JP3245881B2 - 塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸の同時発酵法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、塩基性Ｌ−アミノ駿生
産菌を酸性Ｌ−アミノ酸産生条件下に培養するか或いは
塩基性Ｌ−アミノ酸生産菌と酸性Ｌ−アミノ酸生産菌を
混合培養することを特徴とする塩基性Ｌ−アミノ酸と酸
性Ｌ−アミノ酸の同時発酵法に関する。

【従来の技術】従来発酵法による塩基性Ｌ−アミノ酸と
酸性Ｌ−アミノ酸の同時生産は知られていない。知られ
ていたのは塩基性Ｌ−アミノ酸及び酸性Ｌ−アミノ酸の
いずれか一方の１種のアミノ酸を培地中に蓄積させるも
のであった。この場合、２種以上のアミノ酸が培地中に
認められても、目的以外のアミノ酸は副生物程度の微量
（数１０ｍｇ／ｄｌ）存在するのみであった。換言すれ
ば、塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸を同時に商業的蓄積
量で発酵生産する方法は種々のメリットが期待されるに
も拘わらず未だ知られていない。

【発明が解決しようとする課題】本発明は、塩基性アミ
ノ酸と酸性アミノ酸を同時に商業的蓄積量で発酵生産す
る方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的の
ために種々検討し、塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸を同
時に生産する方法を確立し、本発明を完成した。本発明
は、前記のように、塩基性Ｌ−アミノ酸生産菌を酸性Ｌ
−アミノ酸産生条件下に培養するか或いは塩基性Ｌ−ア
ミノ酸生産菌と酸性Ｌ−アミノ酸生産菌を混合培養する
ことを特徴とする塩基性Ｌ−アミノ酸と酸性Ｌ−アミノ
酸の同時発酵法に関する。以下、本発明を詳細に説明す
る。本発明に云う塩基性Ｌ−アミノ酸にはＬ−リジン
（Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジ
ン（Ｈｉｓ）及びＬ−オルニチン（Ｏｒｎ）が含まれ、
酸性Ｌ−アミノ酸にはＬ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）及び
Ｌ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）が含まれる。先ず、塩基
性Ｌ−アミノ酸生産菌を使用し、これを酸性Ｌ−アミノ
酸産生条件下に培養して塩基性Ｌ−アミノ酸と酸性Ｌ−
アミノ酸を同時に発酵生産する本発明に係わる第１の方
法について説明する。発酵培地としては、炭素源、窒素
源、無機塩類、生育因子などを含有する栄養培地または
合成培地が用いられる。炭素源としては、グルコース，
フラクトース，シュークロース，糖蜜，デンプン，デン
プン加水分解物，果汁などの炭水化物、エタノール，メ
タノール，プロパノールなどのアルコール類、酢酸など
の有機酸類が使用できる。窒素源としては、硫酸アンモ
ニウム，硝酸アンモニウム，塩化アンモニウム，リン酸
アンモニウム，酢酸アンモニウム，アンモニア，アミン
類，ペプトン，肉エキス，酵母エキス，コーン・スチー
ブ・リカー，カゼイン加水分解物，各種発酵菌体および
その消化物が使用できる。栄養要求性を示す変異株を使
用する場合には、それらの要求物質を標品もしくはそれ
を含有する天然物として添加する。発酵は、通気攪拌，
振盪培養などの好気的条件下で行う。培養温度は２４〜
４０℃、培養日数は２〜７日間である。培養液のｐＨは
５〜９の範囲に維持する。ｐＨの調節には尿素，炭酸カ
ルシウム，アンモニアガス，アンモニア水などを用い
る。 これらの発酵倍地及び発酵条件は従来公知のアミ
ノ酸発酵に採用されているものであるが、本方法では発
酵条件として更に塩基性Ｌ−アミノ酸と酸性Ｌ−アミノ
酸を同時に発酵する条件をも採用しなければならない。
これについて以下詳述する。従来知られている塩基性Ｌ
−アミノ酸生産菌は、通常、酸性Ｌ−アミノ酸生産菌で
あるブレビバクテリウム属細菌、コリネバクテリウム属
細菌などのコリネ型細菌を各種の変異処理に付して得ら
れている。例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＴＣＣ １３８６９にニトロソグアニジンを
変異剤として変異処理をほどこし、ＡＥＣ（Ｓ−２−ア
ミノエチル−Ｌ−システイン）の耐性を付けたリジン生
産菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ ２１７９８がある。一方、コリネ型細菌に属する酸
性Ｌ−アミノ酸生産菌は、涌堂ビオチン要求性である
が、ビオチンが充分量存在する培地（１０μｇ／ｌ以
上）では菌体が増殖するのみで酸性Ｌ−アミノ酸の蓄積
は殆んど見られない。酸性Ｌ−アミノ酸を蓄積させるた
めには菌体の増殖を抑制することが必要で、そのために
は低ビオチン濃度の培地を使用するかビオチンが充分量
存在する培地の場合はポリオキシエチレンソルビタンモ
ノパルミテート（ＰＥＳＰ）、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノステアレート（ＰＥＳＳ）、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート（ＰＥＳＬ）などの界面
活性剤又はペニシリン、セファロリジンなどのラクタム
系抗生物質を培養の初発又は徐上で培地に添加する必要
がある。因みにこのようなコリネ型細菌に属する酸性Ｌ
−アミノ酸生産菌から変異誘導された塩基性Ｌ−アミノ
酸生産菌はやはりビオチン要求性であるが、これを培養
して塩基性Ｌ−アミノ酸を発酵生産する場合は、元の酸
性Ｌ−アミノ酸生産菌を培養して酸性Ｌ−アミノ酸を発
酵生産する場合とは異なり、培地に充分量のビオチンが
存在していてもよく、ビオチンを低濃度に制限する必要
はない。本発明の方法に使用できるＬ−アミノ酸生産菌
の例を表１に示す。

【表１】 しかして、本発明者は、上のような塩基性Ｌ−アミノ酸
性産菌を元の酸性Ｌ−アミノ酸生産菌を使用して酸性Ｌ
−アミノ酸を発酵生産する培養条件下に培養したとこ
ろ、極めて予期せざることに、塩基性Ｌ−アミノ酸のみ
ならす酸性Ｌ−アミノ酸をも同時に蓄積することを見出
したのである。尤も、この場合塩基性Ｌ−アミノ酸の対
炭素源収率は低下し、酸性Ｌ−アミノ酸が低下分に相当
する量で蓄積する。かくして、塩基性Ｌ−アミノ酸生産
菌が上のようなビオチン栄養要求性細菌である場合、そ
の酸性Ｌ−アミノ酸産生条件は低ビオチン濃度の培地を
使用するかビオチンが充分量存在する培地の場合はＰＥ
ＳＰなどの界面活性剤又はペニシリンなどのラクタム系
抗生物質を培養の初発又は途上で培地に添加することで
ある。 低ビオチン濃度とは濃度０．５〜１０μｇ／ｌ
のビオチン濃度である。こうすることによって例えばＬ
ｙｓと共にＧｌｕを生産することができる。培養の初発
又は途上で培地に添加するＰＥＳＰなどの界面活性剤及
びペニシリンなどのラクタム系抗生物質の添加量は、界
面活性剤については０．０１〜０．５ｇ／ｄｌ程度、ペ
ニシリンについては０．１〜１０Ｕ／ｍｌ程度である。
こうすることによって、例えばＬｙｓと共にＧｌｕを生
産することができる。次に、本発明に係わる第２の方
法、すなわち、塩基性Ｌ−アミノ酸性産菌と酸性Ｌ−ア
ミノ酸生産菌を併用して、混合培養する塩基性Ｌ−アミ
ノ酸と酸性Ｌ−アミノ酸の同時発酵法について説明す
る。塩基性Ｌ−アミノ酸生産菌及び酸性Ｌ−アミノ酸生
産菌がブレビバクテリウム属細菌、コリネバクテリウム
属細菌などのコリネ型細菌、枯草菌、などのバチルス属
細菌、大腸菌などのエシエリヒア属細菌等に属すること
は周知であり、これらのアミノ酸生産菌は広く使用され
る。又、発酵培地及び発酵条件は、第１の方法に関して
前記した従来公知のアミノ酸発酵に採用されているもの
でよい。第２の方法における塩基性Ｌ−アミノ酸と酸性
Ｌ−アミノ酸の同時発酵条件は塩基性Ｌ−アミノ酸生産
菌を使用して塩基性Ｌ−アミノ酸を発酵蓄積させる条件
と酸性Ｌ−アミノ酸生産菌を使用して酸性Ｌ−アミノ酸
を発酵蓄積させる条件とを単に相加的に併用するだけで
よい。しかして、２種の発酵条件はいずれも前記した従
来公知のアミノ酸発酵条件として一括されるものであっ
て、両者間に実質的な相違はない。相違のあるのは、例
えば、混合培養する２種の細菌の一方のみが栄養要求性
で他方が栄養要求性のない場合であるが、この場合栄養
要求性のある細菌の培養条件として培地に要求栄養物質
を添加することが必要なのに対して栄養要求性のない細
菌の培養条件として培地に要求栄養物質を特に加える必
要がない。栄養要求性細菌と非栄養要求性細菌の混合培
養の場合、両者の発酵条件の相加的併用とは培地に該栄
養物質を添加することである。非栄養要求性細菌と栄養
要求性細菌を混合培養して一方の細菌に塩基性Ｌ−アミ
ノ酸を産生せしめ、他方の細菌に酸性Ｌ−アミノ酸を産
生せしめる場合、当該要求栄養物質を培地に添加しても
非栄養要求性細菌のアミノ酸産生には何らの悪影響も及
ぼさないのである。前記のような同時発酵の条件を採用
することにより、本発明の方法（第１及び第２）によれ
ば、塩基性Ｌ−アミノ酸と酸性Ｌ−アミノ酸を同時に各
々商業的蓄積量、すなわち、約５００ｍｇ／ｄｌ以上の
蓄積量で培地中に蓄積させることができる。発酵終了液
から生成蓄積したアミノ酸を分離取得するには常法でよ
く、例えばイオン交換樹脂法（例えば、発酵終了液から
先ず陽イオン交換樹脂により塩基性アミノ酸を吸着分離
し、ついで陰イオン交換樹脂により酸性アミノ酸を吸着
分離する。）によることができる。塩基性Ｌ−アミノ酸
と酸性Ｌ−アミノ酸の混合物の用途に対してはもちろん
両種のアミノ酸を相互に分離することは不要である。前
記のように本発明の塩基性Ｌ−アミノ酸と酸性Ｌ−アミ
ノ酸の同時発酵法は種々のメリットを有するが、以下こ
れらについて説明する。培地中のイオン量の低減に関し
て云えば、例えば、Ｌｙｓ発酵の場合、従来のＬｙｓ単
独発酵法では生成するＬｙｓを中和するために酸性イオ
ンが０．２〜０．４Ｍ必要であったが、本発明の方法を
用いてＬｙｓ及びＧｌｕの同時発酵を行うことにより
０．１〜．０．２Ｍと必要イオン量が半減できる。発酵
生産性の向上（アミノ酸生成速度の向上）に関し云え
ば、例えば、従来のＬｙｓ単独発酵の場合、菌体・時間
当りのＬｙｓ生成速度は０．０３〜０．０４ｈｒ^−１で
あるが、本発明の方法を用いてＬｙｓ及びＧｌｕの同時
発酵を行うことによりＬｙｓ及びＧｌｕの合計生成速度
は０．０６〜０．０８ｈｒ^−１と約２倍に向上する。培
地成分の節減省略に関して云えば、例えば、従来のＬｙ
ｓ発酵の場合、培地成分として硫酸アンモニウム及びア
ンモニアが２〜６ｇ／ｄｌ必要なのに対し、本発明の方
法を用いてＬｙｓ及びＧｌｕの同時発酵を行うことによ
り硫酸アンモニウムは必要なくアンモニアも１ｇ／ｄｌ
以下でよい。発酵液処理（アミノ酸の単離操作）での簡
略化に関して云えば、例えば、従来のＬｙｓ発酵の場
合、処理工程で脱塩工程が必要となるが、本発明の方法
によりＬｙｓ及びＧｌｕの同時発酵を行うことにより処
理工程での脱塩工程が不要になる。廃液の環境保全負荷
の低減に関して云えば、例えば、従来のＬｙｓ発酵の場
合、その製造工程より排出される廃液には活性汚泥処理
やその後に続く脱窒処理により除去すべき窒素化合物が
含有されているが、本発明の方法によりＬｙｓ及びＧｌ
ｕの同時発酵を行えば、この廃液中の窒素化合物をほと
んどゼロにすることができる。

【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。 実施例１（Ｌｙｓ生産菌の培養によるＬｙｓとＧｌｕの
同時生産） 粗糖を糖として１４０ｍｇ／ｍｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｍｇ
／ｍｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｆｅ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／ｍｌ、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ
_２Ｏ ２０μｇ／ｍｌ、尿素５ｍｇ／ｍｌ、大豆蛋白酸
加水分解物「味液」（登録商標）５μｌ／ｍｌ、ビオチ
ン５０μｇ／ｌ及びサイアミン６０μｇ／ｌを含有する
水溶液培地を調製し、その２０ｍｌづつを５００ｍｌ容
の振盪フラスコに入れ１１５℃で１０分間加熱滅菌し
た。この培地にＬｙｓ生産菌ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム（ＡＴＣＣ ２１７９８）を接種し往
復振盪機により３１．５℃で培養を行った。培養中、培
養液をｐＨ６．５ないし８．０に保つように４００ｍｇ
／ｍｌの濃度の尿素水溶液を少量づつ添加した。培養液
の２６倍希釈液の５６２μｍおける吸光度が０．３０に
到達した時にＰＥＳＰ（ポリオキシエチレンソルビタン
モノパルミテート）を４ｍｇ／ｍｌ添加し、３０時間で
発酵を終了し、発酵液中に蓄積したＬ−リジン及びＬ−
グルタミン酸を液体クロマトグラフィーにより定量した
ところ、Ｌ−リジン３０ｍｇ／ｍｌ及びＬ−グルタミン
酸２２ｍｇ／ｍｌが蓄積していた。同様の培地に硫酸ア
ンモニウム２５ｍｇ／ｍｌ加えた培地と同じ菌株を用い
て、培養途中でＰＥＳＰを添加しないこと以外は同様の
方法によりリジン単独発酵を行ったところ、５５時間で
発酵が終了し、発酵液中にＬ−リジンが５３ｍｇ／ｍｌ
蓄積していた。Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸の同時発
酵の場合の培地中のイオン量は０．１３Ｍと後者のＬ−
リジン単独発酵の場合の０．２８Ｍの半量であった。ア
ミノ酸生成速度は、Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸の同
時発酵の場合、菌体・時間当りのＬ−リジンとＬ−グル
タミン酸の合計生成速度は０．０６６ｈｒ^−１、Ｌ−リ
ジン単独発酵ではＬ−リジン生成速度が０．０３５ｈｒ
^−１であった。培地成分の比較では、後者のＬ−リジン
単独発酵の場合には初発培地の硫酸アンモニウム及び初
発と追加添加の尿素由来のアンモニアを併せて３５ｍｇ
／ｍｌ必要なのに対して、Ｌ−リジンとＬ−グルタミン
酸の同時発酵の場合には硫酸アンモニウムはゼロ、尿素
由来のアンモニアは初発と追加添加併せても６ｍｇ／ｍ
ｌであった。さらに、得られた発酵液についてイオン交
換樹脂を用いた常法により処理を行った。イオン交換樹
脂にＬ−リジンやＬ−グルタミン酸を吸着させた残りの
樹脂貫流液中の塩濃度は、Ｌ−リジン単独発酵の場合に
は５％以上と極めて高く、該貫流液を有効利用をするた
めに脱塩が必要であった。一方Ｌ−リジンとＬ−グルタ
ミン酸の同時発酵の場合には２％以下と塩濃度が薄く脱
塩は不要であった。また、樹脂洗浄液等の廃液を活性汚
泥法により処理したところ、Ｌ−リジン単独発酵の廃液
では含有されたＢＯＤは除去し得たが窒素化合物が多量
残存し、さらに別途脱窒処理の必要性が認められたが、
Ｌ一リジンとＬ−グルタミン酸の同時発酵の廃液では活
性汚泥処理によりＢＯＤを除去した処理水中には多量の
窒素化合物は特に認められなかった。 実施例２（Ｌｙｓ生産菌の培養によるＬｙｓとＧｌｕ同
時生産） グルコース １５％、リン酸第一カリ ０．１％、硫酸
マグネシウム・７水塩０．０４％、硫酸アンモニウム２
％、ビチオン １００γ／ｌ、ビタミンＢ_１塩酸塩 ２
００γ／ｌ、鉄イオン及びマンガンイオン各２ｐｐｍ、
及び「味液」１％を含有するｐＨ７．０の水溶液培地を
小型ガラス製ジヤー・フアーメンターに３００ｍｌ分注
し、殺菌後、あらかじめ３０℃で２４時間ブイヨンスラ
ント上で生育させたＬｙｓ生産菌ブレビバクテリウム・
フラバム（ＡＴＣＣ ２１１２７）を接種した。つい
で、これを３１℃で培養を開始し、約１０時間経過した
後、ペニシリンを６Ｕ／ｍｌの濃度になるように添加し
培養を続け、１８時間培養したところ、発酵終了時には
培地中に３．７５ｇ／ｄｌのＬ−リジンと２．０５ｇ／
ｄｌのＬ−グルタミン酸が生成蓄積していた。この発酵
終了液１ｌから、遠心分離によって菌体を除去し、上清
液からイオン交換樹脂をもちいる常法にしたがってＬ−
リジンおよびＬ−グルタミン酸を分離し、精製して、Ｌ
−リジン塩酸塩の結晶２８．１ｇとＬ−グルタミン酸ソ
ーダの結晶１８．５ｇを得た。 実施例３（Ｈｉｓ生産菌の培養によるＨｉｓとＧｌｕの
同時生産） Ｈｉｓ生産菌ブレビバクテリウム・フラバム（ＡＴＣＣ
２１４０６）を下記種培養培地に培種し、２０時間３
１℃にて通気攪拌培養を行った。 種培養培地： グリコース ３ｇ／ｄｌ、尿素 ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ
_２ＰＯ_４ ５０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
０．０４ｇ／ｄｌ、ＦｅおよびＭｎイオン各２ｐｐｍ、
ビオチン２００μｇ／ｌ、サイアミン塩酸塩３００μｇ
／ｌ、大豆タンパク塩酸加水分解液（総窒素７％）１ｍ
ｌ／ｄｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ及び肉エキス０．
５ｇ／ｄｌを含有するｐＨ７．２の水溶液培地。一方、
１ｌ容小型ガラス製ジヤーフアーメンターに下記組成の
主発酵培地を３００ｍｌ分注し、殺菌した。これに上記
種培養液を１５ｍｌ接種し、３１℃にて通気毎分１／１
容の攪拌培養を開始した。 主発酵培地： グルコース １０ｇ／ｄｌ、硫酸アンモニウム ０．５
ｇ／ｄｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ_４・
７Ｈ_２Ｏ ０．０４ｇ／ｄｌ、ＦｅおよびＭｎイオン各
２ｐｐｍ、ビオチン１００μｇ／ｌ、サイアミン塩酸塩
２００μｇ／ｌ及び大豆タンパク塩酸加水分解液（総窒
素７％）２ｍｌ／ｄｌを含有するｐＨ７．２水溶液培
地。３１℃で培養中ｐＨが低下したときに、アンモニア
ガスを添加してｐＨを７．０〜７．５に維持した。培養
開始後１０時間経過後ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノパルミテートを０．４ｇ／ｄｌの濃度となるように添
加し、培養を続けた。１８時間培養後、発酵終了液中に
はＬ−ヒスチジン０．８ｇ／ｄｌおよびＬ−グルタミン
酸１．２ｇ／ｄｌの蓄積が認められた。発酵終了液から
遠心分離により菌体を除去し、その上清液よりイオン交
換樹脂をもちいる常法にしたがってＬ−ヒスチジン結晶
１．９ｇおよびＬ−グルタミン酸結晶２．８ｇを得た。 実施例４（Ｇｌｕ生産菌とＬｙｓ生産菌の混合培養によ
るＧｌｕとＬｙｓの同時生産） Ｇｌｕ生産菌コリネバクテリウム・グルタミクム（ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１２１３８）およびＬｙｓ生産菌ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム（ＡＴＣＣ２１７９
９）を各スラント上より１白金耳かきとり、下記組成の
種培養水溶液培地５０ｍｌにそれぞれ接種し、１８時
間、３１℃にて通気攪拌培養をおこなって、おのおのの
種培養液を調製した。 種培養培地組成： 一方、１ｌ容小型ガラス製ジヤー・フアーメンターに下
記組成の主発酵水溶液培地を３００ｍｌ分注し、常法に
より殺菌した。これらに上記の種培養液を同時にそれぞ
れ１５ｍｌ宛接種し、３１℃にて通気毎分１／１容の攪
拌培養を開始した。主発酵培地： 培養液中に酢酸と酢酸酸アンモニウムとの混合液（酢
酸：酵酸アンモニウムの混合液のモル比は１：０．２
５、混合液の酢酸濃度は６０％）を培地のｐＨを７．２
〜８．０の間に保持するように連続的、あるいは間けつ
的に添加して、３０℃で７２時間培養をおこなった。結
果はＬ−グルタミン酸３７ｇ／ｌ及びＬ−リジン５４ｇ
／ｌの蓄積が認められた。 実施例５（Ａｓｐ生産菌とＡｒｇ生産菌の混合培養によ
るＡｓｐとＡｒｇの同時生産） Ａｓｐ生産菌コリネバクテリウム・グルタミクム（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２１７８）及びＡｒｇ産菌ブレビバクテリ
ウム・フラバム（ＡＴＣＣ ２１４９３）を下記組成の
種培養水溶液培地にそれぞれ別々に接種し、１８時間３
０℃にて通気攪拌培養を行った。 種培養培地組成： グリコース ３％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１％、ＭｇＳＯ
_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０４％、Ｆｅ^＋＋ ２ｐｐｍ、Ｍｎ
^＋＋、２ｐｐｍ、「味液」３ｍｌ／ｄｌ、ビオチン ５
μｇ／ｌ、ビタミンＢ_１・塩酸塩 ３００ｒ／ｌ、尿素
０．３％、ｐｈ７．２。一方、小型ガラス製ジャーフ
ァーメンターに下記組成よりなる主発酵水溶液倍地を３
００ｍｌ分注し雑菌した。これに上気各種培養液を同時
に各々１５ｖ／ｖ％接種し、３１℃にて１５００ｒ．
ｐ．ｍ、通気攪拌培養を開始した。 主発酵灰地組織： エチルアルコール １．５％、硫酸アンモニウム ０．
５％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
０．０４％、Ｆｅ^＋＋２ｐｐｍ、「味液」（登録商標）
２ｍｌ／ｄｌ、ビオチン ５μｇ／１、ビタミン Ｂ_１
・塩酸塩 ３００γ／ｌ、ｐＨ７．２。培養中ｐＨが低
下したときにアンモニアガスを添加してｐＨを７．０〜
７．５に維持した。エチルアルコールは、その消費をガ
スクロマトグラフで定量し、その濃度が０．０１％前後
に減小したときに追添加した。４８時間倍養後、倍養終
了液中はＬ−アスパラギン酸が１．３０ｇ／ｄｌおよび
Ｌ−アルギニンが１．０５ｇ／ｄｌ生成していた。発酵
終了液よりイオン交換樹脂を用いる常法によりＬ−アス
パラギン酸の結晶が２．１８ｇ及びＬ−アルギニンの結
晶が１．９５ｇ得られた。 実施例６（Ａｓｐ生産菌とＨｉｓ生産菌の混合培養によ
るＡｓｐとＨｉｓの同時生産） シュークロース １３ｇ／ｄｌ、尿素 ０．５ｇ／ｄ
ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ ０．０４ｇ／ｄｌ、ＦｅおよびＭｎイオン各２ｐ
ｐｍ、ビオチン ５μｇ／ｌ、サイアミン塩酸塩 ２０
０μｇ／ｌ及び大豆タンパク塩酸加水分解物（総窒素７
％）０．３ｍｌ／ｄｌを含みｐＨ７．２に調節した水溶
液培地を調製し、その２０ｍｌを５００ｍｌ容の振とう
フラスコに分注した。殺菌後あらかじめブイヨンスラン
ト上で生育させたＡｓｐ生産菌コリネバクテリウム・グ
ルタミクム（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１７８）及びＨｉｓ生
産菌ブレビバクテリウム・フラバム（ＡＴＣＣ ２１４
０６）を同じフラスコに接種し、３１℃にて７２時間振
とう培養した。培養中、ｐＨが６．５から８．０の間に
なるように４０ｇ／ｄｌの濃度の尿素水溶液を少量づつ
添加した。培養終了液中には、Ｌ−アスパラギン酸が
０．９５ｇ／ｄｌ及びＬ−ヒスチジンが０．８５ｇ／ｄ
ｌ蓄積していた。培養終了液から遠心分離によって菌体
を除いて得た上澄液をイオン交換樹脂を用いる常法によ
り精製し、Ｌ−アスパラギン酸の結晶１．７５ｇとＬ−
ヒスチジンの結晶１．６ｇを得た 実施例７（Ｇｌｕ生産菌とＬｙｓ生産菌の混合培養によ
るＧｌｕとＬｙｓの同時生産） グルコース ５０ｍｇ／ｍｌ、尿素 ２ｍｇ／ｍｌ、Ｋ
Ｈ_２ＰＯ_４ １ｍｇ／ｍｌ、ＭｇｓＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
０．４ｍｇ／ｍｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０μｇ／
ｍｌ、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ ８μｇ／ｍｌ、大豆蛋白
酸加水分解物「味液」５μｌ／ｍｌ、サイアミン塩酸塩
１０．０μｇ／ｄｌ及びビオチン０．２５μｇ／ｄｌを
含有する水溶液培地を調製しその２０ｍｌを５００ｍｌ
容の振盪フラスコに入れ１１５℃で１０分間加熱殺菌し
た。この培地にＧｌｕ生産菌ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム（ＡＴＣＣ １３８６９）及びＬｙｓ
生産菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ａ
ＴＣＣ ２１８００）を接種し、振とうしつつ３１．５
℃にて培養した。培養中、培養液をｐＨ６．５ないし
８．０に保つように４５０ｍｇ／ｍｌの濃度の尿素溶液
を少量ずつ添加し、３０時間で培養を終了した。培養液
中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びＬ−リジンを定量し
た。その結果、Ｌ−グルタミン酸が１０．５ｍｇ／ｍｌ
及びＬ−リジンが１５．３ｍｇ／ｍｌ蓄積していた。

【発明の効果】塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸を同時に
商業的蓄積量で発酵生産することに係わる本発明により
得られるメリットは、培地中のイオン量を低減すること
が可能となり、延いては培養中の浸透圧の上昇を抑える
ことによる発酵生産性の向上（アミノ酵中成速度の向
上）、培地成分の節減省略、発酵液処理（アミノ酸の単
離操作）での簡略化、発酵液からアミノ酸を分離取得し
た後の廃液の環境保全負荷の低減等が可能となることで
ある。特に廃液の環境保全負荷の低減は、環境保全が強
く叫ばれている現今、看過し得ざるメリットである。総
じて、本発明によればアミノ酸生産における大巾なコス
トダウンの達成が可能となり、安価にアミノ酸を供給で
きる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/14 (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/14 (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 石井 俊昌 三重県四日市市大字日永1730 味の素株 式会社 東海工場内 (72)発明者 吉原 康彦 佐賀県佐賀郡諸富町大字諸富津450 味 の素株式会社 九州工場内 (56)参考文献 特開 昭53−86088（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/04 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ―グルタミン酸および塩基性Ｌ―アミ
   ノ酸の製造法であって、コリネ型Ｌ―グルタミン酸生産
   菌から変異誘導された塩基性Ｌ―アミノ酸を生産する能
   力を有する細菌を、またはコリネ型Ｌ―グルタミン酸生
   産菌とコリネ型Ｌ―グルタミン酸生産菌から変異誘導さ
   れた塩基性Ｌ―アミノ酸生産菌とを、コリネ型Ｌ―グル
   タミン酸生産菌がＬ―グルタミン酸を培地中に生産する
   のに適した培地および培養条件にて培地中に培養する培
   養工程、前記培養工程により培地中に塩基性Ｌ―アミノ
   酸とＬ―グルタミン酸が生成され、培地中に生成された
   塩基性Ｌ―アミノ酸とＬ―グルタミン酸は培地中におい
   て相互に対イオンとなって存在し、および培地中に生成
   されたＬ―グルタミン酸と塩基性Ｌ―アミノ酸を採取す
   る採取工程、 を含むことを特徴とする製造法。
2. 【請求項２】 前記塩基性Ｌ―アミノ酸がＬ―リジンで
   ある請求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】 前記採取工程が、塩基性アミノ酸とＬ―
   グルタミン酸とが相互に対イオンとなって存在している
   溶液について、イオン交換樹脂法により行われる請求項
   １または２に記載の製造法。