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CN1247783C - 发酵生产l－氨基酸的方法 - Google Patents

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CN1247783C CNB001348914A CN00134891A CN1247783C CN 1247783 C CN1247783 C CN 1247783C CN B001348914 A CNB001348914 A CN B001348914A CN 00134891 A CN00134891 A CN 00134891A CN 1247783 C CN1247783 C CN 1247783C
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Abstract

通过培养被编码丙酮酸羧化酶的基因转化了的和具有L-氨基酸产生能力埃希氏杆菌属的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸生产L-氨基酸(如L-苏氨酸和L-谷氨酸)。

Description

发酵生产L-氨基酸的方法
本发明涉及一种生产L-氨基酸的方法，尤其涉及一种使用属于埃希氏杆菌属的细菌生产L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的方法。
传统上，L-氨基酸(如L-苏氨酸和L-谷氨酸)主要是采用属于短杆菌属、棒状杆菌属和微杆菌属的棒形细菌或其突变体通过发酵方法进行生产(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan Center，195-215页，1986)。
另外，已经公开了采用基因重组技术培育生产L-氨基酸的埃希氏杆菌属细菌的技术。
例如，已经公开了一种采用大肠杆菌生产L-赖氨酸的方法，其中大肠杆菌中编码二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶的基因被脱敏而对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制不敏感，并且二氨基庚二酸脱氢酶(或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶)被增强(95/16042)。
尽管L-氨基酸的产生能力通过培育上述的微生物得到很大的提高或生产方法被改进，但仍然希望研究出生产L-氨基酸更有效的方法以便满足将来对氨基酸的大量需要。
丙酮酸羧化酶[丙酮酸：二氧化碳连接酶(形成ADP)，EC 6.4.1.1]是一种含生物素的酶。它催化丙酮酸形成草酰乙酸的羧化反应。还不知道大肠杆菌中是否有丙酮酸羧化酶，但枯草芽胞杆菌(Diesterhaft，M.D.和Freese，E.，J.，生物化学，248，No.176062-6070(1973))和谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch，P.G.等，微生物学，144，915-927(1998))具有丙酮酸羧化酶，并且编码酶的基因的核苷序列已被报导过。
而且，已知丙酮酸羧化酶的活性被增强了的谷氨酸棒状杆菌或丙酮酸羧化酶基因被灭活了的谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch，P.G.等，微生物学，144，915-927(1998))。然而，构创建这些微生物是为了作为实验材料来研究利用葡萄糖生长所必需的酶。还不知道丙酮酸羧化酶活性与L-氨基酸产生能力的关系。也不知道将丙酮酸羧化酶基因引入埃希氏杆菌属的细菌中的意图。
本发明根据前述观点得以完成，其目的是提供一种高效生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的方法。
为了达到上述目的，进行了辛勤的研究，结果本发明的发明人发现将编码丙酮酸羧化酶的基因(下文定义为“pyc基因”)引入埃希氏杆菌属的细菌中能够提高细菌生产L-氨基酸的产生能力。因此本发明得以完成。
即，本发明涉及被编码丙酮酸羧化酶的基因转化了并且具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌。
本发明也提供了含有源自于芽胞杆菌属细菌的编码丙酮酸羧化酶的基因的上述细菌。
本发明进一步提供了引入了低拷贝数的编码丙酮酸羧化酶的基因的上述细菌。
本发明还进一步提供了其中所说的L-氨基酸选自于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸的上述细菌。
本发明也提供了包括在培养基中培养上述细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸的L-氨基酸生产方法。
本发明进一步提供了其中所说的L-氨基酸选自于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸的上述方法。
术语“L-氨基酸产生能力”是指所述细菌比其野生型菌株在培养基中更多地生产和积累L-氨基酸的特性。
根据本发明，L-氨基酸，如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的产生能力在埃希氏杆菌属的细菌中能得到提高。并且，本发明可被用来培育属于埃希氏杆菌属的L-氨基酸产生菌。
图1表示为克隆pycA基因构建枯草芽胞杆菌pycA::KmR受体菌株的方案；
图2表示自枯草芽胞杆菌168克隆pycA基因的方案；
图3表示含有pycA基因的质粒的构建方案。
下面详述本发明。
<1>用pyc基因转化的埃希氏杆菌属的细菌
本发明埃希氏杆菌属的细菌是用pyc基因转化的细菌。作为埃希氏杆菌属的细菌，以大肠杆菌为例。然而，本发明使用的pyc基因并不特别限定，只要它能编码具有丙酮酸羧化酶活性的蛋白，pyc基因的例子包括，例如，源自于芽胞杆菌属细菌的pyc基因或源自于棒状杆菌的pyc基因。已经报导了源自于枯草芽胞杆菌(Genbank/EMBL/DDBJ Accession Z97025，NID g2224758)和谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch，P.G.等，微生物学，144，915-927(1998))的pyc基因的核苷酸序列。因此，采用根据芽胞杆菌属细菌(如枯草芽胞杆菌)或棒状杆菌属细菌(如谷氨酸棒状杆菌)染色体DNA的核苷酸序列合成的引物，以该引物作模板、通过PCR(多聚酶链反应：White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))可制备出pyc基因。
其中具有含枯草芽胞杆菌pyc基因的pMW119-pycA的大肠杆菌44/pMW119-pycA转化子自1999年8月30日被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms Depositary)，GNIIgenetika；1，Dorozhny Proezd.1，113545，莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-7822，并且根据布达佩斯条约于2000年9月1日被从原始保藏转为国际保藏。
其中具有含枯草芽胞杆菌pyc基因的pMW119-pycA的大肠杆菌.MG442/pMW119-pycA的转化子自1999年8月30日被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms Depositary)，GNIIgenetika；1，DorozhnyProezd.1，113545，莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-7821，并且根据布达佩斯条约于2000年9月1日被从原始保藏转为国际保藏。
另外，通过下述完成本发明的方法克隆了编码枯草芽胞杆菌的丙酮酸羧化酶的基因(pycA基因)。
首先，构建了一株pycA基因缺陷型的枯草芽胞杆菌菌株。然后，以该菌株作为受体，通过从枯草芽胞杆菌野生型菌株的基因组DNA文库中分离补充柠檬酸或天冬氨酸营养缺陷菌株的DNA片段进行pycA基因的克隆。由于枯草芽胞杆菌通过丙酮酸羧化酶产生草酰乙酸，如果枯草芽胞杆菌是该酶的缺陷型，其就不能在基本培养基上生长。然而，通过添加L-天冬氨酸、L-谷氨酸、柠檬酸或琥珀酸，可以恢复生长。pycA基因的核苷酸序列和通过该基因编码的氨基酸序如SEQ ID NoS：3和4所示。
pycA基因-缺陷菌株，例如，按如下所述获得。紧接在pycA基因后面的定位在染色体上的ylaP基因的部分DNA片段通过PCR获得。作为PCR的合成引物由SEQ ID NoS：1和2所示的寡聚核苷酸举例说明。然后用含有获得的DNA片段和标记基因的质粒DNA转化一株枯草芽胞杆菌的野生型菌株，接着通过同源重组将该质粒DNA整合到染色体DNA上的ylaP基因中。采用能识别pycA基因中的限制酶切位点的限制酶，例如，PstI来构建所获得的菌株的染色体DNA文库。含有标记基因和部分pycA基因片段的重组质粒可通过用该文库转化一株枯草芽胞杆菌的野生型菌株并筛选表达标记基因的克隆来获得。然后，用线性化的该重组质粒转化一株枯草芽胞杆菌的野生型菌株并且筛选出表达标记基因的克隆以便获得pycA基因-缺陷株，该基因缺陷株中的质粒DNA被整合到该菌株染色体DNA上的pycA基因中。
用pyc基因转化埃希氏杆菌属的细菌，可通过将pyc基因插到在埃希氏杆菌属的细菌中具有功能的合适载体上以构建一个重组载体，并将重组载体引入埃希氏杆菌属的细菌中来完成。
载体通过质粒(如pBR322，pMW118，pMW119，pUC18，pUC19等)，噬菌体载体(如λ1059，λBF101，M13mp9等)，和转座子(如Mu，Tn10，Tn5等)来举例说明。然而，本发明中，因为如果以高拷贝质粒作为载体引入pycA基因，含有该载体的转化子可能是不稳定的，所以低拷贝质粒诸如pMW118和pMW119是更优选的。
将DNA引入埃希氏杆菌属的细菌中可通过，例如，D.A.Morrison的方法(酶学方法68，326，(1979))或采用氯化钙处理受体细菌细胞来增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.，Mol.Biol.，53，159(1970))等来完成。
基因组DNA的制备，基因组DNA文库的构建，杂交，PCR，质粒DNA的制备，DNA的消化和连接，转化等根据本技术领域的技术人员已知的方法进行。这种方法由Sambrook，J.，Fritsche，E.F.，Maniatis，T.在冷泉港实验室出版社的“分子克隆”1.21(1989)中进行了描述。
埃希氏杆菌属的细菌生产L-氨基酸的能力可通过采用PYC基因转化细菌来赋予或增强细菌中丙酮酸羧化酶的活性进行提高。这可能是由于草酰乙酸不但由磷酸烯醇丙酮酸生成，也由丙酮酸生成的缘故。即，由磷酸烯醇丙酮酸系统调节的葡萄糖(或蔗糖)分子到细菌细胞中的运送是通过消耗一个分子的磷酸烯醇丙酮酸而伴随着一个分子的丙酮酸生成而进行的。尽管形成的丙酮酸不是直接用于细菌细胞中L-氨基酸的合成，L-氨基酸的产生能力可通过从丙酮酸生成草酰乙酸来提高。
可采用一株具有产生目的L-氨基酸能力的菌株，作为引入PYC基因的埃希氏杆菌属的细菌。或者，被PYC基因转化的埃希氏杆菌属的细菌可被赋予生产L-氨基酸的能力。另外，大肠杆菌的PYC基因不是已知的，然而，如果以后大肠杆菌中发现了该基因，可以使用该基因。
下面描述生产L-氨基酸的埃希氏杆菌属细菌的实施例。
(1)L-苏氨酸-产生菌
埃希氏杆菌属的L-苏氨酸-产生菌可通过菌株MG442(被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms Depositary)，GNIIgenetika；1，DorozhnyProezd.1，113545，莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-1628)(USP4278765；Guayatiner M.M.等，Genetika(在俄罗斯)，14，947-956(1978))来举例说明。所得到的菌株MG442为抗L-苏氨酸类似物，2-氨基-3-羟基戊酸的突变体，它也是一种渗漏型的异亮氨酸营养缺陷体。它以副产物的形式产生L-苏氨酸和L-谷氨酸。
或者，用pVIC40(USP5175107)转化MG442的转化体优选地被用作L-苏氨酸-产生菌株。
(2)L-赖氨酸-产生菌株
埃希氏杆菌属的L-赖氨酸-产生菌株可通过WO95/16042中描述的各种细菌来举例说明。L-赖氨酸-产生菌株通过其中天冬氨酸激酶活性和二氢二吡啶甲酸还原酶活性增高了的细菌诸如W3110(tyrA)RSFD80+pdapB来具体举例说明。
(3)L-高丝氨酸-产生菌株
埃希氏杆菌属的L-高丝氨酸-产生菌株可通过菌株44(thrB)来举例说明。这菌株是从作为Leu+回复突变株的已知菌株C600(thrB，leuB)(Appleyard R.K.，Genetics，39，440-452(1954))衍生来的。用含有编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的质粒转化44的转化菌株可优选被使用。
大肠杆菌44的一株菌自1980年9月23日被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms Depositary)，GNIIgenetika；l，Dorozhny Proezd.1，113545，莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-2175，并且根据布达佩斯条约于2000年9月1日被从原始保藏转为国际保藏。
(4)L-谷氨酸-产生菌
埃希氏杆菌属的L-谷氨酸-产生菌可通过一株抗缬氨酸的菌株，例如，大肠杆菌菌株B11，K-12(ATCC10798)，B(ATCC11303)和W(ATCC9637)来举例说明。
(5)L-异亮氨酸-产生菌
埃希氏杆菌属的L-异亮氨酸-产生菌可通过一株菌TDH6/pVIC40，pMWD5(Hashiguchi，K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(4)，672-679(1999))或EPO685555A1中记载的AJ12919来举例说明。
<2>L-氨基酸的生产方法
可通过培养被上述pyeA基因转化并在适当培养基中具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，和收集培养基中的L-氨基酸来有效生产L-氨基酸。
L-氨基酸优选地通过L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸来举例说明。通过本发明的方法可生产出单一种类的L-氨基酸或两种以上L-氨基酸的混合物。
本发明的方法中，埃希氏杆菌属的细菌的培养，液体培养基中的氨基酸的收集和纯化可通过与采用细菌发酵生产氨基酸的传统方法类似的方式进行。只要培养基包括碳源和氮源以及矿物质，培养使用的培养基既可以是合成培养基也可以是天然培养基，并且如果必要，细菌所用营养的量需适合于菌体的生长。碳源可包括各种碳水化合物(如葡萄糖和蔗糖)，以及各种有机酸。根据所使用细菌的同化能力，可以使用包括乙醇在内的醇和甘油。氨、各种铵盐诸如硫酸铵、其它氮化合物诸如胺、天然氮源诸如胨、大豆水解物和消化的发酵微生物被作为氮源使用。磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙被作为矿物质使用。
培养优选地是在有氧条件诸如振荡培养、和通气并搅拌培养下进行。培养的温度通常是20至40℃，优选地是30至38℃。培养PH通常是5和9，优选地是6.5和7.2。培养基的PH可采用氨，碳酸钙，各种酸，各种碱，和缓冲液来调节。通常培养1至3天可导致培养基中积累目的L-氨基酸。
L-氨基酸的收集和纯化可通过培养后的离心或膜过滤从培养基中去掉固体(如细胞)，接着进行离子交换，浓缩和结晶分馏等方法来进行。
本发明将通过下述实施例得到更具体的解释。
实施例1：从枯草芽胞杆菌168菌株克隆pycA基因
<1>用于克隆的枯草芽孢杆菌pycA::KmR受体菌株的构建
通过pycA基因的插入诱变，构建枯草芽孢杆菌的受体菌株。pycA基因的片段分两步克隆(参考图.1和图.2)
在数据库中枯草芽孢杆菌基因组序列方案中的一个阅读框(ylaP)被鉴定为pycA基因，编码丙酮酸羧化酶。使用下面一对寡聚核苷酸：5′-GATATAAGGGGACTTCAGAG，和
5′-GGCGCTTTATGCGTTTCAATC
通过PCR扩增克隆紧接在pycA基因终止子后面定位的区域。
用DNA聚合酶I的Klenow片段使269bp(碱基对)的DNA片段平端化并克隆到E.coli菌株的pBR322质粒的ScaI位点上。产生的质粒pBRYCAll用ClaI消化并连接到带有cat基因的1628bp(碱基对)的DNA片段上，该DNA片段通过用ClaI消化pC194而获得。然后，采用获得的质粒pBRYCAllCmR3转化枯草芽胞杆菌168trpC2菌株并筛选CmR-克隆。质粒pBRYCAllCmR3在芽胞杆菌属的细菌中不能自主复制，但能够通过与269bp DNA片段同源整合到pycA基因附近的染色体上。该菌株被命名为枯草芽孢杆菌trpC2xyz::pBRYCACmR3。整合体携带有pBR322-复制子、源自于pBR322的抗四环素的tet编码基因和CmR标记。
分离枯草芽孢杆菌trpC2xyz::pBRYCACmR3的染色体DNA并用来克隆pycA基因的末端部分。用PstI消化的染色体DNA自身连接并转化到E.coli TG1菌株中。筛选出对四环素和氯霉素有抗性的重组子。从一个重组子中提取质粒并命名为pPYC1。质粒pPYC1获得了单一BglII限制酶切位点，该位点定位在pycA基因片段中。这一位点被插到含有用于B.芽胞杆菌的卡那霉素抗性标记的1818bp DNA片段中。质粒pPYC1用BglII消化并连接到被BamHI消化的pUC7KmR上来获得质粒pPYC1::KmR。
野生型枯草芽孢杆菌168trpC2中的pycA基因的失活通过线性化的质粒pPYC1::KmR一步转化相同菌株而获得，接着在补充了卡那霉素的Luria培养液上进行筛选。通过同源双交换重组将KmR标记插到染色体DNA的pycA基因中。
除非培养基中加入柠檬酸或天冬氨酸，所构建的枯草芽孢杆菌pycA::KmR trpC2不能在具有色氨酸的Spizizen基本培养基(Anagnostopoulos，C和Spizizen，J.，J.Bacteriol.，81，741-746(1961))中生长。
(Spizizen基本培养基的组成)
K2HPO4·3H2O                                18.3g/L
KH2PO4                                      6.0g/L
(NH4)2SO4                                   2.0g/L
五水柠檬酸钠                                1.2g/L
MgSO4·7H2O                                 0.2g/L
葡萄糖                                      10.0g/L
pH7.0
枯草芽孢杆菌trpC2pycA::KmR recE::TcR菌株通过用噬菌体E40转导枯草芽孢杆菌recE::TcR菌株中的recE基因的钝化等位基因构建(图.2)。终止受体菌株中重组过程是克隆枯草芽孢杆菌的pycA基因所必要的。所构建的枯草芽孢杆菌trpC2pycA::KmR recE::TcR菌株被用作克隆pycA基因的受体。
<2>通过互补克隆枯草芽孢杆菌的天然pycA基因
从枯草芽孢杆菌168trpC2菌株克隆pycA基因。从菌株168trpC2制备的染色体DNA用EcoRI部分消化并连接到被EcoRI消化的pCB20(EmR)(由Yu Jomantas博士赠送，参考L.O.Butler等编的“遗传转化和表达”，eds.，Intercept Ltd.，POBOX402，Wimborne，Dorset，BH229T2，U.K.，1989，269-281页)上。然后用连接混合物转化trpC2pycA::KmR recE::TcR受体菌株(图.2)。在没有补充柠檬酸或天冬氨酸而补充了色氨酸、红霉素和卡那霉素的Spizizen基本培养基上筛选Asp+，EmR，KmR克隆。互补了pycA突变体的一个筛选克隆中的质粒pPYCR3具有可描述的结构并在二次转化后赋予了相同的Asp+，EmR表型。<3>将含有枯草芽孢杆菌168trpC2菌株的pycA基因的DNA片断克隆到高拷贝数质粒pUC18和pUC19中
质粒pPYCR3用HindII和ScaI消化，然后将带有pycA基因和其5′端上游的序列(包括启动子和核糖体结合位点)的HindII-ScaI片断(4414bp)克隆到用SmaI消化了的pUC18上。因此获得了质粒pUC18-pycA(图.3，上边)。连接反应如下具体进行。90ng SmaI消化的pUC18和300ng由琼脂糖凝胶电泳纯化的带有pycA基因的HindII-ScaI片断(4414bp)在45μl含有1x One-Phor-All缓冲液(Pharmacia，Sweden)和1mM ATP的反应混合物中用2单位的T4DNA连接酶(Pharmacia，Sweden)进行连接反应。
用pUC18-pycA转化E.Coli TG1。获得的转化子通过采用KpnI、XbaI、BamHI、HindIII和EcoRI核酸内切酶进行分析。所有克隆在pUC18质粒的lac启动子的反方向上带有pycA基因。然而，pUC18上克隆的pycA基因可在固有启动子基因的调控下表达。
然后，为了将pycA基因重新置于在lac启动子的调控下，pUC18-pycA的KpnI-XbaI片断被克隆到用KpnI-XbaI消化的pUC19上。然而，所获得的克隆不稳定并且在短的培养时间内(6-8小时)重组质粒丢失。
<4>将带有pycA基因的DNA片断克隆到低拷贝数质粒pMW119中
pUC18-pycA的KpnI-XbaI片断被连接到用KpnI和XbaI消化的低拷贝数质粒pMW119中(图.3，下边)。连接反应于50μl含有60ng用KpnI和XbaI消化的pMW119，120ng由琼脂糖凝胶电泳纯化的pUC18-pycA的KpnI-XbaI片断，1x One-Phor-ALL缓冲液(Pharmacia，Sweden)，1mM ATP和1单位的T4DNA连接酶(Pharmacia，Sweden)的反应混合物中进行。
采用连接混合物转化E.coli TG1。产生的转化子采用SacI、KpnI、XbaI、BamHI、HindIII和EcoRI进行分析。所有克隆带有由pMW119的lac启动子和其本身启动子调控的pycA基因。由此获得的克隆被命名为TG1(pMW119-pycA)，从该克隆获得质粒pMW119-pycA。
           实施例2：L-苏氨酸和L-谷氨酸的生产
E.coli菌株MG442用质粒pMW119-pycA转化并筛选出10个Ampr(抗氨苄青霉素)克隆。克隆生产L-苏氨酸和L-谷氨酸的能力通过下面的发酵培养基来检测。
(发酵培养基的组成)
葡萄糖(单独灭菌)                      60g/L
(NH4)2SO4                             15.0g/L
KH2PO4                                          1.5g/L
MgSO4·7H2O                                     1.0g/L
L-异亮氨酸                                      100mg/L
硫胺素                                          0.1mg/L
CaCO3(单独灭菌)                                 20g/L
通过摇床，发酵在32℃下于试管(20×300mm)中进行72小时。10个克隆的每一个克隆取一环接种到含有2.0ml发酵培养基的试管中。不含质粒的菌株MG442的10个单菌落作为对照。发酵培养后，通过薄层层析测定培养基中积累的L-苏氨酸和L-谷氨酸的浓度。结果见表1。
                              表1
  克隆编号   MG442(对照)   MG442(pMW119-pycA)
  L-苏氨酸G/L   L-谷氨酸G/L   L-苏氨酸g/L   L-谷氨酸g/L
  1   5.5   9.5   7.8   12.3
  2   3.2   7.1   9.8   12.3
  3   3.6   7.1   9.4   13.3
  4   3.4   8.9   9.8   11.8
  5   3.3   8.9   9.8   11.8
  6   4.8   7.3   9.9   11.8
  7   3.3   7.0   10.0   10.7
  8   4.7   8.3   10.0   10.4
  9   3.2   7.3   9.7   11.2
  10   2.6   4.1   10.0   10.7
  平均值   3.8   7.4   9.6   11.6
               实施例3：L-高丝氨酸的生产
生产L-高丝氨酸的E.coli菌株44用质粒pMW119-pycA转化并筛选出5个抗氨卞青霉素的克隆。按照实施例1的方法检测L-高丝氨酸的产量，但发酵培养基中补充了0.5g/l的L-苏氨酸。使用不含质粒的菌株44的克隆作对照。发酵培养后，L-高丝氨酸的平均浓度是4.5g/l(菌株44)和5.7g/l(含有质粒pMW119-pycA的菌株44)。
pycA基因对于L-赖氨酸的产生能力的影响也是可以预测的，因为确信pycA基因对与L-赖氨酸共用部分相同的生物合成途径的L-苏氨酸和L-谷氨酸的生产具有正面影响。
                          序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>发酵生产L-氨基酸的方法
<130>OP877
<141>2000-10-14
<150>RU 99121636
<151>2000-10-14
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
gatataaggg gacttcagag                                                  20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
ggcgctttat gcgtttcaatc                                                 20
<210>3
<211>3462
<212>DNA
<213>芽胞枯草杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(16)..(3458)
<400>3
aagggggagga aaagt ttg tct cag caa tcg ata caa aaa gta tta gta gca     51
                  Leu Ser Gln Gln Ser Ile Gln Lys Val Leu Val Ala
                    1               5                  10
aac agg gga gaa att gca atc cga ata ttc cgg gcg tgt acc gag ttg       99
Asn Arg Gly Glu Ile Ala Ile Arg Ile Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu
         15                  20                 25
aat att cgt aca gtt gcg gtc tat tca aaa gaa gat tcc ggt tcc tac       147
Asn Ile Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Lys Glu Asp Ser Gly Ser Tyr
     30                  35                  40
cat cgg tac aaa gcg gat gaa gca tac ttg gtc ggt gaa ggg aaa aaa       195
His Arg Tyr Lys Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly Lys Lys
 45                  50                  55                  60
ccg att gat gct tac ctg gat att gaa ggt atc att gat att gcg aaa       243
Pro Ile Asp Ala Tyr Leu Asp Ile Glu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys
                 65                  70                  75
aga aac aaa gtc gat gca att cat ccg gga tac ggt ttc tta tct gaa       291
Arg Asn Lys Val Asp Ala Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu
             80                  85                  90
aat att cat ttt gcg aga cga tgt gaa gaa gaa ggc atc gta ttc ata       339
Asn Ile His Phe Ala Arg Arg Cys Glu Glu Glu Gly Ile Val Phe Ile
         95                 100                 105
ggg cca aaa tcc gag cat ctc gat atg ttt ggt gac aag gta aaa gcg       387
Gly Pro Lys Ser Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys Val Lys Ala
    110                 115                 120
cgt gag cag gca gaa aaa gcg gga atc ccc gtg att ccg gga agc gac       435
Arg Glu Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Pro Val Ile Pro Gly Ser Asp
125                 130                 135                 140
ggt cct gcc gaa acg ctt gaa gcc gtc gaa caa ttt gga caa gct aac       483
Gly Pro Ala Glu Thr Leu Glu Ala Val Glu Gln Phe Gly Gln Ala Asn
                145                 150                 155
ggt tat ccg atc atc att aaa gcc tcg ctt ggc ggc ggc ggc cgc ggt       531
Gly Tyr Pro Ile Ile Ile Lys Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gly
            160                 165                 170
atg cgg att gtc aga tct gaa agt gaa gtt aaa gaa gca tat gag cgt       579
Met Arg Ile Val Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu Ala Tyr Glu Arg
        175                 180                 185
gct aaa tca gag gcg aaa gca gcc ttt ggc aat gat gaa gtt tat gta       627
Ala Lys Ser Glu Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn Asp Glu Val Tyr Val
    190                 195                 200
gaa aaa tta att gag aat ccg aaa cat att gag gtt cag gtc att gga       675
Glu Lys Leu Ile Glu Asn Pro Lys His Ile Glu Val Gln Val Ile Gly
205                 210                 215                 220
gac aag cag ggc aat gtc gtc cat ctt ttt gag agg gat tgc tcc gtt       723
Asp Lys Gln Gly Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val
                225                 230                 235
caa aga cgc cat caa aaa gtc att gaa gtg gcg ccg agt gtc tcg ctg       771
Gln Arg Arg His Gln Lys Val Ile Glu Val Ala Pro Ser Val Ser Leu
            240                 245                 250
tca cct gaa tta agg gac caa att tgt gag gct gca gtt gcg ctt gcc       819
Ser Pro Glu Leu Arg Asp Gln Ile Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala
        255                 260                 265
aaa aat gta aac tat ata aat gcg ggg acg gtc gaa ttc ctt gtt gca       867
Lys Asn Val Asn Tyr Ile Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala
    270                 275                 280
aac aac gag ttc tac ttt att gaa gta aat cct cgc gta caa gtt gaa      915
Asn Asn Glu Phe Tyr Phe Ile Glu Val Asn Pro Arg Val Gln Val Glu
285                 290                 295                 300
cac acg ata aca gaa atg att act ggt gtc gat att gtt caa act cag      963
His Thr Ile Thr Glu Met Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Gln Thr Gln
                305                 310                  315
atc ctt gtt gcc caa ggg cac agc ctt cac agc aaa aaa gta aat att      1011
Ile Leu Val Ala Gln Gly His Ser Leu His Ser Lys Lys Val Asn Ile
            320                 325                 330
cct gag caa aag gac att ttt aca atc ggc tat gcc att cag tca cgg      1059
Pro Glu Gln Lys Asp Ile Phe Thr Ile Gly Tyr Ala Ile Gln Ser Arg
        335                 340                 345
gtt acg act gag gat ccg caa aat gat ttc atg cct gat aca gga aaa      1107
Val Thr Thr Glu Asp Pro Gln Asn Asp Phe Met Pro Asp Thr Gly Lys
    350                 355                 360
atc atg gct tac cgc tca ggc ggc ggt ttt ggt gtc cgt ctt gat acc      1155
Ile Met Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Phe Gly Val Arg Leu Asp Thr
365                 370                 375                 380
gga aac agc ttc cag ggc gcc gtg atc aca cca tac tat gat tca ctt      1203
Gly Asn Ser Phe Gln Gly Ala Val Ile Thr Pro Tyr Tyr Asp Ser Leu
                385                 390                 395
ctc gtt aag ctt tca act tgg gct tta acg ttt gaa cag gca gct gcc      1251
Leu Val Lys Leu Ser Thr Trp Ala Leu Thr Phe Glu Gln Ala Ala Ala
            400                 405                 410
aaa atg gtg cga aac ctt cag gag ttt aga atc aga ggc ata aaa acg      1299
Lys Met Val Arg Asn Leu Gln Glu Phe Arg Ile Arg Gly Ile Lys Thr
        415                 420                 425
aac att ccg ttc ctt gag aac gtt gca aag cat gag aag ttc ctg aca      1347
Asn Ile Pro Phe Leu Glu Asn Val Ala Lys His Glu Lys Phe Leu Thr
    430                 435                 440
ggg caa tat gat aca tct ttc att gat aca acg cct gaa tta ttt aat      1395
Gly Gln Tyr Asp Thr Ser Phe Ile Asp Thr Thr Pro Glu Leu Phe Asn
445                 450                 455                 460
ttc cct aaa caa aaa gac cgc gga acg aaa atg ctc act tac atc ggc      1443
Phe Pro Lys Gln Lys Asp Arg Gly Thr Lys Met Leu Thr Tyr Ile Gly
                465                 470                 475
aat gtg aca gtg aac ggc ttc cct gga atc ggg aaa aaa gaa aaa ccg      1491
Asn Val Thr Val Asn Gly Phe Pro Gly Ile Gly Lys Lys Glu Lys Pro
            480                 485                 490
gcg ttt gac aaa ccg tta ggc gta aag gta gac gtt gat cag cag cct      1539
Ala Phe Asp Lys Pro Leu Gly Val Lys Val Asp Val Asp Gln Gln Pro
        495                 500                 505
gcc aga gga aca aag caa att ctc gat gaa aaa ggt gca gaa ggg ctt      1587
Ala Arg Gly Thr Lys Gln Ile Leu Asp Glu Lys Gly Ala Glu Gly Leu
    510                 515                 520
gca aat tgg gtt aag gag cag aaa tct gtc ctt tta act gat acg aca      1635
Ala Aan Trp Val Lys Glu Gln Lys Ser Val Leu Leu Thr Asp Thr Thr
525                 530                 535                 540
ttc agg gat gcc cac caa tcg tta ttg gca act aga atc aga tcg cat      1683
Phe Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Ile Arg Ser His
                545                 550                 555
gat ttg aaa aaa atc gca aat ccg acg gct gcg tta tgg cct gaa cta      1731
Asp Leu Lys Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ala Ala Leu Trp Pro Glu Leu
            560                 565                 570
ttc agt atg gaa atg tgg gga ggc gcg acc ttc gat gta gcc tac cga      1779
Phe Ser Met Glu Met Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp Val Ala Tyr Arg
        575                 580                 585
ttc ctg aaa gaa gat ccg tgg aaa cgt ttg gaa gat ctt cgc aaa gaa      1827
Phe Leu Lys Glu Asp Pro Trp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Arg Lys Glu
    590                 595                 600
gtg ccg aat acc tta ttc cag atg ttg ctt cgc tca tca aat gcg gtc      1875
Val Pro Asn Thr Leu Phe Gln Met Leu Leu Arg Ser Ser Asn Ala Val
605                 610                 615                 620
ggc tat acg aat tat ccg gac aat gtg att aaa gaa ttt gtg aag caa      1923
Gly Tyr Thr Asn Tyr Pro Asp Asn Val Ile Lys Glu Phe Val Lys Gln
                625                 630                 635
tca gct caa tcc ggt att gat gtg ttt cgt att ttc gac agc tta aac      1971
Ser Ala Gln Ser Gly Ile Asp Val Phe Arg Ile Phe Asp Ser Leu Asn
            640                 645                 650
tgg gta aaa ggg atg acg tta gcc att gat gct gtt agg gat acc ggc      2019
Trp Val Lys Gly Met Thr Leu Ala Ile Asp Ala Val Arg Asp Thr Gly
        655                 660                 665
aaa gtg gca gaa gct gcg att tgt tat acg gga gat atc ctt gac aag      2067
Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Asp Lys
    670                 675                 680
aac cgg acg aag tac gac ctt gca tat tat aca tcg atg gcg aag gag      2115
Asn Arg Thr Lys Tyr Asp Leu Ala Tyr Tyr Thr Ser Met Ala Lys Glu
685                 690                 695                 700
ctt gag gcg gcc gga gcc cat att ctc ggg att aaa gat atg gca ggg      2163
Leu Glu Ala Ala Gly Ala His Ile Leu Gly Ile Lys Asp Met Ala Gly
                705                 710                 715
ctg tta aaa ccg cag gct gca tat gag ctc gtt tct gcg ttg aaa gaa      2211
Leu Leu Lys Pro Gln Ala Ala Tyr Glu Leu Val Ser Ala Leu Lys Glu
            720                 725                 730
acg atc gac att ccg gtt cac ctt cat acg cat gat acg agc gga aac      2259
Thr Ile Asp Ile Pro Val His Leu His Thr His Asp Thr Ser Gly Asn
        735                 740                 745
ggt att tat atg tat gcg aaa gct gtt gaa gcc ggc gtt gat atc ata      2307
Gly Ile Tyr Met Tyr Ala Lys Ala Val Glu Ala Gly Val Asp Ile Ile
    750                 755                 760
gac gtg gcg gtc agc tca atg gcg gga tta acg tca cag cct agc gcg      2355
Asp Val Ala Val Ser Ser Met Ala Gly Leu Thr Ser Gln Pro Ser Ala
765                 770                 775                 780
agc gga ttt tat cat gcg atg gaa ggc aac gac cgc cgt ccg gaa atg      2403
Ser Gly Phe Tyr His Ala Met Glu Gly Asn Asp Arg Arg Pro Glu Met
                785                 790                 795
aat gtc caa ggc gtt gaa ttg ctg tcc caa tat tgg gag tcg gtg cgt      2451
Asn Val Gln Gly Val Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Trp Glu Ser Val Arg
            800                 805                 810
aaa tat tat agt gaa ttt gaa agc gga atg aag tct ccg cat act gaa      2499
Lys Tyr Tyr Ser Glu Phe Glu Ser Gly Met Lys Ser Pro His Thr Glu
        815                 820                 825
att tat gaa cac gaa atg cca ggg ggc caa tac agc aac ctg cag cag      2547
Ile Tyr Glu His Glu Met Pro Gly Gly Gln Tyr Ser Asn Leu Gln Gln
    830                 835                 840
caa gcc aag gga gta ggc ctt ggc gac cgc tgg aac gaa gtc aag gaa      2595
Gln Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly Asp Arg Trp Asn Glu Val Lys Glu
845                 850                 855                 860
atg tac aga cgc gtg aac gat atg ttc ggt gac atc gtc aag gta acg      2643
Met Tyr Arg Arg Val Asn Asp Met Phe Gly Asp Ile Val Lys Val Thr
                865                 870                 875
cct tcc tca aaa gta gtc gga gat atg gca ctc tac atg gtg caa aac      2691
Pro Ser Ser Lys Val Val Gly Asp Met Ala Leu Tyr Met Val Gln Asn
            880                 885                 890
aat ctg act gaa aaa gac gtt tac gaa aaa ggt gaa tct tta gat ttc      2739
Asn Leu Thr Glu Lys Asp Val Tyr Glu Lys Gly Glu Ser Leu Asp Phe
        895                 900                 905
cct gat tct gtc gtg gag ctt ttt aaa gga aat atc ggc cag cct cat      2787
Pro Asp Ser Val Val Glu Leu Phe Lys Gly Asn Ile Gly Gln Pro His
    910                 915                 920
ggc gga ttc cca gaa aaa ctg caa aag ctg atc tta aaa ggg cag gag      2835
Gly Gly Phe Pro Glu Lys Leu Gln Lys Leu Ile Leu Lys Gly Gln Glu
925                 930                 935                 940
ccg att aca gtc aga ccg ggc gaa ctg ctt gag ccg gtg tca ttt gaa      2883
Pro Ile Thr Val Arg Pro Gly Glu Leu Leu Glu Pro Val Ser Phe Glu
                945                 950                 955
gcg atc aaa cag gaa ttt aaa gag cag cat aac ttg gaa att tca gat      2931
Ala Ile Lys Gln Glu Phe Lys Glu Gln His Asn Leu Glu Ile Ser Asp
            960                 965                 970
cag gat gct gtg gca tat gcc ctt tat cct aaa gtc ttc act gat tat      2979
Gln Asp Ala Val Ala Tyr Ala Leu Tyr Pro Lys Val Phe Thr Asp Tyr
        975                 980                 985
gtg aaa acg aca gaa agc tat gga gac atc tcg gta tta gat aca ccg      3027
Val Lys Thr Thr Glu Ser Tyr Gly Asp Ila Ser Val Leu Asp Thr Pro
    990                 995                1000
aca ttc ttc tac ggt atg aca tta ggt gaa gag ata gaa gtt gaa att      3075
Thr Phe Phe Tyr Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile
1005               1010                1015                1020
gag cgc ggc aaa acg ctg atc gtt aag ctg att tca atc ggt gag cct      3123
Glu Arg Gly Lys Thr Leu Ile Val Lys Leu Ile Ser Ile Gly Glu Pro
               1025                1030                1035
cag cct gat gcc acc cgc gtc gtt tat ttc gaa ctc aac ggg cag ccg      3171
Gln Pro Asp Ala Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Gln Pro
           1040                1045                1050
cgt gaa gta gtc att aaa gat gaa agc att aag tct tcc gtt cag gaa      3219
Arg Glu Val Val Ile Lys Asp Glu Ser Ile Lys Ser Ser Val Gln Glu
       1055                1060                1065
agg ctg aaa gca gac cgg aca aat cca agc cac atc gca gct tcc atg      3267
Arg Leu Lys Ala Asp Arg Thr Asn Pro Ser His Ile Ala Ala Ser Met
   1070                1075                1080
cct gga aca gtt att aag gta ttg gct gaa gca ggc aca aaa gtc aat      3315
Pro Gly Thr Val Ile Lys Val Leu Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn
1085               1090                1095                1100
aaa ggt gat cat ttg atg att aat gaa gcg atg aaa atg gaa aca acg      3363
Lys Gly Asp His Leu Met Ile Asn Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Thr
               1105                1110                1115
gtt cag gcg cct ttc tca gga aca atc aag cag gtt cat gtg aaa aat      3411
Val Gln Ala Pro Phe Ser Gly Thr Ile Lys Gln Val His Val Lys Asn
           1120                1125                1130
ggt gag ccg atc caa acg gga gat ctg ctc ctt gaa att gaa aaa gca      3459
Gly Glu Pro Ile Gln Thr Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala
       1135                1140                1145
taa                                                                  3462
<210>4
<211>1148
<212>PRT
<2l3>枯草芽胞杆菌
<400>4
Leu Ser Gln Gln Ser Ile Gln Lys Val Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu
  1               5                  10                  15
Ile Ala Ile Arg Ile Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu Asn Ile Arg Thr
             20                  25                  30
Val Ala Val Tyr Ser Lys Glu Asp Ser Gly Ser Tyr His Arg Tyr Lys
         35                  40                  45
Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly Lys Lys Pro Ile Asp Ala
     50                  55                  60
Tyr Leu Asp Ile Glu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Arg Asn Lys Val
 65                  70                  75                  80
Asp Ala Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ile His Phe
                 85                  90                  95
Ala Arg Arg Cys Glu Glu Glu Gly Ile Val Phe Ile Gly Pro Lys Ser
            100                 105                 110
Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys Val Lys Ala Arg Glu Gln Ala
        115                 120                 125
Glu Lys Ala Gly Ile Pro Val Ile Pro Gly Ser Asp Gly Pro Ala Glu
    130                 135                 140
Thr Leu Glu Ala Val Glu Gln Phe Gly Gln Ala Asn Gly Tyr Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ile Ile Lys Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Ile Val
                165                 170                 175
Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu Ala Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Glu
            180                 185                 190
Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn Asp Glu Val Tyr Val Glu Lys Leu Ile
        195                 200                 205
Glu Asn Pro Lys His Ile Glu Val Gln Val Ile Gly Asp Lys Gln Gly
    210                 215                 220
Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His
225                 230                 235                 240
Gln Lys Val Ile Glu Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Ser Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Arg Asp Gln Ile Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala Lys Asn Val Asn
            260                 265                 270
Tyr Ile Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala Asn Asn Glu Phe
        275                 280                 285
Tyr Phe Ile Glu Val Asn Pro Arg Val Gln Val Glu His Thr Ile Thr
    290                 295                 300
Glu Met Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Gln Thr Gln Ile Leu Val Ala
305                 310                 315                 320
Gln Gly His Ser Leu His Ser Lys Lys Val Asn Ile Pro Glu Gln Lys
                325                 330                 335
Asp Ile Phe Thr Ile Gly Tyr Ala Ile Gln Ser Arg Val Thr Thr Glu
            340                 345                 350
Asp Pro Gln Asn Asp Phe Met Pro Asp Thr Gly Lys Ile Met Ala Tyr
        355                 360                 365
Arg Ser Gly Gly Gly Phe Gly Val Arg Leu Asp Thr Gly Asn Ser Phe
    370                 375                 380
Gln Gly Ala Val Ile Thr Pro Tyr Tyr Asp Ser Leu Leu Val Lys Leu
385                 390                 395                 400
Ser Thr Trp Ala Leu Thr Phe Glu Gln Ala Ala Ala Lys Met Val Arg
                405                 410                 415
Asn Leu Gln Glu Phe Arg Ile Arg Gly Ile Lys Thr Asn Ile Pro Phe
            420                 425                 430
Leu Glu Asn Val Ala Lys His Glu Lys Phe Leu Thr Gly Gln Tyr Asp
        435                 440                 445
Thr Ser Phe Ile Asp Thr Thr Pro Glu Leu Phe Asn Phe Pro Lys Gln
    450                 455                 460
Lys Asp Arg Gly Thr Lys Met Leu Thr Tyr Ile Gly Asn Val Thr Val
465                 470                 475                 480
Asn Gly Phe Pro Gly Ile Gly Lys Lys Glu Lys Pro Ala Phe Asp Lys
                485                 490                 495
Pro Leu Gly Val Lys Val Asp Val Asp Gln Gln Pro Ala Arg Gly Thr
            500                 505                 510
Lys Gln Ile Leu Asp Glu Lys Gly Ala Glu Gly Leu Ala Asn Trp Val
        515                 520                 525
Lys Glu Gln Lys Ser Val Leu Leu Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
    530                 535                 540
His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Ile Arg Ser His Asp Leu Lys Lys
545                 550                 555                 560
Ile Ala Asn Pro Thr Ala Ala Leu Trp Pro Glu Leu Phe Ser Met Glu
                565                 570                 575
Met Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp Val Ala Tyr Arg Phe Leu Lys Glu
            580                 585                 590
Asp Pro Trp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Arg Lys Glu Val Pro Asn Thr
        595                 600                 605
Leu Phe Gln Met Leu Leu Arg Ser Ser Asn Ala Val Gly Tyr Thr Asn
    610                 615                 620
Tyr Pro Asp Asn Val Ile Lys Glu Phe Val Lys Gln Ser Ala Gln Ser
625                 630                 635                 640
Gly Ile Asp Val Phe Arg Ile Phe Asp Ser Leu Asn Trp Val Lys Gly
                645                 650                 655
Met Thr Leu Ala Ile Asp Ala Val Arg Asp Thr Gly Lys Val Ala Glu
            660                 665                 670
Ala Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Asp Lys Asn Arg Thr Lys
        675                 680                 685
Tyr Asp Leu Ala Tyr Tyr Thr Ser Met Ala Lys Glu Leu Glu Ala Ala
    690                 695                 700
Gly Ala His Ile Leu Gly Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Lys Pro
705                 710                 715                 720
Gln Ala Ala Tyr Glu Leu Val Ser Ala Leu Lys Glu Thr Ile Asp Ile
                725                 730                 735
Pro Val His Leu His Thr His Asp Thr Ser Gly Asn Gly Ile Tyr Met
            740                 745                 750
Tyr Ala Lys Ala Val Glu Ala Gly Val Asp Ile Ile Asp Val Ala Val
        755                 760                 765
Ser Ser Met Ala Gly Leu Thr Ser Gln Pro Ser Ala Ser Gly Phe Tyr
    770                 775                 780
His Ala Met Glu Gly Asn Asp Arg Arg Pro Glu Met Asn Val Gln Gly
785                 790                 795                 800
Val Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Trp Glu Ser Val Arg Lys Tyr Tyr Ser
                805                 810                 815
Glu Phe Glu Ser Gly Met Lys Ser Pro His Thr Glu Ile Tyr Glu His
            820                 825                 830
Glu Met Pro Gly Gly Gln Tyr Ser Asn Leu Gln Gln Gln Ala Lys Gly
        835                 840                 845
Val Gly Leu Gly Asp Arg Trp Asn Glu Val Lys Glu Met Tyr Arg Arg
    850                 855                 860
Val Asn Asp Met Phe Gly Asp Ile Val Lys Val Thr Pro Ser Ser Lys
865                 870                 875                 880
Val Val Gly Asp Met Ala Leu Tyr Met Val Gln Asn Asn Leu Thr Glu
                885                 890                 895
Lys Asp Val Tyr Glu Lys Gly Glu Ser Leu Asp Phe Pro Asp Ser Val
            900                 905                 910
Val Glu Leu Phe Lys Gly Asn Ile Gly Gln Pro His Gly Gly Phe Pro
        915                 920                 925
Glu Lys Leu Gln Lys Leu Ile Leu Lys Gly Gln Glu Pro Ile Thr Val
    930                 935                 940
Arg Pro Gly Glu Leu Leu Glu Pro Val Ser Phe Glu Ala Ile Lys Gln
945                 950                 955                 960
Glu Phe Lys Glu Gln His Asn Leu Glu Ile Ser Asp Gln Asp Ala Val
                965                 970                 975
Ala Tyr Ala Leu Tyr Pro Lys Val Phe Thr Asp Tyr Val Lys Thr Thr
            980                 985                 990
Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Val Leu Asp Thr Pro Thr Phe Phe Tyr
        995                1000                 1005
Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile Glu Arg Gly Lys
   1010                1015                1020
Thr Leu Ile Val Lys Leu Ile Ser Ile Gly Glu Pro Gln Pro Asp Ala
1025               1030                1035                1040
Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Gln Pro Arg Glu Val Val
               1045                1050                1055
Ile Lys Asp Glu Ser Ile Lys Ser Ser Val Gln Glu Arg Leu Lys Ala
           1060                1065                1070
Asp Arg Thr Asn Pro Ser His Ile Ala Ala Ser Met Pro Gly Thr Val
       1075                1080                1085
Ile Lys Val Leu Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn Lys Gly Asp His
   1090                1095                1100
Leu Met Ile Asn Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Thr Val Gln Ala Pro
1105               1110                1115                1120
Phe Ser Gly Thr Ile Lys Gln Val His Val Lys Asn Gly Glu Pro Ile
               1125                1130                1135
Gln Thr Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala
           1140                1145

Claims (4)

1.生产L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养经编码丙酮酸羧化酶的基因转化的、并且具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属(Escherichia)的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中编码丙酮酸羧化酶的基因源自于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌。
3.如权利要求1所述的方法，其中L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
RU2207371C2 (ru) 2000-09-26 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот семейства l-глутаминовой кислоты, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
JP2006230202A (ja) * 2003-06-23 2006-09-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
BRPI0613662A2 (pt) * 2005-07-18 2017-05-09 Basf Ag microorganismo recombinante, e, método para produzir metionina
WO2007086608A1 (en) * 2006-01-27 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
WO2007086618A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN1986777B (zh) * 2006-07-11 2010-09-08 湖北大学 活体催化工程菌及利用α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
RU2395579C2 (ru) 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2010263790A (ja) 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
CN101939412B (zh) * 2007-09-04 2016-01-20 味之素株式会社 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
EP2248906A4 (en) 2008-01-23 2012-07-11 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
EP2336347B1 (en) 2008-09-08 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN105008532B (zh) 2013-05-13 2017-07-21 味之素株式会社 L‑氨基酸的制造方法
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
CN106459857B (zh) 2013-10-02 2019-04-19 味之素株式会社 氨控制装置及氨控制方法
WO2015060314A1 (ja) 2013-10-21 2015-04-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
EP3061828B1 (en) 2013-10-23 2024-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
JP2015156844A (ja) * 2014-02-25 2015-09-03 花王株式会社 枯草菌変異株及びそれを用いたジピコリン酸の製造方法
CN105505969A (zh) * 2014-09-26 2016-04-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用
JP6623690B2 (ja) 2015-10-30 2019-12-25 味の素株式会社 グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法
CN106148261B (zh) * 2016-07-01 2019-09-03 江南大学 一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR101947959B1 (ko) * 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
RU2714763C1 (ru) * 2018-11-08 2020-02-19 Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор для таргетной генной терапии, способ его получения (варианты), штамм для его производства, способ его получения
KR20230092008A (ko) 2020-10-28 2023-06-23 아지노모토 가부시키가이샤 L-아미노산의 제조법
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU875663A1 (ru) * 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
DE19681532T1 (de) * 1995-08-23 1998-12-03 Ajinomoto Kk Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation
AU741038B2 (en) * 1997-10-04 2001-11-22 Degussa A.G. Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamatefamily and agents which can be used in said method
AR015762A1 (es) * 1998-04-13 2001-05-16 Univ Georgia Una celula manipulada por ingenieria metabolica; un metodo para producir dicha celula; un metodo para producir una sustancia bioquimica derivada deoxalacetato y un fragmento de acido nucleico aislado de p. fluorescens

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