DE69514914T2

DE69514914T2 - Ein aus corynebakterien abstammendes gen und seine verwendung

Info

Publication number: DE69514914T2
Application number: DE69514914T
Authority: DE
Inventors: Chizu Abe; Yoshio Kawahara; Eiichiro Kimura; Tsuyoshi Nakamatsu; Yasuhiko Yoshihara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 2000-06-15
Anticipated expiration: 2015-02-24
Also published as: ES2143617T3; CN1146216A; EP0752472A4; WO1995023224A1; EP0752472B1; JP3738449B2; CN1117861C; PE38597A1; JP2005323606A; EP0752472A1; DE69514914D1; BR9506883A; MY113040A; US5929221A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Züchtung und Verwendung von Coryneform Bakterien, die zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure und L-Lysin, und anderen Substanzen verwendet werden und deren Verwendung.

Beschreibung des Standes der Technik

Coryneform Bakterien stellen bei ihrer Kultivierung in einem Medium mit einer begrenzten Biotinmenge eine große L- Glutaminsäuremenge her. Auf der anderen Seite stellen Coryneform Bakterien bei ihrer Kultivierung in einem Medium, das eine überschüssige Biotinmenge enthält, keine L- Glutaminsäure her. Es ist jedoch bekannt, dass bei der Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels oder von Penicillin zu einem Medium, das eine überschüssige Biotinmenge enthält, das Wachstum der Bakterien in diesem Medium gehemmt ist und die Bakterien eine große L-Glutaminsäuremenge darin herstellen.
Zur Gewährleistung, dass Coryneform Bakterien L-Glutaminsäure herstellen, ist eine der folgenden Maßnahmen durchzuführen.
1. Die Biotinkonzentration in dem Medium wird suboptimal bereitgestellt. Siehe S. Okumura, T. Tsugawa, T. Tsunoda und A. Kitai, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 36, 197-203 (1962).
2. Ein oberflächenaktives Mittel wird zu dem Medium gegeben, vorausgesetzt, dass eine ausreichende Biotinmenge vorhanden ist. Siehe I. Shiio, H. Otsuka und N. Atsuya, J. Biochem, 53, 333-340 (1963); K. Takinami, H. Okada und T. Tsunoda, Agr. Biol. Chem., 27, 853-863 (1963).
3. Penicillin wird zu dem Medium gegeben, vorausgesetzt dass eine ausreichende Biotinmenge vorhanden ist. US Patent Nr. 3 080 297, japanische Patentveröffenlichungsnr. 37-1695 (1962); M. Shibui, T. Kurima, S. Okabe und T. Osawa, Amino Acid and Nucleic Acid, 17, 61-65 (1968).
Die Mechanismen dieser Maßnahmen scheinen auf die folgende Weise erklärt werden zu können.
In bezug auf die Herstellung von L-Glutaminsäure durch Begrenzung von Biotin kann der folgende Gesichtspunkt hauptsächlich in Betracht gezogen werden: Biotin ist ein Coenzym für Acetyl-CoA-Carboxylase zur Synthese von Fettsäuren und außerdem von ungesättigten Fettsäuren, wie Oleinsäure, und ihre Derivate weisen eine selbständige Wirkung für Biotin auf. Biotin wird daher einen Einfluss auf die Zusammensetzung der Fettsäuren ausüben, die in der Zellmembran vorhanden sind, wodurch sich die Durchlässigkeit von L-Glutaminsäure durch die Zellmembran verändert (I. Shiio, S. Otsuka und M. Takahashi, J. Biochem. 51, 56-62 (1962); I. Shiio, K. Narui, N. Yahaba und M. Takahashi, J. Biochem. 51, 109-111 (1962).
Die Herstellung von L-Glutaminsäure bei Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels oder von Penicillin und die Änderung der Durchlässigkeit der cytoplasmatischen Membran für L- Glutaminsäure, die auf die Änderung der Struktur der Zelloberfläche zurückzuführen ist, wurde außerdem untersucht (Shiio, S. Otsuka und N. Katsuya, J. Biochem. 52, 333-340 (1953)).
Die Herstellung von L-Glutaminsäure wurde wie oben beschrieben in bezug auf ihre Durchlässigkeit durch die Zellmembran diskutiert, aber es wurden keine Ergebnisse erhalten, die direkt die Beziehung zueinander bestätigen.
Es ist unklar, durch welche Mechanismen die Begrenzung von Biotin oder die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels oder von Penicillin die Fähigkeit von Coryneform Bakterien L- Glutaminsäure herzustellen verbessert.
Außerdem sind keine Informationen auf dem Genniveau verfügbar, die ein wichtiger Schlüsselfaktor zur Aufklärung dieser Mechanismen sein würden.
Ein Staphilococci Plasmid, das die Beständigkeit eines oberflächenaktiven Mittels gegen kationische oberflächenaktive Mittel und Trimethoprim codiert, wird von Townsend, D. E. et al. in J. of Antimicrobial Chemotherapy (1984) 14, 115-124 beschrieben.
FR-A-2 230 723 betrifft ein Fermentierungsverfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der L-Lysin bei einem pH zwischen 5 und 9 herstellt. Bei diesem Verfahren werden Antibiotika, Antioxidationsmittel und/oder oberflächenaktive Mittel zu der Kultur gegeben, um Lysin durch Fermentierung herzustellen.
GB-A-1 106 554 betrifft ein Fermentierungsverfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, in dem Coryneform Bakterien in einem Medium kultiviert werden, das Melasse, die bei der Zuckerherstellung entsteht (sugar-waste molasses), und eine überschüssige Biotinmenge enthält. Während des Kultivierungsverlaufes wird entweder ein nicht-ionisches oder kationisches oberflächenaktives Mittel mit einem kationischen oberflächenaktiven Mittel zu dem Medium gegeben, um die in dem Medium angesammelte L-Glutaminsäuremenge zu erhöhen.

Offenbarung der Erfindung

Die Aufgabe dieser Erfindung ist es, den Mechanismus, durch Coryneform Bakterien L-Glutaminsäure herzustellen, aufzuklären, insbesondere die Wirkung des zuzugebenden oberflächenaktiven Mittels auf den Mechanismus der Glutaminsäureherstellung durch Coryneform Bakterien, und L-Glutaminsäure herstellende Coryneform Bakterien und dergleichen auf der Basis der so erhaltenen Informationen zu züchten und zu verbessern.
Die Aufgabe ist daher insbesondere, auf dem Genniveau den Mechanismus der Glutaminsäureherstellung durch Coryneform Bakterien aufzuklären, ein Gen der Coryneform Bakterien zu isolieren, das an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel beteiligt ist, und das so erhaltene Gen zur Züchtung von L-Glutaminsäure herstellenden Coryrieform Bakterien und zur Herstellung von L-Glutaminsäure und dergleichen durch Coryneform Bakterien zu verwenden.
Die Erfinder haben sehr intensive Untersuchungen durchgeführt, um die oben erwähnte Aufgabe zu bewerkstelligen und haben die Gegenwart eines Gens festgestellt, das sich an der L- Glutaminsäureherstellung durch Coryneform Bakterien beteiligt (das Gen wird hiernach als dtsR-Gen und das durch das Gen codierte Protein wird als DTSR-Protein bezeichnet). Außerdem haben die Erfinder eine wertvolle Verwendung für dieses Gen gefunden. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde die vorliegende Erfindung vollendet.

Die Erfindung umfasst die folgenden Ausführungsformen:

(1) Ein von einem Coryneform Bakterium abstammendes Gen, das ein Protein codiert, das dieses Bakterium beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht.
(2) Das Gen nach (1), wobei das Protein eine Aminosäure mit den Aminosäuren Nrn. 37 bis 543 der in SEQ. ID Nr. 2 der Sequenzliste gezeigten Aminosäuresequenz umfaßt oder eine Aminosäuresequenz, die in der Aminosäuresequenz eine Substitution, Deletion oder Insertion aufweist, die keine wesentliche Gegenwirkung auf die Aktivität hat, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel zu machen.
(3) Gen nach (1), das eine Sequenz der Nucleotide Nrn. 467 bis 1987 der in SEQ. ID Nr. 1 der Sequenzliste gezeigten Nucleotidsequenz aufweist oder eine Nucleotidsequenz, die im wesentlichen mit dieser Sequenz übereinstimmt.
(4) Rekombinante DNA, die erhältlich ist durch Legieren eines Vektors, der in Coryneform Bakterien wirkt, an das in (1), (2) oder (3) definierte Gen.
(5) Ein Coryneform Bakterium, das die in (4) definierte rekombinante DNA aufweist.
(6) Ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, umfassend das Kultivieren eines Coryneform Bakteriums, das die in (4) definierte rekombinante DNA aufweist und L-Lysin in einem flüssigen Medium herstellen kann, um L-Lysin in der Kultur herzustellen und anzuhäufen, und Sammeln des L-Lysins.
(7) Ein Gen, umfassend eine Nucleotidsequenz mit einer Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder - Inversion einer oder mehrerer Nucleotide in einer Nucleotidsequenz des in (1), (2) oder (3) definierten Gens, so dass ein durch diese Nucleotidsequenz codiertes Protein nicht normal wirkt in bezug auf die Aktivität, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktives Mittel zu machen.
(8) Rekombinante DNA, erhältlich durch Ligieren eines Vektors, der in Coryneform Bakterien wirkt, an das in Anspruch 7 definierte Gen.
(9) Coryneform Bakterium mit einer Substitution, -Deletion, - Insertion, -Addition oder -Inversion einer oder mehrerer Nucleotide in einer Nucleotidsequenz des in (1), (2) oder (3) definierten Gens oder mit einem auf dem Chromosom liegenden Promotor davon, so dass ein Protein, das Aktivität aufweist, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel zu machen, nicht normal wirkt.
(10) Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend das Kultivieren eines Coryneform Bakteriums mit einer Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion einer oder mehrerer Nucleotide in einer Nucleotidsequenz des in (1), (2) oder (3) definierten Gens oder mit einem auf dem Chromosom liegenden Promotor, so dass ein Protein, das Aktivität aufweist, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel zu machen, nicht normal wirkt, wobei das Bakterium L- Glutaminsäure in einem flüssigen Medium herstellen kann, um L-Glutaminsäure in der Kultur herzustellen und anzuhäufen und Sammeln der L-Glutaminsäure.
Diese Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.
Coryneform Bakterien, auf die hier Bezug genommen wird, sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, S. 599 (1974) definiert sind. Die Bakterien sind aerob, Gram-positiv, nicht säurefeste Bacilli, die die Fähigkeit zur Sporenbildung nicht besitzen, und umfassen Bakterien, die als Bakterien klassifiziert wurden, die zu der Gattung Brevibacterium gehören, die aber jetzt der Gattung Coryneform Bakterium zugeordnet werden [siehe Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)] und umfassen außerdem Bakterien der Gattung Brevibacterium und Microbacterium, die eng mit der Gattung Coryneform Bacterium verwandt sind. Von solchen Coryneform Bakterien sind die unten aufgeführten, die als L-Glutaminsäure herstellende Bakterien bekannt sind, erfindungsgemäß am meisten bevorzugt.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium mellasecola
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium immariophilium
Brevibacterium roseum
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium thiogenitalis
Insbesondere werden die folgende Stämme dieser Bakterien beispielhaft aufgeführt:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium glutamicum ATCC 13060
Brevibacterium divarlaatum ATCC 14020
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium mellasecola ATCC 17965
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium immariophilium ATCC 14068
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium flavum ATCC 13826
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Diese Stämme sind von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich. Eine Registrierungsnummer wurde jedem dieser Bakterien zugeordnet. Auf der Basis dieser Registrierungsnummer kann jeder den entsprechenden Bakterienstamm von ATCC erhalten. Die Registrierungsnummern der Bakterienstämme, die bei ATCC hinterlegt sind, sind in dem ATCC Katalog aufgeführt.
Oberflächenaktive Mittel, auf die in der Erfindung Bezug genommen wird, wie Penicillin, beschleunigen die Herstellung von L- Glutaminsäure durch Coryneform Bakterien in einem Medium, das eine überschüssige Biotinmenge enthält, und umfassen verschiedene nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, kationische oberflächenaktive Mittel und anionische oberflächenaktive Mittel [siehe K. Yamada, J. Takahashi und J. Nakamura, the Hakkokogaku Kaishi, 20, 348-350 (1962); K. Udagawa, S. Abe und I. Kinoshita, Hakkokogaku Kaishi, 40, 614-619 (1962)]. Von den nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln haben Tween 60® (Polyoxyethylensorbitanmonostearat) und Tween 40® (Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat) eine Penicillin-ähnliche Wirkung [siehe I. Shiio, S. Otsuka und K. Katsuya, J. Biochem. 53, 330- 340 (1963)]. C&sub3; bis C&sub1;&sub8; freie gesättigte Aminosäuren haben dieselbe Wirkung [siehe K. Takinami, H. Okada und T. Tsunoda, Agr. Biol. Chem., 28, 114-118 (1964)]. Tween 40® wurde in den erfindungsgemäßen Beispielen verwendet.

< 1> Isolierung eines Gens aus einem Coryneform Bakterium, das an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel beteiligt ist.

Zur Isolierung eines Gens aus einem Coryneform Bakterium, das an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel beteiligt ist, kann beispielsweise das folgende Verfahren verwendet werden.
(1) Eine Mutante eines Coryneform Bakteriums, die empfindlich für ein oberflächenaktives Mittel ist und eine höhere Empfindlichkeit für oberflächenaktive Mittel zeigt, wird erhalten;
(2) verschiedene Fragmente einer chromosomalen DNA, die aus einem Wildtyp-Stamm eines Coryneform Bakteriums hergestellt wurden, werden jeweils an einen Vektor ligiert, der in Coryneform Bakterien wirkt, um verschiedene rekombinante DNA herzustellen;
(3) die rekombinanten DNA werden jeweils in die Zellen der Mutante eines Coryneform Bakteriums, die empfindlich für oberflächenaktive Mittel sind, eingeführt, um die Transformation durchzuführen;
(4) aus den resultierenden Transformanten werden Stämme, die die Empfindlichkeit für ein oberflächenaktives Mittel verloren haben, ausgewählt;
(5) rekombinante DNA werden aus den so ausgewählten Transformanten, die nicht empfindlich für ein oberflächenaktives Mittel sind, gewonnen; und
(6) die Struktur des chromosomalen DNA-Fragments von dem Wildtyp-Stamm eines Coryneform Bakteriums, das an den Vektor ligiert ist, wird untersucht.
Das von dem Wildtyp-Stamm eines Coryneform Bakteriums erhaltene chromosomale DNA-Fragment enthält ein aus einem Coryneform Bakterium abstammenden Gen, das an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel beteiligt ist. Dieses Gen nimmt zumindest an dem Mechanismus der Anhäufung von L-Glutaminsäure durch Coryneform Bakterien in einem Medium, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, teil. Außerdem nimmt dieses Gen an der Herstellung von L-Glutaminsäure in einem Medium, das Penicillin oder eine begrenzte Biotinmenge enthält, teil.
Eine Mutante eines Coryneform Bakteriums, die empfindlich für ein oberflächenaktives Mittel ist, und die eine höhere Empfindlichkeit für oberflächenaktive Mittel zeigt, bedeutet eine Mutante eines Coryneform Bakteriums, die schlecht in einem Medium wächst, das ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration enthält, die keinen Einfluss auf das Wachstums des Wildtyp-Stamms der Coryneform Bakterien in dem Medium hat. Hinsichtlich des oberflächenaktiven Mittels Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat wächst eine Mutante eines Coryneform Bakteriums, die empfindlich für ein oberflächenaktives Mittel ist, schlechter als der entsprechende Wildtyp in einem Medium, das das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/dl enthält. Im Gegensatz dazu wird das Wachstum eines Wildtyp-Stamms eines Coryneform Bakteriums nicht durch die Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/dl in dem Medium beeinträchtigt. Bei der Kultivierung einer solchen Mutante in einem Medium, das eine überschüssige Biotinmenge enthält, um durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels L-Glutaminsäure herzustellen, kann die notwendige Konzentration des zu dem Medium zuzugebenden oberflächenaktiven Mittels niedriger sein als gewöhnlich. Es wird angenommen, dass der Zustand der Zellen der Mutante, die empfindlich für ein oberflächenaktives Mittel ist, ähnlich wie der der entsprechenden Zellen des Wildtyp-Stamms, die den oberflächenaktiven Mitteln ausgesetzt werden, ist.
Zum Erhalt einer Mutante eines Coryneform Bakteriums, das für ein oberflächenaktives Mittel empfindlich ist, kann das in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 50-126877 (1975) (japanische Patentveröffentlichungsnr. 52-24593 (1977)) verwendet werden.
Als Beispiel für eine Mutante eines Coryneform Bakteriums, die für ein oberflächenaktives Mittel empfindlich ist, wird Brevibacterium lactofermentum (Corynebacicerium glutamicum) AJ 11060 erwähnt. Diese Mutante ist bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-3678 hinterlegt.
Zur Herstellung verschiedener Fragmente der chromosomalen DNA eines Wildtyp-Stamms eines Coryneform Bakteriums wird das folgende Verfahren angewendet. Der Wildtyp-Stamm eines Coryneform Bakteriums wird in einem flüssigen Medium kultiviert, die darin gewachsenen Zellen werden gesammelt, und die chromosomale DNA wird aus den gesammelten Zellen gemäß dem Verfahren von Saito et al. [siehe H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys., Acta 72, 619 (1963)] gewonnen. Die so gewonnene chromosomale DNA wird mit Restriktionsenzymen teilweise gespalten. Vier Basenerkennungsenzyme werden als Restriktionsenzyme verwendet und die Spaltung wird zur Herstellung von verschiedenen DNA- Fragmenten durchgeführt, unter Bedingungen, bei denen die DNA unvollständig zersetzt wird.
Der in Coryneform Bakterien wirkende Vektor, auf den hier bezug genommen wird, ist zum Beispiel ein Plasmid, das in Coryneform Bakterien autonom replizierbar ist.

Spezifische Beispiele des Vektors sind unten erwähnt.

pAM 330 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 58-67699 (1983)
pHM 1519 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 58-77895 (1983)
pAJ 655 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 58-192900 (1983)
pAJ 611 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 58-192900 (1983)
pAJ 1844 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 58-192900 (1983)
pCG 1 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 57-134500(1982)
pCG 2 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 58-35197 (1983)
PCG 4 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 57-183799 (1982)
PCG 11 Siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 57-183799 (1982)
Zur Herstellung verschiedener rekombinanter DNA durch Ligieren des in Coryneform Bakterien wirkenden Vektors und verschiedener Fragmente der chromosomalen DNA eines Wildtyp-Stamms von Coryneform Bakterien kann das folgende Verfahren verwendet werden. Der Vektor wird zunächst mit einem Restriktionsenzym gespalten. Das zur Spaltung des Vektors zu verwendende Restriktionsenzym ist das gleiche, das zur Spaltung der chromosomalen DNA verwendet wurde oder ist eines, durch das der Vektor gespalten wird, unter Erhalt von Enden, die komplementär zu den Enden des Fragments der chromosomalen DNA sind. Die Ligation des Vektors und DNA-Fragments wird im allgemeinen durch eine Ligase bewirkt, wie T4 DNA Ligase usw.
Zum Einführen der rekombinanten DNA in die Mutante eines Coryneform Bakteriums, die empfindlich für eine oberflächenaktives Mittel ist, kann jedes bekannte Transformationsverfahren verwendet werden. Zum Beispiel sind verwendbar ein Verfahren zur Behandlung von Empfängerzellen mit Calciumchlorid, um die Durchlässigkeit der DNA zu erhöhen, wobei Escherichia coli K-12 verwendet wurde [siehe Mandel M. und Higa, A., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)] und ein Verfahren zur Herstellung von kompetenten Zellen aus Zellen, die sich in der Wachstumsphase befinden, gefolgt von der DNA-Einführung, wobei Bacillus subtilis verwendet wurde [siehe Duncan, C. H., Wilson, G. A. und Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)]. Des weiteren ist ein Verfahren verwendbar, bei dem DNA- Empfängerzellen in Protoplasten oder Spheroplasten verwandelt werden, die einfach rekombinante DNA aufnehmen können, gefolgt von der Einführung der rekombinanten DNA in die Zellen, wobei bekannt ist, das das Verfahren in Bacillus subtilis, Actinomycetes und Hefen anwendbar ist [siehe Chang, S. und Choen, S. N., Molec. Gen. Genet. 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. und Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. und Fink, G. R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)].
Das oben erwähnte Protoplastenverfahren für Bacillus subtilis kann erfindungsgemäß verwendet werden, um eine ausreichend hohe Frequenz zu erhalten. Außerdem ist ein Verfahren verwendbar, bei dem eine DNA in Protoplasten eines Coryneform Bakteriums eingeführt wird, während die Protoplasten in Kontakt entweder mit Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol und mit zweiwertigen Metallionen gebracht werden, wie in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 57-183799 (1982) beschrieben. Bei diesem Verfahren können Carboxymethylcellulose, Dextran, Ficoll®, Pluronic F68® (hergestellt von Serva Co.) usw. anstelle von Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol verwendet werden, um die Einführung der DNA in die Protoplasten zu beschleunigen. In den erfindungsgemäßen Beispielen wird die Transformation durch ein elektrisches Impulsverfahren durchgeführt (siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2-207791 (1990)).
Das Verfahren zum Auswählen des Stammes, der die Empfindlichkeit für ein oberflächenaktives Mittel verloren hat, aus den Transformanten wird nachfolgend beschrieben.
DNA-Fragmente mit einer Größe von ungefähr 4 bis 6 kBp, die durch teilweisen Verdau der chromosomalen DNA eines Wildtyp- Stamm eines Coryneform Bakteriums mit dem Restriktionsenzym Sau3AI erhalten worden waren, wurden zur Herstellung rekombinanter DNA an einem Plasmidvektor ligiert, der sowohl in Escherichia coli als auch Coryneform Bakterien autonom replizierbar ist, und diese rekombinanten DNA wurden in die kompetente Escherichia coli DH5 Zellen (hergestellt von Takata Shuzo Co., Ltd.) eingeführt. Die resultierenden Transformanten wurden kultiviert, um eine Genbibliothek eines Wildtyp-Stamms eines Coryneform Bakteriums herzustellen.
Unter Verwendung der rekombinanten DNA in dieser Genbibliothek wird Brevibacterium lactofermentum AJ 11060 transformiert. Die resultierenden Transformanten wurden auf eine Agarplatte M- CM2G, die kein oberflächenaktives Mittel enthält (enthaltend 5 g Glucose, 10 g Polypepton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 0,2 g DL-Methionin, 15 g Agar und 4 mg Chloramphenicol in einem Liter Wasser und mit einem pH von 7,2) aufgetragen und ungefähr 40.000 Kolonien wurden darauf gebildet. Diese Kolonien wurden auf einer Platte M-CM2G, enthaltend 30 mg/l eines oberflächenaktiven Mittels, Tween 40®, repliziert und die Kolonien, die auf dieser oberflächenaktives Mittel enthaltenden M-CM2G gut wuchsen, gesammelt. Folglich wurden Transformanten, die die Empfindlichkeit für ein oberflächenaktives Mittel verloren hatten, erhalten.
Zur Gewinnung der rekombinanten DNA aus den so erhaltenen Transformanten, die die Empfindlichkeit für ein oberflächenaktives Mittel verloren hatten, kann das gleiche Verfahren verwendet, wie das zur Herstellung der chromosomalen DNA des Wildtyp-Stammes eines Coryneform Bakteriums verwendete. Kurz gesagt, werden die Transformanten in einem flüssigen Medium kultiviert, die Zellen werden aus der Kultur gesammelt und die rekombinanten DNA werden gemäß dem Verfahren von Saito et al. [siehe H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys., Acta 72, 619 (1963)] gewonnen.
Die Struktur des chromosomalen DNA-Fragments des Wildtyp- Stammes eines Coryneform Bakteriums, das an den Vektor ligiert worden war, wurde wie folgt untersucht. Die vollständige Nucleotidsequenz des chromosomalen DNA-Fragments wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt, das ein gewöhnliches Nucleotidsequenzierungsverfahren ist, und die DNA-Struktur wurde zur Bestimmung der Positionen des Enhancers, des Promotors, des Operators, der SD-Sequenz, des Leader-Peptids, des Attenuators, des Anfangscodons, des Endcodons, des offenen Leserahmens usw. untersucht.
Das aus dem Coryneform Bakterium erhaltene Gen, das an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel beteiligt ist, ist das dtsR-Gen, das eine Sequenz aufweist, die von den Nucleotiden 467-469 (ATG) bis zu den Nucleotiden 1985-1987 (CTG) reicht, und die in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz, die durch das Gen codiert werden kann, ist in der SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste gezeigt. Ein weiteres ATG (Nucleotid Nrn. 359- 361) ist stromaufwärts von dem ATG der Nucleotide 467-469 in dem gleichen Rahmen vorhanden und die Möglichkeit, dass dieses ATG ein Anfangscodon ist, wird nicht verneint. Aufgrund der Analyse der Consensus-Sequenz in dem stromaufwärts liegenden Bereich des Gens wird jedoch angenommen, dass das ATG der Nucleotide 467-469 ein Anfangscodon ist. Das heißt, es wird angenommen, dass die Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nrn. 37- 543 in der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäure die Aminosäuresequenz des DTSR-Proteins ist. Sofern auf die Aminosäuresequenz von dem DTSR-Protein und die Nucleotidsequenz von dem dtsR-Gen in der Beschreibung und den Ansprüchen bezug genommen wird, können diese mit dem ATG der Nucleotide 467 bis 469 als Anfangscodon beschrieben werden. Es sollte jedoch die Möglichkeit in Erwägung gezogen werden, dass das ATG der Nucleotide 359 bis 361 das Anfangscodon ist. Bei der Einführung des dtsR-Gens in ein Coryneform Bakterium zur Verbesserung der Expression wird angenommen, dass die Expression der Sequenz mit den Nucleotiden Nrn. 467-1987 der in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleotidsequenz ausreichend ist. Für den Fachmann ist jedoch selbstverständlich, dass bei Einführung des codierenden Bereichs und des stromaufwärts liegenden Bereichs, der in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleotidsequenz, einschließlich der Nucleotide Nrn. 359-466, in ein Coryneform Bakterium, das DTSR-Protein richtig exprimiert wird, welches ATG auch immer das Anfangscodon ist. In beiden Fällen kann das N-terminale Methionin, das durch das Anfangscodon codiert wird, mit einer Aminopeptidase bei der Expression des dtsR-Gens in Zellen gespalten werden.
Gemäß einer Datenbankrecherche wurde bestätigt, dass das dtsR- Gen mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleotidsequenz und das DTSR-Protein, das durch diese Sequenz codiert wird, neu sind. Es wurde festgestellt, dass dieses Protein homolog mit dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8049-8053 (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4864-4869 (1986) und Gene, 122, 199-202 (1992) beschriebenen Protein ist, das als Propionyl-CoA- Carboxylase (PCC) β Untereinheitsprotein bezeichnet wird. Jedoch weist keine dieser Veröffentlichungen darauf hin, dass das Protein an der Herstellung von Glutaminsäure beteiligt ist.
Propionyl-CoA-Carboxylase ist ein Enzym, das eine Reaktion des Stoffwechselweges katalysiert, bei dem α-Ketoglutarinsäure in Succinyl-CoA über 2-Hydroxyglutarinsäure, Propionyl-CoA, Di- Methylmalonyl-CoA und L-Methylmalonyl-CoA umgewandelt wird, und es scheint, dass der Stoffwechselweg ein Umleitungsweg für die durch α-Ketoglutaratdehydrogenase katalysierte Reaktion in dem TCA-Zyklus ist. In diesem Zusammenhang sollte speziell erwähnt werden, dass Propionyl-CoA-Carboxylase ein Enzym ist, das Biotin als Coenzym benötigt, was darauf hinweist, dass die Herstellung von Glutaminsäure in dem Verfahren, bei dem ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wird, mit der Herstellung von Glutaminsäure in dem Verfahren, bei dem Biotin begrenzt vorliegt, verwandt ist.

< 2> Herstellung eines Coryneform Bakteriums mit der rekombinanten DNA

Die rekombinante DNA, die das dtsR-Gen aus einem Coryneform Bakterium enthält, das an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel beteiligt ist, und das unter dem vorherigen Punkt < 1> erhalten wurde, wird in vitro hergestellt und in Coryneform Bakterien eingeführt. Durch die Einführung wird eine Coryneform Bakterium hergestellt, bei dem die intrazelluläre Konzentration des DTSR-Proteins erhöht ist. Die allgemeine Maßnahme für diesen Zweck ist die intrazelluläre Expression des dtsR-Gens zu verbessern oder die Zahl der Kopien des dtsR-Gens in den Zellen zu erhöhen.
Zur Verbesserung der intrazellulären Expression des dtsR-Gens wird das Gen stromwärts eines starken Promotors ligiert. Das dtsR-Gen wird beispielhaft durch eine Nucleotidsequenz dargestellt, die eine Aminosäuresequenz der Aminosäuren 37-543 der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Insbesondere werden eine Nucleotidsequenz der Nucleotide 467 bis 1987 der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleotidsequenz und eine Nucleotidsequenz, die im wesentlichen gleich wie die Nucleotidsequenz ist, erwähnt. Der Ausdruck "Nucleotidsequenz, die im wesentlichen die gleiche ist", der hier verwendet wird, bedeutet eine Nucleotidsequenz, die ein Protein codiert, das im wesentlichen das gleiche Protein ist, das durch die Nucleotidsequenz der Nucleotide 467 bis 1987 codiert wird in bezug auf die Aktivität, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel zu machen. Hinsichtlich dieser Nucleotidsequenzen sei erwähnt, dass das DTSR-Protein eine Substitution, Deletion oder Insertion einer Aminosäure aufweisen kann, die im wesentlichen nicht die Aktivität beeinträchtigt, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel zu machen.
Als starke Promotoren, die intrazellulär in Coryneform Bakterien wirken, sind der lac Promotor, tac Promotor, und Trp Promotor, abstammend von Escherichia coli, bekannt [siehe Y. Morinaga, M. Tsuchiya, K. Miwa und K. Sano, J. Biotech. 5, 305- 312 (1987)]. Der trp Promotor, der von einem Coryneform Bakterium abstammt, ist bevorzugt (siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 62-195294 (1987)).
Die DNA, enthaltend das dtsR-Gen, und die DNA, enthaltend einen solchen Promotor, werden getrennt hergestellt und werden in vitro miteinander ligiert. Zur Spaltung dieser DNA und zu deren Ligation werden jeweils Restriktionsenzyme und eine Ligase verwendet. Die durch diese Ligation erhaltene rekombinante DNA wird anschließend in Zellen eines Coryneform Bakteriums eingeführt. Zur Einführung kann das gleiche Verfahren, auf das in dem vorherigen Punkt < 1> bezug genommen wird, verwendet werden.
Zur Einführung der rekombinanten DNA, umfassend einen starken Promotor und das dtsR-Gen, in Zellen eines Coryneform Bakteriums, muss ein. Vektor verwendet werden, der in den Zellen des Coryneform Bakteriums wirkt. Bei Verwendung des Vektors, auf den unter Punkt < 1> bezug genommen wird, in diesem Schritt, liegt die rekombinante DNA außerhalb des Chromosoms. Zur Herstellung der rekombinanten DNA auf der chromosomalen DNA wird ein Temperatur-empfindliches Plasmid, wie das in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-7491 (1983) beschriebene, als Vektor verwendet, und die Zellen werden bei einer nicht erlaubten Temperatur kultiviert, um homologe Rekombination zu bewirken.
Die Expression des dtsR-Gens durch die so erhaltenen Zellen des Coryneform Bakteriums, die die rekombinante DNA enthalten, die einen starken Promotor und das dtsR-Gen umfasst, wird verbessert, und die intrazelluläre Konzentration von dem DTSR- Protein wird erhöht.
Bei der Ligation der das dtsR-Gen enthaltenden DNA an ein Mehrfachkopienplasmid und bei der Einführung in Zellen eines Coryneform Bakteriums wird die Kopienzahl dieses Gens in den Zellen erhöht. Als Beispiel eines solchen Mehrkopienplasmids wird auf die unter Punkt < 1> erwähnten bezug genommen.
Außerdem kann ein Verfahren verwendet werden, bei dem die homologe Rekombination bewirkt wird, indem ein Ziel, eine Sequenz, die in einer großen Zahl auf der chromosomalen DNA eines Coryneform Bakteriums vorkommt, verwendet wird. Als Beispiel der Sequenz, die häufig auf der chromosomalen DNA des Coryneform Bakteriums vorkommt, ist eine Insertionssequenz zu erwähnen, die an beiden Enden des transposalen Elements des Coryneform Bakteriums vorkommt. Die Sequenz und ein Verfahren bei dem eine solche homologe Rekombination bewirkt wird, indem dem die Sequenz verwendet wird, sind in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO93/18151 beschrieben.
Die Expression des dtsR-Gens durch die so erhaltenen Zellen eines Coryneform Bakteriums, bei dem die Kopienzahl des dtsR- Gens erhöht wurde, wird verbessert, und die intrazelluläre Konzentration des DTSR-Proteins wird erhöht.

< 3> Herstellung von L-Lysin durch Coryneform Bakterien mit der rekombinanten DNA.

Verschiedene synthetische Mutanten wurden daher als L-Lysin herstellende Bakterien verwendet. Bei deren Verwendung als Wirte kann die erfindungsgemäße rekombinante DNA in diese eingeführt werden zur Verbesserung ihrer L-Lysin Produktivität. Solche synthetische Mutanten sind folgende: S-(2-Aminoethyl)- Cystein (hiernach als "AEC" bezeichnet)-resistente Mutanten, Mutanten, die Aminosäuren, wie L-Homoserin für deren Wachstum benötigen (siehe japanische Patentveröffentlichungsnr. 48-28078 (1973) und 56-6499 (1981)), Mutanten, die gegen AEC resistent sind und Aminosäuren, wie L-Leucin, L-Homoserin, L-Prolin, L- Serin, L-Arginin, L-Alanin, L-Valin usw. benötigen (siehe US Patente Nrn. 3 708 395 und 3 825 472), L-Lysin herstellende Mutanten, die resistent sind gegen DL-α-Amino-&epsi;-Caprolactam, L- Aminolauryl-Lactam, Asparaginsäureanaloga, Sulphonamid-Arzneimittel, Chionide und N-Lauroyl-Leucin und L-Lysin herstellende Mutanten, die resistent sind gegen Oxalacetat-Decarboxylase Inhibitoren oder Enzyminhibitoren gegen die Atemwege (siehe offengelegte japanische Patentanmeldungen Nrn. 50-53588 (1975), 50-31093 (1975), 52-102498 (1977), 53-9394 (1978), 53-86089 (1978), 55-9783 (1980), 55-9759 (1980), 56-32995 (1981981) 56- 39778 (1981), japanische Patentveröffentlichungs-Nrn. 53-43591 (1978) und 53-1833 (1978)), L-Lysin herstellende Mutanten, die Inositol oder Essigsäure benötigen (siehe offengelegte japanische Patentanmeldungen Nrn. 55-9784 (1980) und 56-8692 (1981), L-Lysin herstellende Mutanten, die empfindlich gegen Fluorpyruvinsäure oder gegen Temperaturen von 34ºC oder höher sind (siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 53- 86090 (1978)), L-Lysin herstellende Mutanten von Brevibacterium oder Corynebacterium, die resistent gegen Ethylenglycol sind (siehe US Patent Nr. 4 411 997).
Als spezifische Beispiele wird auf die folgenden Stämme bezug genommen.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12031 (FERM BP-277), siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 60-62994 (1985).
Brevibacterium lactofermentum ATCC 39134, siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 60-62994 (1985).
Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (FERM P-1987), siehe japanische Patentveröffentlichungsnr. 51-34477 (1976).
Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (FERM BP-2294), siehe US Patent Nr. 5 304 476.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 (FERM BP 3239), siehe US Patent Nr. 5 304 476.
Corynebacterium glutamicum AJ12596 (FERM BP-3242), siehe US Patent Nr. 5 304 476.
Bei dem Coryneform Bakterium, das erhalten wird durch Einführen der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA in diese L-Lysin herstellenden Bakterien gemäß dem Verfahren unter Punkt < 2> , ist die intrazelluläre Konzentration des DTSR-Proteins erhöht, und das resultierende Bakterium kann eine große L-Lysinmenge herstellen.
Das zur L-Lysinherstellung verwendete Medium kann gewöhnliches Medium sein, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und, wenn gewünscht, andere sekundäre organische Nährstoffe enthält.
Zucker, wie Hydrolysate aus Stärke usw., Alkohole, wie Ethanol, Inositol usw., organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarinsäure, Zitronensäure, Succinsäure usw. sind verwendbar.
Als Stickstoffquellen sind verwendbar anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat usw., organische Stickstoffverbindungen, wie Hydrolysate von Sojabohnen usw., sowie Ammoniakgas, wässriges Ammoniak usw.
Als anorganische Ionen werden kleine Mengen von Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Magnesiumionen zu dem Medium gegeben. Als sekundäre organische Nährstoffe sind wesentliche Substanzen, wie Vitamin B1 usw. sowie Hefeextrakt usw. in geeigneten Mengen bevorzugt enthalten, wenn notwendig.
Es ist ratsam, die Kultivierung unter aeroben Bedingungen 16-72 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 30-45ºC durchzuführen, und während der Kultivierung wird der pH des Mediums zwischen 5 und 7 eingestellt. Zur Einstellung des pHs können anorganische oder organische saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas usw. verwendet werden.
Die Sammlung von Lysin aus der Fermentierungsflüssigkeit kann durch ein gewöhnliches Ionenaustauscherverfahren, ein Ausfällungsverfahren und andere bekannte Verfahren in Kombination durchgeführt werden.

< 4> Herstellung von Coryneform Bakterien, bei denen das DTSR- Protein nicht normal wirkt.

Das dtsR-Gen wurde als Gen erhalten, das Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, wie unter dem vorherigen Punkt < 1> erwähnt. Es war daher zu erwarten, dass der Stamm mit dem amplifizierten dtsR-Gen keine L-Glutaminsäure in einem Medium herstellen würde, in das ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration gegeben wurde, bei der der Wildtyp-Stamm eines Coryneform Bakteriums L-Glutaminsäure in der Gegenwart einer überschüssigen Biotinmenge herstellt.
Diesbezüglich wurde die Wirkung der Amplifikation des dtsR-Gens auf die Herstellung von L-Glutaminsäure, wobei ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wurde, gemäß dem Verfahren untersucht, das in den unten beschriebenen Beispielen gezeigt ist und, wie zu erwarten war, wurde eine merkbare Hemmung der Herstellung von L-Glutaminsäure beobachtet. Außerdem wurde bestätigt, dass die Amplifikation des dtsR-Gens zu der Unterdrückung der Herstellung von L-Glutaminsäure führt bei dem Verfahren, bei dem Biotin begrenzt vorliegt und dem Verfahren, bei dem Penicillin zugegeben wird, eine überschüssige Biotinmenge vorhanden ist. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das dtsR-Gen den Stamm nicht nur beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, sondern auch eine wichtige Rolle bei der Herstellung von L-Glutaminsäure spielt.
Wegen dieser Gründe wurde erwartet, dass wenn im Gegensatz zu dem vorher gesagten, die Expression des dtsR-Gens gehemmt und die intrazelluläre Konzentration oder Aktivität des DTSR- Proteins verringert wird, die Fähigkeit der Zellen, L- Glutaminsäure herzustellen, verbessert sein könnte und L- Glutaminsäure insbesondere in einem Medium hergestellt werden könnte, das eine überschüssige Biotinmenge enthält ohne Zugabe einer Substanz, die die Biotinaktivität unterdrückt, wie oberflächenaktive Mittel oder Antibiotika.
Diesbezüglich wurde ein Stamm, bei dem das dtsR-Gen des Wildtyps zerstört worden war, hergestellt und die Fähigkeit des so modifizierten Stamms, L-Glutaminsäure herzustellen, wurde untersucht, und es wurde bestätigt, dass der dtsR-Gen zerstörte mutante Stamm eine große L-Glutaminsäuremenge herstellt, selbst wenn Biotin in einer so hohen Konzentration vorhanden ist, bei der der Wildtyp-Stamm wenig L-Glutaminsäure herstellt, dies wird in den folgenden Beispielen verdeutlicht.
Der Stamm, bei dem das dtsR-Gen mutiert ist, kann durch ein Verfahren erhalten werden, bei die Mutation unter Verwendung eines chemischen Mittels ausgelöst wird, oder durch ein Verfahren unter Verwendung einer rekombinanten DNA-Technik. Sofern das Gen schon vorhanden ist, kann es durch homologe Rekombination leicht zerstört werden. Die Zerstörung eines Gens durch homologe Rekombination wird allgemein angewendet.
Dafür sind ein Verfahren, bei dem eine lineare DNA verwendet wird, und ein Verfahren, bei dem ein Temperatur-empfindliches Plasmid verwendet wird, verwendbar.
Insbesondere durch seitengerichtete Mutation [siehe Kramer, W. und Faits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)] oder durch Mutation mit Chemikalien, wie Natriumhyposulfit, Hydroxylamin usw. [siehe Shortle, D. und Nathans, D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 270 (1978)] wird die Substitution, - Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion eines oder mehrerer Nucleotide in der Nucleotidsequenz des codierenden Bereichs oder dem Promotorbereich in dem dtsR-Gen durchgeführt. Das so modifizierte oder zerstörte Gen wird mit dem normalen Gen auf dem Chromosom ersetzt, wodurch die Aktivität des genetischen Produkts, des DTSR-Proteins, verringert wird oder verschwindet oder durch die Transkription verringert wird oder verschwindet.
Bei der seitengerichteten Mutagenese werden synthetische Oligonucleotide verwendet und gemäß diesem Verfahren ist es möglich, jede gewünschte Substitution, -Deletion, -Insertion, - Addition oder -Inversion in nur (ein) beschränktes Basenpaar/beschränkte Basenpaare einzuführen. Zur Durchführung dieses Verfahrens wird zunächst ein Plasmid, das das gewünschte Gen aufweist, das kloniert und dessen Nucleotidsequenz bestimmt worden war, denaturiert, um eine einzelsträngige DNA herzustellen. Anschließend wird ein synthetisches Oligonucleotid, das mit der zu mutierenden Stelle komplementär ist, hergestellt. Das synthetische Oligonucleotid soll so sein, dass es keine vollständig komplementäre Sequenz aufweist, sondern jede gewünschte Nucleotid-Substitution, -Deletion, - Insertion, -Addition oder -Inversion aufweisen kann. Danach wird die einzelsträngige DNA mit dem synthetischen Nucleotid, das eine solche gewünschte Nucleotid-Substitution, -Deletion, - Insertion, -Addition oder -Inversion aufweist, anneliert. Dann wird unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA Polymerase I und T4 Ligase ein vollständiges doppelsträngiges Plasmid gebildet. Das resultierende Plasmid wird anschließend in die kompetente Escherichia coli Zelle eingeführt. Einige dieser so erhaltenen Transformanten weisen ein Plasmid auf, das das Gen enthält, das die gewünschte Nucleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion hat. Als ähnliches Verfahren zum Modifizieren oder Zerstören des Gens durch das Einführen der Mutation ist das rekombinante PCR-Verfahren bekannt [siehe PCR Technology, Stockton Press (1989)].
Das chemische Behandlungsverfahren ist ein Verfahren zur direkten Behandlung des DNA-Fragments, das das beabsichtigte Gen enthält, mit Natriumhyposulfit, Hydroxylamin oder einer ähnlichen Chemikalie, wobei zufallsbedingt die Mutation mit der Nucleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder - Inversion in das DNA-Fragment eingeführt wird.
Ob die gewünschte Mutation eingeführt wird oder nicht, kann bestätigt werden durch Transformieren einer Mutante, die empfindlich gegen ein oberflächenaktives Mittel ist, mit dem DNA-Fragment, das der Mutationsbehandlung unterzogen wurde, und Bestimmen, dass die resultierenden Transformanten beständig gegen oberflächenaktive Mittel sind. Bei dieser Gelegenheit kann ein mutiertes Gen, das Temperatur-empfindlich ist, erhalten werden, indem das Wachstum sowohl bei niedriger als auch bei hoher Temperatur innerhalb der Temperatur, bei der Coryneform Bakterien gewöhnlich wachsen, untersucht, und ein Transformant, der bei niedriger Temperatur wachsen kann und dessen Wachstum bei hoher Temperatur gehemmmt wird, ausgewählt wird.
Als Maßnahme zum Substituieren des so erhaltenen Gens, das modifiziert oder durch Einführung der Mutation auf dem Chromosom eines Coryneform Bakteriums für das normale Gen zerstört wurde, ist ein Verfahren unter Verwendung homologer Rekombination verwendbar [siehe Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press 81972), Matsuyma, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)]. Gemäß der homologen Rekombination tritt, wenn ein Plasmid oder dergleichen mit einer Sequenz, die homolog mit der Sequenz des Chromosoms ist, in die Zelle eingeführt wird, eine Rekombination an den Stellen auf, die die homologe Sequenz mit einer bestimmten Häufigkeit aufweisen, wodurch das vollständig eingeführte Plasmid in das Chromosom aufgenommen wird. Beim Auftreten einer weiteren Rekombination an den Stellen, die die homologe Sequenz auf dem Chromosom aufweisen, wird das Plasmid aus dem Chromosom entfernt. Durch die letztere Rekombination wird das Gen, in das die Mutation eingeführt wurde, auf dem Chromosom fixiert, wobei dies von der rekombinierten Stelle abhängt, und das ursprüngliche normale Gen kann aus dem Chromosom zusammen mit dem Plasmid entfernt werden. Durch Auswählen eines solchen Stammes ist es möglich, einen Stamm zu erhalten, bei dem das modifizierte oder durch das Einführen einer Mutation, einer Nucleotid-Substitution, -Deletion, - Insertion, -Addition oder -Inversion zerstörte Gen mit dem normalen Gen auf dem Chromosom ausgetauscht wurde.

< 5> Herstellung von L-Glutaminsäure durch Coryneform Bakterien, bei denen das DTSR-Protein nicht normal wirkt.

Wie oben beschrieben weist ein Stamm, der ein L-Glutaminsäure herstellendes Coryneform Bakterium ist, und bei dem die intrazelluläre Konzentration oder Aktivität des DTSR-Proteins verringert ist, das heißt, ein Stamm, bei dem das DTSR-Protein nicht normal wirkt, eine verbesserte L-Glutaminsäure- Produktivität auf. Insbesondere kann der Stamm L-Glutaminsäure herstellen, ohne Zugabe einer Substanz, die die Biotinaktivität unterdrückt, wie ein oberflächenaktives Mittel oder Antibiotikum, selbst wenn Biotin im Überschuss vorhanden ist.
Damit eine Mutante erhalten wird, bei der das DTSR-Protein nicht normal wirkt, werden Coryneform Bakterien, die L- Glutaminsäure herstellen, gezüchtet, und es kann ein Glutaminsäure herstellender Wildtyp-Stamm oder eine von Coryneform Bakterien abstammende Mutante als Ausgangsstamm verwendet werden. Im folgenden werden einige Beispiele der Mutante aufgeführt:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12745 (FERM BP-2922), siehe US Patent Nr. 5 272 067.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746, (FERM BP-2923), siehe US Patent Nr. 5 272 067.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12747, (FERM BP-2924), siehe US Patent Nr. 5 272 067.
Corynebacterium glutamicum AJ 12478 (FERM BP-2925), siehe US Patent Nr. 5 272 067.
Corynebacterium glutamicum ATCC 21492.
Das zur Herstellung von L-Glutaminsäure verwendete Medium kann ein gewöhnliches Medium sein, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen, und, wenn gewünscht, andere sekundäre organische Nährstoffe enthält.
Als Kohlenstoffquellen sind verwendbar Saccharide, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Stärkehydrolysate usw., Alkohole, wie Ethanol, Inositol usw., organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarinsäure, Zitronensäure, Succinsäure usw.
Als Stickstoffquellen sind verwendbar anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat usw., organische Stickstoffverbindungen, wie Hydrolysate von Sojabohnen usw., sowie Ammoniakgas, wässriges Ammoniak usw.
Als anorganische Ionen werden kleine Mengen an Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Magnesiumionen zu dem Medium gegeben. Als sekundäre organische Nährstoffe sind wesentliche Substanzen, wie Vitamin B1 usw. sowie Hefeextrakt usw. bevorzugt in geeigneten Mengen enthalten, wenn notwendig.
Es wird empfohlen, die Kultivierung unter aeroben Bedingungen 16-72 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 30-45ºC durchzuführen, und während der Kultivierung den pH des Mediums auf 5 bis 8 zu halten. Zur Einstellung des pHs können anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas usw. verwendet werden.
Oberflächenaktive Mittel oder Penicillin können zu dem Medium gegeben werden, wenn der so erhaltene dtsR-Gen zerstörte Stamm kultiviert, wird oder die Biotinkonzentration indem Medium kann begrenzt werden. Auf diese Weise kann die Ausbeute der in den Medien herzustellenden L-Glutaminsäure weiter erhöht werden.
Die Sammlung von Lysin aus der Fermentierungsflüssigkeit kann durch ein gewöhnliches Ionenaustauschverfahren, ein Ausfällungsverfahren und andere bekannte Verfahren in Kombination bewirkt werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Wachstum von AJ 11060/pDTR6 (dtsR-Gen amplifizierter Stamm) und AJ 11060/pSAC4 (Kontrolle) in einem Medium, das kein oberflächenaktives Mittel enthält oder zu dem ein oberflächenaktives Mittel gegeben wurde.
O: Stamm, in den pDTR6 eingeführt wurde, in einem Medium ohne oberflächenaktives Mittel
: Stamm, in den pSAC4 eingeführt wurde, in einem Medium ohne oberflächenaktives Mittel
: Stamm, in den pDTR6 eingeführt wurde, in einem Medium, zu dem ein oberflächenaktives Mittel gegeben wurde
: Stamm, in den pSAC4 eingeführt wurde, in einem Medium, zu dem ein oberflächenaktives Mittel gegeben wurde
Fig. 2 zeigt den Grad der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel von ATCC 13869/pHSGX-KΔE (dtsR-Gen amplifizierter Stamm, bei dem eine Mutation vom Typ Deletion durchgeführt wurde), ATCC 13869/pDTR6 (dtsR-Gen amplifizierter Stamm) und ATCC 13869/pSAC4 (Kontrolle).
O: Stamm, in den pSAC4 eingeführt wurde
Δ: Stamm, in den pHSGX-KΔE eingeführt wurde,
: Stamm, in den pDTR6 eingeführt wurde
Fig. 3 zeigt die Wachstumskurve von AJ 11060/pDTR6 und AJ 11060/pSAC4 in einem Medium, das 300 oder 3 ug/Liter Biotin enthält.
O: Stamm, in den pDTR6 eingeführt wurde, in der Gegenwart von 300 ug/Liter Biotin
: Stamm, in den pSAC4 eingeführt wurde, in der Gegenwart von 300 ug/Liter Biotin
: Stamm, in den pDTR6 eingeführt wurde, in der Gegenwart von 3 ug/Liter Biotin
: Stamm, in den pSAC4 eingeführt wurde, in der Gegenwart von 3 ug/Liter Biotin

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 Herstellung chromosomaler DNA aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (ein Wildtyp-Stamm von Coryneform Bakterien)

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde in 100 ml T-Y Medium (enthaltend 1% Bacto-Tripton (von Difco), 0,5% Bacto- Hefeextrakt (von Difco)und 0,5% NaCl, pH 7,2) geimpft und 8 Stunden bei 31,5ºC kultiviert. Diese Kultur wurde bei 3000 Upm 15 Minuten unter Erhalt von 0,5 g nasser Zellen zentrifugiert. Aus den nassen Zellen wurde die chromosomale DNA gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (siehe Biochem. Biophys., Acta 72, 619 (1963)) erhalten. Danach wurden 60 ug chromosomale DNA und drei Einheiten des Restriktionsenzyms Sau3I in 10 mM Tris- HCl Puffer (enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSO&sub4; und 1 mM Dithiothreitol, pH 7,4) gemischt und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung einer gewöhnlichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen, um 50 ug chromosomale DNA- Fragmente aus mit Sau3AI verdauten Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 zu erhalten.

Beispiel 2 Herstellung einer Genbibliothek von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 unter Verwendung einer Plasmidvektor-DNA

20 ug einer Plasmidvektor-DNA (pSAC4), die sich sowohl in Escherichia coli Zellen als auch in Coryneform Bakterien Zellen autonom replizieren kann, und 200 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI wurden in 50 mM Tris-HCl Puffer (enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM Magnesiumsulfat, pH 7,4) gemischt und bei 37ºC zwei Stunden unter Erhalt einer verdauten Lösung reagiert, und die Lösung wurde anschließend einer gewöhnlichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen. Danach wurde das DNA- Fragment von Phosphor befreit mit bakterieller alkalischer Phosphatase gemäß dem Verfahren, das in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, beschrieben ist [J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 1.56 (1989)], um das Wiederverbinden des Plasmidvektor-abstammenden DNA- Fragments zu verhindern, anschließend wurde das DNA-Fragment, das von Phosphor befreit war, einer gewöhnlichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen.
Ein ug des mit BamHI verdauten pSAC4, 1 ug der mit Sau3AI verdauten chromosomalen DNA-Fragmente aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, die in Beispiel 1 erhalten wurden, und zwei Einheiten T4 DNA Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 66 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), enthaltend 66 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP gegeben und darin 16 Stunden bei 16ºC reagiert, um die Ligation der DNA durchzuführen. Dann wurden die Escherichia coli Zellen DH5 mit dieser DNA-Mischung transformiert, und die resultierenden transformanten Zellen wurden in ein L-Agar Medium, enthaltend 170 ug/ml Chloramphenicol, geimpft, um ungefähr 20000 Kolonien zu erhalten, die eine Genbibliothek bilden.

Beispiel 3 Transformation von Brevibacterium lactofermentum AJ 11060

Von diesen oben erwähnten ungefähr 20000 Kolonien wurden die rekombinanten DNA gemäß dem oben beschriebenen Verfahren von Saito und Miura zurückgewonnen.
Die rekombinante DNA-Mischung, die in 50 Chargen unterteilt wurde, wurde in Zellen des Stammes AJ 11060 eingeführt, eine Mutante, die empfindlich gegen oberflächenaktive Mittel ist, durch gewöhnliche Transformation unter Verwendung von elektrischem Impuls (siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2-207791 (1990)). Die resultierenden transformanten Zellen wurden in ein L-Agarmedium, zu dem Glucose gegeben wurde, geimpft, und die Kultivierung wurde bei statischer Inkubation bei 31,5ºC durchgeführt, wodurch auf dem Medium ungefähr 20000 Kolonien von Transformanten gebildet wurden. Anschließend wurden diese Kolonien von Transformanten auf dem gleichen Medium, das aber 30 mg/l des oberflächenaktiven Mittels enthielt, repliziert und verschiedene Stämme, die beständig gegen oberflächenaktive Mittel sind, und auf dem Medium wachsen, wurden erhalten.

Beispiel 4 Messung der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel von Stämmen mit Mehrfachkopien des dtsR-Gens

Die rekombinante DNA wurde aus jedem der unterschiedlichen Stämme, die wachsen gelassen worden waren, extrahiert und Brevibacterium lactofermentum AJ 11060 wurde wieder mit der DNA transformiert. Aus den resultierenden Transformanten wurde ein Stamm, der beständig gegen oberflächenaktive Mittel ist, ausgewählt. Die rekombinante DNA dieses Stammes wurde pDTR6 genannt, und das Gen, das in diesem Plasmid enthalten ist, und das den Stamm beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, wird dtsR genannt. Die Hemmung des Wachstums von AJ 11060, der das Plasmid aufweist, ist in einem flüssigen Medium, zu dem 3 g/Liter oberflächenaktives Mittel gegeben wurden, unterdrückt (siehe Fig. 1).

Beispiel 5 DNA-Herstellung

Das Plasmid wurde aus AJ 11060/pDTR6, das die rekombinante DNA, die oben erhalten wurde, aufweist, gemäß einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt, und es wurde in Escherichia coli JM 109 eingeführt. Die resultierenden Escherichia coli JM 109/pDTR6 wurden in 20 ml Medium, enthaltend 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt und 0,5 NaCl, 24 Stunden bei 37ºC kultiviert, und 20 ml der resultierenden Kultur wurden in 1 Liter eines Mediums, das die gleiche Zusammensetzung wie oben hat, geimpft und die Kultivierung wurde drei Stunden bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurden 0,2 g Chloramphenicol zugegeben, und die Kultivierung wurde weitere 20 Stunden bei der gleichen Temperatur unter Erhalt einer Kultur fortgesetzt. Danach wurde die resultierende Kultur 10 Minuten bei 3000 Upm unter Erhalt von 2 g nasser Zellen zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen wurden in 20 ml 350 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,0), enthaltend 25 % Sucrose, suspendiert und anschließend wurden 10 mg Lysozym (hergestellt von Sigma Co.), 8 ml 0,25 M EDTA-Lösung (pH 8,0) und 8 ml 20% Natriumdodecylsulfat-Lösung zugegeben. Daraufhin wurde die resultierende Suspension 30 Minuten bei 60ºC unter Erhalt eines Lysats erwärmt. 13 ml 5 M NaCl Lösung wurden zu dem Lysat gegeben, und das Lysat wurde anschließend 16 Stunden bei 4ºC behandelt. Nach der Behandlung wurde es 30 Minuten bei 15000 Upm zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde einer gewöhnlichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unter Erhalt eines DNA Niederschlags unterworfen.
Der Niederschlag wurde bei reduziertem Druck getrocknet und anschließend in 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, gelöst und 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml Ethidiumbromid (19 mg/ml) wurden zugegeben. Anschließend wurde eine Dichtegradient-Zentrifugation im Gleichgewicht unter. Verwendung einer Ultrazentrifuge bei 39.000 Upm 42 Stunden durchgeführt, wodurch die DNA isoliert wurde. Anschließend wurde unter Verwendung von n-Butanol Ethidiumbromid daraus entfernt und danach wurde eine Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, durchgeführt, um ungefähr 500 ug einer gereinigten rekombinanten DNA, pDTR6, zu erhalten. Die Nummer AJ 12967 wurde Escherichia coli JM 109/pDTR6 zugeordnet. Dieser Stamm wurde am 22. Februar 1994 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14168 hinterlegt und bekam am 9. Februar 1995 die internationale Hinterlegungsnummer FERM BP-4994 gemäß Budapester Vertrage über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen.

Beispiel 6 Analyse der Nucleotidsequenz der DNA mit dem dtsR-Gen

Die Nucleotidsequenz der in Beispiel 5 erhaltenen rekombinanten DNA wurde bestimmt. Die Sequenzierung wurde gemäß dem Sanger Verfahren unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (hergestellt von Applied Biochemicals, Co.) durchgeführt. Die Nucleotidsequenz der so erhaltenen DNA ist in der Sequenzliste mit der SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Während der längste offene Leserahmen dieser Sequenz eine Nucleotidsequenz ist, die von der Position 359, die ein A ist, bis zur Position 1987, die ein G ist, in der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleotidsequenz reicht, wird aufgrund der Analyse der Consensus-Sequenz angenommen, dass das ATG an der Position 467 bis 469, das sich in dem stromaufwärts liegenden Bereich des Gens befindet, das Anfangscodon ist. Die Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammen mit der Nucleotidsequenz gezeigt, wobei sie durch den offenen Leserahmen codiert wird, der von der Position 359, die ein A ist, bis zur Position 1987, die ein G ist, reicht. Außerdem ist ausschließlich die Aminosäuresequenz in der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste gezeigt. Ein Protein, das durch die Nucleotidsequenz der Nucleotide von 467 bis 1987 codiert wird, wird als DTSR-Protein bezeichnet.
Es ist bekannt, dass der N-terminale Methioninrest des Proteins nach der Translation durch die Wirkung einer Peptidase deletiert wird. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das N- terminale Methionin von dem Translationsanfangscodon ATG abstammt und daher in keinerlei Beziehung zu der intrinsischen Wirkung des Proteins in den meisten Fällen steht. Höchstwahrscheinlich ist der Methioninrest auch in dem erfindungsgemäßen DTSR-Protein deletiert.
Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz wurden mit bekannten Sequenzen hinsichtlich der Homologie verglichen. Die für den Vergleich verwendeten Datenbanken waren EMBL und SWISS-PROT. Die Ergebnisse bestätigten, dass das in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste dargestellte Gen und das dadurch codierte Protein neu sind.

Beispiel 7 Bestätigung der Teilnahme des dtsR-Gens an der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel

Der offene Leserahmen wurde durch Nucleotidsequenzierung, die das Vorhandensein des DTSR-Proteins nahe legt, bestimmt. Zur weiteren Bestimmung, dass das Gen, das Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, in diesem Bereich vorkommt, wurde ein Teil des Gens in dem Bereich des offenen Leserahmens deletiert, in dem eine Deletion des in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste dargestellten Genfragments durchgeführt wurde, und dieses Genfragment wurde daraufhin untersucht, ob es Aktivität oder keine aufweist, Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel zu machen. Insbesondere wurde pDTR6 mit XbaI und KpnI verdaut, um ein Fragment zu erhalten, das das dtsR-Gen enthält. Dieses Genfragment wurde an ein Fragment des Plasmids pHSG398 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), das mit XbaI und KpnI behandelt worden war, unter Verwendung der T4 DNA Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert, um das Plasmid pHSGX-K herzustellen. Das dtsR-Gen weist zwei Seiten auf, die mit Eco52I verdaut werden, und zwar an den Nucleotiden 766 und 1366 in der SEQ ID Nr. 1. pHSGX-K wurde vollständig mit Eco52I verdaut und anschließend wieder ligiert, um das Plasmid pHSGX-KΔE herzustellen, aus dem 600 Basenpaare der Eco52I-Fragmente deletiert wurden. Die Struktur von dem dtsR- Gen in pHSGX-KΔE war derart, dass der mittlere Teil auf einem im Rahmen liegende Weise deletiert wurde.
Damit sich pHSGX-KAE in Coryneform Bakterien autonom replizieren kann, wurde anschließend der Replikationsursprung, der von dem bekannten Plasmid pHM1519, das sich selbständig in Coryneform Bakterien amplifizieren kann (siehe Miwa, K. et al., Agric. Biol. Chem. 48, 2901-2903 (1984), offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-7491 (1993)) in die einzige KpnI Spaltstelle, die in pHSGX-KAE vorhanden ist, eingeführt. Genauer gesagt wurde pHM1519 mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um ein Genfragment mit einem Replikationsursprung zu erhalten, und das resultierende Fragment wurde mit glatten Enden versehen unter Verwendung eines Bluntingkits, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., und anschließend in die KpnI Spaltstelle von pHSGX-KΔE unter Verwendung eines KpnI Linkers (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unter Erhalt von pKCX-KΔE eingeführt. Als Kontrollprobe wurde der Replikationsursprung von pHM1519 in die SalI Stelle von pHSG399 unter Verwendung eines SalI-Linkers, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., eingeführt, unter Erhalt von pSAC4. pKCX-KΔE und pSAC4 wurden getrennt in Zellen eines Wildtyp-Stamms von Coryneform Bakterien, nämlich in Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, gemäß dem oben erwähnten elektrischen Impulsverfahren eingeführt, und die resultierenden Transformanten wurden auf den Grad der Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel untersucht. Für diese Untersuchung wurden die Zellen in einem M-CM2G flüssigen Medium kultiviert, zu dem von 0 bis 10 mg/dl Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat gegeben worden war, und das Wachstumsvermögen in der Zellkultur wurde gemessen.
Die Ergebnisse verifizieren, dass das dtsR-Gen vom Deletionstyp die Wirkung verloren hatte, Beständigkeit gegen oberflächenaktive Mittel zu vermitteln.

Beispiel 8 Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines dtsR-Genamplifizierten Stammes durch das Biotin-begrenzte Verfahren

Der Stamm AJ 11060/pDTR6 wurde kultiviert, um L-Glutaminsäure gemäß dem oben erwähnten Biotin-begrenzten Verfahren herzustellen. Genauer gesagt wurde der Stamm AJ 11060/pDTR6 auf einer M-CM2G Platte, die 4 mg/Liter Chloramphenicol enthält, getrennt kultiviert. Anschließend wurden die Zellen, die wachsen gelassen wurden, in ein Medium geimpft, das 80 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4; · 7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysatlösung, 200 ug Thiaminhydrochlorid, 60 ug Biotin, 4 mg Chloramphenicol und 50 g CaCO&sub3; in einem Liter reinem Wasser [der pH des Mediums wurde mit KOH auf 7,0 eingestellt] enthält und darin 20 Stunden bei 31,5ºC kultiviert. Die resultierende Kultur wurde in das gleiche Medium wie oben geimpft, das aber kein Biotin in einer Konzentration von 5% pro Volumen enthält (dieses Medium wird hiernach als "Biotin-begrenztes Medium" bezeichnet), und die Kultivierung wurde 20 Stunden bei 31,5ºC durchgeführt.
Während der Kultivierung des Stammes AJ 11060/pDTR6 in dem Biotin-begrenzten Medium wurde die Biotin-Menge, die pro Gewichtseinheit der in dem Medium wachsenden Zellen erforderlich war, gemessen (siehe Fig. 3). Als Kontrolle wurde der Stamm AJ 11060/pSAC4 auf die gleiche Weise wie oben kultiviert.
Die Mengen der Zellen des Stammes AJ 11060/pDTR6, die wachsen gelassen wurden, waren größer als die der Kontrolle. Folglich war der Biotinbedarf pro Gewichtseinheit der Zellen von AJ 11060/pDTR6 geringer als der des Stammes AJ 11060/pSAC4.

Beispiel 9 Herstellung von L-Lysin durch den dtsR-Genamplifizierten Stamm

pDTR6 wurde in einen L-Lysin herstellenden Stamm von Coryneform Bakterien, nämlich in Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (FERM BP-2294), durch ein elektrisches Impulsverfahren eingeführt. Die resultierenden Transformanten wurden in einem oben erwähnten Medium zur Herstellung von L-Lysin kultiviert.
Genauer gesagt wurde der Stamm auf einer M-CM2G Platte, die 4 mg/Liter Chloramphenicol enthält, kultiviert, und die so erhaltenen Zellen wurden in ein Medium, enthaltend 100 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4; · 7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysatlösung, 200 ug Thiaminhydrochlorid, 300 ug Biotin, 4 mg Chloramphenicol und 50 g CaCO&sub3; in einem Liter reinem Wasser [der pH des Mediums wurde mit KOH auf 7,0 eingestellt] enthält, 40 Stunden bei 32ºC geimpft. Als Kontrolle wurde ein Stamm verwendet, in dem pSAC4 anstelle von pDTR6 auf die gleiche Weise eingeführt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Stamm L-Lysin (g/Liter)

AJ 12435/pSAC4 15
AJ 12435/pDTR6 25

Vergleichsbeispiel 1 Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines dtsR-Gen- amplifizierten Stamms durch das Verfahren, bei dem ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wird

Durch Zugabe eines oberflächenaktives Mittels als Mittel, das die Biotinaktivität unterdrückt, kann der Stamm AJ 11060 eine große Menge von L-Glutaminsäure herstellen, selbst wenn eine hohe Biotinkonzentration vorhanden ist. Da dtsR-Gen-amplifizierte Stämme eine erhöhte Beständigkeit gegen ein oberflächenaktives Mittel aufweisen, wurde angenommen, dass die Herstellung von L-Glutaminsäure durch diese Stämme verringert sein wird, auch wenn ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wird. Die Stämme AJ 11060/pSAC4 und AJ 11060/pDTR6 wurden zur Herstellung von L-Glutaminsäure gemäß dem oben erwähnten Verfahren, bei dem ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wird, kultiviert. Genauer gesagt, wurden diese Stämme auf einer M-CM2G Platte, die 4 mg/Liter Chloramphenicol enthält, kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in ein Medium geimpft, enthaltend 80 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4; · 7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysatlösung, 200 ug Thiaminhydrochlorid, 300 ug Biotin, 4 mg Chloramphenicol, 3,0 g Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat und 50 g CaCO&sub3; in einem Liter reinem Wasser [der pH des Mediums wurde mit KOH auf 8,0 eingestellt] und darin 20 Stunden bei 31,5ºC kultiviert.
Nach der Kultivierung wurde die hergestellte und in jeder Kultur angehäufte L-Glutaminsäuremenge gemessen. Die erhaltenen Ausbeuten sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ausbeute ist dargestellt als Ausbeute von L-Glutaminsäure auf der Basis von dem zu dem Medium gegebenen Zucker (Gewichtsbasis).

Tabelle 2

Stamm Ausbeute von L-Glutaminsäure (%)

AJ 11060/pSAC4 29,6
AJ 11060/pDTR6 9,0
Durch Amplifizieren des dtsR-Gens ist die Ausbeute von L- Glutaminsäure auffallend verringert. Dies deutet darauf hin, dass das DTSR-Protein eng an der Herstellung von L- Glutaminsäure durch das Verfahren, bei dem ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wird, beteiligt ist.

Vergleichsbeispiel 2 Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines dtsR-Gen-amplifizierten Stamms durch das Verfahren, bei dem Penicillin zugegeben wird

Die Stämme AJ 11060/pSAC4 und AJ 11060/pDTR6 wurden zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch das Verfahren, bei dem Penicillin zugegeben wird, auf die gleiche Weise wie in Vergleichsbeispiel 1 kultiviert, außer dass 30 Einheiten Penicillin anstelle von Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat zu dem Medium gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Stamm Ausbeute von L-Glutaminsäure (%)

AJ 11060/pSAC4 27,6
AJ 11060/pDTR6 12,8
Durch Amplifizieren des dtsR-Gens ist die L-Glutaminsäureausbeute auffallend verringert. Dies weist darauf hin, dass das DTSR-Protein an der Herstellung von L-Glutaminsäure durch das Verfahren, bei dem Penicillin zugegeben wird, sowie an der Herstellung von L-Glutaminsäure durch das Verfahren, bei dem ein oberflächenaktives Mittel zugegeben wird, beteiligt ist.

Beispiel 10 Herstellung eines Stamms, bei dem das dtsR-Gen zerstört ist

Da festgestellt wurde, dass die Herstellung von L-Glutaminsäure durch Amplifikation des dtsR-Gens verringert wurde, wurde erwartet, dass die Zerstörung des dtsR-Gens zu einer Erhöhung der Ausbeute von L-Glutaminsäure führen würde. Der Gen-zerstörte Stamm wurde durch das homologe Rekombinationsverfahren, das in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-7491 (1993) offenbart ist, unter Verwendung eines Temperatur-empfindlichen Plasmids, erhalten.
Genauer gesagt, wurde der Replikationsursprung, der aus einem Plasmid erhalten wurde, das sich in Coryneform Bakterien autonom repliziert und bei dem die autonome Replikation Temperatur-empfindlich ist, in die KpnI-Erkennungsstelle des in Beispiel 7 gezeigten pHSGX-KΔE eingeführt unter Bildung des Plasmids pKTC-KΔE.
pKTC-KΔE wurde in den Wildtyp-Stamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 durch ein elektrisches Impulsverfahren eingeführt, und das dtsR-Gen auf dem Chromosom wurde durch ein dtsR- Gen des Deletionstyps gemäß dem in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-7491 (1993) beschriebenen Verfahren ersetzt. Genauer gesagt wurde ATCC 13869/pKTC-KAE durch Schütteln in einem wässrigen M-CM2G Medium, enthaltend 50 ug/ml Oleinsäure, 6 Stunden bei 25ºC kultiviert, und die Kultur wurde in ein M-CM2G Medium, enthaltend 5 ug/ml Chloramphenicol und 50 ug/ml Oleinsäure geimpft. Die Plasmid-eingeführten Stämme bildeten bei 34ºC Kolonien und diese wurden gesammelt. Von den so erhaltenen Stämmen wurden diejenigen durch ein Replikationsverfahren ausgewählt, die bei 34ºC empfindlich auf Chloramphenicol reagieren. Die Chromosomen dieser empfindlichen Stämme wurden durch ein gewöhnliches Verfahren erhalten, und die Struktur des dtsR-Gens auf jedem dieser Chromosomen wurde durch das Souffhern- Hybridisierungsverfahren untersucht. Folglich wurde der Stamm, bei dem das dtsR-Gen durch ein dtsR-Gen vom Deletionstyp ersetzt worden war, bestätigt und als Stamm ΔE bezeichnet.

Beispiel 11 Bestimmung der L-Glutaminsäure Produktivität in dem Stamm ΔE

Die Stämme ATCC 13869, AJ 11060 und ΔE wurden kultiviert, um L-Glutaminsäure auf die gleiche Weise wie unten erwähnt herzustellen. Diese Stämme wurden jeweils aufgefrischt durch Kultivierung auf einer M-CM2G Platte. Die so aufgefrischten Stämme wurden in ein Medium geimpft, enthaltend 80 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4; · 7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat, 200 ug Thiaminhydrochlorid, 300 ug Biotin, 1 g Tween 80® (Polyoxyethylensorbitanmonooleat) und 50 g CaCO&sub3; in einem Liter reinem Wasser [der pH des Mediums wurde mit KOH auf 8,0 eingestellt] und die Kultivierung wurde 20 Stunden bei 31,5ºC durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Stamm L-Glutaminsäure (g/Liter)

ATCC 13869 0
AJ 11060 0
ΔE 34
In bezug auf den Wildtyp-Stamm und den Stamm AJ 11060 wurde keine Anhäufung von L-Glutaminsäure beobachtet, da Biotin in einer überschüssigen Menge in dem Medium vorhanden ist. Im Gegensatz dazu stellte der Stamm AE L-Glutaminsäure ausreichend her und häufte sie an.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Das erfindungsgemäße dtsR-Gen ist ein Gen, das eine wichtige Rolle spielt bei der Herstellung von L-Glutaminsäure in Coryneform Bakterien, die zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentierung verwendet werden. Wenn dieses Gen in L- Lysin herstellenden Coryneform Bakterien amplifiziert wird, wird die L-Lysin-Produktivität verbessert. Wenn dieses Gen in L-Glutaminsäure herstellenden Coryneform Bakterien zerstört wird, wird die L-Glutaminsäure-Produktivität verbessert.

SEQUENZLISTE

ANGABEN ZU SEQ. ID NR. 1
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2855
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(1x) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 359..1987
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID Nr. 1:
ANGABEN ZU SEQ. ID NR. 2,
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 543
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID Nr. 2:

Claims

1. Gen, abstammend von einem Coryneform Bakterium, das ein Protein codiert, das die Aminosäuren 37 bis 543 der in SEQ. ID Nr. 2 der Sequenzliste gezeigten Aminosäuresequenz umfasst und das Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht.

2. Gen nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 37 bis 543 eine Substitution, -Deletion, - Insertion, -Addition oder -Inversion umfasst, die die Aktivität, die Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, nicht nachteilig beeinflusst.

3. Gen nach Anspruch 1 oder 2, das die Nucleotide 467 bis 1987 der in SEQ. ID Nr. 1 der Sequenzliste gezeigten Nucleotidsequenz umfasst.

4. Rekombinante DNA, erhältlich durch Legieren eines Vektors, der in Coryneform Bakterien wirkt, an das in den Ansprüchen 1 bis 3 definierte Gen.

5. Coryneform Bakterium, das die in Anspruch 4 definierte rekombinante DNA aufweist.

6. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, umfassend das Kultivieren eines Coryneform Bakteriums, das die in Anspruch 4 definierte rekombinante DNA aufweist und L- Lysin in einem flüssigen Medium herstellen kann, um L- Lysin in der Kultur herzustellen und anzuhäufen, und das Sammeln von L-Lysin.

7. Gen nach den Ansprüchen 1 bis 3, umfassend eine Nucleotidsequenz mit einer Substitution, -Deletion, - Insertion, -Addition oder -Inversion von einem oder mehreren Nucleotiden, wobei die Aktivität des durch die besagte Nucleotidsequenz codierten Proteins, das Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, verringert ist.

8. Rekombinante DNA, erhältlich durch Ligieren eines in Coryneform Bakterien wirkenden Vektors an das in Anspruch 7 definierte Gen.

9. Coryneform Bakterium, bei dem die intrazelluläre Konzentration oder Aktivität eines durch das in den Ansprüchen 1 bis 3 definierte Gen codierten Proteins, das Coryneform Bakterien beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, verringert ist.

10. Coryneform Bakterium nach Anspruch 9, bei dem die Aktivität, die es beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, verringert ist, indem das Auftreten der homologen Rekombination zwischen der in Anspruch 8 definierten rekombinanten DNA, die in das Coryneform Bakterium eingeführt ist, und einem Gen auf einem Chromosom des Coryneform Bakteriums ermöglicht wird, wobei das Gen das Protein codiert, dass das Coryneform Bakterium beständig gegen oberflächenaktive Mittel macht, wodurch das Gen eine Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide in der Nucleotidsequenz des Gens erhält.

11. Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend das Kultivieren des im Anspruch 9 oder 10 definierten Coryneform Bakteriums, das L-Glutaminsäure herstellen kann, in einem flüssigen Medium, um L-Glutaminsäure in der Kultur herzustellen und anzuhäufen, und Sammeln der L-Glutaminsäure.