CN1179045C - 通过发酵生产l-谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

通过在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株，其中在这一细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强；在该培养基中生产并积累L-谷氨酸；并从该培养基中回收L-谷氨酸这些步骤来生产L-谷氨酸。

Description

通过发酵生产L-谷氨酸的方法

                         技术领域

本发明涉及一种通过发酵来生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的氨基酸，被应用于食品，临床药物及其它方面。

                         背景技术

传统上，L-谷氨酸主要是通过发酵，用属于短杆菌属、棒状杆菌属或微菌属的所谓的生产L-谷氨酸棒状细菌或其突变体进行生产的(Amino Acid Fermentotios，Gakkai Shuppan Center，195-215(1986))。已知的使用其它细菌菌株来生产L-谷氨基的发酵方法有：使用包括杆菌、链霉菌以及青霉素的微生物的方法(美国专利第3,220,929号)；以及使用包括假单孢菌属、节核细菌属、沙雷氏菌属以及假丝酵母的微生物的方法(美国专利第3,563,857号)。虽然通过使用传统的方法已经可以大大提高L-谷氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展一种更有效、更廉价的生产L-谷氨酸的方法。

L-谷氨酸是由微生物细胞内柠檬酸循环的中间产物α-酮戊二酸通过生物合成而来的。由α-酮戊二酸通过铵离子的同化作用来形成L-谷氨酸的生物合成途径有两条。其中一条途径是在有高浓度的铵离子存在的情况下，通过谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，下文称“GDH”)的催化来合成L-谷氨酸。另外一条途径(GS/GOGAT途径)是由谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来合成L-谷氨酸。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，下文称“GS”)催化L-谷氨酸和铵离子转化为谷氨酰胺的反应；谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶(glutamine-oxoglutaric acid amino transferase，也称“谷氨酸合成酶”(glutamate synthase，下文称“GOGAT”)催化L-谷氨酸合成反应，在该反应中，由已经由GS合成的一分子的谷氨酰胺和一分子的α-酮戊二酸分子合成两分子的L-谷氨酸。迄今为止，利用细菌菌株GDH途径生产L-谷氨酸并通过提高其GDH活性来增强L-谷氨酸生产的方面已有报道，但是利用细菌菌株GS/GOGAT途径生产L-谷氨酸并使其生产得以增强的方法尚不知晓。

                       本发明的说明

本发明的一个目的是培养能高效生产L-谷氨酸的细菌菌株并提出一种更有效、更廉价的L-谷氨酸生产方法，以满足对L-谷氨酸的日益增长的需求。

本发明的发明者们已经使用其GOGAT活性得到增强的细菌菌株对L-谷氨酸的生产方法进行了研究，上述的GOGAT是参与GS/GOGAT途径的其中一种酶，它催化L-谷氨酸的生成。结果发明者们发现，当能够生产L-谷氨酸的细菌菌株的GOGAT活性被增强时，其生产L-谷氨酸的能力即得以提高，这样即完成了此发明。

也就是说，本发明提供了一种属于 棒状杆菌属的细菌菌株，这一菌株具有生产L-谷氨酸的能力，其细胞中的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强。这种谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活力的增强可以通过增加编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶基因的拷贝数来完成。另外，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强也可以通过改变编码该酶基因的表达调控序列来完成。谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶可以得自属于 埃希氏杆菌属或 棒状杆菌属的微生物。

另外，本发明还提供了一个编码氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因，它包含的核苷酸序列至少对应于SEQ ID NO：7中所描述的核苷酸序列的第565-6614位。

而且，本发明还提供了一种通过发酵来生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养一种属于 棒状杆菌属的细菌菌株，该菌株具L-谷氨酸生产能力，其细胞内的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活力被增强；在培养基中生产并积累L-谷氨酸；以及从该培养基中回收L-谷氨酸的步骤。

本发明将在下面作详细说明。

(1)属于 棒状杆菌属的具有生产L-谷氨酸能力的细菌

此处所指的属于 棒状杆菌属的细菌是一组在Bergey′s Manual ofDeterminative Bacteriology第8版第599页(1974)中所定义的微生物。这些细菌是好氧、革兰氏阳性、不具有形成芽孢的能力的不耐酸杆菌，同时包括一些曾经被分类为 短杆菌属而现在被统一到 棒状杆菌属的细菌(见Int.J.Syst.Bacteriol.，41，225(1981))，以及与 棒状杆菌属紧密相关的 短杆菌属及 微菌属中的一些细菌。在上述的属于 棒状杆菌属的细菌中，列于下面的已知是L-谷氨酸生产细菌的，是本发明中最优选的。

嗜乙酰棒杆菌( Corynebacterium  acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌( Corynebacterium  acetoglutamicum)

美棒杆菌( Corynebacterium  callunae)

谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium   glutamicum)

Corynebacterium  lilium( Corynebacterium  glutamicum)

Corynebacterium  melassecola

Brevibacterium  divaricatum( Corynebacterium  glutamicum)

Brevibacterium  lactofermentum( Corynebacterium  glutamicum)

解糖短杆菌( Brevibacterium  saccharolyticum)

Brevibacterium  immariophilium

玫瑰色短杆菌( Brevibacterium  roseum)

Brevibacterium  flavum( Corynebacterium  glutamicum)

生硫短杆菌( Brevibacterium  thiogenitalis)

具体地说，这些细菌中的下列菌株被作为例子采用：

嗜乙酰棒杆菌 (Corynebacterium  acetoacidophilum)    ATCC 13870

醋谷棒杆菌( Corynebacterium  acetoglutamicum)       ATCC 15806

美棒杆菌( Corynebacterium  callunae)                ATCC 15991

谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium  glutamicum)          ATCC 13032

谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium  glutamicum)          ATCC 13060

Brevibacterium  divaricatum                         ATCC 14020

Brevibacterium  lactofermentum                      ATCC 13869

Corynebacterium  lilium                             ATCC 15990

Corynebacterium  melassecola                        ATCC 17965

解糖短杆菌( Brevibacterium  saccharolyticum)        ATCC 14066

Brevibacterium  immariophilium                      ATCC 14068

玫瑰色短杆菌( Brevibacterium  roseum)               ATCC 13825

黄色短杆菌( Brevibacterium  flavum)                 ATCC 13826

生硫短杆菌( Brevibacterium  thiogenitalis)          ATCC 19240

这些菌株可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。每种细菌菌株都指定了一个保藏号。任何人都可以根据保藏号从ATCC中获得相应的细菌菌株。在ATCC的目录中描述了保藏于ATCC中的细菌菌株的保藏号。

当用上述的属于棒状杆菌属的细菌生产L-谷氨酸时，采用下述的任一方法都是可行的。

1.使培养基中生物素的浓度不达到最理想值。参阅S.Okumura，T.Tsugawa，T.Tsunoda及A.Kitai，Nippon Nogeikagaku Kaishi， 36，197-203(1962)。

2.如果培养基中含足量的生物素，则向其中加入表面活化剂。参阅I.Shiio，H.Otsuka及N.Atsuya，J.Biochem.， 53，333-340(1963)；K.Takinami，H.Okada及T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.， 27，853-863(1963)。

3.如果培养基中含足量的生物素，则向其中加入青霉素。参阅美国专利第3,080,297号；日本专利公开第37-1695号(1962)；M.Shibui，T.Kurima，S.Okabe及T.Osawa，Amino Acid and Nucleic Acid， 17，61-65(1968)。

另外，还可以通过使用以上所述的属于 棒状杆菌属的细菌的突变体的方法来生产L-谷氨酸。值得提及的突变体有：

Brevibacterium  lactofermentum AJ 12745(FERM-BP 2922)；见美国专利第5,272,067号。

Brevibacterium  lactofermentum AJ 12746(FERM-BP 2923)；见美国专利第5,272,067号。

黄色短杆菌( Brevibacterium  flavum)AJ 12747(FERM-BP2924)；见美国专利第5,272,067号。

谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium  glutamicum)AJ 12478(FERM-BP 2925)；见美国专利第5,272,067号。

谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium  glutamicum)ATCC 21492。

在本发明中上述的产L-谷氨酸细菌是最优选使用的。

(2)GOGAT活性的增强

细菌细胞中GOGAT活性可以这样来增强：连接编码GOGAT的基因片段与在 棒状杆菌属细菌中发挥功能的载体以构建重组DNA，把这一重组DNA引入棒状杆菌属细菌的宿主菌株中对其进行转化，从而增强该细菌细胞中GOGAT的活性。GOGAT是由大小亚基组成的异寡聚物，其中大小亚基分别由gltB及gltD基因编码。在转化菌株细胞中编码GOGAT的基因(下文称“gltBD基因”)拷贝数的增加导致了GOGAT活性的增强。

至于gltBD基因，属于 棒状杆菌属的细菌的基因以及来源于包括 大 肠杆菌的其它生物体的基因都可被使用。得自属于 棒状杆菌属的细菌的gltBD基因的核苷酸序列尚未知道，但 大肠杆菌K-12(Gene，60，1-11(1987))以及酵母( Saccharomyces  cerevisiae，GenBank访问号码X89221)的gltBD基因的核苷酸序列早已被阐明。因此，可以根据这些gltBD基因的核苷酸序列合成引物，并通过PCR方法用从例如大肠杆菌K12及 Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869中制备的染色体DNA当模板获得这些微生物的gltBD基因。这些引物可以由SEQ IDNos：3-6中所示的引物来举例说明。在随后所述的实施例中所分离的 Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：7中。

Brevibacterium  lactofermentum的gltBD基因是一新颖的基因。

至于用于基因克隆的质粒，任何可以在如大肠杆菌的微生物细胞中复制的质粒都是可用的，而pBR322、pTWV228、pMW119以及pUC19则被具体地举例说明。

此处所指的在 棒状杆菌属细菌中发挥功能的载体是，例如，一种可以在 棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒。下列的是载体的一些具体的例子。

pAM330，见日本专利申请公开58-67699号(1983)

pHM1519，见日本专利申请公开58-77895号(1983)

pAJ655，见日本专利申请公开58-192900号(1983)

pAJ611，见日本专利申请公开58-192900号(1983)

pAJ1844，见日本专利申请公开58-192900号(1983)

pCG1，见日本专利申请公开57-134500号(1982)

pCG2，见日本专利申请公开58-35197(1983)

pCG4，见日本专利申请公开57-183799号(1982)

pCG11，见日本专利申请公开57-183799号(1983)

为了通过连接编码GOGAT的gltBD基因及在 棒状杆菌属细菌的细胞中发挥功能的载体来制备重组DNA，用与gltBD基因末端相应的限制性酶对载体进行消化。连接通常是用连接酶，如T4 DNA连接酶来进行的。

当要把如上述所制备的重组DNA导入到 棒状杆菌属细菌中时，可以采用任何已知的转化方法。例如，可用的一种方法是用氯化钙对受体细胞进行处理以增加DNA的通透性，这一方法已被报导用于 大肠杆菌K-12中(见Mandel，M.及Higa，A.，J.Mol.Bid.， 53，159(1970))；可用的另一种方法是用处于生长期的细胞制备感受态细胞随后再把DNA导入其中，这一方法已被报导用于 枯草杆菌中(见Duncan，C.H.，Wilson，G.A.及Young，F.E.，Gene， 1，153(1977))。除此之外，可用的另一种方法是把DNA受体细胞制成原生质体或原生质球形体，它们在重组DNA被导入细胞之后可以容易地吸收重组DNA，这种方法已知可被用于 枯草杆 菌、放线菌类及酵母中(见Chang，S.及Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.及Hopwood，O.A.，Nature， 274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.及Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA， 75，1929(1978))。

在本发明的实施例中所用的转化的方法是电脉冲法(参阅日本专利申请公开2-207291号)。

GOGAT活性的增强也可以通过把多拷贝的gltBD基因导入到上述宿主菌株的染色体DNA中。为了把多拷贝的gltBD基因导入到 棒状杆菌属细菌的染色体DNA中，用在染色体DNA中有多拷贝的序列作为目标进行同源重组。可被使用的在染色体DNA上存在多拷贝的序列有重复性DNA、转座元件末端的反向重复序列。而且，如日本专利申请公开2-109985号中所揭示的，可以把gltBD基因整合到转座子中并让转座子转移以把多拷贝的gltBD基因导入到染色体中。通过任何一种方法都可以使经转化的菌株细胞中gltBD基因的拷贝数增加，结果使GOGAT活性增强。

除了上述的基因扩增法之外，GOGAT活性的增强还可以通过把gltBD基因的表达调控序列，如启动子替换成更强的来实现。例如，已知的强有力的启动子有lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、以及λ噬菌体的P_R及P_L启动子。通过把gltBD基因固有的启动子替代成这些启动子即可增强gltBD基因的表达，从而增强GOGAT的活性。

(3)使用本发明的细菌菌株生产L-谷氨酸。

通过使用一种具L-谷氨酸生产能力的 棒状杆菌属细菌菌株(这一菌株细胞中的GOGAT活性已被增强)即可以普通的方法来生产L-谷氨酸，上述方法使用含有碳源、氮源、无机盐并根据需要含有其它次要有机营养物，如氨基酸及维生素的普通营养培养基。任何可以被用于待培养的细菌菌株的碳源及氮源都可被用于培养基中。

一些糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物以及糖蜜被用作碳源。而其它的有机酸如乙醇及柠檬酸也可被单独用作碳源，或与其它的碳源结合使用。

可用作氮源的是氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵以及乙醇铵或者硝酸盐。

至于次要有机营养物，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物以及大豆蛋白水解物这些含有上述营养成分的物质都可被使用。如果使用的是需要氨基酸或其它物质用于生长的营养突变型的突变体，则应该补充必需的营养物质。

可用作无机盐的有磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等等。

至于培养方法，培养是在有氧条件下进行的，发酵温度被控制在20至45℃之间，而pH值刚被控制于5至9之间。如果pH值在培养的过程中降低了，则加入碳酸钙或用碱性物质如氨气对培养基进行中和。如此培养10小时至4天之后，在培养基中即可积累大量的L-谷氨酸。

至于在培养后从培养基中回收L-谷氨酸的方法，任何已知的回收方法都可被使用。例如，可以在把细胞从培养基中除去之后用浓缩结晶法来收集产物。或者也可以用离子交换层析或其它方法。

                      附图的简要说明

图1中所示的是质粒pBD35-43的构建过程。

                    优选实施方案的描述

以下参照实施例对本发明进行更具体的解释。

实施例1

(1) 大肠杆菌K-12gltBD基因的克隆

大肠杆菌K-12的gltBD基因的核苷酸序列是已知的(Gene，60，1-11(1987))。以上述报导的核苷酸序列为基础，合成了如序列表中SEQID NOs：1及2中所示的引物并根据PCR方法用源于 大肠杆菌K-12的JM109菌株的染色体DNA(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产)为模板对gltBD基因进行扩增。

在所合成的引物中，SEQ ID NO：1对应于在Gene，60，6(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列图中的第57至96位核苷酸，但是在引物中，第77及第78位核苷酸被从A替换为G，而且已在其中插入了限制性酶GamHI的识别位点。SEQ ID NO：2对应于在Gene，60，7(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列图中的第6261至第6290位核苷酸，但是在引物中，第6380位核苷酸被从T替换为G，第6282位核苷酸被从A替换成T，第6284位核苷酸被从A替换成C，这样就插入了限制性酶BamHI的识别位点。而且SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列是在Gene，60，7(1987)中所描述的核苷酸序列图中第6261至6290位核苷酸的互补链，是从5′端开始的。

大肠杆菌K-12染色体DNA的制备是根据通常的方法进行的(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu Kougaku-kai编辑，97-98，Baifu-kan，(1992))。而且，PCR反应也是用PCRTechnology(Henry Enrich编辑，Stockton Press，1989，第8页)中所描述的标准反应条件进行的。

把获得的PCR产物用通常的方法进行纯化，然后用限制性酶BamHI对其进行处理，接着用连接试剂盒把其与已经BamHI消化的pMW219(由Nippon Gene Co.，Ltd.生产)相连接，然后用 大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)的感受态细胞进行转化。然后把细胞涂布在含有10μg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/mlX-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l细菌用酵母提取物、15g/l NaCl，15g/l琼脂，pH7.2)上并培养过夜，然后挑出所形成的白色菌落并把其分离为单一菌落以获得转化菌株。

用碱法从转化菌株制备质粒(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，NihonSeibutsu Kogaku-kai编辑，105，Baifu-kan，(1992))，然后给已被插入到载体中的DNA片段制作一张限制性位点图谱，然后根据它与已报导的gltBD基因限制性位点图谱的比较，把在其中已经插入了一个其限制性位点图谱与已报导的图谱一致的DNA片段的质粒命名为pMWGOGAT35。

另外，为了证实gltBD基因已被表达，用电穿孔法把pMWGOGAT35导入到缺乏gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的 大肠杆菌PA340菌株中。结果，导入了pMWGOGAT35的转化菌株的L-谷氨酸需要消失了，这样，gltBD基因的表达即得确证实。

(2)构建一个含有 大肠杆菌K-12gltBD基因及一 棒状杆菌属细菌复制起始位点的质粒。

图1中示出了构建一个含有 大肠杆菌K-12gltBD基因以及 棒状杆 菌属细菌复制起始位点的质粒的过程。具体地说，用限制性酶BamHI及KpnI对质粒pHK₄(日本专利申请公开5-7491号)进行消化(这一质粒带有来源于可以在 棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)的复制起始位点(日本专利申请公开Hei 5-7491号))以获得包括复制起始位点的基因片段，然后用DNA切齐试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.， Blunting Kit)把所得片段的末端切齐，然后把这一片段导入到质粒pMWGOGAT35的XbaI位点上，此前在质粒pMWGOGAT中已经用XbaI连接序列(由TakaraCo.，Ltd生产)插入了被克隆的 大肠杆菌K-12菌株的gltBD基因。把这一质粒命名为pBD35-43。

(3)把pBD35-43导入 棒状杆菌属AJ 12036及AJ 13029的野生型细菌株菌中并通过培养来估计所获得的转化子

用电脉冲法(参照日本专利公开公告2-207791号)用质粒pBD35-43对 棒状杆菌属AJ 12036(Agric.Giod.Chem.，51，93-100(1987))及AJ 13029的野生型细菌株菌进行转化并获得转化菌株。培养通过在野生型菌株AJ 12036中导入质粒pBD35-43而获得的转化菌株AJ 12036/pBD35-43以便在下述的生物素限制条件下生产L-谷氨酸。把培养在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培养基平板上的AJ12036/pBD35-43菌株的细胞接种在培养基(80g葡萄糖、1g KH₂PO₄、0.4g MgSO₄·7H₂O、30g (NH₄)₂SO₄、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01gMnSO₄·7H₂O、15ml大豆水解物、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素、50g CaCO₃加入1升纯水中，用KOH调到pH8.0)中，细胞在31.5℃下振荡培养，直到培养基中的糖耗尽为止。把所获得的培养物接种在不加生物素和卡拉霉素的上述培养基(下文称“生物素限制培养基”)中，培养数量为5％，31.5℃振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。在对照实验中，用如上所述的同样的方法培养AJ 12036菌株。培养完成之后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的Biotech Analyzer AS-210测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。所得结果示于表1中。

                      表1

细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)
		AJ 12036	34.3
AJ 12036/pBD35-43	36.8

另外，通过把质粒pBD35-43导入AJ 13029菌株获得转化菌株AJ13029/pBD35-43并如下进行培养以生产L-谷氨酸。把培养在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培养基平板上的AJ 13029/pBD35-43菌株的细胞接种到培养基(30g葡萄糖、1g KH₂PO₄、0.4g MgSO₄·7H₂O、30g(NH₄)₂SO₄、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·7H₂O、15ml大豆水解物、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素以及50g  CaCO₃加入到1升纯水中，用KOH调到pH8.0)，在31.5℃进行振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。以5％的量将获得的培养物接种进相同组成的培养基中，然后在37.0℃振动培养直至培养基中的糖耗尽为止。作为对照，用如上所述的同样方法培养AJ 12029菌株。培养完成后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的Biotech AnalyzerAS-210测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。所得结果示于表2中。AJ 12029菌株是在WO 96/06180中所描述的一种菌株，它对生物素活性抑制物质具温度敏感性。这一菌株被根据布达佩斯条约保藏于National Institute of Bioscience and Human Technology，Agencyof Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry(邮编：305-8566，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)中。这一菌株的保藏号为FERM BP-5189。

                        表2

细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)
		AJ 13029	16.5
AJ 13029/pBD35-43	17.7

基于以上结果，可以清楚地发现属于 棒状杆菌属并通过引入gltBD基因而使其GOGAT活性增强的产L-谷氨酸细菌的L-谷氨酸产量提高了。

实施例2

(1) Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869 gltBD基因的克隆

当用属于 棒状杆菌属的细菌通过发酵法生产L-谷氨酸时，使用源于该种细菌的gltBD基因是合乎需求的。

SEQ ID NOs：3及4中所示的寡核苷酸是根据由在 大肠杆菌和酵母中高度同源的gltB基因产物的选定区域的氨基酸序列推断而得的核苷酸序列合成的。用Bacterial Genomic DNA纯化试剂盒(由Advancedgenetic Technologies Corp.生产)制备 Brevibacterium  lactofermentumATCC 13869的染色体DNA。以上述的寡核苷酸为引物、以染色体DNA为模板，用“PCR Technology”(Henry Enrich编辑，Stockton Press，1989，第8页)中所描述的标准反应条件进行PCR反应。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现扩增出了一个长度大概为1.4Kbp的DNA片段。用SEQ ID NOs：3及4中的寡核苷酸对所得DNA的两端进行测序。测序是用DNA测序试剂盒(由Applied Biosystems Co.，Ltd.生产)根据Sanger的方法(J.Mol.Boil.，143，161(1980))进行的。把所确定的核苷酸序列翻译为氨基酸并把这一氨基酸序列与由 大肠杆菌及酵母的gltB基因推断的氨基酸序列进行比较。结果，因为存在高度的同源性，所以可以下结论由PCR扩增的DNA片段是 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltB基因的一部分。然后，用通常的方法用ECoRI、BamHI、HindIII、PstI以及SalI(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产)对通过上述方法所制备的 Brevibacterium  lactofermentumATCC 13869染色体DNA进行消化并用经扩增的DNA片段作为探针以及DIG DNA标记及检测试剂盒(由Boeringer Mannhein生产)进行Southern杂交。结果发现有由HindIII酶切而得的大约14kb的片段与DNA探针发生杂交。这样，用琼脂糖凝胶对用通常方法制备的 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869染色体DNA的HindIII片段进行电泳，并用玻璃粉回收了大约10kb大小或更大的DNA片段。用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)把经回收的DNA片段连接到已经限制性酶HindIII(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)酶切的载体pMW219(由Nippon Gene Corporation生产)上。用连接混合物对 大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)的感受态细胞进行转化。把转化菌株涂布在含有10μg/ml IPIG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l细菌用酵母提取物，15g/l NaCl，15g/L琼脂糖，pH7.2)，培养过夜。把由此获得的白色菌落挑起来并把其分离为单菌落，获得大约1000个转化菌株。使用所获得的转化菌株，用碱性法(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu-kogaku Gakkai，105，Baifu-kan，(1997))制备质粒。用如上所述的条件，用含有如SEQ ID NOs：5及6中所示的核苷酸序列且是根据DNA序列中被用作探针的被测序的那一部分进行合成的合成寡核苷酸当引物，并且用上述的质粒当模板，进行PCR反应。然后挑选出那些能够扩增出长度大概为1.3kbp的片段的转化菌株，这一扩增片段与用上述引物并用 Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869的染色体当模板进行PCR反应所扩增出来的DNA片段大小是相同的。

(2) Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869 gltBD基因核苷酸序列的测定

从在(1)中通过碱法获得的转化菌株制备的质粒DNA含有来源于Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869染色体的大约为14kbp的DNA片段。用与如上所述同样的方法测定了来源于 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869染色体的长度大约为14kbp的DNA片段中所含的gltBD基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7中所示的如上所测定的这些核苷酸序列中含有gltBD基因的AatII片段。从核苷酸序列分析可以假定存在有两个开放阅读框。SEQ ID NO：7中还示出了从核苷酸序列推定的翻译产物的氨基酸序列。也就是说，编码两个含有SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的蛋白质的基因是 Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因。在这一序列中，第565至5094号核苷酸对应于gltBD基因，第5097至6614则对应于gltD基因。SEQ ID NOs：8及9分别示出了由gltB基因及gltD基因所编码的氨基酸序列。顺便提一下，由于位于蛋白质N端的甲硫氨酸残基是源于起始密码ATG的，所以这一残基通常与蛋白质自身的功能并不存在联系，而且公知的是它在翻译后将由肽酶除去。相应地，在上述蛋白质的情形中，甲硫氨酸残基也可能被除去了。

把核苷酸序列及氨基酸序列与已知的序列进行同源性比较。所用的数据库是EMBL及SWISS-PROT。结果发现，SEQ ID NO：7中所示的DNA是 棒状杆菌属细菌中一个新的基因，它与已被报导的 大肠杆 菌、酵母等等的gltBD基因具同源性。

(3)制备含有 Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因以及 棒状杆菌属细菌的复制启始位点的质粒

为了研究 Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的扩增效力，构建了一个含有 Brevibacterium  lactofermentum ATCC13869的gltBD基因以及 棒状杆菌属细菌的复制启始位点的质粒。具体地说，用限制性酶AatII剪切质粒DNA，这一DNA含有源于 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869染色体的大约为14kbp的DNA片段，这一片段是从在(1)中获得的转化菌株用碱法制备的。剪切后获得含有Brevibacterium  lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的DNA片段，把所得的这一片段的末端用DNA切平试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产，Blunting Kit)切平，然后把其插入到质粒pVC 7中限制性酶SmaI的位点中，其中质粒pVC 7含有源于质粒pAM 330的复制起始位点，而质粒pAM 330可以在 棒状杆菌属细菌中自主复制(日本专利申请公开Sho 58-67699号)。这一质粒被命名为pVCGOGAT。把pHSG 399(一种 大肠杆菌载体，Cm^r；Takeshita，S.等人， Gene， 61，63-74(1987)与pAM 330(一种 Brevibacterium  lactofermentum的隐藏质粒)连接在一起以构建质粒pVC 7。pAM 330是用 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株制备的。用仅产生一个剪切位点的限制性酶AvaII(Takara Shuzo生产)对pHSG 399进行酶解，然后用T4DNA聚合酶把末端切平，再把其与已经过HindIII(Takara Shuzo生产)酶解并用T4 DNA聚合酶切平末端的pAM 330相连接。PVC 7在大肠杆菌及 Brevibacterium  lactofermentum中都可以自主复制并含有源于pHSG 339及 lacZ′的多克隆位点。

进而，为了证实gltBD基因已被表达，用电穿孔法把pVCGOGAT导入到缺少gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的 大肠杆菌PA 340菌株(E.Coli Genetic Stock Center(Yale University，U.S.A.))中。结果发现，含有pVCGOGAT的转化菌株不再对L-谷氨酸有需求，从而由此证实gltBD基因已被表达。

(4)把pVCGOGAT导入到棒状杆菌属AJ 12036细菌野生型菌株中并对其估计其培养的情况

通过电脉冲法(日本专利出版公开Hei 2-207791号)用质粒pVCGOGAT对棒状杆菌属AJ 12036细菌(Agric.Biol.Chem.，51，93-100(1987))的野生型菌株进行转化以获得转化菌株。把通过把质粒pVCGOGAT导入到AJ 12036野生型菌株而获得的转化菌株AJ12036/pVCGOGAT在如下的生物素限制条件中进行培养以生产L-谷氨酸。把通过培养于含有5mg/ml氯霉素的CM2B培养基平板而获得的AJ12036/pVCGOGAT菌株的细胞接种在培养基(80g葡萄糖、1gKH₂PO₄、0.4g MgSO₄·7H₂O，30g(NH₄)₂SO₄、0.01gFeSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·7H₂O、15ml大豆水解液、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、10mg氯霉素、50g  CaCO₃，加入到1升的纯水中，用KOH调到pH8.0)中并在31.5℃振荡培养，直至培养基中的糖耗尽为止。

把所得的培养物以5％的数量接种到不含有生物素及氯霉素的上述培养基(下文称“生物素限制培养基”)中并在31.5℃振荡培养，直至培养基中的糖耗尽为止。作为对照，用如上所述的同样方法培养通过把pVC 7用如上所述方法导入到AJ 12036菌株中而制备的细菌菌株。培养之后，用Biotech Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产)测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。结果示于表3中。

                        表3

细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)
		AJ 12036/pVC 7	33.6
AJ 12036/pVCGOGAT	37.0

                       工业实用性

根据本发明的方法，属于棒状杆菌属的能够生产L-谷氨酸的细菌菌株，当其GOGAT活性被增强时，其L-谷氨酸的生产能力即可被提高，从而使L-谷氨酸的生产变得更加廉价和有效。而且，获得源于 棒 状杆菌属细菌的gltBD基因并把其有效地用于 棒状杆菌属细菌的谷氨酸生产。

                              序列表

<110>AJINOMOTO CO.，INC.

<120>通过发酵生产L-谷氨酸的方法

<130>OP 778

<140>PCT/JP98/03535

<141>1998-08-07

<150>JP 9-216906

<151>1997-08-12

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>人造序列的描述：用于扩增大肠杆菌gltBD基因的引物

<400>1

agccttaaag ataggatcca ttttaatttc

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>人造序列的描述：用于扩增大肠杆菌gltBD基因的引物

<400>2

attcatggat ccctcgctta aacttccagc

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<221>未确定

<222>(3，9，12)

<223>n＝a或c或g或t

<220>

<223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentum

gltBD基因的引物

<400>3

ggngarggng gngarga

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<221>未确定

<222>(1，4，7)

<223>n＝a或c或g或t

<220>

<223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentum

gltBD基因的引物

<400>4

nccnccngtc atrtaytc

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentum

gltBD基因的引物

<400>5

aatccacgtg aagctagtgg cagaacaagg cg

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentum

gltBD基因的引物

<400>6

acgaatgaac aattcaccac tggttgcgcc

<210>7

<211>8734

<212>DNA

<213>Brevibacterium lactofermentum

<220>

<221>CDS

<222>(565)..(5094)

<220>

<221>CDS

<222>(5097)..(6614)

<400>7

gacgtcgcgg aggaatgctg ccacgccttc gatttttccg gaatcgtctt tcaggatcgt  60

gatggagaat tccagggaca ttttagatcc gtctgcacgc actcccggaa cattgagggg  120

ctcggagccg tagcgggttt caccggattc catgacgtga tcccatccgt cccagtgtgc  180

cttgcggtgt ttttcgggga tgatgatgtc gagggatttt ccgagtgctt cgccggccgt  240

gtatccaaag agtttctcgg agccgccgtt ccagagtctg attattccat cgcgggtggc  300

gtagatgatt gcttcttctg tttcggtgac aagtcgggct gcgatggtgt caaaatcgac  360

catttttatc ttctttcacg gggtggatag gcgaacatct tctaccatat cctgtgatgt  420

gtaacacagg agcgtaatct gacctcccgt tttcctatag attgatcgaa agtaaccctt  480

ttgttacttg cgttgcaggt agtgcgcctg attttcttat tatcgaacga ttgatagaaa  540

caggattaaa gtgaggtatc ccgc atg aaa cca caa gga ctc tac aac cct     591

                           Met Lys Pro Gln Gly Leu Tyr Asn Pro

                             1               5

gcg cat gaa cat gac gcc tgc ggt gtg gcg ttt att gcg gat atc cac    639

Ala His Glu His Asp Ala Cys Gly Val Ala Phe Ile Ala Asp Ile His

10                   15                  20                  25

ggt cga ccc agc cgc agc att gtt gat cgt gca ctt gag gcg ctt cgc    687

Gly Arg Pro Ser Arg Set Ile Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg

                 30                  35                  40

aac att gac cac cgt ggc gca gcc ggt gca gag aag aac act ggc gat    735

Asn Ile Asp His Arg Gly Ala Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp

             45                  50                  55

ggt gcg ggc atc ctc atg cag att ccg gac ggc ttt tat cgt gaa gta   783

Gly Ala Gly Ile Leu Met Gln Ile Pro Asp Gly Phe Tyr Arg Glu Val

         60                  65                  70

tct ggc att gag ctt cct gag gca ggg gag tat gcc act ggt att gcg    831

Ser Gly Ile Glu Leu Pro Glu Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Gly Ile Ala

     75                  80                  85

ttc ttg cct cgc ggt cgc atg gcg atg atg gat gct cag aag gaa att    879

Phe Leu Pro Arg Gly Arg Met Ala Met Met Asp Ala Gln Lys Glu Ile

 90                  95                 100                 105

gag cgc atc gca aag caa gaa ggt gcc gat gtg ctt ggt tgg cgc atg    927

Glu Arg Ile Ala Lys Gln Glu Gly Ala Asp Val Leu Gly Trp Arg Met

                110                 115                 120

gtt cct ttt gat tcc cgt gag ctg ggt tcc atg gct gag gag gcg atg    975

Val Pro Phe Asp Ser Arg Glu Leu Gly Ser Met Ala Glu Glu Ala Met

            125                 130                 135

cct agt ttc gcg cag att ttc ctt act gtg cct gga aaa tct ggt gaa    1023

Pro Ser Phe Ala Gln Ile Phe Leu Thr Val Pro Gly Lys Ser Gly Glu

        140                 145                 150

gat ctt gac cgt gtg atg ttc ttt atc cgt aag cgt tgt gag cgt gag    1071

Asp Leu Asp Arg Val Met Phe Phe Ile Arg Lys Arg Cys Glu Arg Glu

    155                 160                 165

ctg ggc acc acc aat ggt cgc gat acg gtg tat ttc ccg tcg cta tct    1119

Leu Gly Thr Thr Asn Gly Arg Asp Thr Val Tyr Phe Pro Ser Leu Ser

170                 175                 180                 185

tca cgc acc atc att tac aaa ggc atg ttg acc act ctg cag ctt gag    1167

Ser Arg Thr Ile Ile Tyr Lys Gly Met Leu Thr Thr Leu Gln Leu Glu

                190                 195                 200

ggc ttc ttt gag gat ctg ggt gat gct cgc ctg gag tcg gcc att gct    1215

Gly Phe Phe Glu Asp Leu Gly Asp Ala Arg Leu Glu Ser Ala Ile Ala

            205                 210                 215

att gtg cac tcg cgt ttc tcc acg aac act ttc cca agc tgg ccg ctg    1263

Ile Val His Ser Arg Phe Ser Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu

        220                 225                 230

gcg cac ccg tac cgt ttc gtt gcc cac aac ggt gag atc aac act gtg    1311

Ala His Pro Tyr Arg Phe Val Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Val

    235                 240                 245

cgt ggc aat gaa aac tgg atg cgc gcc cgc gag gcg ctt atc aaa aac    1359

Arg Gly Asn Glu Asn Trp Met Arg Ala Arg Glu Ala Leu Ile Lys Asn

250                 255                 260                 265

gac aag ctg ggc aat ttg agc agc gtg ctg cct atc tgc acc ccg gag    1407

Asp Lys Leu Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Pro Ile Cys Thr Pro Glu

                270                 275                 280

ggc tcg gat acc gcg cgt ttc gac gag gct ttg gag ctt ttg cac ctg    1455

Gly Ser Asp Thr Ala Arg Phe Asp Glu Ala Leu Glu Leu Leu His Leu

            285                 290                 295

ggc gga tac tca ctt ccg cat gct gtt gcg atg atg atc cct cag gcg    1503

Gly Gly Tyr Ser Leu Pro His Ala Val Ala Met Met Ile Pro Gln Ala

        300                 305                 310

tgg gaa cac aac aag acg ctg agc cct gag ctg cgt gat ttc tac gaa    1551

Trp Glu His Asn Lys Thr Leu Ser Pro Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Glu

    315                 320                 325

tac cac tct tgt ctg atg gag cca tgg gat ggt cct gca gcg ctg gca    1599

Tyr His Ser Cys Leu Met Glu Pro Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Ala

330                 335                 340                 345

ttt act gac ggt cgt ttt gtg ggt gcc gtg ctg gac cgt aat ggc ctg    1647

Phe Thr Asp Gly Arg Phe Val Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu

                350                 355                 360

cga cct ggg cga atc acc att act gat tcg ggt ttg gtt gtg atg gct    1695

Arg Pro Gly Arg Ile Thr Ile Thr Asp Ser Gly Leu Val Val Met Ala

            365                 370                 375

tct gaa tcg gga gtg ttg gac ttg agg gag gag agc gtc gta aag cgt    1743

Ser Glu Ser Gly Val Leu Asp Leu Arg Glu Glu Ser Val Val Lys Arg

        380                 385                 390

act cgc gta cag cct gga cgc atg ttc ctt gtt gac acg gcc gag ggt    1791

Thr Arg Val Gln Pro Gly Arg Met Phe Leu Val Asp Thr Ala Glu Gly

    395                 400                 405

cgc atc gtt gaa gac gag gaa atc aag cag aaa tta agc gaa gcg cag    1839

Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu Ile Lys Gln Lys Leu Ser Glu Ala Gln

410                     415             420                 425

cca tat ggt gag tgg att cgc gat aat ttt gtg cat ctg gat cgt ctg    1887

Pro Tyr Gly Glu Trp Ile Arg Asp Asn Phe Val His Leu Asp Arg Leu

                430                 435                 440

cct cag aca cgc tac aac tac atg gcg cac tct cgt gct gtg ttg cgt    1935

Pro Gln Thr Arg Tyr Asn Tyr Met Ala His Ser Arg Ala Val Leu Arg

            445                 450                 455

cag cgt gtt ttc gga atc act gaa gaa gat gtg gat ttg ttg ctg ctg    1983

Gln Arg Val Phe Gly Ile Thr Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Leu Leu

        460                 465                 470

ccg atg gcc cgc cag ggt gct gag gcg att ggt tcc atg ggt tcg gat    2031

Pro Met Ala Arg Gln Gly Ala Glu Ala Ile Gly Ser Met Gly Ser Asp

    475                 480                 485

acg cca att gcg gcg cta tcc cag cga cca cgc atg ctt tat gat ttc    2079

Thr Pro Ile Ala Ala Leu Ser Gln Arg Pro Arg Met Leu Tyr Asp Phe

490                 495                 500                 505

ttc gcg cag cgc ttt gct cag gtg aca aac cca ccg ttg gac tct atc    2127

Phe Ala Gln Arg Phe Ala Gln Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ser Ile

                510                 515                 520

cgc gaa aag cct gtg acc agc atg ttc act ttg ttg ggt gcg cag tct    2175

Arg Glu Lys Pro Val Thr Ser Met Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gln Ser

            525                 530                 535

gac gtg ctc aat ccg ggt cct gat gcg gcg cga cgt atc cgt ttg gaa    2223

Asp Val Leu Asn Pro Gly Pro Asp Ala Ala Arg Arg Ile Arg Leu Glu

        540                 545                 550

tcg ccg atc att gat aac cat gag ctg gcc acc ttg atc aat gcc aac    2271

Ser Pro Ile Ile Asp Asn His Glu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Ala Asn

    555                 560                 565

gcg cat ggt gag tgg gat tcc ttt ggt gct gct gta att tct ggt ttg    2319

Ala His Gly Glu Trp Asp Ser Phe Gly Ala Ala Val Ile Ser Gly Leu

570                575                  580                 585

tac cca gtg gct cac cat ggt gcc ggc atg aag gct gcg att gct cgt    2367

Tyr Pro Val Ala His His Gly Ala Gly Met Lys Ala Ala Ile Ala Arg

                590                 595                 600

gtg cgc cgc gag gtt tct gaa gca atc cgc aat ggc aag acg ttg atc    2415

Val Arg Arg Glu Val Ser Glu Ala Ile Arg Asn Gly Lys Thr Leu Ile

            605                 610                 615

gtg ctg tcg gat cgt gaa tct gat gag cgc atg gca cct atc cct gcg    2463

Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Asp Glu Arg Met Ala Pro Ile Pro Ala

        620                 625                 630

ctg ctg ctg act tcc gct gtg cat cag tac ttg gtg cag caa cgt acc    2511

Leu Leu Leu Thr Ser Ala Val His Gln Tyr Leu Val Gln Gln Arg Thr

    635                 640                 645

cgt acc cag tgc tcc ctg gtg gtg gaa tcc ggc gat gcc cgc gag gtt    2559

Arg Thr Gln Cys Ser Leu Val Val Glu Ser Gly Asp Ala Arg Glu Val

650                 655                 660                 665

cat cac ctg gcg atg ctc att ggt ttt ggt gcc gat gcg atc aac ccg    2607

His His Leu Ala Met Leu Ile Gly Phe Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro

                670                 675                 680

tac atg gca ttt gaa acc atc gat gag ctg cgc atg aag ggt cag ttg    2655

Tyr Met Ala Phe Glu Thr Ile Asp Glu Leu Arg Met Lys Gly Gln Leu

            685                 690                 695

ggt gat ctt tct ttg gat gag gca tcc cga aac tac atc aag gca gcc    2703

Gly Asp Leu Ser Leu Asp Glu Ala Ser Arg Asn Tyr Ile Lys Ala Ala

        700                 705                 710

acc act ggt gtg ctg aag gtg atg tcc aag atg ggc att gca acg gtg    2751

Thr Thr Gly Val Leu Lys Val Met Ser Lys Met Gly Ile Ala Thr Val

    715                 720                 725

tct tcg tac cgt ggc gcg cag ctt gct gat gtc acc ggt ctg cat cag    2799

Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Gln Leu Ala Asp Val Thr Gly Leu His Gln

730                 735                 740                 745

gat ctc ctg gac aac tac ttc ggt ggc att gct tca cca att tct ggt    2847

Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Phe Gly Gly Ile Ala Ser Pro Ile Ser Gly

                750                 755                 760

atc ggt ctg gat gag gtt gca gct gat gtg gaa gct cgt cac cgc agc    2895

Ile Gly Leu Asp Glu Val Ala Ala Asp Val Glu Ala Arg His Arg Ser

            765                 770                 775

gca ttt ttg cca cgc cca gaa gag cac gct cac cgc gaa ttg gat ttg    2943

Ala Phe Leu Pro Arg Pro Glu Glu His Ala His Arg Glu Leu Asp Leu

        780                 785                 790

ggt ggt gaa tac aag tgg cgc cgc gaa ggt gaa tat cac ctg ttc aac    2991

Gly Gly Glu Tyr Lys Trp Arg Arg Glu Gly Glu Tyr His Leu Phe Asn

    795                 800                 805

cca gaa acc atc ttc aag ctg cag cat gca act cgt tct ggc agc tac    3039

Pro Glu Thr Ile Phe Lys Leu Gln His Ala Thr Arg Ser Gly Ser Tyr

810                 815                 820                 825

gag att ttc aag gat tac acc cgc aag gtt gat gat caa tcc act cgc    3087

Glu Ile Phe Lys Asp Tyr Thr Arg Lys Val Asp Asp Gln Ser Thr Arg

                830                 835                 840

ttg ggt act att cgt gga ctg ttt gag ttc agc acg gat cgc aag cca    3135

Leu Gly Thr Ile Arg Gly Leu Phe Glu Phe Ser Thr Asp Arg Lys Pro

            845                 850                  855

att tcg gtg tct gag gtg gag ccg gtc agt gag atc gtg aag cgt ttc    3183

Ile Ser Val Ser Glu Val Glu Pro Val Ser Glu Ile Val Lys Arg Phe

        860                 865                 870

tcc act ggt gcg atg tct tat ggc tcg att tct gct gaa gcc cat gag    3231

Ser Thr Gly Ala Met Ser Tyr Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Glu

    875                 880                 885

gtc ttg gcc atc gcc atg aac cga ctg ggc ggt atg tcc aac tcc ggc    3279

Val Leu Ala Ile Ala Met Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Asn Ser Gly

890                 895             900                     905

gaa ggt ggc gag gac gcc cgc cga ttc gat gtg gaa ccc aac ggt gac    3327

Glu Gly Gly Glu Asp Ala Arg Arg Phe Asp Val Glu Pro Asn Gly Asp

               910                  915                 920

tgg aag cgc tct gcc att aag cag gtg gcc tcg gga cgt ttc ggc gtg    3375

Trp Lys Arg Ser Ala Ile Lys Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val

            925                 930                 935

acc agc cac tac ttg aac aac tgc acc gat att cag atc aag atg gca    3423

Thr Ser His Tyr Leu Asn Asn Cys Thr Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala

        940                 945                 950

cag ggc gca aag ccc ggt gaa ggt ggc cag ctg cca cca aac aag gtg    3471

Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val

    955                 960                 965

tac cca tgg gtt gca gaa gtc cgc atc acc acc cca ggc gtt ggt ctg    3519

Tyr Pro Trp Val Ala Glu Val Arg Ile Thr Thr Pro Gly Val Gly Leu

970                 975                 980                 985

att tcc cct cca cca cac cac gat att tac tcc att gag gat ctg gct    3567

Ile Ser Pro Pro Pro His His Asp Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala

                990                 995                 1000

cag ctg atc cac gac ctg aag aac gct aac cca cgc gca cga atc cac    3615

Gln Leu Ile His Asp Leu Lys Asn Ala Asn Pro Arg Ala Arg Ile His

            1005                1010                1015

gtg aag cta gtg gca gaa caa ggc gtg ggc acc gtt gcc gca ggt gtg    3663

Val Lys Leu Val Ala Glu Gln Gly Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Val

        1020                1025                1030

tcc aaa gca cac gct gat gtg gtg ctt att tcc ggc cac gac ggc gga    3711

Ser Lys Ala His Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Gly His Asp Gly Gly

    1035                1040                1045

act ggc gca tct cct ttg acc tcc ctg aag cat gcc ggt ggt cca tgg    3759

Thr Gly Ala Ser Pro Leu Thr Ser Leu Lys His Ala Gly Gly Pro Trp

1050                1055                1060                1065

gag ttg ggc ttg gct gaa acc cag caa acg ttg ctg ctc aac ggc ctg    3807

Glu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Gln Gln Thr Leu Leu Leu Asn Gly Leu

                1070                1075                1080

cgt gat cgt att cgc gtg cag tgc gat ggt cag ctg aaa act ggc cga    3855

Arg Asp Arg Ile Arg Val Gln Cys Asp Gly Gln Leu Lys Thr Gly Arg

            1085                1090                1095

gac gta gtt atc gca gct ctg ctc ggt gcc gaa gaa ttc ggt ttc gcc    3903

Asp Val Val Ile Ala Ala Leu Leu Gly Ala Glu Glu Phe Gly Phe Ala

        1100                1105                1110

acc gca ccg ctg gtg gtt gaa ggc tgc atc atg atg cgc gtc tgc cac    3951

Thr Ala Pro Leu Val Val Glu Gly Cys Ile Met Met Arg Val Cys His

    1115                1120                1125

ctg gac acc tgc ccg gtg ggt atc gct acc cag aac ccg gat ttg cgt    3999

Leu Asp Thr Cys Pro Val Gly Ile Ala Thr Gln Asn Pro Asp Leu Arg

1130                1135                1140                1145

tcc aag ttc acc ggc aag gct gaa cac gtg gtc aac ttc ttc acc ttc    4047

Ser LVs Phe Thr Gly Lys Ala Glu His Val Val Asn Phe Phe Thr Phe

                1150                1155                1160

atc gcc cag gaa gtc cgt gag tac ttg gca cag ctt ggt ttc cgc tct    4095

Ile Ala Gln Glu Val Arg Glu Tyr Leu Ala Gln Leu Gly Phe Arg Ser

            1165                1170                1l75

att gat gaa gcc gta gga caa gcc cag gtg ctg cgt aag cgt tcc gga    4143

Ile Asp Glu Ala Val Gly Gln Ala Gln Val Leu Arg Lys Arg Ser Gly

        1180                1185                1190

atc cca gct gat tcc cgc gca gca cac ctg gat ttg agc cca att ttc    4191

Ile Pro Ala Asp Ser Arg Ala Ala His Leu Asp Leu Ser Pro Ile Phe

    1195                1200                1205

cat cgc cca gaa act cca cac ttc cca act cag gat gtg cgt tgc acc    4239

His Arg Pro Glu Thr Pro His Phe Pro Thr Gln Asp Val Arg Cys Thr

1210                1215                1220                1225

aag acc cag gaa cac agc cta gaa aaa gcc ctg gac aac gca ttt att    4287

Lys Thr Gln Glu His Ser Leu Glu Lys Ala Leu Asp Asn Ala Phe Ile

                1230                1235                1240

gat aag gct tcg gac aca atc acc cgt gcc gca gcg ggt gtg gaa acc    4335

Asp Lys Ala Ser Asp Thr Ile Thr Arg Ala Ala Ala Gly Val Glu Thr

            1245                1250                1255

agc att gtt att gat agc tcc atc agc aac gtc aac cgt tca gtt ggc    4383

Ser Ile Val Ile Asp Ser Ser Ile Ser Asn Val Asn Arg Ser Val Gly

        1260                1265                1270

acg atg ctg ggt tct gca gtc agc cgc gtg gct ggt gcc caa ggt ttg    4431

Thr Met Leu Gly Ser Ala Val Ser Arg Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu

    1275                1280                1285

cca gac ggc acc atc acc ttg aat ctt caa ggc tgc gcc ggt aac tcc    4479

Pro Asp Gly Thr Ile Thr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Ala Gly Asn Ser

1290                1295                1300                1305

ttt ggc gcg ttc atc cca cga ggc atc acc atc aac ctc acc ggc gat    4527

Phe Gly Ala Phe Ile Pro Arg Gly Ile Thr Ile Asn Leu Thr Gly Asp

                1310                1315                1320

gcc aat gac ttt gtg ggc aag gga tta tct ggc gga aag att gtg atc    4575

Ala Asn Asp Phe Val Gly Lys Gly Leu Ser Gly Gly Lys Ile Val Ile

            1325                1330                1335

aag cct tcc gct cag gct ccg aag cag ctg aag aac aat cca aat atc    4623

Lys Pro Ser Ala Gln Ala Pro Lys Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asn Ile

        1340                1345                1350

att gcc gga aac gtg ctt gga tac ggc gca acc agt ggt gaa ttg ttc    4671

Ile Ala Gly Asn Val Leu Gly Tyr Gly Ala Thr Ser Gly Glu Leu Phe

    1355                1360                1365

att cgt ggc cag gtc ggc gaa cgt ttc tgc gtc cgt aac tct ggc gcc    4719

Ile Arg Gly Gln Val Gly Glu Arg Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala

1370                1375                1380               1385

acc gca gtg gtt gaa ggt atc gga aac cac ggt tgt gag tac atg act    4767

Thr Ala Val Val Glu Gly Ile Gly Asn His Gly Cys Glu Tyr Met Thr

                1390                1395                1400

ggc ggc cga gtc ctg gtt ttg ggc ccg gtt ggt gag aac ttt ggt gcc    4815

Gly Gly Arg Val Leu Val Leu Gly Pro Val Gly Glu Asn Phe Gly Ala

            1405                1410                1415

ggc atg tct ggt ggc att gca tac ctg gct aat tcc ccg gac cta aac    4863

Gly Met Ser Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ser Pro Asp Leu Asn

        1420                1425                1430

cag aag atc aat ggc gaa ttg gtg gat gtt gtt cca ctg agc gct gac    4911

Gln Lys Ile Asn Gly Glu Leu Val Asp Val Val Pro Leu Ser Ala Asp

    1435                1440                1445

gat ctg acg tgg gct gat gag ctc att gct cgc cac cgc gaa ctc acc    4959

Asp Leu Thr Trp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Arg His Arg Glu Leu Thr

1450                1455                1460                1465

gga tcc gag acc aag ctg cgt gca caa gat ttg gtg aaa atc atg ccg    5007

Gly Ser Glu Thr Lys Leu Arg Ala Gln Asp Leu Val Lys Ile Met Pro

                1470                1475                1480

cgc gat ttc caa aaa gta ctc aac atc atc gaa acg gcc cac gct gag    5055

Arg Asp Phe Gln Lys Val Leu Asn Ile Ile Glu Thr Ala His Ala Glu

            1485                1490                1495

ggc caa gac cca gca atc aag atc atg gag gca gtg agc ta atg gcc     5102

Gly Gln Asp Pro Ala Ile Lys Ile Met Glu Ala Val Ser    Met Ala

1500                1505                        1510     1

gac cca caa gga ttc atc aaa tac tcc cga cgc gag cct gca cac cgc    5150

Asp Pro Gln Gly Phe Ile Lys Tyr Ser Arg Arg Glu Pro Ala His Arg

          5                  10                  15

ccg gtc ccg ctg cgc ctc atg gac tac tcc gag gtc tac gaa aag gca    5198

Pro Val Pro Leu Arg Leu Met Asp Tyr Ser Glu Val Tyr Glu Lys Ala

     20                  25                  30

ccg gca ggt cag atc gag gaa cag gct gcc cgc tgc atg gat tgc ggt    5246

Pro Ala Gly Gln Ile Glu Glu Gln Ala Ala Arg Cys Met Asp Cys Gly

 35                  40                  45                  50

gtc ccg ttc tgc cac gaa ggc tgc cca ctg ggc aac atc atc cct gag    5294

Val Pro Phe Cys His Glu Gly Cys Pro Leu Gly Asn Ile Ile Pro Glu

                 55                  60                  65

tgg aat gat ctg gta cgc caa ggt cgg tgg aag gaa gcc tac gat cgc    5342

Trp Asn Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Trp Lys Glu Ala Tyr Asp Arg

             70                  75                  80

ctg cac gcg acc aac aat ttc ccc gag ttc acc ggc cgt ttg tgc ccc    5390

Leu His Ala Thr Asn Asn Phe Pro Glu Phe Thr Gly Arg Leu Cys Pro

         85                  90                  95

gca ccc tgc gaa ggc gcc tgc gtg ctc ggc atc aac gat gat tct gtc    5438

Ala Pro Cys Glu Gly Ala Cys Val Leu Gly Ile Asn Asp Asp Ser Val

    100                 105                 110

acc atc aaa aac gtt gag ctg gaa atc gtc gaa aaa gca ttc cgc gaa    5486

Thr Ile Lys Asn Val Glu Leu Glu Ile Val Glu Lys Ala Phe Arg Glu

115                         120         125                 130

ggc tgg gtt cag cct gtc gtc gca tcc atg tcc acc ggc ctg tcc gta    5534

Gly Trp Val Gln Pro Val Val Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu Ser Val

                135                 140                 145

gcc gtc gtc ggc tcc ggt ccc gct ggc ctt gcc gcc gcg cag cag ctc    5582

Ala Val Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln Gln Leu

            150                 155                 160

acc cgc gca ggt cac agc gtg acc gtc ttc gaa cgc gac gac cgc ctc    5630

Thr Arg Ala Gly His Ser Val Thr Val Phe Glu Arg Asp Asp Arg Leu

        165                 170                 175

ggc ggc ctc atg cgc tac ggc gtg cca gaa tac aaa atg gaa aac cgc    5678

Gly Gly Leu Met Arg Tyr Gly Val Pro Glu Tyr Lys Met Glu Asn Arg

    180                 185                 190

tgg atc gac cgc cgc atc gag caa atg gaa gca gag ggc aca act ttc    5726

Trp Ile Asp Arg Arg Ile Glu Gln Met Glu Ala Glu Gly Thr Thr Phe

195                 200                 205                 210

cag gta ggc acc tcg cca cgc gcc gct gaa cta gcg ctt ttc gac gcg    5774

Gln Val Gly Thr Ser Pro Arg Ala Ala Glu Leu Ala Leu Phe Asp Ala

                215                 220                 225

atc ctc ctc gca acc ggc acc cca gtg gcc cgc gaa ctc tca gtt cca    5822

Ile Leu Leu Ala Thr Gly Thr Pro Val Ala Arg Glu Leu Ser Val Pro

            230                 235                 240

ggc cac gat ctc aac ggc atc cat gcg gca atg gat tac ctc acc gcc    5870

Gly His Asp Leu Asn Gly Ile His Ala Ala Met Asp Tyr Leu Thr Ala

        245                 250                 255

caa aac cgc atc aat gaa ggc gac ggt gaa gtc tct cca atc aac gcc    5918

Gln Asn Arg Ile Asn Glu Gly Asp Gly Glu Val Ser Pro Ile Asn Ala

    260                 265                 270

aaa ggc aag aaa gtt gtc atc atc ggt ggc ggc gac acc ggc acc gac    5966

Lys Gly Lys Lys Val Val Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Gly Thr Asp

275                 280                 285                290

tgc ttt ggt aca gcg ctg cgc caa gga gcg gaa tca gtc acc caa ttt    6014

Cys Phe Gly Thr Ala Leu Arg Gln Gly Ala Glu Ser Val Thr Gln Phe

                295                 300                 305

gat atc cgc ccc cgc gct cct ttc cag cgc gcc gat tcc acc cca tgg    6062

Asp Ile Arg Pro Arg Ala Pro Phe Gln Arg Ala Asp Ser Thr Pro Trp

            310                 315                 320

ccg atg tac ccc aac ctc ttc cgc acc gca acg gct cac gaa gaa ggc    6110

Pro Met Tyr Pro Asn Leu Phe Arg Thr Ala Thr Ala His Glu Glu Gly

        325                 330                 335

gaa tac atc atc act ggc gat gaa tca gcc gat gaa atc gca gcc ctg    6158

Glu Tyr Ile Ile Thr Gly Asp Glu Ser Ala Asp Glu rle Ala Ala Leu

    340                 345                 350

ggc ctc gcc gaa cgc gcc gca ggc tcc acg ctt ggt gaa cgt aaa ttt    6206

Gly Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gly Ser Thr Leu Gly Glu Arg Lys Phe

355                 360                 365                 370

gct gtc aac acc gtg gaa ttc cac ggc aac aac ggc cac gtc acc gga    6254

Ala Val Asn Thr Val Glu Phe His Gly Asn Asn Gly His Val Thr Gly

                375                 380                 385

ctc acc ggc aac caa atc cga gtt gtc aac ggc aaa cgt gaa cca atc    6302

Leu Thr Gly Asn Gln Ile Arg Val Val Asn Gly Lys Arg Glu Pro Ile

            390                 395                 400

gaa ggc acc gaa ttt ccc ttc gaa gca gac ctc gtt ctc gtc gca ctc    6350

Glu Gly Thr Glu Phe Pro Phe Glu Ala Asp Leu Val Leu Val Ala Leu

        405                 410                 415

gga ttc acc ggc gca gaa caa ggc gga ttg gca cac gaa cta ggc gta    6398

Gly Phe Thr Gly Ala Glu Gln Gly Gly Leu Ala His Glu Leu Gly Val

    420                 425                 430

ggt ttc gac gac cga gga cgc atc ctc cgc gat tcc gaa tac cgc agc    6446

Gly Phe Asp Asp Arg Gly Arg Ile Leu Arg Asp Ser Glu Tyr Arg Ser

435                 440                 445                 450

ccc acc aac tcc cgc gtt tac atc gca ggc gac aac ggc cgt ggc caa    6494

Pro Thr Asn Ser Arg Val Tyr Ile Ala Gly Asp Asn Gly Arg Gly Gln

                455                 460                 465

tcc ctg atc gtg tgg gca atc gcc gaa ggc cgc gca tgc gcc gca gct       6542

Ser Leu Ile Val Trp Ala Ile Ala Glu Gly Arg Ala Cys Ala Ala Ala

            470                 475                 480

atc gac gcc gac ctc atg ggt gaa act gca ctt cca gta gca gtt gca       6590

Ile Asp Ala Asp Leu Met Gly Glu Thr Ala Leu Pro Val Ala Val Ala

        485                 490                 495

cca cag gac gtg ccg ctg gct gtc taggaggatt ggcgccaaga accactcgaa      6644

Pro Gln Asp Val Pro Leu Ala Val

    500                 505

actgcaattt cgagtggttt tgcgtattca gaatttaagg aaatgcttca aaactatcca     6704

tatttttgaa gcgtactaag gccgagtttc aattagttgc cgatgctcca cgtatgcaca     6764

ggttggccac tttcttgatt ctgtaaatac tgttgcaaca ttgctgcaag acctgctttt     6824

cgagcatcgg aacccggcat gcttccgtgt gcttccagct tgttgaggct acgcaactgc     6884

caggtggcac cgttttggcg ggacttcgcg cgttcggtga tgatgccgag gtattggtcg     6944

ataaggtctt tatttacttc aagtcgttcc agtccgattc tggcttgagg gatgaggtgc     7004

tcttggacca gattcgcaac gttgacttgt ccgagggttg gccaggtcat gcgggcgaac     7064agccctgaac gtgcaccgga ttggaagttc ttttccgcat cagggaatag gagacgtgac     7124

cagacagggc ggttttcctc ggcaagatat ttgaccaaac cgtaatagaa agcggcatcg     7184

gcagtgatgt cgatgggggt gggacctgca ggtaggagac ggttttccag gcgcaggtgg     7244

gagcgctctt cgcccggtga gtaaatgggt cggttccagc gccacaccgt tccgttgtgc     7304

aggttgaggt agtggagtgc gggggatttt cccttcatca ttggtgtgcc agacagtgcg     7364

cgggattctg cgatgagagg ggagaagtag cgtacgtttt cttcgaaaag atcaaaaaca     7424

ctggtgatcc atcgttcgcc gaaccatact ctggggcgga ctccttgatt cacaagttca     7484

ggagtacgcg tatcgatggc ttgttgaaac actggaatgc ggctttcatg ccacacccga     7544

cggcctagga aaagtgggga gttggcggaa agagctgctt gaacaccagc tattgcttgc     7604

gacgcattcc acgctgcagc aaacttattg ggcgctaatt gcaggtgcaa ctgaatagac     7664

gtgcaagttg attcgggggc gagatcagtg aaatcgtgga tgatttgttc acggtcggcg     7724

atgttgatgt gcactaactc gccacgcgat tccatcaccg cattgctcag cgcacggtag     7784

cggttttctt gggtcatcca tgccggatct tcaagaaatt ccggagtgat ggtgggcagc     7844

gtgccgatca tcgccacgtt cacattctcc gatgtggcgg ccgcgcgcac gcgacctaga     7904

cgcgaggtga tgccttgctc gaggcgtcgt aaagcatcgc ctttaacgga tagtggcggg     7964

tggttcattt caacattaaa gttaccgatc tccgactggt actcatcgtc taaatgggaa     8024

agcaccgcgt ggcctgccaa agcaggttgc atatgcttat ccacgaggtt gagttccaac     8084

tcgaggccga tggaaccctg atcctcaaaa tcggaatgct gcaaatgccg atcaaaaatc     8144

tcaagatctt ccatgagcag ctggcgataa cgcgtgcgct gctgcggagt gtacctgtca     8204

gtacttactg attcgcccat aacttagagc aaaccacaaa aaatggtgct gggtaaggat     8264

accaatcagg aattttccac gcgataaacc tgagccacca attgggtacg cgacctgact     8324

ttgaaaatat ccaacaattg ggacactgtc ttcttcactg tcgctatcgt gaggcctgtg     8384

gctttggcaa tttggcggtt ggaattgccc tcgcaaacaa gtttcatcac tcgctgctga     8444

gtcgccgtta attgttcagg aatctgcgtg gttctgggaa gcatggcacg cagacgagtc     8504

atggccaacg gggaaagcgt ggtgccaccg gacacagcaa tgcggatgat atcgcgaatg     8564

tcctgggcac ggtcgctctt gacaatgtat gcagctgcac cattggagag catttcaacc     8624

agagtttcat ctgtagaaaa agcagtcata gtgacaaaag ctggtggctc ggaaagtttg     8684

cgtacctcag tgagcagctg cctgccgtcc atgtgaggca tttcgacgtc                8734

<210>8

<211>1510

<212>PRT

<213>Brevibacterium lactofermentum

<400>8

Met Lys Pro Gln Gly Leu Tyr Asn Pro Ala His Glu His Asp Ala Cys

  1               5                  10                  15

Gly Val Ala Phe Ile Ala Asp Ile His Gly Arg Pro Ser Arg Ser Ile

             20                  25                  30

Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ile Asp His Arg Gly Ala

         35                  40                  45

Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp Gly Ala Gly Ile Leu Met Gln

     50                  55                  60

Ile Pro Asp Gly Phe Tyr Arg Glu Val Ser Gly Ile Glu Leu Pro Glu

 65                  70                  75                  80

Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Gly Ile Ala Phe Leu Pro Arg Gly Arg Met

                 85                  90                  95

Ala Met Met Asp Ala Gln Lys Glu Ile Glu Arg Ile Ala Lys Gln Glu

            100                 105                 110

Gly Ala Asp Val Leu Gly Trp Arg Met Val Pro Phe Asp Ser Arg Glu

        115                 120                 125

Leu Gly Ser Met Ala Glu Glu Ala Met Pro Ser Phe Ala Gln Ile Phe

    130                 135                 140

Leu Thr Val Pro Gly Lys Ser Gly Glu Asp Leu Asp Arg Val Met Phe

145                 150                  155                160

Phe Ile Arg Lys Arg Cys Glu Arg Glu Leu Gly Thr Thr Asn Gly Arg

                165                 170                 175

Asp Thr Val Tyr Phe Pro Ser Leu Ser Ser Arg Thr Ile Ile Tyr Lys

            180                 185                 190

Gly Met Leu Thr Thr Leu Gln Leu Glu Gly Phe Phe Glu Asp Leu Gly

        195                 200                 205

Asp Ala Arg Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ile Val His Ser Arg Phe Ser

    210                 215                 220

Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu Ala His Pro Tyr Arg Phe Val

225                 230                 235                 240

Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Val Arg Gly Asn Glu Asn Trp Met

                245                 250                 255

Arg Ala Arg Glu Ala Leu Ile Lys Asn Asp Lys Leu Gly Asn Leu Ser

            260                 265                 270

Ser Val Leu Pro Ile Cys Thr Pro Glu Gly Ser Asp Thr Ala Arg Phe

        275                 280                 285

Asp Glu Ala Leu Glu Leu Leu His Leu Gly Gly Tyr Ser Leu Pro His

    290                 295                 300

Ala Val Ala Met Met Ile Pro Gln Ala Trp Glu His Asn Lys Thr Leu

305                 310                 315                 320

Ser Pro Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Glu Tyr His Ser Cys Leu Met Glu

                325                 330                 335

Pro Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Ala Phe Thr Asp Gly Arg Phe Val

            340                 345                 350

Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu Arg Pro Gly Arg Ile Thr Ile

        355                 360                 365

Thr Asp Ser Gly Leu Val Val Met Ala Ser Glu Ser Gly Val Leu Asp

    370                 375                 380

Leu Arg Glu Glu Ser Val Val Lys Arg Thr Arg Val Gln Pro Gly Arg

385                 390                 395                 400

Met Phe Leu Val Asp Thr Ala Glu Gly Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu

                405                 410                 415

Ile Lys Gln Lys Leu Ser Glu Ala Gln Pro Tyr Gly Glu Trp Ile Arg

            420                 425                 430

Asp Asn Phe Val His Leu Asp Arg Leu Pro Gln Thr Arg Tyr Asn Tyr

        435                 440                 445

Met Ala His Ser Arg Ala Val Leu Arg Gln Arg Val Phe Gly Ile Thr

    450                 455                 460

Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Leu Leu Pro Met Ala Arg Gln Gly Ala

465                 470                 475                 480

Glu Ala Ile Gly Ser Met Gly Ser Asp Thr Pro Ile Ala Ala Leu Ser

                485                 490                 495

Gln Arg Pro Arg Met Leu Tyr Asp Phe Phe Ala Gln Arg Phe Ala Gln

            500                 505                 510

Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ser Ile Arg Glu Lys Pro Val Thr Ser

        515                 520                 525

Met Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gln Ser Asp Val Leu Asn Pro Gly Pro

    530                 535                 540

Asp Ala Ala Arg Arg Ile Arg Leu Glu Ser Pro Ile Ile Asp Asn His

545                 550                 555                 560

Glu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Ala Asn Ala His Gly Glu Trp Asp Ser

                565                 570                 575

Phe Gly Ala Ala Val Ile Ser Gly Leu Tyr Pro Val Ala His His Gly

            580                 585                 590

Ala Gly Met Lys Ala Ala Ile Ala Arg Val Arg Arg Glu Val Ser Glu

        595                 600                 605

Ala Ile Arg Asn Gly Lys Thr Leu Ile Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser

    610                 615                 620

Asp Glu Arg Met Ala Pro Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ser Ala Val

625                 630                 635                 640

His Gln Tyr Leu Val Gln Gln Arg Thr Arg Thr Gln Cys Ser Leu Val

                645                 650                 655

Val Glu Ser Gly Asp Ala Arg Glu Val His His Leu Ala Met Leu Ile

            660                 665                 670

Gly Phe Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro Tyr Met Ala Phe Glu Thr Ile

        675                 680                 685

Asp Glu Leu Arg Met Lys Gly Gln Leu Gly Asp Leu Ser Leu Asp Glu

    690                 695                 700

Ala Ser Arg Asn Tyr Ile Lys Ala Ala Thr Thr Gly Val Leu Lys Val

705                 710                 715                 720

Met Ser Lys Met Gly Ile Ala Thr Val Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Gln

                725                 730                 735

Leu Ala Asp Val Thr Gly Leu His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Phe

            740                 745                 750

Gly Gly Ile Ala Ser Pro Ile Ser Gly Ile Gly Leu Asp Glu Val Ala

        755                 760                 765

Ala Asp Val Glu Ala Arg His Arg Ser Ala Phe Leu Pro Arg Pro Glu

    770                 775                 780

Glu His Ala His Arg Glu Leu Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Lys Trp Arg

785                 790                 795                 800

Arg Glu Gly Glu Tyr His Leu Phe Asn Pro Glu Thr Ile Phe Lys Leu

                805                 810                 815

Gln His Ala Thr Arg Ser Gly Ser Tyr Glu Ile Phe Lys Asp Tyr Thr

            820                 825                 830

Arg Lys Val Asp Asp Gln Ser Thr Arg Leu Gly Thr Ile Arg Gly Leu

        835                 840                 845

Phe Glu Phe Ser Thr Asp Arg Lys Pro Ile Ser Val Ser Glu Val Glu

    850                 855                 860

Pro Val Ser Glu Ile Val Lys Arg Phe Ser Thr Gly Ala Met Ser Tyr

865                 870                 875                 880

Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Glu Val Leu Ala Ile Ala Met Asn

                885                 890                 895

Arg Leu Gly Gly Met Ser Asn Ser Gly Glu Gly Gly Glu Asp Ala Arg

            900                 905                 910

Arg Phe Asp Val Glu Pro Asn Gly Asp Trp Lys Arg Ser Ala Ile Lys

        915                 920                 925

Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val Thr Ser His Tyr Leu Asn Asn

    930                 935                 940

Cys Thr Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu

945                 950                 955                 960

Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val Tyr Pro Trp Val Ala Glu Val

                965                 970                 975

Arg Ile Thr Thr Pro Gly Val Gly Leu Ile Ser Pro Pro Pro His His

            980                 985                 990

Asp Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala Gln Leu Ile His Asp Leu Lys

        995                 1000                1005

Asn Ala Asn Pro Arg Ala Arg Ile His Val Lys Leu Val Ala Glu Gln

   1010                 1015                1020

Gly Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Val Ser Lys Ala His Ala Asp Val

1025                1030                1035                1040

Val Leu Ile Ser Gly His Asp Gly Gly Thr Gly Ala Ser Pro Leu Thr

                1045                1050                1055

Ser Leu Lys His Ala Gly Gly Pro Trp Glu Leu Gly Leu Ala Glu Thr

            1060                1065                1070

Gln Gln Thr Leu Leu Leu Asn Gly Leu Arg Asp Arg Ile Arg Val Gln

        1075                1080                1085

Cys Asp Gly Gln Leu Lys Thr Gly Arg Asp Val Val Ile Ala Ala Leu

    1090                1095                1100

Leu Gly Ala Glu Glu Phe Gly Phe Ala Thr Ala Pro Leu Val Val Glu

1105                1110                1115                1120

Gly Cys Ile Met Met Arg Val Cys His Leu Asp Thr Cys Pro Val Gly

                1125                1130                1135

Ile Ala Thr Gln Asn Pro Asp Leu Arg Ser Lys Phe Thr Gly Lys Ala

            1140                1145                1150

Glu His Val Val Asn Phe Phe Thr Phe Ile Ala Gln Glu Val Arg Glu

        1155                1160                1165

Tyr Leu Ala Gln Leu Gly Phe Arg Ser Ile Asp Glu Ala Val Gly Gln

    1170                1175                1180

Ala Gln Val Leu Arg Lys Arg Ser Gly Ile Pro Ala Asp Ser Arg Ala

1185                1190                1195                1200

Ala His Leu Asp Leu Ser Pro Ile Phe His Arg Pro Glu Thr Pro His

                1205                1210                1215

Phe Pro Thr Gln Asp Val Arg Cys Thr Lys Thr Gln Glu His Ser Leu

            1220                1225                1230

Glu Lys Ala Leu Asp Asn Ala Phe Ile Asp Lys Ala Ser Asp Thr Ile

        1235                1240                1245

Thr Arg Ala Ala Ala Gly Val Glu Thr Ser Ile Val Ile Asp Ser Ser

    1250                1255                1260

Ile Ser Asn Val Asn Arg Ser Val Gly Thr Met Leu Gly Ser Ala Val

1265                1270                1275                1280

Ser Arg Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu Pro Asp Gly Thr Ile Thr Leu

                1285                1290                1295

A5n Leu Gln Gly Cys Ala Gly Asn Ser Phe Gly Ala Phe Ile Pro Arg

            1300                1305                1310

GlyIle Thr Ile Asn Leu Thr Gly Asp Ala Asn Asp Phe Val Gly Lys

       13l5                1320                1325

Gly Leu Ser Gly Gly Lys Ile Val Ile Lys Pro Ser Ala Gln Ala Pro

    1330                1335                1340

Lys Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Leu Gly

1345                1350                1355                1360

Tyr Gly Ala Thr Ser Gly Glu Leu Phe Ile Arg Gly Gln Val Gly Glu

            1365                    1370                1375

Arg Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala Thr Ala Val Val Glu Gly Ile

        1380                    1385                1390

Gly Asn His Gly Cys Glu Tyr Met Thr Gly Gly Arg Val Leu Val Leu

        1395                1400                1405

Gly Pro Val Gly Glu Asn Phe Gly Ala Gly Met Ser Gly Gly Ile Ala

    1410                1415                1420

Tyr Leu Ala Asn Ser Pro Asp Leu Asn Gln Lys Ile Asn Gly Glu Leu

1425                1430                1435                1440

Val Asp Val Val Pro Leu Ser Ala Asp Asp Leu Thr Trp Ala Asp Glu

                1445                1450                1455

Leu Ile Ala Arg His Arg Glu Leu Thr Gly Ser Glu Thr Lys Leu Arg

            1460                1465                1470

Ala Gln Asp Leu Val Lys Ile Met Pro Arg Asp phe Gln Lys Val Leu

        1475                1480                1485

Asn Ile Ile Glu Thr Ala His Ala Glu Gly Gln Asp Pro Ala Ile Lys

    1490                1495                1500

Ile Met Glu Ala Val Ser

1505                1510

<210>9

<211>506

<212>PRT

<213>Brevibacterium lactofermentum

<400>9

Met Ala Asp Pro Gln Gly Phe Ile Lys Tyr Ser Arg Arg Glu Pro Ala

  1               5                  10                  15

His Arg Pro Val Pro Leu Arg Leu Met Asp Tyr Ser Glu Val Tyr Glu

             20                  25                  30

Lys Ala Pro Ala Gly Gln Ile Glu Glu Gln Ala Ala Arg Cys Met Asp

         35                  40                  45

Cys Gly Val Pro Phe Cys His Glu Gly Cys Pro Leu Gly Asn Ile Ile

    50                   55                  60

Pro Glu Trp Asn Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Trp Lys Glu Ala Tyr

 65                  70                  75                  80

Asp Arg Leu His Ala Thr Asn Asn Phe Pro Glu Phe Thr Gly Arg Leu

                 85                  90                  95

Cys Pro Ala Pro Cys Glu Gly Ala Cys Val Leu Gly Ile Asn Asp Asp

            100                 105                 110

Ser Val Thr Ile Lys Asn Val Glu Leu Glu Ile Val Glu Lys Ala Phe

        115                 120                 125

Arg Glu Gly Trp Val Gln Pro Val Val Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu

    130                 135                 140

Ser Val Ala Val Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln

145                 150                 155                 160

Gln Leu Thr Arg Ala Gly His Ser Val Thr Val Phe Glu Arg Asp Asp

                165                 170                 175

Arg Leu Gly Gly Leu Met Arg Tyr Gly Val Pro Glu Tyr Lys Met Glu

            180                 185                 190

Asn Arg Trp Ile Asp Arg Arg Ile Glu Gln Met Glu Ala Glu Gly Thr

        195                 200                 205

Thr Phe Gln Val Gly Thr Ser Pro Arg Ala Ala Glu Leu Ala Leu Phe

    210                 215                 220

Asp Ala Ile Leu Leu Ala Thr Gly Thr Pro Val Ala Arg Glu Leu Ser

225                 230                 235                 240

Val Pro Gly His Asp Leu Asn Gly Ile His Ala Ala Met Asp Tyr Leu

                245                 250                 255

Thr Ala Gln Asn Arg Ile Asn Glu Gly Asp Gly Glu Val Ser Pro Ile

            260                 265                 270

Asn Ala Lys Gly Lys Lys Val Val Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Gly

        275                 280                 285

Thr Asp Cys Phe Gly Thr Ala Leu Arg Gln Gly Ala Glu Ser Val Thr

    290                 295                 300

Gln Phe Asp Ile Arg Pro Arg Ala Pro Phe Gln Arg Ala Asp Ser Thr

305                 310                 315                 320

Pro Trp Pro Met Tyr Pro Asn Leu Phe Arg Thr Ala Thr Ala His Glu

                325                 330                 335

Glu Gly Glu Tyr Ile Ile Thr Gly Asp Glu Ser Ala Asp Glu Ile Ala

            340                 345                 350

Ala Leu Gly Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gly Ser Thr Leu Gly Glu Arg

        355                 360                 365

Lys Phe Ala Val Asn Thr Val Glu Phe His Gly Asn Asn Gly His Val

    370                 375                 380

Thr Gly Leu Thr Gly Asn Gln Ile Arg Val Val Asn Gly Lys Arg Glu

385                 390                 395                 400

Pro Ile Glu Gly Thr Glu Phe Pro Phe Glu Ala Asp Leu Val Leu Val

                405                 410                 415

Ala Leu Gly Phe Thr Gly Ala Glu Gln Gly Gly Leu Ala His Glu Leu

            420                 425                 430

Gly Val Gly Phe Asp Asp Arg Gly Arg Ile Leu Arg Asp Ser Glu Tyr

        435                 440                 445

Arg Ser Pro Thr Asn Ser Arg Val Tyr Ile Ala Gly Asp Asn Gly Arg

    450                 455                 460

Gly Gln Ser Leu Ile Val Trp Ala Ile Ala Glu Gly Arg Ala Cys Ala

465                 470                 475                 480

Ala Ala Ile Asp Ala Asp Leu Met Gly Glu Thr Ala Leu Pro Val Ala

                485                 490                 495

Val Ala Pro Gln Asp Val Pro Leu Ala Val

            500                 505

Claims (4)

1.一种具有在液体培养基中生产并积累L-谷氨酸的能力的棒状杆菌属 (Corynebacterium)细菌菌株，其中在所述的细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性通过扩增编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因的拷贝数或改变该基因的表达调节序列被增强。

2.根据权利要求1的菌株，其中所述的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来源于 埃希氏杆菌属(Escherichia)或 棒状杆菌属细菌。

3.根据权利要求1的菌株，其中所述编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因由对应于SEQ ID NO：7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列组成。

4.一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括如下步骤：

在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株，其中，在所述细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性通过扩增编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因的拷贝数或改变该基因的表达调节序列被增强，

在培养基中生产并积累L-谷氨酸，以及

从培养基中回收L-谷氨酸。