CN1198919C

CN1198919C - 经过发酵生产l－丝氨酸的方法

Info

Publication number: CN1198919C
Application number: CNB991004418A
Authority: CN
Inventors: 菅美喜子; 杉本雅一; 大住刚; 中松亘; 日比野涉; 伊藤美佳
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2019-01-12
Also published as: DE69928845D1; US6037154A; EP0931833A3; EP0931833A2; DE69928845T2; EP0931833B1; CA2256758A1; JPH11253187A; US20030175912A1; JP4066543B2; CN1227264A; CA2256758C

Abstract

经过在培养基中培养其中至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性被增强的具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，优选进一步具有导入其中的编码其中L-丝氨酸反馈抑制被脱敏的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的基因的棒杆菌，使L-丝氨酸在此培养基中积累以及从该培养基中收集L-丝氨酸来生产L-丝氨酸。

Description

经过发酵生产L-丝氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生产L-丝氨酸的方法和构建棒杆菌的方法，其中，L-丝氨酸用于生产在药物，化学药品和化妆品领域中使用的氨基酸混合物。

背景技术

作为通过发酵制备L-丝氨酸的常规方法，已报导这样一种方法，即其中能够将甘氨酸和糖转化成L-丝氨酸的细菌菌株在含有30g/L甘氨酸的培养基中用于生产至多14g/L的L-丝氨酸。通过该方法将甘氨酸转化成L-丝氨酸的产量达到46％(Kubota K.农业生物化学，49，7-12(1985))。用能够将甘氨酸和甲醇转换成L-丝氨酸的细菌菌株，可从100g/L的甘氨酸中生产出53g/L的L-丝氨酸(T.Yoshida等，发酵和生物工程杂志，79卷，第2期，181-183，1995)。在使用诺卡氏菌属细菌的方法中，已知可通过培养那些对氧肟酸盐、重氮丝氨酸等具有抗性的菌株而提高该细菌L-丝氨酸的生产力(日本专利公开No.57-1235)。然而，这些方法包括使用作为L-丝氨酸前体的甘氨酸并且包括复杂的操作且从费用的角度也是不利的。

作为可直接从糖发酵L-丝氨酸并且无需在培养基中添加L-丝氨酸前体的菌株，已知有谷氨酸棒杆菌，该菌对D-丝氨酸、α-甲基丝氨酸、O-甲基丝氨酸、异丝氨酸(isoserine)、丝氨酸氧肟酸盐和3-氯丙氨酸具有抗性但是L-丝氨酸的积累低达0.8g/L(Nogei Kagakukaishi，48卷，第3期，p201-208，1974)。因此，有必要进一步改进菌株以用于工业规模L-丝氨酸的直接发酵。

另一方面，关于棒杆菌，已经公开了能够在细胞中自主复制并且具有药物抗性标记基因的质粒(参考美国专利4,514,502)和将基因导入该细胞中的方法(公开的日本专利申请No.2-207791)和培养产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸细菌的可能性(美国专利4,452,890和4,442,208)。同样，有关产生L-赖氨酸细菌的培养，已知一种包括掺入参与L-赖氨酸生物合成的基因至质粒载体中并在细胞中扩增该质粒的技术(公开的日本专利申请No.56-160997)。

在大肠杆菌的情况中，参与L-丝氨酸生物合成的酶包括相对于野生型中L-丝氨酸生产而言对反馈抑制敏感的酶并且已知有这样一种实例，即其中导入突变基因从而可对反馈抑制脱敏而导致L-丝氨酸的增加(日本专利No.2584409)。作为这种基因，具体地已知有3-PGDH基因(下文，编码3-PGDH蛋白的基因也将称为“SerA”)。

此外，在棒杆菌的情况中，已知有这样的实例，即其中3-PPGDH基因的扩增影响了L-色氨酸的生产力(公开的日本专利申请No.3-7591)。

本发明的目的是提供将糖转变为L-丝氨酸的微生物并且提供了利用微生物将糖转变为L-丝氨酸的能力在培养基中积累L-丝氨酸的方法，即在工业规模的实践中优越的生产L-丝氨酸的方法。

为实现上述目的而进行了深入研究，作为其结果，现在本发明人已发现从具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，优选从L-丝氨酸分解活性缺陷型细菌或其具有对L-丝氨酸类似物抗性的突变体筛选至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性增强的菌株并使用所筛选的菌株进行L-丝氨酸发酵将大幅度增强L-丝氨酸的积累。基于这一发现完成了本发明。

发明内容

即，本发明涉及具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，其中至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性增强。

另外，本发明涉及上文所述的磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性均增强的棒杆菌；上文所述的由于L-丝氨酸分解活性有缺陷而具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌；上文所述的由于其具有对L-丝氨酸类似物的抗性而具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌；上文所述的经过在其细胞中增加上述棒杆菌编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因和编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因的拷贝数而增强了磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性的棒杆菌；以及上文所述的具有导入其中的编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶基因且其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的棒杆菌。

另外，本发明涉及生产L-丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上文所述的棒杆菌以便在培养基中积累L-丝氨酸并从培养基中收集L-丝氨酸。

附图说明

图1显示L-丝氨酸对各种菌株3-PGDH的反馈抑制方式。水平轴表示在该酶溶液中L-丝氨酸的浓度。纵轴表示L-丝氨酸存在时3-PGDH活性对L-丝氨酸不存在时的百分比。符号◆显示L-丝氨酸对ATCC14067菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号■显示L-丝氨酸对AJ13377菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号◆显示L-丝氨酸对AJ13324菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号×显示L-丝氨酸对AJ13325菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号*显示L-丝氨酸对AJ13327菌株3-PGDH的反馈抑制方式。

图2显示质粒pVK7和pVK6的构建。

图3说明了携带serB的质粒pSB的构建。

图4说明了携带serC的质粒pSC的构建。

图5说明了携带serB和serC的质粒pBC8和pBC14的构建。

具体实施方式

本发明中提及的棒杆菌为伯杰氏细菌鉴定手册，第8版，第599页(1974)中定义的一组微生物，它们是不具有酸抗性并且无孢子形成能力的需氧格兰氏阳性杆菌。这些棒杆菌包括棒杆菌属的细菌、属于迄今分类进短杆菌属但目前统一到棒杆菌属中的短杆菌属细菌以及与棒杆菌属和微杆菌属细菌密切相关的短杆菌属的细菌。

本发明的棒杆菌是具有L-丝氨酸生产力的且其中磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的活性被增强的棒杆菌。例如，经过在具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌细胞中增加编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因(下文称为“serB”)或编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因(下文称为“serC”)的拷贝数可获得该细菌。

另外，本发明的棒杆菌可经过赋予增强了磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶活性的棒杆菌以L-丝氨酸生产力来获得。

作为具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，可提到的有，例如，L-丝氨酸分解活性缺陷型棒杆菌，对L-丝氨酸类似物有抗性的棒杆菌，以及L-丝氨酸分解活性缺陷型且对L-丝氨酸类似物有抗性的棒杆菌。

在本发明中，L-丝氨酸类似物包括重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸。

对L-丝氨酸类似物有抗性且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，更优选其中的L-丝氨酸分解活性缺陷型棒杆菌可使用野生型或具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌作为亲本菌株进行人工突变或诱导。

对L-丝氨酸类似物有抗性，L-丝氨酸分解活性缺陷型且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌可按，例如，如下方式收集。以常规方法(与N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍接触，等)对黄色短杆菌ATCC14067进行突变处理以获得L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株，然后从作为亲本菌株的突变株收集对诸如重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的L-丝氢酸类似物有抗性的细菌。另外，在获得L-丝氨酸类似物抗性细菌后，可获得L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株。在以上述方法获得的突变株中，存在以高浓度积累L-丝氨酸的菌株。

经过将下文所述突变的SerA导入亲本菌株或L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株中可获得L-丝氨酸类似物抗性细菌。

术语“L-丝氨酸类似物抗性”是指细菌在含L-丝氨酸类似物的培养基中比野生型生长更快的特性。

更具体地说，例如，术语“重氮丝氨酸抗性”指细菌在含有重氮丝氨酸的培养基中较野生型细菌生长更快的特性。例如，在含有0.25g/L重氮丝氨酸的固体培养基上30℃在4-5天内形成菌落的菌株称为具有重氮丝氨酸抗性。

类似地，术语“β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性”指细菌在含有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的培养基中较野生型细菌生长更快的特性。例如，在含有0.25g/Lβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的固体培养基上30℃在4-5天内形成菌落的菌株称为具有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性。

下文将描述磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。

经过将serB或serC分别以可表达的形式导入棒杆菌可实现磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。经过借助于分开的启动子增强编码各自的酶的基因的表达或者增强在单个启动子控制下的两个基因的表达可做到这一点。不论这些基因是在质粒上还是在染色体上，可经过增强诸如基因启动子的表达控制序列，或者提高翻译效率来增强表达。另外，可经过扩增染色体上的基因数来增强酶活性。而且可使用以使得所编码的修饰酶比活增强的方式修饰的编码磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的修饰的基因实现这些酶活性的增强。

为了将SerB或SerC导入棒杆菌，可将含有SerB或SerC的DNA片断与在棒杆菌中具有功能的载体连接以产生重组DNA，随后将它导入具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌宿主以转化它。由于在转化菌株的细胞中SerB或SerC的拷贝数增加，结果扩增了其磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。将含有SerB及SerC两者的重组DNA或者含有SerB的重组DNA以及含有SerC的重组DNA两者导入棒杆菌将同时扩增磷酸丝氨酸磷酸酶活性和磷酸丝氨酸转氨酶活性。

SerB和SerC的碱基序列是已知的(SerB：GenBank；XO3046M30784，SerC：GenBank；D90728)。可合成以其碱基序列为基础的引物并使用大肠杆菌，黄色短杆菌或其它微生物的染色体DNA作模板经PCR方法收集这些微生物的SerB基因或SerC基因。至于该引物，可提到的是具有序列鉴定号15至18所示的碱基序列的引物。

优选的是将SerB基因或SerC基因与能够在大肠杆菌和/或棒杆菌细胞中自主复制的载体DNA连接以制备重组DNA，并且将此重组DNA导入前述的大肠杆菌细胞中。这种前提使下面的操作变得容易。能够在大肠杆菌细胞中自主复制的载体优选为能够在包括，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，pHSG398和RSF1010的宿主细胞中自主复制的质粒载体。

当SerB基因和SerC基因位于分开的载体上以导入棒杆菌时，优选使用两个具有互不相同的各自的标记基因的载体。

可利用转座子(国际公开号WO 02/02627，国际公开号WO 93/18151，公开的欧洲专利申请No.0445385，公开的日本专利申请No.6-46867，Vertes，A.A.分子微生物学.，11，739-746(1994)，Bonamy，C.，等，分子微生物学，14，571-581(1994)Vertes，A.A.等，分子普通遗传学.，245，397-405(1994)Jagar，W.等.，FEMS微生物学通讯。126，1-6(1995)，公开的日本专利申请No.7-107976，公开的日本专利申请No.7-327680，等)、噬菌体载体、染色体重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.细菌学杂志.，162，1196(1985))等制备重组DNA。

当将具有使质粒可在棒杆菌中自主复制的能力的DNA片段插入到这些载体中时，它们可用作在大肠杆菌和棒杆菌中均能自主复制的所谓的穿梭载体。

这样的穿梭载体包括以下载体。带有各载体的微生物和国际保藏机构的保藏号显示于括弧中。

pHC4：大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)

pAJ655：大肠杆菌AJ1 1882(FERM BP-136)

谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC 39135)

pAJ1844：大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)

谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC 39136)

pAJ611：大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)

pAJ3148：谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC 39137)

pAJ440：枯草芽孢杆菌AJ11901(FERM BP-140)

这些载体可按如下方法从保藏的微生物中得到。于对数生长期收集的细胞用溶菌酶和SDS加以裂解，然后于30,000×g离心对裂解液进行分离以获得上清并向其中加入聚乙二醇，然后通过氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心方法对其进行分级分离和纯化。

可根据，例如D.M.Morrison方法( 酶学方法， 68，326(1979))或其中的受体细胞以氯化钙处理以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志， 53，159(1970))导入质粒而转化大肠杆菌。

质粒向棒杆菌中的导入以引起转化可通过电脉冲方法(Sugimoto等.，公开的日本专利申请No.2-207791)进行。

用于导入上述DNA的棒杆菌的实例包括，例如，下面的野生型菌株：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870；

醋谷棒杆菌ATCC 15806；

美棒杆菌ATCC 15991；

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；

(扩展短杆菌)ATCC 14020；

(乳发酵短杆菌)ATCC 13869；

(百合棒状杆菌)ATCC 15990；

(黄色短杆菌)ATCC 14067；

Corynebacterium melassecola ATCC 17965；

解糖短杆菌ATCC 14066；

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；

玫瑰色短杆菌ATCC 13825

生硫短杆菌ATCC 19240；

嗜氨微杆菌ATCC 15354；

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)。

经过将多拷贝的serB基因或serC基因导入上述宿主菌株的染色体DNA也可实现磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。为了将多拷贝的serB基因或serC基因导入棒杆菌的染色体DNA，使用在染色体DNA中存在多个拷贝的序列作为靶序列进行同源重组。至于在染色体DNA中存在多个拷贝的序列，可使用在可转座元件末端存在的重复DNA颠倒重复序列。另外，正如在公开的日本专利申请号2-109985中所公开的，可将SerB基因或SerC基因掺入转座子，并使其被转移以便将多拷贝的SerB基因或SerC基因导入染色体DNA。以任何一种方法可增加转化菌株细胞内的SerB基因或SerC基因的拷贝数，结果，增强了磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。

除了上述基因扩增外，也可经过构建诸如带有多个有效启动子的SerB基因或SerC基因启动子的表达调控序列来实现增强磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。例如，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子和λ噬菌体的P_R启动子及P_L启动子称为有效启动子。经过构建在带有这些启动子的SerB基因或SerC基因中固有的启动子可增强SerB基因或SerC基因的表达，从而增强磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。

在优选的实施方案中，本发明的棒杆菌是经过将其中L-丝氨酸反馈抑制被脱敏的编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的基因(下文也称为“3-PGDH”)导入具有L-丝氨酸生产力且增强了磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶活性的棒杆菌而获得的菌株。

3-PGDH催化这样的反应，即在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为辅酶存在时将3-磷酸甘油酸氧化成3-磷酸羟基丙酮酸。

来自野生型棒杆菌的3-PGDH对L-丝氨酸的反馈抑制敏感并且其活性几乎完全受10mML-丝氨酸存在的抑制。术语“其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的3-PGDH”意为即使在10mML-丝氨酸存在下3-PGDH具有无L-丝氨酸存在时活性的20％或更多，优选40％或更多，更为优选地是90％或更多。来自下面实施例中描述的黄色短杆菌AJ13327的3-PGDH在80mM L-丝氨酸存在下基本上保留100％的活性且因此为最优选的3-PGDHs之一。

编码其中L-丝氨酸反馈抑制被脱敏的D-3-PGDH的基因可从L-丝氨酸类似物抗性棒杆菌，例如，在下述实施例中获得的黄色短杆菌重氮丝氨酸抗性菌株AJ13327，的染色体DNA制备。

来自野生型棒杆菌的3-PGDH(下面，编码该酶的DNA也称为“野生型serA”)具有序列表中的SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列。其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的3-PGDH的具体实例(下面，编码该酶的DNA也称为“突变型serA”)包括这样的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，其特征在于该D-3-磷酸甘油酸脱氢酶具有序列表中的SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列或与上述相同但具有一个或更多个氨基酸替代、添加或缺失且相应于SEQ ID NO：12中氨基酸序列的第325个谷氨酸残基的氨基酸残基被其它氨基酸所替代的氨基酸序列。最为优选的是该其它氨基酸为赖氨酸残基。

例如，可根据Saito和Miura的方法(H.Saito和K.Miura，生化.生物物理学报，72，619(1963))等制备染色体DNA并且然后通过聚合酶链式反应方法(PCR：聚合酶链式反应；参考White，T.J.等.，遗传学进展.5，185(1989))扩增serA基因从棒杆菌中分离含有serA基因的DNA片段。例如，为了扩增含有序列表中的SEQ ID NO：11ORF(172至1705)的DNA片段，从SEQ IN NO：11中第一个碱基至紧邻ATG前面的碱基之间的区域选择任意20至30个碱基以获得一条引物。此外，从紧邻终止密码子后面的碱基至SEQ IN NO：11中最后一个碱基之间的区域选择任意20至30个碱基以获得另一条引物。

当从3-PGDH的野生型菌株分离serA时，获得野生型serA并且从带有其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的3-PGDH的突变体中(3-PGDH突变体)分离serA得到突变的serA。具体地说，野生型serA具有序列表中的SEQ ID NO：11中列出的序列，并且突变体serA具有序列表中的SEQ ID NO：13中列出的序列。

经过与导入serB或serC相同的方式用含有突变型serA的重组载体转化棒杆菌可将突变型serA导入棒杆菌。突变型serA优选以多拷贝导入。突变型serA与serB或serC可位于单个载体上或分别位于分开的两个或三个载体上。

对于用本发明的菌株进行L-丝氨酸的生产，可使用下面的方法。作为待用的培养基，可使用含有碳源、氮源、无机盐和如果必要的话，任选的诸如氨基酸、维生素等有机痕量营养成分的常规液体培养基。

作为碳源，可使用如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖；糖化的淀粉溶液、甜土豆糖浆、糖甜菜糖浆和包括上述糖的最高糖浆；有机酸如乙酸；醇如乙醇；甘油等。

作为氮源，可使用氨气、水溶性氨、铵盐、尿素、硝酸盐等。此外，可使用有机氮源用于补充使用，例如，油性蛋糕、大豆水解液、分解的酪蛋白、其它氨基酸、玉米浆、酵母或酵母提取物、肽如蛋白胨等。

作为无机离子，可任选加入磷酸离子、镁离子、钙离子、铁离子和锰离子等。

当使用需要营养物如氨基酸用于其生长的本发明微生物时，应该补充所需的营养物。

通常在pH5到8并且25到40℃的温度范围的有氧条件下孵育微生物。根据无机或有机酸、碱性物质、尿素、碳酸钙、氨气等的存在与否将培养基的pH控制在上述预定的范围内。

例如，可通过分离和去除细胞、进行离子交换树脂处理、浓缩冷却结晶、膜分离和其它已知的方法以任何适当的组合从发酵液中收集L-丝氨酸。为了去除杂质，可以用活性碳吸附和重结晶进行纯化。

本发明提供了一种从糖合成L-丝氨酸的棒杆菌。该棒杆菌可用于工业上优越的生产L-丝氨酸的方法中。

(实施例1)产L-丝氨酸的黄色短杆菌AJ 13324和AJ13327的构建

从L-丝氨酸分解活性缺陷的获自野生型黄色短杆菌ATCC 14067的黄色短杆菌AJ13377构建黄色短杆菌AJ13324和AJ13327。

为了获得突变体，将在肉汤培养基(在1升水中含有1g鱼肉提取物，1g聚胨，0.5g酵母提取物，和0.5g氯化钠，调至pH7.0的培养基)中扩增24小时的细胞悬浮于100mM的磷酸缓冲液(pH7.0)(含有10⁹至10¹⁰个细胞/ml)中。将NG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)加入到悬液中至200μg/ml的浓度并且于30℃放置30分钟。将这样处理的细胞用上述缓冲液充分洗涤。

为了从NG处理的细胞中筛选具有无L-丝氨酸分解活性的菌株，将洗涤后以NG处理的黄色短杆菌ATCC14067细胞涂布在肉汤琼脂培养基上并且于30℃培养24小时以使菌落形成。然后，将肉汤琼脂培养基上的菌落用作阴性菌落并且于基本培养基和用于筛选的基本培养基上进行复制子形成。然后，筛选生长于基本培养基上但不生长于用于筛选的基本培养基上的菌株。该基本培养基为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基，包括20g葡萄糖，1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g 7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(II)，0.01g 4-至5水硫酸锰，50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200ug烟酰胺和2.0g琼脂。用于筛选的基本培养基为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基，包括1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g 7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(II)，0.01g 4-至5水硫酸锰，50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200μg烟酰胺，0.5gL-丝氨酸和2.0g琼脂。通过此方法获得的突变体中发现许多具有无L-丝氨酸分解活性的菌株并且获得黄色短杆菌AJ13377作为一个这样的菌株。

为了用黄色短杆菌AJ13377作为亲本菌株从NG处理的菌株中筛选重氮丝氨酸抗性的菌株，将洗涤后的NG处理的黄色短杆菌AJ13377细胞接种于用于筛选的基本培养基上。该用于筛选的基本培养基上为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基，包括20g葡萄糖，1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g 7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(II)，0.01g 4-至5水硫酸锰，50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200μg烟酰胺和250mg重氮丝氨酸。将NG处理的突变体于30℃在上述培养基中培养5至10天。将这样获得的细胞培养物涂布在肉汤琼脂培养基上并且于30℃培养24小时用于菌落形成。从形成菌落的菌株中获得重氮丝氨酸抗性菌株。这样获得的突变体包括许多以高产量大量积累L-丝氨酸的菌株。从这些菌株中获得2个菌株，即，黄色短杆菌AJ13324和AJ13327。已证实这些菌株能够在0.25g/L重氮丝氨酸存在下生长。

(实施例2)新的产L-丝氨酸黄色短杆菌AJ 13325的构建

从L-丝氨酸分解活性缺陷的获自野生型黄色短杆菌ATCC 14067的黄色短杆菌AJ13377构建黄色短杆菌AJ13325。

为了从用黄色短杆菌AJ13377作为亲本菌株的NG处理的菌株中筛选对β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性的菌株，将黄色短杆菌AJ13377细胞在接种于用于筛选的基本培养基上之前以NG处理并且洗涤。该用于筛选的基本培养基上为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基，包括20g葡萄糖，1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g 7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(II)，0.01g 4-至5水硫酸锰，50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200μg烟酰胺250mgβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸。将NG处理的突变体于30℃在上述培养基中培养5至10天。将这样获得的细胞培养物涂布在肉汤琼脂培养基上并且于30℃培养24小时用于菌落形成。从形成菌落的这些菌株中获得对β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性的菌株。这样获得的突变体包括许多以高产量大量积累L-丝氨酸的菌株。作为一个这样的菌株获得了黄色短杆菌AJ13325。已证实这些菌株能够在0.25g/Lβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸存在下生长。

(实施例3)通过产L-丝氨酸的黄色短杆菌AJ13324，AJ13325和AJ13327生产L-丝氨酸

将黄色短杆菌AJ13324，AJ13325和AJ13327分别于30℃在肉汤培养基上培养24小时并且将1菌环量的每种微生物接种于500ml的摇瓶中，其中该摇瓶含有20ml具有表1所示组分的发酵培养基。作为对照，按上述相同的方式接种亲本菌株黄色短杆菌ATCC 14067和AJ13377。以氢氧化钾调节培养基至pH7.0并且于115℃高压灭菌15分钟。灭菌和冷却后，加入5g/L量的于180℃干热灭菌的碳酸钙。

表1

成份含量/升

葡萄糖 110.0g

磷酸二氢钾 0.4g

7水硫酸镁 0.4g

7水硫酸铁(II) 0.01g

4-至5水硫酸锰 0.01g

硫酸铵 25.0g

盐酸硫胺素 100μg

生物素 100μg

大豆蛋白盐酸裂解物(“Mieki”(注册商标)) 40ml

pH 7.0

用高效液相色谱(日立L-8500氨基酸分析仪)对L-丝氨酸的测定显示黄色短杆菌AJ13324，AJ13325和AJ13327分别以15.2g/L、14.3g/L和15.4g/L的量在培养基中积累L-丝氨酸。另一方面，作为对照培养的黄色短杆菌菌株ATCC 1406和AJ 13377分别以0g/L和5.0g/L的量积累L-丝氨酸。

离心黄色短杆菌AJ13324的培养基并且用阳离子交换树脂对此上清进行脱盐处理，随后用阴离子交换树脂和阴离子交换树脂进行色谱分离以去除副产品并且通过结晶纯化以从55％的培养基产量中获得至少99％纯度的L-丝氨酸结晶。

(实施例4)3-PGDH活性的测定

将黄色短杆菌AJ13324，AJ13325和AJ13327分别于30℃在肉汤琼脂培养基上培养24小时并且将1菌环量的每种微生物接种于500ml的摇瓶中，其中该摇瓶含有50ml具有表2所示组分的发酵培养基。作为对照，按上述相同的方式接种亲本菌株黄色短杆菌ATCC 14067和AJ13377。以氢氧化钠调节用于接种的培养基至pH5.5并且于115℃高压灭菌15分钟。

表2

成份含量/升

葡萄糖 30.0g

磷酸二氢钾 1.0g

7水硫酸镁 0.4g

7水硫酸铁(II) 0.01g

4-至5水硫酸锰 0.01g

硫酸铵 3.0g

大豆蛋白盐酸裂解物(“Mieki”(注册商标)) 3.0ml

盐酸硫胺素 200μg

生物素 50μg

尿素 3.0g

酵母提取物 2.0g

pH 5.5

从每种菌株的培养基中收集细胞以后，用生理盐水洗涤细胞2次并且悬浮于含有2mM二硫苏糖醇的50mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中。冰冷以后，将悬液用超声仪破碎细胞并且超速离心所得的液体。超速离心在45,000rpm进行1小时以获得粗酶溶液。

用Salach H.J.等的方法(酶学方法，9卷，216-220(1966))测定3-PGDH的酶活性。

更具体地说加入0.4ml 0.015M NAD，0.12ml 0.25M EDTA(pH 9，Na0H)，0.1ml0.05M谷光甘肽(pH 6，KOH)，0.5ml 1M肼(pH 9，乙酸盐)，0.6ml 1M Tris(pH 9，Hcl)，适当浓度的L-丝氨酸(0-40mM)和水以制成2.3ml，预先加热至25℃。然后，加入0.2ml的粗酶溶液并且维持恒温5分钟。之后，加入0.5ml 0.1M 3-PGA(3-磷酸甘油酸二钠盐，pH 7，NaOH)。搅拌后，于340nm处测定反应混合物的吸光率30秒。反应于25℃进行。

为了进行活性测定，使用日立U-2000A分光光度计。

图1显示得到的结果。与野生型菌株ATCC 14067相比，AJ13377菌株的L-丝氨酸敏感性降低。AJ13324菌株的L-丝氨酸敏感性降低得更多并且AJ 13325菌株与AJ13324菌株在这方面的水平相同。AJ13327菌株大大地降低了L-丝氨酸的敏感性。并且甚至在80mM L-丝氨酸的存在下抑制被完全脱敏。

尽管已报导大肠杆菌中L-丝氨酸对3-PGDH抑制脱敏的一些实例(Tosa和Pizer，细菌学杂志.106：972-982(1971)或公开的日本专利申请No.6-510911)，但是已知还没有在如此高浓度L-丝氨酸存在下对此抑制完全脱敏的实例。

(实施例5)来自棒杆菌野生型和突变型serA的克隆

如实施例4中所示，在AJ 13327菌株中L-丝氨酸的反馈抑制被完全脱敏。因此，为了弄清什么样的变异并且证实3-PGDH的扩增效果，试图克隆编码来自ATCC14067菌株野生型3-PGDH和来自AJ13327菌株突变型3-PGDH的serA基因。

为了用PCR方法从黄色短杆菌染色体中扩增serA，生产相应的引物是必要的。由于没有有关黄色短杆菌serA克隆和核苷酸序列的报导，使用了来自棒杆菌的serA序列。从谷氨酸棒杆菌K82(参考FERM BP-2444和公开的日本专利申请No.3-7591)中提取质粒，其中的来自棒杆菌的serA片段用Wizard Minipreps DNA纯化系统(Promega生产)克隆并且以限制酶 BamHI(Takara Shuzo有限公司生产)切割含有serA的约1.4kb的DNA片段。

作为用于克隆基因片段的载体，用新近构建的克隆载体pVK7用于棒杆菌。

通过以下述方式连接(大肠杆菌克隆载体)pHSG299(Kmr；Takeshita，S.等.，基因，61，63-74(1987)，公开的日本专利申请No.10-215883)至pAM330，一种乳酸发酵短杆菌的隐蔽性质粒而构建pVK7。以单特异性限制酶 AvaII(TakaraShuzo有限公司生产)切割pHSG299并且以T4 DNA聚合酶末端补平。将它与已经用HindIII(Takara Shuzo有限公司生产)切割并且以T4 DNA聚合酶补平末端的pAM330连接。根据pAM330相对于pHSG299的插入方向将得到的这2种质粒命名为pVK6和pVK7。pVK7用于下面的实验。pVK7可以在大肠杆菌和乳酸发酵短杆菌中自主复制并且保留来自pHSG299的多克隆位点和lacZ’。图2显示pVK6和pVK7的构建过程。

向这样构建的穿梭载体pVK7上连接一个含有serA的约1.4kb的DNA片段。pDTS9901以限制酶 BamHI(Takara Shuzo有限公司生产)切割并且连接至同样以限制酶 BamHI切割的pVK7上。根据前述方法用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)进行DNA的连接。

对于测序反应，使用PCR热循环仪MP型(Takara Shuzo有限公司生产)和染色终止循环测序FS即用反应试剂盒(珀金-埃尔默公司生产)。作为DNA引物，使用M13(-21)，RV引物(Takara Shuzo有限公司生产)。序列表中的SEQ ID NO：1显示了这样得到的序列。SEQ ID NO：2显示了可由该序列编码的氨基酸序列。

根据这样测定的碱基序列合成引物并且用突变型黄色短杆菌AJ13327的染色体DNA作为模板通过PCR方法扩增serA。序列表中的SEQ ID NO：3和4分别显示合成用于基因扩增的DNA引物的N-末端和C-末端序列。

在黄色短杆菌染色体DNA制备中，使用了基因组DNA纯化试剂盒(细菌性的)(先驱遗传学技术公司生产)并且制备方法根据其所附的方案进行。

对于PCR反应，使用了PCR热循环仪MP型(Takara Shuzo有限公司生产)和TaKaRa Taq(Takara Shuzo有限公司生产)。

PCR产物用Original TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)直接连接至质粒pCR2.1载体上并且用INVαF’的感受态细胞进行转化。将转化的细胞涂布在进一步含有40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和25μg/ml卡那霉素的L培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L细菌用酵母提取物，15g/L NaCl，和15g/L琼脂)并且培养过夜。收集出现的白色菌落并且分离至单菌落以获得转化的菌株。

从转化的菌株中提取质粒并且以限制酶EcoRI处理经PCR方法证实有serA片段插入的那些质粒并且连接至穿梭载体pVK中。对此产物的碱基序列测定表明C-末端不含有全长序列。这样得到的序列相应于序列表中SEQ ID NO：13中5’端上游277碱基至SEQ ID NO：13中3’端1134碱基之间的区域。

为了获得含有全长serA基因的片段，黄色短杆菌AJ13327菌株染色体DNA缺失部分的克隆用TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)根据所附的方案进行。

首先，将这样制备的染色体DNA以各种限制酶完全消化并且与其中具有相应限制酶位点的连接盒连接。用盒式引物(C1)(序列表中的SEQ ID NO：5)和与已知的DNA(S1)区域(序列表中的SEQ ID NO：6)互补的引物进行第1轮PCR。用该反应混合物的一部分，用内部引物C2(序列表中的SEQ ID NO：7)和S2(序列表中的SEQ ID NO：8)进行第2轮PCR以仅仅扩增目的DNA。

当 EcoRI(Takara Shuzo有限公司生产)用作限制酶时，证实该目的DNA的扩增并且直接测定该PCR产物的碱基序列。根据这样获得的碱基序列，生产编码C-末端一侧的引物并且从作为野生型菌株的黄色短杆菌ATCC 14067和作为突变菌株的黄色短杆菌AJ13327中收集含有全长serA的片段。序列表中的SEQ ID NOS：9和10分别显示N-末端和C-末端侧链DNA引物的序列。

用Original TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)将分别含有全长野生型serA和突变型serA的基因片段连接至 EcoRI-切割的穿梭载体pVK7中。分别生产带有相应基因片段的质粒并且测定其碱基序列。SEQ ID NOS：11和13分别表示野生型和突变型的序列。SEQ ID NOS：12和14分别表示这些序列可编码的氨基酸序列。比较这样测定的碱基序列，证实在突变型serA中，第1087个碱基G突变成A并且因此第325个氨基酸，谷氨酸变成赖氨酸。

(实施例6)将含有3-PGDH基因的质粒导入黄色短杆菌中

将带有野生型serA或突变型serA的质粒分别导入黄色短杆菌AJ13377中。这些质粒通过电脉冲方法(Sugimoto等.，公开的日本质粒申请No.2-207791)导入。在含有25μg/ml卡那霉素的完全培养基中筛选转化的细胞。

(实施例7)通过转化的细胞生产L-丝氨酸

其中分别导入了具有含全长野生型serA或突变型serA基因片段的质粒的转化细胞在根据实施例3的500ml摇瓶中培养，并且测定产生的L-丝氨酸。作为对照，类似地培养作为宿主的AJ13377菌株。

观察到其中导入野生型serA的转化细胞其L-丝氨酸生产力没有影响而证实其中导入了突变型serA的转化细胞L-丝氨酸生产力增加(表3)

黄色短杆菌AJ13377已于1997年10月15日保藏于通商产业省工业科学和技术院生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305-8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM P-16471，并且根据布达佩斯条约于1998年11月20日由原始保藏转化为国际保藏，且保藏号为FERM BP-6567。

此外，含有突变型serA的质粒包含在黄色短杆菌ATCC14067中。带有此质粒的菌株命名为黄色短杆菌AJ1338并且已于1997年10月15日保藏于通商产业省工业科学和技术院生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305-8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM P-16472，并且根据布达佩斯条约于1998年11月20日由原始保藏转化为国际保藏，且保藏号为FERM BP-6577。

(实施例8)在黄色短杆菌产L-丝氨酸的菌株中

扩增serB和/或serC

(1)构建表达serB或serC的质粒

按图3和4所示构建表达serB的质粒pSB和表达serC的质粒pSC。

对于serB基因，根据已知的碱基序列(GenBank；X03046，M30784)制备引物(序列表中的SEQ ID NOS：15和16分别表示N-末端和C-末端)。另一方面，对于serC基因，根据已知的碱基序列(GenBank；D90728)制备引物(序列表中的SEQ IDNOS：17和18分别表示N-末端和C-末端)并使用大肠杆菌JM109染色体DNA作模板进行PCR以获得含有编码serB的ORF的基因片断(1197bp)和含有编码serC的ORF的基因片断(1380bp)。

SEQ ID NOS：15和16的碱基序列相应于序列GenBank；X03046，M30784中碱基号1197至1175和碱基号1至23的区域且SEQ ID NOS：17和18的碱基序列相应于序列GenBank；D90728中碱基号13205至13227和碱基号14584至14562的区域。

serB片断在钝端化后插入高拷贝型载体pHSG399的SmaI位点以获得p399B。为了使该质粒能在棒状杆菌属细菌中自主复制，从来自pHM1519的保留有复制因子的pBK4裂解复制因子(下文称为“Brev.-ori”)并插入p399B以获得pSB(图3)。pBK4制备如下。即，含有Brev.-ori的质粒pHC4从含有该质粒的大肠杆菌AJ12617菌株(FERM BP-3532)制备并用 KpnI(Takara Shuzo有限公司生产)和 BamHI(TakaraShuzo有限公司生产)裂解以提取Brev.-ori片断，然后将其钝端化。根据前述方法使用DNA钝端化试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)进行钝端化。随后，将产物连接到已磷酸化的 BamHI连接子上并用 BamHI再次裂解。将它连接到也用 BamHI裂解的pHSG298上以获得pBK4。pBK4可用于以 BamHI裂解Brev.-ori片断。另外，将serC片断插入pPCR-Seript SK(+)的 SrfI位点以获得pScript-serC。向所得质粒的 SacI位点插入一个 PstI连接子。然后，用 PstI裂解serC片断并插入pHSG399的 PstI位点以获得p399C。从保留有来自pHM1519的复制因子的pBK4裂解复制因子并插入p399C以获得pSC(图4)。

(2)构建表达serB和serC的质粒

随后，制备分别表达serB和serC的质粒pBC8和pBC14(图5)。向存在于上述pScript-serC的serC片断外侧的 SacI位点插入一个 PstI连接子以导入一个PstI位点。用 PstI处理该质粒以裂解serC片断，然后将它插入含有serB的质粒pSB的 PstI位点。证实其碱基序列且serC片断反向插入lacz的质粒命名为pBC8，其正向插入lacz的质粒命名为pBC14。

(3)以serB和serC扩增的菌株生产L-丝氨酸

使用上述制备的质粒pSB，pSC和pBC8转化黄色短杆菌野生型菌株ATCC 14067并从转化细胞中提取质粒。将质粒用于转化具有L-丝氨酸生产力的黄色短杆菌AJ13377和AJ13327。另外用黄色短杆菌AJ13378(FERM P-16472)中携带的含有突变型serA的质粒转化携带pBC8的黄色短杆菌AJ13377和AJ13327。

在含10mg/L氯霉素的琼脂培养基上培养各转化的菌株并按与实施例3相同的方式分别培养形成的菌落，接着测量培养基中积累的L-丝氨酸。经过向培养基中加入25mg/L卡那霉素培养含有突变serA的转化菌株。表3显示了所得的结果。

表3

菌株扩增的基因积累的L-丝氨酸的量(g/L)

AJ13377 - 5.0

serA 5.0

serA* 12.0

serB 19.3

serC 8.3

serB，serC 19.5

serA^※，serB，serC 24.8

AJ13327 - 15.4

serB 24.2

serC 19.8

serB，serC 26.4

serA^※，serB，serC 35.2

serA*：突变型serA基因

如上所述，serB或serC的扩增增加了积累的L-丝氨酸的量。另外，serB和serC基因同时扩增进一步增加了积累的L-丝氨酸的量。此外，基因与突变型serA基因一起扩增使积累的L-丝氨酸量增加得更多。使用pBC14代替pBC8获得了相似的结果。

在本实施例中，尽管黄色短杆菌的L-丝氨酸分解活性缺陷型菌株(AJ13377)或L-丝氨酸分解活性缺陷型，重氮丝氨酸抗性菌株(AJ13327)用作具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌宿主以扩增各基因，但也可使用其它的重氮丝氨酸抗性菌株(AJ13324)或L-丝氨酸分解活性缺陷型，β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性菌株(AJ13325)。

序列表

<110>Ajinomoto有限公司

<120>通过发酵生产L-丝氨酸的方法

<130>OP813

<150>JP 10-3751

<151>1998-01-12

<150>JP 10-35352 1

<151>1998-12-11

<160>18

<170>专利2.0版

<210>1

<211>1432

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(398)..(1432)

<400>1

ggatccggac acacgtgaca aaattgtaga aaattggatg attttgtcac gcctgtctgg 60

tttagctctg gttcgggacg ggcgtggaat ggaggtagcg caccgagacc ttgacccgcg 120

gcccgacaag ccaaaagtcc ccaaaacaaa cccacctcgc cggagacgtg aataaaattc 180

gcagctcatt ccatcagcgt aaacgcagct ttttgcatgg tgagacacct ttgggggtaa 240

atctcacagc atgaatctct gggttagatg actttctggg tgggggaggg tttagaatgt 300

ttctagtcgc acgccaaaac ccggcgtgga cacgtctgca gccgacgcgg tcgtgcctgt 360

tgtaggcgga cattcctagt ttttccagga gtaactt gtg agc cag aat ggc cgt 415

Val Ser Gln Asn Gly Arg

1 5

ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag tcc act gtt gac gcg 463

Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln Ser Thr Val Asp Ala

10 15 20

ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac gga cct aac cgc cca 511

Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp Gly Pro Asn Arg Pro

25 30 35

gaa ctg ctt gat gca gtt aag gaa gcg gac gca ctg ctc gtg cgt tct 559

Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp Ala Leu Leu Val Arg Ser

40 45 50

gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct gcc cct aac ttg aag 607

Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala Ala Pro Asn Leu Lys

55 60 65 70

atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac gtt gac atc cct gct 655

Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn Val Asp Ile Pro Ala

75 80 85

gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca ccg acc tct aac att 703

Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala Pro Thr Ser Asn Ile

90 95 100

cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg ctg tct act gct cgc 751

His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu Leu Ser Thr Ala Arg

105 110 115

cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag ggc gag tgg aag cgg 799

Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Trp Lys Arg

120 125 130

tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa act gtc ggt atc gtc 847

Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys Thr Val Gly Ile Val

135 140 145 150

ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag cgt ctt gct gcg ttt 895

Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln Arg Leu Ala Ala Phe

155 160 165

gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gcc aac cct gct cgt gca 943

Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala Asn Pro Ala Arg Ala

170 175 180

gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat gag ctg atg agc cgt 99l

Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu Asp Glu Leu Met Ser Arg

185 190 195

tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc aag gaa act gct ggc 1039

Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr Lys Glu Thr Ala Gly

200 205 210

atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag aag ggc cag atc atc 1087

Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ile Ile

215 220 225 230

atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gag cag gct ttg gct gat 1135

Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu Gln Ala Leu Ala Asp

235 240 245

gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt ttc gat gtg tac tcc 1183

Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly Phe Asp Val Tyr Ser

250 255 260

acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag ttg cct cag gtt gtt 1231

Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys Leu Pro Gln Val Val

265 270 275

gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag gct cag gat cgt gcg 1279

Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu Ala Gln Asp Arg Ala

280 285 290

ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg ctg gct ggc gag ttc 1327

Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala Leu Ala Gly Glu Phe

295 300 305 310

gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc gtg ggc gaa gag gtt 1375

Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg Val Gly Glu Glu Val

315 320 325

gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt ctt ctt gct ggc aag 1423

Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly Leu Leu Ala Gly Lys

330 335 340

ctt gtc gac 1432

Leu Val Asp

345

<210>2

<211>345

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>2

Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val

20 25 30

Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp

35 40 45

Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala

50 55 60

Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn

85 90 95

Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu

100 105 110

Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg

115 120 125

Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly

130 135 140

Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala

145 150 155 160

Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu

180 185 190

Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys

195 200 205

Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser

210 215 220

Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp

225 230 235 240

Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala

245 250 255

Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe

260 265 270

Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu

275 280 285

Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys

290 295 300

Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly

305 310 315 320

Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu

325 330 335

Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp

340 345

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

ggacacacgt gacaaaattg tag

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

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gccagcaaga agaccaagct tgc

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

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gtacatattg tcgt tagaac gcgtaatacg actca

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

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tcatcaacgc tgctcgtggt ggc

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga

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<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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gacgttgctg attctgtgct caa

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<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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gggagggttt agaatgtttc tag

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<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<211>1730

<212>DNA

<213>黄色短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(115)..(1704)

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Val

1

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Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln

5 10 15

tcc act gtt gac gcg ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac 213

Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp

20 25 30

gga cct aac cgc cca gaa ctg ctt gat aca gtt aag gaa gcg gac gca 261

Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp Ala

35 40 45

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Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala

50 55 60 65

gcc cct aac ttg aag atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac 357

Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn

70 75 80

gtt gac atc cct gct gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca 405

Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala

85 90 95

ccg acc tct aac att cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg 453

Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu

100 105 110

ctg tct act gct cgc cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag 501

Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu

115 120 125

ggc gag tgg aag cgg tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa 549

Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys

130 135 140 145

act gtc ggt atc gtc ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag 597

Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln

150 155 160

cgt ctt gct gcg ttt gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gct 645

Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala

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aac cct gct cgt gcg gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat 693

Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu AGp

180 185 190

gag ctg atg agc cgt tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc 741

Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr

195 200 205

aag gaa act gct ggc atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag 789

Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys

210 215 220 225

aag ggc cag atc atc atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gaa 837

Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu

230 235 240

cag gct ttg gct gat gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt 885

Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly

245 250 255

ttc gat gtg tac tcc acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag 933

Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys

260 265 270

ttg cct cag gtt gtt gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag 981

Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu

275 280 285

gct cag gat cgt gcg ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg 1029

Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala

290 295 300 305

ctg gct ggc gag ttc gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc 1077

Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg

310 315 320

gtg ggc gaa gag gtt gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt 1125

Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly

325 330 335

ctt ctt gct ggc aag ctt gtc gac gcc gcc cca gtc tcc att gag gtt 1173

Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Val

340 345 350

gag gct cga ggc gag ctt tct tcc gag cag gtc gat gca ctt ggt ttg 1221

Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly Leu

355 360 365

tcc gct gtt cgt ggt ttg ttc tcc gga att atc gaa gag tcc gtt act 1269

Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val Thr

370 375 380 385

ttc gtc aac gct cct cgc att gct gaa gag cgt ggc ctg gac atc tcc 1317

Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile Ser

390 395 400

gtg aag acc aac tct gag tct gtt act cac cgt tcc gtc ctg cag gtc 1365

Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln Val

405 410 415

aag gtc att act ggc agc ggc gcg agc gca act gtt gtt ggt gcc ctg 1413

Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala Leu

420 425 430

act ggt ctt gag cgc gtt gag aag atc acc cgc atc aat ggc cgt ggc 1461

Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg Gly

435 440 445

ctg gat ctg cgc gca gag ggt ctg aac ctc ttc ctg cag tac act gac 1509

Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr Asp

450 455 460 465

gct cct ggt gca ctg ggt acc gtt ggt acc aag ctg ggt gct gct ggc 1557

Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala Gly

470 475 480

atc aac atc gag gct gct gcg ttg act cag gct gag aag ggt gac ggc 1605

Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp Gly

485 490 495

gct gtc ctg atc ctg cgt gtt gag tcc gct gtc tcc gaa gag ctg gaa 1653

Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu Glu

500 505 510

gct gaa atc aac gct gag ttg ggt gct act tcc ttc cag gtt gat ctt 1701

Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp Leu

515 520 525

gec taattagaga tccattttct agaacc 1730

Asp

530

<210>12

<211>530

<212>PRT

<213>黄色短杆菌

<400>12

Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val

20 25 30

Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp

35 40 45

Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala

50 55 60

Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn

85 90 95

Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu

100 105 110

Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg

115 120 125

Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly

130 135 140

Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala

145 150 155 160

Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu

180 185 190

Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys

195 200 205

Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser

210 215 220

Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp

225 230 235 240

Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala

245 250 255

Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe

260 265 270

Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu

275 280 285

Glu Ala Gln Asp Arg Ala GLy Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys

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Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly

305 310 315 320

Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu

325 330 335

Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu

340 345 350

Val Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly

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Leu Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val

370 375 380

Thr Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile

385 390 395 400

Ser Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln

405 410 415

Val Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala

420 425 430

Leu Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg

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Gly Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr

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Gly Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp

485 490 495

Gly Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu

500 505 510

Glu Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp

515 520 525

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<210>13

<211>1730

<212>DNA

<213>黄色短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(115)..(1704)

<400>13

gggagggttt agaatgtttc tagtcgcacg ccaaaacccg gcgtggacac gtctgcagcc 60

gacgcggtcg tgcctgttgt aggcggacat tcctagtttt tccaggagta actt gtg 117

Val

1

agc cag aat ggc cgt ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag 165

Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln

5 10 15

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Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp Ala

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Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala

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<213>黄色短杆菌

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<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>15

ggcaagacag aacaggacaa tca

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>16

agcttttgcc acggtgtacc tcg

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>17

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<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>18

cggttagaaa cgctcttgga acc

Claims

1.具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，其中所述棒杆菌含有一种L-丝氨酸反馈抑制被脱敏或敏感性降低的突变型D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，所述突变型D-3-磷酸甘油酸脱氢酶来自黄色短杆菌野生型D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，并且其中至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性通过在其细胞中增加上述棒杆菌的编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因或编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因的拷贝数而被增强，所述磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶来自大肠杆菌。

2.权利要求1所要求的棒杆菌，其中所述细菌磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性均被增强。

3.权利要求1所要求的棒杆菌，其中所述棒杆菌的野生型D-3-磷酸甘油酸脱氢酶具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，以及编码磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的基因分别具有Genbank X03046 M30784或Genbank D90728的核苷酸序列。

4.权利要求2所要求的棒杆菌，其中所述棒杆菌的野生型D-3-磷酸甘油酸脱氢酶具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，以及编码磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的基因分别具有Genbank X03046 M30784或Genbank D90728的核苷酸序列。

5.生产L-丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上述权利要求1至4中任意一项所要求的棒杆菌从而使L-丝氨酸在此培养基中积累以及从该培养基中收集L-丝氨酸的步骤。