Ala Gln Val Arg 210 215 220 Glu Leu Ser His Phe Ala Asn Gly Phe Leu Ile Gly Ser Ala Leu Met 225 230 235 240 Ala His Asp Asp Leu His Ala Ala Val Arg Arg Val Leu Leu Gly Glu 245 250 255 Asn Lys Val Cys Gly Leu Thr Arg Gly Gln Asp Ala Lys Ala Ala Tyr 260 265 270 Asp Ala Gly Ala Ile Tyr Gly Gly Leu Ile Phe Val Ala Thr Ser Pro 275 280 285 Arg Cys Val Asn Val Glu Gln Ala Gln Glu Val Met Ala Ala Ala Pro 290 295 300 Leu Gln Tyr Val Gly Val Phe Arg Asn His Asp Ile Ala Asp Val Val 305 310 315 320 Asp Lys Ala Lys Val Leu Ser Leu Ala Ala Val Gln Leu His Gly Asn 325 330 335 Glu Glu Gln Leu Tyr Ile Asp Thr Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala His 340 345 350 Val Ala Ile Trp Lys Ala Leu Ser Val Gly Glu Thr Leu Pro Ala Arg 355 360 365 Glu Phe Gln His Val Asp Lys Tyr Val Leu Asp Asn Gly Gln Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gln Arg Phe Asp Trp Ser Leu Leu Asn Gly Gln Ser Leu Gly 385 390 395 400 Asn Val Leu Leu Ala Gly Gly Leu Gly Ala Asp Asn Cys Val Glu Ala 405 410 415 Ala Gln Thr Gly Cys Ala Gly Leu Asp Phe Asn Ser Ala Val Glu Ser 420 425 430 Gln Pro Gly Ile Lys Asp Ala Arg Leu Leu Ala Ser Val Phe Gln Thr 435 440 445 Leu Arg Ala Tyr 450 <210> 47 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trpB-eco <400> 47 Met Thr Thr Leu Leu Asn Pro Tyr Phe Gly Glu Phe Gly Gly Met Tyr 1 5 10 15 Val Pro Gln Ile Leu Met Pro Ala Leu Arg Gln Leu Glu Glu Ala Phe 20 25 30 Val Ser Ala Gln Lys Asp Pro Glu Phe Gln Ala Gln Phe Asn Asp Leu 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Ala Gly Arg Pro Thr Ala Leu Thr Lys Cys Gln Asn 50 55 60 Ile Thr Ala Gly Thr Asn Thr Thr Leu Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu 65 70 75 80 Leu His Gly Gly Ala His Lys Thr Asn Gln Val Leu Gly Gln Ala Leu 85 90 95 Leu Ala Lys Arg Met Gly Lys Thr Glu Ile Ile Ala Glu Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Gln His Gly Val Ala Ser Ala Leu Ala Ser Ala Leu Leu Gly Leu 115 120 125 Lys Cys Arg Ile Tyr Met Gly Ala Lys Asp Val Glu Arg Gln Ser Pro 130 135 140 Asn Val Phe Arg Met Arg Leu Met Gly Ala Glu Val Ile Pro Val His 145 150 155 160 Ser Gly Ser Ala Thr Leu Lys Asp Ala Cys Asn Glu Ala Leu Arg Asp 165 170 175 Trp Ser Gly Ser Tyr Glu Thr Ala His Tyr Met Leu Gly Thr Ala Ala 180 185 190 Gly Pro His Pro Tyr Pro Thr Ile Val Arg Glu Phe Gln Arg Met Ile 195 200 205 Gly Glu Glu Thr Lys Ala Gln Ile Leu Glu Arg Glu Gly Arg Leu Pro 210 215 220 Asp Ala Val Ile Ala Cys Val Gly Gly Gly Ser Asn Ala Ile Gly Met 225 230 235 240 Phe Ala Asp Phe Ile Asn Glu Thr Asn Val Gly Leu Ile Gly Val Glu 245 250 255 Pro Gly Gly His Gly Ile Glu Thr Gly Glu His Gly Ala Pro Leu Lys 260 265 270 His Gly Arg Val Gly Ile Tyr Phe Gly Met Lys Ala Pro Met Met Gln 275 280 285 Thr Glu Asp Gly Gln Ile Glu Glu Ser Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Pro Ser Val Gly Pro Gln His Ala Tyr Leu Asn Ser Thr Gly 305 310 315 320 Arg Ala Asp Tyr Val Ser Ile Thr Asp Asp Glu Ala Leu Glu Ala Phe 325 330 335 Lys Thr Leu Cys Leu His Glu Gly Ile Ile Pro Ala Leu Glu Ser Ser 340 345 350 His Ala Leu Ala His Ala Leu Lys Met Met Arg Glu Asn Pro Asp Lys 355 360 365 Glu Gln Leu Leu Val Val Asn Leu Ser Gly Arg Gly Asp Lys Asp Ile 370 375 380 Phe Thr Val His Asp Ile Leu Lys Ala Arg Gly Glu Ile 385 390 395 <210> 48 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TrpA-eco <400> 48 Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys Glu 1 5 10 15 Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile Glu Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu 35 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Phe Val Gln Pro Met Lys Ala Ala Thr Arg Ser 260 265

Claims

N-말단이 서열번호 32의 아미노산 서열로 구성되고 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 트립토판 오페론 및 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자의 발현이 강화된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 트립토판 오페론 발현의 강화는 트립토판 오페론의 프로모터가 내재적 프로모터에 비해 발현 활성이 증가한 프로모터로 치환된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 N-말단이 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성된 피드백 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 대장균 유래 트립토판 오페론이 도입되고 발현이 강화된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제3항에 있어서, 상기 대장균 유래 트립토판 오페론은 트립토판 오페론의 프로모터가 내재적 프로모터에 비해 발현 활성이 증가한 프로모터로 치환된, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
N-말단이 서열번호 32의 아미노산 서열로 구성되고 피드백 저해가 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 트립토판 오페론 및 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자의 발현이 강화된 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 N-말단이 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성된 피드백 해제된 안스라닐산 합성효소를 코딩하는 유전자와 이를 포함하는 대장균 유래 트립토판 오페론이 발현되도록 변형된, L-트립토판 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-트립토판 생산 방법.