JP2000232890A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を
育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造
法を提供する。 【解決手段】 細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子のコピー数を高めることにより細胞中
のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され、かつＬ
−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を、好まし
くはビタミンＢ₁を２０μｇ／Ｌ以上含有する培地に培
養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せし
め、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−グルタミン酸
生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸
の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品
等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】

【０００３】従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミ
ン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバク
テリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により
工業生産されている（アミノ酸発酵、学会出版センタ
ー、１９５〜２１５頁、１９８６年）。これらのコリネ
型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離
した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。

【０００４】また、組換えＤＮＡ技術により、Ｌ−グル
タミン酸生合成系酵素の遺伝子を増強することによっ
て、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術
が開示されている。例えば、特開昭63-214189号公報に
は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ
遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強すること
によって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術
が開示されている。

【０００５】しかし、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子をコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の育種に利用する
ことは知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高い
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安
価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供するこ
とにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｌ−グルタ
ミン酸生産能を有するコリネ型細菌のピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ活性を増強することによって、Ｌ−グルタミ
ン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに成
功し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
以下のとおりである。

【０００８】（１）細胞中のピルビン酸デヒドロゲナー
ゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有す
るコリネ型細菌。 （２）前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、
前記細菌細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子のコピー数を高めることによるものである
（１）のコリネ型細菌。

【０００９】（３）ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（２）の
コリネ型細菌。 （４）前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のコリ
ネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミン
酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−グルタミン酸を
採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。

【００１０】（５）前記培地がビタミンＢ₁を２０μｇ
／Ｌ以上含有することを特徴とする（４）の方法。 （６）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ。 （Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタン
パク質。 （Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又
は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸
デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 （７）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（６）
のＤＮＡ。 （ａ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からな
る塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からな
る塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ。 （８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び
０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行わ
れる条件である（７）のＤＮＡ。

【００１１】本発明において「Ｌ−グルタミン酸生産
能」とは、本発明のコリネ型細菌を培地に培養したとき
に、培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。
このＬ−グルタミン酸生産能は、コリネ型細菌の野生株
の性質として有するものであってもよく、育種によって
付与または増強された性質であってもよい。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】＜１＞本発明のコリネ型細菌 本発明のコリネ型細菌は、細胞中のピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能
を有するコリネ型細菌である。

【００１４】コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合
された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 25
5 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁な
ブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型
細菌の例として以下のものが挙げられる。

【００１５】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム 具体的には、下記のような菌株を例示することができ
る。

【００１６】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４

【００１７】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各菌株ごとに対応する登録番
号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受
けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに
記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-1539の受託番
号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。

【００１８】＜２＞ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の
増幅 コリネ型細菌細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性
を増幅するには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好まし
くはマルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮ
Ａを作製し、これをＬ−グルタミン酸生産能を有する宿
主細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細
胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
のコピー数が上昇する結果、ピルビン酸デヒドロゲナー
ゼ活性が増幅される。

【００１９】ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、エシェリ
ヒア・コリでは、E1、E2、E3の３個のサブユニットから
なるヘテロオリゴマーであり、それぞれaceE遺伝子、ac
eF遺伝子およびlpd遺伝子にコードされ、これらの遺伝
子はオペロンを形成している。本発明にいうピルビン酸
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又はピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子とは、このようなピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体をコードするオペロン、又は、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーをコード
する遺伝子をいう。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を
有するモノマーとしては、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムのpdhA遺伝子によりコードされるE1サブ
ユニットが挙げられる。

【００２０】ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、コ
リネ型細菌由来の遺伝子、及びエシェリヒア属細菌等の
他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができ
る。

【００２１】エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸
デヒドロゲナーゼ複合体遺伝子の塩基配列は既に明らか
にされている（FEMS Microbiology Letters、第44巻、4
17頁、1987年）ので、その塩基配列に基づいて作製した
プライマー、例えば配列表配列番号１及び２に示すプラ
イマーを用いて、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳
型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain reactio
n； White,T.J. et al;Trends Genet. 5,185(1989)参
照）によって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取
得することができる。他の微生物由来のピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子も、同様にして取得され得る。コリ
ネ型細菌由来の遺伝子については後述する。

【００２２】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miur
a Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により調
製することができる。

【００２３】ＰＣＲ法により増幅されたピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／又は
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクター
ＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェ
リヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやす
くなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、宿主の細胞内で自立複製可能な
プラスミドベクターが好ましく、例えば pUC19、pUC1
8、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が
挙げられる。

【００２４】コリネ型細菌で機能するベクターとは、例
えばコリネ型細菌で自律複製出来るプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。

【００２５】 ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照 ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照 ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照 ｐＡＪ ６１１ 同 上 ｐＡＪ １８４４ 同 上 ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照 ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照 ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照 ｐＣＧ １１ 同 上 ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照

【００２６】ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とコリ
ネ型細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡ
を調製するには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の
末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが
普通である。

【００２７】上記のように調製した組み換えＤＮＡをコ
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。

【００２８】ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅
は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネ型細菌
の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても
達成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮ
Ａ上にピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を多コピーで
導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列
を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ
上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮ
Ａ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピ
ートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５
号公報に開示されているように、ピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移さ
せて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能であ
る。いずれの方法によっても形質転換株内のピルビン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。

【００２９】ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅
は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又
はプラスミド上のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の
プロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する
ことによっても達成される（特開平１−２１５２８０号
公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモータ
ー、ラムダファージのＰ_Rプロモーター、Ｐ_Lプロモータ
ー等が強力なプロモーターとして知られている。これら
のプロモーターへの置換により、ピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子の発現が強化されることによってピルビン
酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。発現調節配列の
増強は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数
を高めることと組み合わせてもよい。

【００３０】また、本発明のコリネ型細菌は、ピルビン
酸デヒドロゲナーゼ以外の他のＬ−グルタミン酸生合成
を触媒する酵素の活性が高められていてもよい。このよ
うなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素としては、
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテター
ゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンター
ゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムター
ゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が
ある。

【００３１】さらに、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路か
ら分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよ
い。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グ
ルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫ
ＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラン
スフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、等
がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好まし
い。

【００３２】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、
１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。

【００３３】＜３＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのピルビン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（pdhA）は、例えばブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９
株の染色体ＤＮＡから、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配
列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列
表の配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマーを
用いたPCRにより取得することができる。

【００３４】pdhA遺伝子は、上記のようにしてＰＣＲに
より取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの塩基配
列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブと
するハイブリダイゼーションによって、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡリブラリー
から取得することもできる。

【００３５】ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブ
リダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、
ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambroo
k,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, C
old Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記
載されている。

【００３６】本発明のＤＮＡは、コードされるピルビン
酸デヒドロゲナーゼの活性が損なわれない限り、１若し
くは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼをコードするものであってもよい。ここで、
「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造に
おける位置や種類によっても異なるが、具体的には、前
記「数個」は、２から４００個、好ましくは、２から１
００個、より好ましくは２から２０個である。

【００３７】上記のようなピルビン酸デヒドロゲナーゼ
と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例
えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸
残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように
塩基配列を改変することによって得られる。また、上記
のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処
理によっても取得され得る。変異処理としては、ピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシ
ルアミン等でインビトロ処理する方法、及びピルビン酸
デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを保持する微生
物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理する方法が挙げられる。

【００３８】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、ピルビン酸デヒドロゲナー
ゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場
合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含
まれる。

【００３９】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ活性を調べることにより、ピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが
得られる。また、変異を有するピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞か
ら、例えば配列表の配列番号９の塩基番号２３６０〜５
１２５からなる塩基配列を有するＤＮＡ又は同塩基配列
を有するＤＮＡから調製されるプローブとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼを有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を単離することによっても、ピルビン酸デヒドロゲナー
ゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得
られる。前記プローブは、配列番号９のＤＮＡからＰＣ
Ｒによって適当な領域を増幅することによって得ること
ができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば４０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好まし
くは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃
度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００４０】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ活性を、公知の方法（Methods
in Enzymology、第9巻、248〜249頁、1966年）で測定す
ることによって容易に取り除くことができる。

【００４１】＜４＞本発明のコリネ型細菌を用いたＬ−
グルタミン酸の生産 コリネ型細菌に属し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性
が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株
を用いてＬ−グルタミン酸を生産させるには、炭素源、
窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタ
ミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用
いて常法により行うことができる。合成培地または天然
培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素
源及び窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならば
いずれの種類を用いてもよい。

【００４２】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

【００４３】窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。

【００４４】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使
用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株
を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必
要である。

【００４５】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
本発明のコリネ型細菌は、通常のＬ−グルタミン酸生産
菌の培養に用いる培地に必要とするよりも少量のビタミ
ンＢ₁存在下、例えば２０μg／Ｌ以下のビタミンＢ₁存
在下でも、従来の方法と同程度のＬ−グルタミン酸を生
産することができる。また、本発明のコリネ型細菌の培
養に用いる培地に、ビタミンＢ₁を２０μg／Ｌ以上、好
ましくは５００μg／Ｌ以上含有させることにより、Ｌ
−グルタミン酸の生産量を増大させることができる。

【００４６】培養方法は、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨ
を５〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが
下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニ
アガス等のアルカリで中和する。かくして１０時間〜４
日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グル
タミン酸が蓄積される。

【００４７】培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析す
る方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によっ
て採取される。

【００４８】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４９】

【実施例１】＜１＞エシェリヒア・コリＫ−１２のピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（FEMS
Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）。報
告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号１及び
２に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−
１２由来ＪＭ１０９株（宝酒造社製）の染色体ＤＮＡを
鋳型にしてＰＣＲ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子を増幅した。

【００５０】合成したプライマーの内、配列番号１は、
FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年に
記載されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩
基配列図の1039番目から1071番目の塩基に至る配列に相
当するが、1039番目と1042番目と1046番目の塩基をA
に、1040番目と1043番目の塩基をTに、1044番目の塩基
をGに変更し、制限酵素XhoIの認識配列を挿入してい
る。配列番号２は、FEMS Microbiology Letters、第44
巻、417頁、1987年に記載されているピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子の塩基配列図の7700番目から7732番目
の塩基に至る配列に相当するが、7726番目と7727番目と
7730番目の塩基をAに、7729番目の塩基をCに、7724番目
の塩基をTに変更し、制限酵素XhoIの認識配列を挿入し
た塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したもので
ある。

【００５１】エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体
ＤＮＡの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生
物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。ま
た、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、
共立出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標
準反応条件を用いた。

【００５２】生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、
制限酵素XbaIとXhoIを反応させ、制限酵素XbaIとXhoIで
切断したpHSG396（宝酒造社製）とライゲーションキッ
ト（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・
コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用
いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａ
ｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコ
ール20μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０
ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布
し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。

【００５３】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２
年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入
されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されて
いるピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素地図
（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987
年）と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が
挿入されているプラスミドをpHSGEPDHと名付けた。

【００５４】さらに、調製したプラスミドpHSGEPDHは、
制限酵素XbaIとSacIを反応させ、制限酵素XbaIとSacIで
切断したpMW219（ニッポンジーン製）とライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）
を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−
Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン
25μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／
Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一
晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロ
ニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカ
リ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、
培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した
後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を
作成し、報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有す
るＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpMWEPDHと
名付けた。

【００５５】さらに、クローニングされたピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子が発現していることを確認するた
め、JM109株及び、pMWEPDHを保持するJM109株のピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ活性をWillms等の方法（Methods
in Enzymology、第9巻、248〜249頁、1966年）により測
定した。その結果、表１に示すように、pMWEPDHを保持
するJM109株ではJM109株の約４倍のピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を示すことから、ピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子が発現していることを確認した。

【００５６】

【表１】表１ ─────────────────────── 菌 株 PDH活性（units/mg蛋白質） ─────────────────────── JM109 0.03 JM109/pMWEPDH 0.12 ───────────────────────

【００５７】＜２＞エシェリヒア・コリＫ−１２株由来
ＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およ
びコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドの作製 エシェリヒア・コリＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子およびコリネ型細菌の複製起点を有する
プラスミドを構築するために、既に取得されているコリ
ネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric.
Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点
を持つプラスミドpHK4（特開平５−７４９１号）を制限
酵素BamHI及びKpnIで消化して、複製起点を含む遺伝子
断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット
（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した
後、XbaIリンカー（宝酒造社製）を用いて、上記＜１＞
でクローニングされたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株
のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するプラス
ミドpMWEPDHのXbaI部位に挿入した。本プラスミドをpEP
DHと名付けた。

【００５８】（３）コリネ型細菌へのpEPDHの導入と培
養評価 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）に
よりプラスミドｐEPDHで形質転換し、得られた形質転換
株を得た。得られた形質転換株AJ13029／pEPDHを用いて
Ｌ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行っ
た。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレ
ート培地にて培養して得たAJ13029／pEPDH株の菌体を、
グルコース 30g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄・7H₂O 0.4g、(NH₄)₂
SO₄ 30g、FeSO₄・7H₂O 0.01g、MnSO₄・7H₂O 0.01g、大豆
加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩 200μg、ビオ
チン60μg、カナマイシン25mg及びCaCO₃ 50g を純水１
Ｌ中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調整されている）
に接種し31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう
培養した。得られた培養物を、上記と同じ組成の培地に
５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振
とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029株をpHK4で電気パル
ス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養し
た。

【００５９】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表２に示し
た。なお、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ13029は平成６年９月２日付けで通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＰ−１
４５０１として寄託され、１９９５年８月１日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５１８９が付与されている。

【００６０】

【表２】表２ ─────────────────────── 菌 株 Ｌ−グルタミン酸収率（％） ─────────────────────── AJ13029／pHK4 55.1 AJ13029／pEPDH 57.3 ───────────────────────

【００６１】（４）Ｌ−グルタミン酸生産性に対するビ
タミンB₁添加効果の評価ピルビン酸デヒドロゲナーゼの
補酵素チアミン二リン酸（TPP）の前駆体であるビタミ
ンB₁（サイアミン）の添加効果を調べるために、ピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ活性増強株AJ13029／pEPDH株を、
ビタミンB₁の濃度を変えた培地でＬ−グルタミン酸生産
のための培養を以下のように行った。

【００６２】２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ
２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pEPDH株の
菌体を、グルコース 30g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄・7H₂O 0.4
g、(NH₄)₂SO₄ 30g、FeSO₄・7H₂O 0.01g、MnSO₄・7H₂O 0.0
1g、大豆加水分解液15ml、ビオチン 60μg、カナマイシ
ン25mg及びCaCO₃ 50gを純水１Ｌ中に含む培地（KOHを用
いてpH8.0に調整されている）１Ｌに接種し、31.5℃に
て培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られ
た培養物を、サイアミン塩酸塩をそれぞれ0、10μg、20
μg、200μg、2mg、又は20mg含むこと以外は上記と同じ
組成の培地に、５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消
費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株
を、前記pHK4で電気パルス法（特開平２−２０７７９１
号公報参照）により形質転換した菌株を、上記と同様に
して培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン
酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡ
Ｓ−２１０により測定した。このときの結果を表３及び
図１に示した。

【００６３】

【表３】 表３ ─────────────────────────────── 菌株 サイアミン塩酸塩濃度(μg/L) L-ク゛ルタミン酸収率(%) ─────────────────────────────── AJ13029／pHK4 0 53.5 10 53.6 20 54.3 200 55.1 2000 55.5 20000 55.6 ─────────────────────────────── AJ13029／pEPDH 0 53.6 10 53.9 20 55.0 200 57.3 2000 57.7 20000 57.8 ───────────────────────────────

【００６４】以上の結果から、ピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子を導入してピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性
を増強したコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産
菌は、Ｌ−グルタミン酸収率が向上することが判明し
た。

【００６５】また、コリネ型細菌に属するＬ−グルタミ
ン酸生産菌、及び、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
を導入してピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強した
コリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、いず
れも培地中のビタミンB₁濃度が20μg/L以上の培地中で
培養することにより収率が向上することが判明した。

【００６６】

【実施例２】＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムＡＴＣＣ１３８６９のpdhA遺伝子のクローニン
グ 大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼのE1サブユニット間で相同性の高い領域を選び、配
列番号３および配列番号４に示すプライマーを合成し、
Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Gen
omic DNA Purification Kitによって調製したブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６
９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリー
エーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁
に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、反応液
をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．３キロベ
ースのＤＮＡ断片増幅していることが判明した。

【００６７】得られたＤＮＡは、配列番号３および配列
番号４の合成DNAを用いて、両端の塩基配列の決定を行
った。塩基配列の決定は、DNA Sequencing Kit（Applie
d Biosystems社製）を用いてSangerの方法（J. Mol. Bi
ol., 143, 161（1980））に従って行った。決定された
塩基配列をアミノ酸に翻訳して、大腸菌、緑膿菌および
結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニット
と比較したところ、相同性が高かったので、ＰＣＲによ
り増幅したDNA断片はブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子の一部
であると判断し、その遺伝子の上流および下流部分のク
ローニングを、以下に示すようにして行った。

【００６８】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムＡＴＣＣ１３８６９染色体を制限酵素EcoRI、BamHI、
HindIII、PstI、SalI、XbaI（宝酒造社製）で消化したD
NA断片から、上流部分をクローニングするために配列表
配列番号５および配列番号６に示したプライマーを使
い、下流部分をクローニングするために配列番号７およ
び配列番号８に示したプライマーを使い、LA PCR in vi
tro cloning Kit（宝酒造製）を用いて、それぞれクロ
ーニングを行った。このキットでPCRを行った結果、上
流部分はEcoRI、HindIII、PstI、SalI、XbaIで消化した
断片でそれぞれ約0.5、2.5、3.0、1.5、1.8キロベース
のDNA断片が増幅され、また下流部分はBamHI、HindII
I、PstIで消化した断片でそれぞれ約1.5、1.0、3.5キロ
ベースのDNA断片が増幅されたので、このDNA断片を上記
と同様の方法で塩基配列の決定を行った。

【００６９】その結果、増幅されたDNA断片にはさらに
約920アミノ酸のオープン・リーディング・フレームが
含まれており、さらにその上流にはプロモーター領域と
推定される領域が存在することも明らかとなった。この
オープン・リーディング・フレームの塩基配列から推定
される産物のアミノ酸配列は既知の大腸菌などのピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼE1サブユニットと相同性が高いこ
とから、このオープン・リーディング・フレームがブレ
ビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８
６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットを
コードするpdhA遺伝子であると推定された。このオープ
ン・リーディング・フレーム及びプロモーター領域なら
びにターミネーターと推定される領域を含む塩基配列を
配列表配列番号９に示した。また、前記このオープン・
リーディング・フレームから推定される産物のアミノ酸
配列を、配列番号９及び１０に示した。なお、タンパク
質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるAT
Gに由来するため、タンパク質本来の機能とは無関係で
あることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去
されることがよく知られており、上記タンパク質の場合
にもＮ末端側のメチオニン残基の除去が生じている可能
性がある。ただし、配列番号７に示したATGの６ベース
上流にGTGの配列があり、ここからアミノ酸が翻訳され
ている可能性もある。

【００７０】また、大腸菌など他の微生物のピルビン酸
デヒドロゲナーゼは、E1、E2およびE3の３つのサブユニ
ットから構成されており、これらをコードする遺伝子は
オペロンであることが多いが、ここで明らかとなったpd
hA遺伝子の下流約３キロベース中にはピルビン酸デヒド
ロゲナーゼのE2およびE3サブユニットと考えられるオー
プン・リーディング・フレームは存在しなかった。その
代わり、このオープン・リーディング・フレームの下流
にはターミネーターと推定される配列が存在しているこ
とが明らかとなっていることから、ブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン
酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットは染色体
上の他の部分に存在していると考えられた。

【００７１】＜２＞pdhA増幅株のグルタミン酸収率向上
効果の評価 （１）pdhA増幅用プラスミドの構築 前記のpdhA遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号１１
及び１２に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic
Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNAPurifica
tion Kitによって調製したブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型と
し、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、スト
ックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標
準反応条件でＰＣＲを行い、pdhA遺伝子を増幅した。合
成したプライマーの内、配列番号１１は、配列表配列番
号９に示すpdhA遺伝子の塩基配列の1397番目から1416番
目の塩基に至る配列に相当しており、配列番号１２は、
配列表配列番号９の5355番目から5374番目の塩基に至る
配列に相当する塩基配列の逆ストランドを５’側から表
記したものである。生成したＰＣＲ産物を常法により精
製後、制限酵素SalIとEcoT22Iで消化した。

【００７２】一方、エシェリシア・コリと、コリネ型細
菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクター
を作製した。まず、ストレプトコッカス・フェカリスの
薬剤耐性遺伝子を持つベクターを構築した。ストレプト
コッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同
遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅し
た。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐
性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-
Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（19
83））。この配列を基に配列番号１３および１４に示す
プライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fl
eury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型とし
てPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモ
ーターを含むDNA断片を増幅した。

【００７３】上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて
精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平
滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kit
により行なった。このDNA断片と、配列番号１５および
１６に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et
al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行
って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片
とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA lig
ation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、
エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造
社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガ
ラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロ
ロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカ
ナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g
/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、
寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青
色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換
株を得た。

【００７４】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用
いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２
に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付け
た。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に
保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、
lacZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適し
ている。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAT
CC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699
号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑
末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解
したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転
換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-20
7791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイ
シン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/
L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒
天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを
釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転
換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成
し、図３に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図
を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エ
シェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿
主にカナマイシン耐性を付与する。

【００７５】上記プラスミドpSFK6を制限酵素SalIとPst
Iで切断した。これと上記ＰＣＲ産物のSalI-EcoT22I断
片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結
した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテント
セル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１
０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍ
ｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バク
トトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラク
ト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ
７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニ
ーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。

【００７６】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２
年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入
されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、配列番号９
に示すpdhA遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵
素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミド
をpSFKBPDHAと名付けた。

【００７７】（２）ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムAJ13029へのpSFKBPDHAの導入と
フラスコ培養評価 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ13029を、電気パルス法（特開平２−２０７７９１
号公報参照）によりプラスミドpSFKBPDHAで形質転換
し、形質転換株を得た。得られた形質転換株ＡＴＣＣ１
３８６９／pSFKBPDHA、及びAJ13029／pSFKBPDHAを用い
て、Ｌ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように
行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂ
プレート培地にて培養して得たAJ13029／pSFKBPDHA株の
菌体を、グルコース３０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ０．４ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３０ｇ、Ｆｅ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０
１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２０
０μｇ、ビオチン６０μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及び
ＣａＣＯ₃ ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地(ＫＯＨを用
いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し,３１．５
℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。

【００７８】得られた培養物を、ビオチンを添加してい
ないこと以外は同じ組成の培地に５％量接種し、ＡＴＣ
Ｃ１３８６９は３１．５℃、AJ13029は３７℃にて培地
中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロール
として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９及びAJ13029株をpSFK6で、電気パルス
法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養し
た。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を
旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０
により測定した。結果を表４に示した。

【００７９】

【表４】表４ ─────────────────────── 菌 株 Ｌ−グルタミン酸収率（％） ─────────────────────── ATCC13869／pSFK6 48.3 ATCC13869／pSFKBPDHA 53.2 AJ13029 ／pSFK6 52.3 AJ13029 ／pSFKBPDHA 59.2 ───────────────────────

【００８０】これらの結果から、ブレビバクテリウム・
ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029におい
て、pdhA遺伝子の単独増幅でもＬ−グルタミン酸収率向
上に効果があることが明らかとなった。

【００８１】

【発明の効果】本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活
性が増強されたコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸
生産菌は、従来よりも効率よくＬ−グルタミン酸を生産
することができる。

【００８２】また、培地にビタミンB₁を20μg/L添加す
ることにより、Ｌ−グルタミン酸収率を一層向上させる
ことができる。また、本発明により、新規なpdhA遺伝子
が提供される。

【００８３】

【配列表】 Sequence Listing <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> 発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法（Method for producing L-gluta mic acid） <130> P-7027 <141> 1999-12-15 <150> JP 10-360619 <151> 1998-12-18 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００８４】 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Esherichia coli pyruvate dehydrogenase gene <400> 1 ggctctagag cgagagttca atgggacagg ttc 33

【００８５】 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Esherichia coli pyruvate dehydrogenase gene <400> 2 ggcctcgagg gaaaaagtac agcagcgccc act 33

【００８６】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Brevibacterium lactofermentum pdhA <220> <221> misc_feature <222> (3,6,8,15,18,20) <223> n=inosine <400> 3 acngtntcna tgggnctngg ncc 23

【００８７】 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Brevibacterium lactofermentum pdhA <220> <221> misc_feature <222> (6,12,15,18,20) <223> n=inosine <400> 4 ccttcnccgt tnagngtngt ncg 23

【００８８】 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for LA in vitro cloning of Brevibacterium lactofermentum pdhA gene <400> 5 ttgcagttaa ccacgaaggt caggttgtcc 30

【００８９】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for LA in vitro cloning of Brevibacterium lactofermentum pdhA gene <400> 6 tggatgagac cacgtgattc tggctcgtcc 30

【００９０】 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for LA in vitro cloning of Brevibacterium lactofermentum pdhA gene <400> 7 acagatcctg cacgaaggca tcaacgaggc 30

【００９１】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for LA in vitro cloning of Brevibacterium lactofermentum pdhA gene <400> 8 tcatcgctgc gggtacctcc tacgccaccc 30

【００９２】 <210> 9 <211> 5370 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (2360)..(5125) <400> 9 tcacgttacg gcgatcaaca ccgcaaccac tacgagaaga tctccaaacg agaccaagag 60 cgcttctaag cccgtctcat tttgcacctg ccattctgtg aggatatggc aggtgctttt 120 tcatgccact atcttggggt tctcggtatt agatcttctg ataaaaaccc gatagttttc 180 ttgcgctaga cactaattac ggcaccgctt aagcatggtc gtgacacgta aaacctgact 240 taggccattt tgatgtggtg tagatcatat tgacgtcaat gaatgaagtg actaactccg 300 ccgaatccac atcgtctaaa aggcctgggc gaccacgtaa agacgggcac gacgagaaga 360 tcatcgacgc aactttacgg ctcatcgaca gcaatcgtcc cgtcacggtc aatgcagttg 420 tcaaagaaag cggagtggca cgtgcagcgg tttatcgacg ctggcccagg ctagtggatc 480 tagtagcgga agctttagat gccgggcgag ctccagttga aatagatacc ccaggggaca 540 tcaaagagac cttgattgat gggctgttta caaatcaggc gaaaaccact ggagtctcct 600 atcctcgtca gcgatttcgc aaacggctcg agttggtgat gtcagatcaa gaattacagc 660 tcgcctaatg gaattcacat gtgaagagac gtcgagaagc aaatattcgc gcgctgcaag 720 tcgcgcaaga aaaaggccaa atccgggcgg atctagacat cgaggcgtgc ctcgatgcaa 780 tccttggggt gttttattac caatcggtcg cgcgtggagt aaatttcacc gaccaaggta 840 caacgcaacg atgcagagaa gccttggagg tgatctggca tggaatggaa ccttaaattc 900 aggttctgac gaggtgcgaa gcaagttgtc gcgcgccgca cctcagtatc cggatcaact 960 taatttcgaa gtgctgggtt ttctcgcgca tacccaatgc gtaccgatgt gcccatgagc 1020 gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa cttatcgtgg cctgcttcta tatttgtgcg 1080 ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt ccagctgagc 1140 taaaggcgcg cacgtgcttt tctagaacca ccttggtggc ctcgaaagca acgagtgaaa 1200 tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260 gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt 1320 ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtt gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380 gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440 agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500 gcacgacatc gcacagctcg tcggtttctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560 cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620 gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680 gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740 ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800 ggtactttga accacctttc cctggaattt tttccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860 atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920 acaattctct tcaaaataat ggtggctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980 cagacctgta gttttatgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040 aactacccga taattctttg caaaactttg caaagggtaa tgaacatgca gctagtttcc 2100 gtagaaatgt tctttaaaaa atccacaaca attgccagga agcacaccga ttgatggata 2160 cctgaaatcc cagtgagcgc accactcccc ttacgtcaca gtctgtaaaa caaatcttcg 2220 gtgttgcgta tccttgttaa taacttatgc gttgacccat tcgtgcactt cggtgtgcca 2280 caattaggta cgaccaagaa tgggaccggg aaaccgggac gtataaacga aataaaacat 2340 tccaacagga ggtgtggaa atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc 2392 Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro 1 5 10 tcg gat gac tct aac ttc gcg atg atc cgc gat ggc gtg gca tct tat 2440 Ser Asp Asp Ser Asn Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr 15 20 25 ttg aac gac tca gat ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tca ctc 2488 Leu Asn Asp Ser Asp Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu 30 35 40 gac gga tta ctc cag gag tct tct cca gaa cgt gct cgt tac ctc atg 2536 Asp Gly Leu Leu Gln Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met 45 50 55 ctt cgt ttg ctt gag cgt gca tct gca aag cgc gta tct ctt ccc cca 2584 Leu Arg Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro 60 65 70 75 atg acg tca acc gac tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct 2632 Met Thr Ser Thr Asp Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro 80 85 90 gaa ttc cca ggc gat gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att 2680 Glu Phe Pro Gly Asp Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile 95 100 105 cgc tgg aac gca gcc atc atg gtt cac cgc gct cag cga cca ggc atc 2728 Arg Trp Asn Ala Ala Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile 110 115 120 ggc gtc ggc gga cac att tcc act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac 2776 Gly Val Gly Gly His Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr 125 130 135 gaa gtt ggc ttc aac cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc 2824 Glu Val Gly Phe Asn His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly 140 145 150 155 ggc gac cag atc ttc ttc cag ggc cac gca tca cca ggt atg tac gca 2872 Gly Asp Gln Ile Phe Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala 160 165 170 cgt gca ttc atg gag ggt cgc ctt tct gaa gac gat ctc gat ggc ttc 2920 Arg Ala Phe Met Glu Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe 175 180 185 cgt cag gaa gtt tcc cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac 2968 Arg Gln Glu Val Ser Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His 190 195 200 cca cac ggt atg aag gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt 3016 Pro His Gly Met Lys Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly 205 210 215 ctt ggc cca atg gat gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac ctc 3064 Leu Gly Pro Met Asp Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu 220 225 230 235 gaa aac cgt ggc atc aag gac acc tct gac cag cac gtc tgg gcc ttc 3112 Glu Asn Arg Gly Ile Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe 240 245 250 ctt ggc gac ggc gaa atg gac gag cca gaa tca cgt ggt ctc atc cag 3160 Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln 255 260 265 cag gct gca ctg aac aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc 3208 Gln Ala Ala Leu Asn Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys 270 275 280 aac ctg cag cgt ctc gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag atc atc 3256 Asn Leu Gln Arg Leu Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile 285 290 295 cag gaa ctc gag tcc ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tct gtg atc aag 3304 Gln Glu Leu Glu Ser Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys 300 305 310 315 gtt gtt tgg ggt cgc gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat 3352 Val Val Trp Gly Arg Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp 320 325 330 ggt gca ctt gtt gag atc atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag 3400 Gly Ala Leu Val Glu Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln 335 340 345 acc ttc aag gct aac gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga 3448 Thr Phe Lys Ala Asn Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly 350 355 360 cgt gac cca cgc acc gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa 3496 Arg Asp Pro Arg Thr Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu 365 370 375 atc tgg aag ctg cca cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca 3544 Ile Trp Lys Leu Pro Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala 380 385 390 395 gcc tac aag cga gct ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc atc ctt 3592 Ala Tyr Lys Arg Ala Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu 400 405 410 gct cac acc att aag ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt 3640 Ala His Thr Ile Lys Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg 415 420 425 aac gca acc cac cag atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg 3688 Asn Ala Thr His Gln Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu 430 435 440 ttc cgc gac aag cag ggc atc cca atc acc gat gag cag ctg gag aag 3736 Phe Arg Asp Lys Gln Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys 445 450 455 gat cct tac ctt cct cct tac tac cac cca ggt gaa gac gct cct gaa 3784 Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu 460 465 470 475 atc aag tac atg aag gaa cgt cgc gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca 3832 Ile Lys Tyr Met Lys Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro 480 485 490 gag cgt cgt gag aac tac gat cca att cag gtt cca cca ctg gat aag 3880 Glu Arg Arg Glu Asn Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys 495 500 505 ctt cgc tct gtc cgt aag ggc tcc ggc aag cag cag atc gct acc act 3928 Leu Arg Ser Val Arg Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Ala Thr Thr 510 515 520 atg gcg act gtt cgt acc ttc aag gaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg 3976 Met Ala Thr Val Arg Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu 525 530 535 gct gat cgc ctt gtc cca atc att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt 4024 Ala Asp Arg Leu Val Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly 540 545 550 555 ctt gac tct tgg ttc cca acc ttg aag atc tac aac ccg cac ggt cag 4072 Leu Asp Ser Trp Phe Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln 560 565 570 aac tac gtg cct gtt gac cac gac ctg atg ctc tcc tac cgt gag gca 4120 Asn Tyr Val Pro Val Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala 575 580 585 cct gaa gga cag atc ctg cac gaa ggc atc aac gag gct ggt tcc gtg 4168 Pro Glu Gly Gln Ile Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Val 590 595 600 gca tcg ttc atc gct gcg ggt acc tcc tac gcc acc cac ggc aag gcc 4216 Ala Ser Phe Ile Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala 605 610 615 atg att ccg ctg tac atc ttc tac tcg atg ttc gga ttc cag cgc acc 4264 Met Ile Pro Leu Tyr Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr 620 625 630 635 ggt gac tcc atc tgg gca gca gcc gat cag atg gca cgt ggc ttc ctc 4312 Gly Asp Ser Ile Trp Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu 640 645 650 ttg ggc gct acc gca ggt cgc acc acc ctg acc ggt gaa ggc ctc cag 4360 Leu Gly Ala Thr Ala Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln 655 660 665 cac atg gat gga cac tcc cct gtc ttg gct tcc acc aac gag ggt gtc 4408 His Met Asp Gly His Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val 670 675 680 gag acc tac gac cca tcc ttt gcg tac gag atc gca cac ctg gtt cac 4456 Glu Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His 685 690 695 cgt ggc atc gac cgc atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt atc 4504 Arg Gly Ile Asp Arg Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile 700 705 710 715 tac tac atc acc atc tac aac gag cca acc cca cag cca gct gag cca 4552 Tyr Tyr Ile Thr Ile Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro 720 725 730 gaa gga ctg gac gta gaa ggc ctg cac aag ggc atc tac ctc tac tcc 4600 Glu Gly Leu Asp Val Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser 735 740 745 cgc ggt gaa ggc acc ggc cat gag gca aac atc ttg gct tcc ggt gtt 4648 Arg Gly Glu Gly Thr Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val 750 755 760 ggt atg cag tgg gct ctc aag gct gca tcc atc ctt gag gct gac tac 4696 Gly Met Gln Trp Ala Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr 765 770 775 gga gtt cgt gcc aac att tac tcc gct act tct tgg gtt aac ttg gct 4744 Gly Val Arg Ala Asn Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala 780 785 790 795 cgc gat ggc gct gct cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca 4792 Arg Asp Gly Ala Ala Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala 800 805 810 gat gct ggc gag gca ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc 4840 Asp Ala Gly Glu Ala Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly 815 820 825 cca tac gtt gca gtg tct gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag atc 4888 Pro Tyr Val Ala Val Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile 830 835 840 cgt gaa tgg gtc cca ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc 4936 Arg Glu Trp Val Pro Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe 845 850 855 ggt ttc tct gat acc cgc cca gct gct cgt cgc ttc ttc aac atc gac 4984 Gly Phe Ser Asp Thr Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp 860 865 870 875 gct gag tcc att gtt gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc 5032 Ala Glu Ser Ile Val Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly 880 885 890 aag atc gac gtc tcc gtt gct gct cag gct gct gag aag ttc aag ttg 5080 Lys Ile Asp Val Ser Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu 895 900 905 gat gat cct acg agt gtt tcc gta gat cca aac gct cct gag gaa 5125 Asp Asp Pro Thr Ser Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 910 915 920 taaatcacct caagggacag ataaatcccg ccgccagacg ttagtctggc ggcgggattc 5185 gtcgtaaagc aagctctttt tagccgagaa acgccttgtc agacaatgtt gcgcccttga 5245 tattggcgaa ctcctgcagc aaatcgcgca cagtcaactt cgacttggta gcctgatctg 5305 cctggtagac aatctggcct tcatgcatca tgatcaggcg attgcccagg cgaattgcct 5365 gttcc 5370

【００９３】 <210> 10 <211> 922 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 10 Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn 1 5 10 15 Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp 20 25 30 Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln 35 40 45 Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu 50 55 60 Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp 85 90 95 Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala 100 105 110 Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His 115 120 125 Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn 130 135 140 His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe 145 150 155 160 Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu 165 170 175 Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser 180 185 190 Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys 195 200 205 Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp 210 215 220 Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile 225 230 235 240 Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn 260 265 270 Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu 275 280 285 Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser 290 295 300 Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg 305 310 315 320 Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu 325 330 335 Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr 355 360 365 Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro 370 375 380 Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala 385 390 395 400 Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys 405 410 415 Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln 420 425 430 Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln 435 440 445 Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro 450 455 460 Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys 465 470 475 480 Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn 485 490 495 Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg 500 505 510 Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg 515 520 525 Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val 530 535 540 Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe 545 550 555 560 Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln Asn Tyr Val Pro Val 565 570 575 Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gln Ile 580 585 590 Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Val Ala Ser Phe Ile Ala 595 600 605 Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met Ile Pro Leu Tyr 610 615 620 Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr Gly Asp Ser Ile Trp 625 630 635 640 Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala 645 650 655 Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln His Met Asp Gly His 660 665 670 Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro 675 680 685 Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg 690 695 700 Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile 705 710 715 720 Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val 725 730 735 Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr 740 745 750 Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala 755 760 765 Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn 770 775 780 Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala 785 790 795 800 Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala 805 810 815 Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val 820 825 830 Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro 835 840 845 Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr 850 855 860 Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val 865 870 875 880 Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser 885 890 895 Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser 900 905 910 Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 915 920

【００９４】 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for constructing plasmid for amplifying pdhA gene of Brevibacterium lactofermentum <400> 11 aatgccagga gtcaacaccc 20

【００９５】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for constructing plasmid for amplifying pdhA gene of Brevibacterium lactofermentum <400> 12 acatggaaca ggcaattcgc 20

【００９６】 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 13 cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32

【００９７】 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 14 cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30

【００９８】 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 15 gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26

【００９９】 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 16 aggccttttt ttaaggcagt tattg 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産性に対
するビタミンB₁の効果を示す図。

【図２】プラスミドpK1の構築過程を示す図。

【図３】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 堀埜 一成 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活
   性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコ
   リネ型細菌。
2. 【請求項２】 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の
   増強が、前記細菌細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼ
   をコードする遺伝子のコピー数を高めることによるもの
   である請求項１記載のコリネ型細菌。
3. 【請求項３】 ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードす
   る遺伝子がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌由来で
   ある請求項２記載のコリネ型細菌。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のコ
   リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミ
   ン酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−グルタミン酸
   を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造
   法。
5. 【請求項５】 前記培地がビタミンＢ₁を２０μｇ／Ｌ
   以上含有することを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタン
   パク質。 （Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１
   若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又
   は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸
   デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
7. 【請求項７】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項２記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からな
   る塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からな
   る塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピ
   ルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコ
   ードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 前記ストリンジェントな条件が、１×Ｓ
   ＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗
   浄が行われる条件である請求項７記載のＤＮＡ。