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CN107109487B - 自动处理核酸和电泳样品制备的装置、方法和系统 - Google Patents

自动处理核酸和电泳样品制备的装置、方法和系统 Download PDF

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CN107109487B CN201580067977.8A CN201580067977A CN107109487B CN 107109487 B CN107109487 B CN 107109487B CN 201580067977 A CN201580067977 A CN 201580067977A CN 107109487 B CN107109487 B CN 107109487B
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Abstract

呈现了用于自动提取、纯化和处理生物样品的核酸的方法、系统和装置。在一些实施方式中，水凝胶支撑物用于固定特定的生物输入样品并在操作中提取核酸。水凝胶的使用促进了机器液体处理系统上的自动化样品处理。还提供了用于电泳样品制备的设备、方法和系统。

Description

自动处理核酸和电泳样品制备的装置、方法和系统
本发明得到政府支持，在美国国立卫生研究院给予的SBIR二期拨款No.1R44HG008720-01 PI下作出的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年10月15日提交的名称为“Apparatuses,Methods and Systemsfor Automated Processing of Nucleic Acids”的美国临时申请NO.62/064,054和2015年6月23日提交的名称为“Methods and Devices for Electrophoretic SamplePreparation”的美国临时申请NO.62/183,514的优先权。本申请通过引用将上述申请的每一个的整体结合至本文。
技术领域
本公开内容的一些实施方式呈现了从包含核酸和其他非核酸成分的样品中分离核酸的装置、方法和系统，一些实施方式涉及电泳样品制备的方法和设备。
背景技术
长读测序(Long-read sequencing)和远程作图(long-range mapping)技术可用于产生更精确的基因组。简而言之，有很多的基因组区域，和多种类型的结构变化，其不能从短读(short-read)双末端测序数据进行正确组合，包括典型的由行业先锋生产的测序数据(例如Illumina and Thermo Fisher Life Technologies)。然而，许多这些区域和变体能够使用更新的技术进行正确组合，其产生测度为10-100千碱基(kb)的主要阅读长度(或基因图谱)，例如由Pacific Biosciences、Oxford Nanopore、10X Genomics、GenomicVision、Roche/Genia和Bionano Genomics开发的那些技术。
尽管这些长读技术仍然处于早期发展阶段，他们可用于补充短读长测序功能。例如，DNA提取和库制备技术可用于产生长的和高质量的DNA库。然而，市场存在能产生长DNA片段的商业技术空缺。大多数的商业基因DNA提取试剂盒产生的最大DNA大小为20-50kb。因为一些当前系统能够主要读取大于50kb，然而，现有的DNA提取试剂盒限制了这些系统的能力。另外，长DNA片段可用于光学作图和合成长读系统(例如10X Genomics、BionanoGenomics)，其要求产生自100kb长度的基因组DNA样品库。因此，需要生产极长(例如长度为100-1000kb)、高质量基因组DNA样品的自动的可复制方法。尽管阐明了获得这些样品的需求和作出的努力，然而还没有开发出解决方案。
另外，库制备是多步骤程序，分为两个主要部分，1)从生物样品(生物流体、微粒、细胞和组织)中提取DNA，和2)库构建。由于DNA测序对临床研究、诊断和治疗管理非常有用，一体化流程可使整个过程合理化和自动化。再次，尽管有明确的需要，尚未实现全体样本对库流程的一体化的提升。
此外，检测和诊断感染性疾病的下一代测序(NGS)在分子诊断中有很大的潜力。例如，使用临床样品(经常是全血或来自全血的白血细胞(WBC))的临床流程可经历NGS测序，然后通过将所有序列进行电脑差集运算，其可映射到人参考序列。对其余的“非人类”序列进行检验以鉴定任何已知的病菌序列。尽管这一过程可能是成功的，它需要非常高效的建库方法和深度测序运行，这两者都可能是昂贵的。这笔费用阻止了电脑差集方法的广泛使用。
发明内容
本公开内容的实施方式呈现了多个发明构思，例如涉及从包含核酸和其他非核酸成分的样品中分离核酸的装置、方法和系统，以及涉及电泳样品制备的方法和设备的实施方式。以下是对本文公开的一些实施方式的阐述。
一种从样品分离核酸的系统可包括配置用于固定包含核酸和非核酸成分的样品的水凝胶骨架。系统还可具有配置用于扩散至水凝胶骨架、与固定的生物样品反应并释放细胞样品的非核酸成分的试剂。此外，该系统可包括在释放非核酸成分后从水凝胶骨架洗脱核酸的装置。
在一些实施方式中，水凝胶基质可包含琼脂糖胶。水凝胶骨架可包含大约相同等份体积的水凝胶和生物样品。试剂可以是用于裂解的洗涤剂溶液，包含配置用于消化细菌、真菌和/或植物细胞壁的酶的溶液，蛋白酶溶液，包含DNA处理酶的溶液，包含制作测序库的酶和合成连接体的溶液和/或包含转座酶(transposasome)的溶液。
该系统也可包含至少一种自动化液体处理设备，配置成进行以下一种或两种操作：将生物样品和包含水凝胶的熔融凝胶混合以制备水凝胶骨架，以及调节添加和去除试剂。该系统可具有一载体，配置成一形状与水凝胶骨架交叉，以允许水凝胶骨架和载体的连接。在一些实施方式中，该系统也可具有过滤膜，促进核酸从水凝胶骨架电泳洗脱，并且过滤膜可包含孔，其尺寸定为根据尺寸选择性保留核酸。
也可提供用于从包含核酸和非核酸成分的样品分离核酸的方法。该方法可包括在温控容器中混合样品和熔融凝胶，降低容器温度以造成生物样品和熔融凝胶的胶化，形成水凝胶骨架。水凝胶骨架配置成固定生物样品。试剂可引入水凝胶骨架，且试剂可配置成扩散至水凝胶骨架以与固定的生物样品反应并释放非核酸成分。然后可从水凝胶骨架提取核酸。
在一些实施方式中，水凝胶骨架可包括琼脂糖胶，且生物样品可包括DNA分子。另外，自动化液体处理设备可用于混合生物样品和熔融凝胶。
而且，为了将水凝胶骨架引入试剂，承载水凝胶骨架的载体可浸入试剂混合物。还可通过电泳将试剂移动到水凝胶骨架，从而将该试剂引入水凝胶骨架。
在一些实施方式中，该方法可包括使用过滤膜过滤核酸，该过滤膜包含孔其尺寸定为基于尺寸选择性保留核酸。该方法还可包括在释放非核酸成分后从水凝胶骨架电泳移除非核酸成分。
电泳盒可包括具有电泳缓冲液的容器、置于容器内的电泳凝胶骨架部分以及置于电泳凝胶骨架部分内的样品孔。电泳凝胶骨架部分可横向延伸穿过容器，以将容器分成两个腔室。每一部分可填充电泳缓冲液。通过电泳凝胶骨架部分可将样品孔与电泳缓冲液隔离。
电泳凝胶骨架部分可以是琼脂糖，或者其可以至少是淀粉、琼脂、琼脂糖和聚丙烯酰胺的一种。电泳缓冲液pH可为7-9，且其可包含EDTA作为螯合剂。
在一些实施方式中，盒子还可包含至少一个正电极和至少一个负电极，其中正电极连接至第一腔室且负电极连接至第二腔室。各腔室可填充电泳缓冲液，并可配置成接收裂解试剂。试剂孔可置于样品孔和第二腔室之间。裂解试剂可以是阴离子洗涤剂和与洗涤剂相容的蛋白酶中的一种或多种。如果试剂包括阴离子洗涤剂，该洗涤剂可为SDS，浓度在约0.1％至约10％wt/体积之间。裂解试剂也可为阴离子洗涤剂SDS和蛋白酶K的混合物。
当在电极之间施加电压，驱动裂解试剂穿过电泳凝胶骨架部分进入样品孔。在一些实施方式中，样品孔包含生物样品，施加电压造成生物样品中的DNA分子在靠近第二腔室的样品孔一侧聚集。施加反向电压可将DNA分子移出样品孔一侧。
还可提供电泳系统。该系统可包含具有第一末端、第二末端、一长度、一宽度、第一纵向侧和第二纵向侧的电泳凝胶骨架。试剂孔可包含试剂并可置于靠近第一末端的电泳凝胶骨架部分。包含生物细胞样品的样品孔可置于靠近第一末端的电泳凝胶骨架中，并位于试剂孔和第二末端之间。一对电泳电极的第一负电极可置于第一末端，且该对电泳电极的第一正电极可置于第二末端。在该对电泳电极间施加的第一偏置电压可驱动试剂从试剂孔进入和/或穿过样品孔。
在一些实施方式中，样品孔可包括细胞悬浮液，且试剂孔可包括带负电荷的裂解试剂。由于裂解试剂的裂解，可产生包含在细胞悬浮液的细胞DNA分子。DNA分子可在至少样品孔的一侧聚集，而且，在该对电泳电极间施加第二偏置电压，聚集的DNA可经电泳移出样品孔。
该系统还可包含多个洗脱接收区域或通道，其沿凝胶第一纵向侧排列。每个接收区域可具有置于凝胶第一纵向侧附近的第一侧，以及与接收区域的第一侧具有一定距离的第二侧。而且，该系统可包括多对洗脱电极，其中每一对对应洗脱接收通道。第一对洗脱电极的第一负洗脱电极置于凝胶的第二纵向侧附近，其在第一洗脱接收通道的第一侧对面，且该第一对的第一正洗脱电极置于第一洗脱接收通道的第二侧附近。第二次激活可造成经过电泳的DNA的DNA片段在一个和/或另一个洗脱接收通道附近聚集。而且，在洗脱电极对的一个和/或另一个施加偏置电压，驱动DNA片段进入各自洗脱通道的一个和/或另一个。
电泳方法可包括上述电泳系统。样品可上载于样品孔中，且试剂可上载于试剂孔中。可在电泳电极对间施加第一电压偏置，其造成试剂从试剂孔移动至样品孔。该试剂可造成悬浮液中的细胞裂解，且DNA分子在样品孔的至少一侧形成细胞累积物。
在一些实施方式中，DNA片段可经电泳驱动，从样品孔进入多个洗脱通道。该方法可进一步包含在样品孔中培养细胞悬浮液和/或将DNA分子分解成片段。另外，细胞悬浮液的培养可包括相继添加并培养第一、第二、和/或第三添加物至样品孔，并用样品孔的内容物细胞培养其中的细胞。第一、第二和第三添加物也可同时添加。在一些实施方式中，第一添加剂是Tn和PacBio连接体，第二添加剂是T4pol、dNTPs、E.coli连接酶和NAD，且第三添加剂是核酸外切酶T5。
本领域技术人员能够理解的是，前述构思以及下文更详细讨论的另外的构思(假设这些构思相互不一致)的所有组合可视为本文公开的发明主题的一部分。特别的，在本公开内容末尾出现的要求保护的主题的所有组合均视为本文公开的发明主题的一部分。需理解的是，本文明确使用的术语也可出现在通过引用结合的任何公开内容中，其应与本文公开的特定概念的意思一致。
附图说明
图1显示了一些实施方式的水凝胶的横截面视图，例如但不限于琼脂糖胶，其可用于制备高分子量(HMW)核酸，例如DNA。
图2显示了本文一些实施方式公开的系统的示例性构造，以平行处理多个生物样品。
图3显示了一些实施方式的多孔元件实例，其包含在载体中以促进样品塞与载体的连接。
图4显示了根据一些实施方式，具有包含多孔元件的载体的样品塞的形成。
图5和6显示了一些实施方式的电泳的例示，其可用于加速凝胶塞的处理。
图7显示了图6的配置的多重实施方式。
图8A和8B显示了一些实施方式的上载于分析凝胶的凝胶样品实例。
图9A和9B显示了根据一些实施方式，通过在十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液中对琼脂糖塞进行电泳，使植入琼脂糖样品塞中的全血快速脱蛋白的实例。
图10A-G显示了一些实施方式的一次性盒的横截面视图。
图10H显示了一些实施方式的一次性盒的俯视图。
图11显示了一些实施方式的盒的俯视图。
图12a-h显示了一些实施方式的盒的试剂和样品孔的侧视图。
图13A-B显示了一些实施方式的盒的俯视图。
图14A-B显示了一些实施方式的盒的俯视图。
图15A-C显示了一些实施方式的盒的俯视图。
图16A-L显示了使用一些实施方式所述的盒的示例性流程。
图17A-C显示了在一些实施方式所述的电泳提取之前、之中和之后的凝胶。
图18A-D显示了在一些实施方式所述的电泳提取后的各阶段的凝胶。
图19A显示了一些实施方式所述的制造多排孔的梳子。
图19B显示了一些实施方式所述的通过梳子制造的凝胶排。
图20A-B显示了根据一些实施方式，转座酶对上载于凝胶的白血细胞DNA的活性。
本领域普通技术人员理解并领会到，主题公开内容的附图主要用于阐明目的，并不意欲限制本文描述的发明主题的范围。附图未必成比例；在一些情形下，本文描述的发明主题的各方面可在附图中增大或放大，以有助于不同特征的理解。在附图中，相同字符通常代表相同特征(例如，功能相似和/或结构相似元件)。
具体实施方式
在一些实施方式中，水凝胶可用于制备HMW核酸的某些过程。在一些实施方式中，水凝胶支撑物(例如琼脂糖胶)可用于自动提取和处理HMW核酸。凝胶可形成于各种固体支撑物上，其简化了操作并使得自动处理凝胶植入的样品是可行的。颗粒生物样品的实例包括动物、植物、真菌或细菌细胞。而且，在一些实施方式中，颗粒样品包含非活体生物颗粒，包括病毒和包含核酸的无细胞膜限定的囊泡。
在一些实施方式中，颗粒生物样品被植入水凝胶骨架中用于后续处理。水凝胶基质的实例是那些可用于生物医学应用的，例如Hoffman,Allan S.Advanced DrugDiscovery Reviews,Vol.54,pp.3-12,2002中讨论的那些，以及用于食品和微生物应用的，例如Food Polysaccharides and their Applications,Ed.By A.M.Stephenson andG.O.Philips,2006中讨论的那些。这些公开文献的整体内容及其引用的文献，通过引用明确结合至文本。在一些实施方式中，水凝胶骨架是琼脂糖。尽管描述中的许多讨论涉及包含琼脂糖的水凝胶支撑物，下述描述中的琼脂糖的使用应视为示例性和非限制性的。
在一些实施方式中，水凝胶骨架可具有取代基，该取代基可通过一个或多个样品成分选择性结合。在样品处理过程中或在经处理的核酸的洗脱过程中，这些相互反应可造成选择性保留一种或多种样品成分。
在一些实施方式中，参考图1A-H，公开了在制备高分子量(HMW)核酸如DNA中使用水凝胶，例如但不限于琼脂糖胶。例如，容器101置于与温控支撑物102接触，例如但不限于程控热循环仪。然后，可将合适缓冲液中的大量熔融琼脂糖置于容器中并保持在足以阻止熔融混合物胶化的温度下。在一些实施方式中，可用低熔点琼脂糖限制在凝胶形成过程中将样品暴露于高温下(例如，对于Lonza公司的
Figure BDA0001320508360000051
琼脂糖而言，1.5％凝胶的熔融温度是约65℃，且胶化温度是约30℃)。在一些实施方式中，当使用pH敏感的水凝胶时，可用酸系统调节水凝胶的胶化特性。在一些实施方式中，水凝胶可能是光敏感的，光(例如紫外辐射、可见光等)可用于调节水凝胶的胶化特性。当凝胶在其胶化温度以上培养，包含目标生物材料样品的液体样品105可与熔融胶溶液混合。在一些情形下，通过人工和/或通过自动化液体处理设备如104添加生物样品。在一些实施方式中，选择性选择凝胶溶液和/或生物样品量，使得最终的凝胶样品包括足够高的琼脂糖浓度，以在后续步骤中易于处理。例如，对于约1.5％琼脂糖的熔融凝胶溶液，熔融凝胶溶液和生物样品的量可大致相等，使得最终的凝胶溶液106的凝胶浓度至少为0.75％。
包含凝胶和生物样品的最终的混合物可在胶化温度以上保持于容器101中，载体107可浸没于熔融混合物中。在载体浸没于熔融混合物后，支撑物102的温度降至胶化温度以下，允许包含凝胶和生物样品的混合物固化(例如在载体上)。在一些实施方式中，载体可为注模塑料部件，并可具有设计用于与胶化样品塞108交叉的形状。例如，载体可提供鳍或凸起用于为凝胶提供良好的机械支撑，从而允许样品塞保持与载体连接。在一些实施方式中，使用载体的上部作为人工操作手柄，或者，使用载体的上部作为机器自动操作样品塞，样品塞108可从最初容器101中移除。
在一些实施方式中，样品塞可浸于第二容器109中的试剂混合物110中。而且，可搅动载体107和/或第二容器109，以促进试剂混合物110和样品塞108之间的混合。在一些实施方式中，形成于固体载体上的样品塞可以非常薄，厚度优选小于1mm(例如0.5mm，0.4mm，0.3mm，0.2mm，0.1m，0.05mm，0.01mm)，以促进处理试剂扩散至凝胶支撑物。在一些实施方式中，凝胶层的厚度小于200μm。具有亚毫米厚度的支撑物可用于允许例如是蛋白酶的酶处理试剂扩散进或扩散出凝胶支撑物。
在一些实施方式中，添加处理试剂至样品塞可通过以下方式完成：在含试剂的容器中重融样品塞，混合熔融凝胶和试剂以将试剂分散至包含凝胶和生物样品的整个混合物，并重融混合物。在这些实施方式中，试剂可以液体形式添加至容器，或者以凝胶-植入形式添加。如果试剂以液体形式添加，试剂添加可不稀释混合物以阻止后续的胶化，或者使得样品塞变得脆化。如果试剂以凝胶植入形式添加，在用于样品塞的相同条件下，使用的凝胶可溶解或重胶化。在添加处理试剂通过重融样品塞添加的实施方式中，可使用在低温下溶解或液化的水凝胶基质。例如，基质可为低熔点琼脂糖(例如Lonza公司的
Figure BDA0001320508360000061
琼脂糖)。在通过重融样品塞进行的添加处理试剂的实施方式中，混合步骤可以尽可能温和地进行，避免核酸的剪切破坏。
在一些实施方式中，参考图2，系统可配置为平行处理多个生物样品。例如，载体可具有梳子形状，能够携带多个样品塞208，并在多孔容器209中处理那些塞，每个容器209携带等量试剂210。
参考图3A-H，在一些实施方式中，载体可包含多孔元件302，以促进样品塞和载体的连接。在一些实施方式中，多孔元件连接至固体部分311以促进载体操作。用于固体部分的示例性材料包括但不限于注模塑料。用于多孔元件的示例性材料包括但不限于纸、过滤器、塑料或玻璃丝、多孔烧结玻璃或塑料、例如是塑料网丝或纤维的织物材料。载体的多孔元件可具有多种形状，其非限制性实例显示于图3，包括圆形(图3A和3B)，半圆盘(图3C和3D)，矩形(图3E和3F)，以及具有刚性边界的矩形(图3G和3H)。
参考图4，在一些实施方式中，阐述了包含多孔元件的具有载体的样品塞的形成。包含凝胶和生物样品的熔融混合物在胶化温度以上保持于容器401中，该容器401保持于温控支撑物402上。该载体浸于液体混合物中，使得混合物填充载体的多孔元件。在一些实施方式中，混合物均匀填充多孔元件，在多孔元件中不含空隙/或气泡。在多孔元件浸入包含凝胶和生物样品的熔融混合物后，温控支撑物的温度降低以允许样品塞胶化。在一些实施方式中，含有混合物的容器401腔体可与载体的多孔元件具有近似相同尺寸，使得载体多孔元件外几乎没有或没有未获支撑的样品塞。
在一些实施方式中，本文描述的系统可用于在样品塞上执行连续的化学和/或酶处理，例如如图1G和1H所示。具有样品塞的载体可继续培养于多个容器109中，每个容器109具有不同的试剂110。可用于DNA提取和处理的试剂的非限制性实例包括：用于裂解的洗涤剂溶液，包含消化细菌、真菌或植物细胞壁的酶溶液，蛋白酶溶液、包含DNA处理酶的溶液，包含制作测序库的酶和连接体的溶液和包含用于构建测序库的转座酶溶液。在这些实施方式中，有用的是在包含纯化缓冲液溶液的试剂容器中包括一种或多种培养物，以允许先前步骤中的反应物从样品塞扩散，留下经修饰的DNA产品。在一些实施方式中，可处理在水凝胶中的生物样品以分离样品至亚细胞隔室，例如用含有洗涤剂如Triton X 100，浓度0.1-1％wt/v的溶液处理全血或分散的哺乳动物细胞，将裂解哺乳动物质膜，留下完整的核酸。
在一些实施方式中，系统可配置为连续添加并从单一试剂容器109移除一系列试剂。添加和移除试剂可通过容器内的流体通道完成，所述通道连接至一个或多个容器外的液体处理装置(例如试剂容器)。在其他实施方式中，可通过标准液体处理装置(例如，由Beckman,Agilent,Tecan,Hamilton等出售的框架式液体处理机械手)从容器顶部添加和移除试剂。在这两个实施方式中，具有样品塞的载体能在试剂交换过程中将残留物保持在试剂容器内部或者接近试剂容器。
在一些实施方式中，样品塞可用高浓度琼脂糖形成，以促进处理流程产生更小的DNA片段。这种流程的非限制性实例可以是转座酶调节的短读下代库的代构建(例如使用
Figure BDA0001320508360000071
的Nextera、ThermoFermentas的MuSeek等化学品)。在一些这类流程中，DNA分解成几百至几千bp长度大小的片段。在这类流程中，样品塞中的高浓度琼脂糖将限制库产品从塞扩散，但仍允许有效除去转座酶和自由连接体。
参考图5A-D和6A-B，在一些实施方式中，可用电泳加速凝胶塞的处理。凝胶塞具有相对薄而平的形式，如显示于图3C-3H的那些，其可用于允许样品塞的各种组分(包括样品DNA、非DNA样品组分和试剂)均匀和快速响应于施加电场。在应用电泳时，例如，试剂容器509、609可装配有在其对面的一对电极513、613。样品塞512、612可浸入容器中两电极之间的试剂510、610中，且在电极间施加电压使得塞中的样品组分可移出塞，或者试剂溶液的组分可移进塞。在电泳方法的一些实施方式中，可用传导屏障514、614阻止电泳产物到达样品塞512、612中的DNA。这类屏障的实例描述于美国专利No.5,929,208、美国专利No.6,306,348和美国专利No.6,319,472中。这些专利的整体内容以及其引用的内容通过引用明确结合至本文。
当执行进出样品塞的一系列试剂交换时，可选择凝胶浓度、电压和/或电泳持续时间使得试剂组分有效交换，并且/或者使得DNA保留在样品塞中。由于HMW DNA在琼脂糖中迁移很慢，通常，这种条件对于非常高分子量DNA可以实现。当产生短读库(例如，约500bp片段尺寸)时，可使用高浓度凝胶、低电压和更多优化。
图6A-B显示了具有图3G和3H中显示的形式的载体的电泳。在一些实施方式中，凝胶塞支撑于多孔元件上，该多孔元件在所有边缘与载体连接。因此，最终样品塞形成通过载体的窗口。该载体以一种方式插入试剂容器609中，其将试剂容器分成两个腔室，每一个含有其自身电极613。在一些情形中，该载体和/或样品塞可在两个腔室之间提供不透液体的密封。允许将载体保持于单容器609中，并在样品塞上，通过在载体一侧或两侧交换试剂610，开展一系列处理步骤。电泳可用于驱动新的试剂进入样品塞，并从样品塞移除旧的试剂。
参考图7A-B，在一些实施方式中，对显示于图6A-B中的多种发明构思进行阐述。图7A显示了具有梳子状的复合载体714。每个齿形成用于载体塞712的载体，类似于图3G和3H显示的单个样品载体。梳子具有用于连接自动移动装置的区域715，在自动处理流程中，通过该装置梳子可自动和/或机械的插入试剂容器和/或从该试剂容器移除。在图7B中，显示了用于处理图7A的梳子状载体的复合试剂容器709。容器设计成在容器内的特定位置718容纳梳子。在图7B的实施方式中，梳子设计成插入容器每个腔体的一组槽718中。在容器的每个腔体中提供一组电极。在这个非限制性实例中，通过容器左边缘的接触体716，每个电极可单独处理。图7A-B的实施方式是示例性的，且许多其他电极和梳子放置排列也可与本文公开的一个和/或另一个实施方式兼容。
在某些实施方式中，经处理的核酸，例如但不限于DNA，可通过电泳从样品塞洗脱。在一些情形下，显示于图5C和5D的通用设计的设备可用于经处理核酸的电泳洗脱，其中屏障514最接近正(+)电极，包含孔径足够小以保留经处理的核酸的超滤膜。一种这类示例性膜是聚醚砜膜，具有10kDa分子量截止值(
Figure BDA0001320508360000081
10kDa，来自EMDMillipore)。
在一些实施方式中，可操作用于电泳的电场以选择性回收某些尺寸范围的经处理核酸。例如，脉冲场方法可用于洗脱经处理的长度为50-500kb的DNA片段，而将尺寸大于约2000kb的DNA片段留在样品塞中，其已显示于Jann Noolandi和Chantal Turmel的InMethods in Molecular Biology Volume 12:Pulsed-field gel electrophoresis,Protocols,Methods,and Theories.Ed.Burmeister,Margit,and Ulanovsky,Levy.Humana.，第73-103和135-143页中，其通过引用整体并入本文。如果更大尺寸的片段需要摆脱较小尺寸的，可在尺寸选择性脉冲场条件下首先洗脱较小片段，然后，在其他脉冲场条件或连续场条件下回收更大部分。在这类实施方式中，载体可移至第二洗脱容器(例如图5C和5D)，用于第二次洗脱，以避免无用的第一洗脱产物的遗留物污染。
在一些实施方式中，包含经处理的样品塞的载体可用于上载经处理的核酸至其他电泳设备，用于分析或用于其他样品制备过程，例如尺寸选择。例如，显示于图7A中的复合载体构思能够用于上载分析琼脂糖平板凝胶，使得梳子的齿适配到分析平板凝胶的上样孔。以一种类似的方式，这种梳子设计可用于上载预备的电泳尺寸选择系统，例如描述于美国专利NO.8,361,298和8,361,299中的那些，由此通过引用将其整体并入本文。另外的样品制备方法和设备在示例性实验操作之后进行解释。
一些实施方式的示例性实验操作
实例：使用琼脂糖样品塞和快速电泳纯化，由牛全血制备非常高分子量DNA。
血细胞在琼脂糖中的固定。
通过添加2g琼脂糖至100mL 1x KBB/2mM EDTA(50mL 10X KBB，2mL 500mM EDTA至500mL)制备2％琼脂糖(SeaKem Gold,Lonza)。
等份冷却至45℃。
混合2mL琼脂糖和2mL全牛血(Lampire Biologicals)，并倒入60mm直径的有盖培养皿；进行冷却。
(0.5XKBB缓冲液是51mM Tris碱，28.8mM TAPS酸，0.08mM EDTA酸，pH 8.7。)
电泳脱蛋白
试验1：从SDS缓冲液脱蛋白。
在具有2个12孔1.5mm厚梳子的Galileo galileo 1214凝胶盒托盘中制备水平琼脂糖胶，添加100mL溶于0.5X KBB+0.5％SDS的1％的SeaKem Gold琼脂糖(Lonza)。
从具有全血/琼脂糖的有盖培养皿，压出6.35mm直径的圆盘，并转移至琼脂糖胶的孔中。
通过在250V下电泳21min以脱蛋白。
从孔中移除圆盘，转移至具有TE的新鲜有盖培养皿。
试验2：从SDS/硫脲缓冲液脱蛋白。
所有步骤同试验1，除了凝胶在包含上述组分之外还包含2M硫脲；该凝胶需要冷凝(4℃，30min)固定。
限制酶消化
圆盘处于有盖培养皿中的TE中。
用塑料刮片移除TE中的圆盘，通过在纸巾上轻敲边缘吸干，并添加至具有78uL水/16uL 10X NEB缓冲液/1uL 1M DTT/3uL NEB BSA和酶的2mL微量离心管中，如下所示。
Figure BDA0001320508360000091
Figure BDA0001320508360000101
所有的酶来自NEB且(除了EcoRI和Apa)为10或20u/uL。所有消化物使用2uL酶/孔，除了EcoR1(100u/uL)和Apa1 50u/uL)，在该情形下仅1uL酶。所有组分在37℃下培养过夜。反应用8uL 0.5M EDTA(～25mM)和8uL 10％SDS(～0.5％)终止。
使用Cutsmart的反应具有强盐度值(ppt)，可能是由于缓冲液中的K+。
进行分析的琼脂糖胶电泳
用具有1％seakem gold和0.5X KBB缓冲液制备水平凝胶；将圆盘从上转移至样品孔；使用Pippin Pulse(Sage Science)在80V下运行12h，电场参数(常数A-G)为300，100，30，10，30，10，45(MJ5协议)。
标准包括低分子量标签(NEB延伸梯)、λ基因组DNA(48.5Kb)和NEBλ梯PF标准。
上样于分析凝胶的凝胶样品描述(图8A-B)
Figure BDA0001320508360000102
Figure BDA0001320508360000111
在分析凝胶电泳后染色样品塞
在分析凝胶电泳后，将样品塞圆盘从凝胶上样孔移除，在24孔微孔板中在700uL0.5ug/mL溴化乙锭中染色。对已经脱蛋白但未在分析凝胶上运行的对照圆盘也进行染色，并显示于右下侧孔中。
凝胶用溴化乙锭染色并用UV透照法拍照，图像用CaptureNX软件(尼康)进行分析。
结果：经过电泳脱蛋白但保留在TE缓冲液中未经限制性内切酶处理的样品塞在分析凝胶电泳后用乙啡啶鲜明染色(图8B底排，从左数孔2和3)。极少量DNA从未经消化的TE塞电泳并且迁移，其表观尺寸为约100-150kb(图8A，底道)。从分析凝胶的顶道中的λ梯可见，约250kb的λ多聚体在所用脉冲条件下将进入凝胶。因此，TE塞中的DNA表现出好像其远远大于250kb，因为在这些脉冲条件下，其将不会离开凝胶。
从染色塞可见，所有其他限制性内切酶处理，从样品塞释放大量DNA。从无酶限制性缓冲液处理的塞中可见，存在一些样品的示踪微量核酸酶活性残留，(图8A“Mg++无酶”通道，图8B，顶排左数第二个)，但是活性足够低使得迁移进塞的大部分DNA的迁移表观尺寸大于150kb。从塞释放的DNA尺寸与酶剪切尺寸的期望频数对应。尤其的，牛DNA具有丰富的DNA重复组分，其在EcoRI消化时产生了1.4kb，该期望的条带清楚见于图8A中。总之，这些结果表明在脱蛋白塞中的大多数DNA是非常高分子量的线性双链DNA。
实例：通过电泳从植入琼脂糖的全血样品快速去除蛋白
目标：论证当全血与琼脂糖混合，可在SDS存在下通过电泳除去所有蛋白，并比较获得的琼脂糖塞样品的蛋白谱和用蛋白酶K处理的琼脂糖塞的蛋白谱。
实验
混合全血和琼脂糖
对于2mL 1.5％seakem gold琼脂糖，在0.5X KBB缓冲液(Sage Science)加1mMEDTA中，在48℃，添加2mL全血，并在快速打旋混合后，将混合物倒入60mm直径的有盖培养皿中并进行冷却。
通过蛋白酶K处理脱蛋白
运行1：使用钻孔机从有盖培养皿制造6.35mm直径圆盘；在具有1mL SarE缓冲液的2mL微离心管中摇动培养圆盘过夜。
(SarE缓冲液：制作1mL，混合375uL水，100uL 10％wt/v N-十二烷基肌氨酸，500uLNa2EDTA和25uL 20mg/mL蛋白酶K溶液(Fisher Scientific，目录#FP2500150))
运行2：如上所述，但用1mLSTCP缓冲液培养6.35mm圆盘。
STCP缓冲液：制作1mL，混合890uL水，50uL 10％wt/v SDS，50uL 1M Tris HCl，pH7.5；1uL 1M CaCl2；5uL 20mg/mL蛋白酶K。
运行3：(无蛋白酶对照)：如上所述，但用含有0.5X KBB/0.5％SDS的缓冲液培养圆盘。
在SDS存在下通过电泳脱蛋白
运行4：转移6.35mm圆盘至琼脂糖凝胶孔(1％seakem gold，0.5X KBB，0.5％SDS，1mM EDTA)。运行缓冲液是相同的(0.5XKBB/0.5％SDS/1mM EDTA)。凝胶(50mL总量琼脂糖)倒入具有1.5mm厚度梳子、6孔框架的Galileo bioscience型号0708凝胶盒。
在220V电泳5min；该时间足够使深棕色血红蛋白条带完全清除琼脂糖圆盘。
将圆盘转移至具有1mL新鲜运行缓冲液的2mL微离心管。
运行5：如运行4，但是在220V电泳8min。
运行6：如运行4，但在4min后，将琼脂糖凝胶孔(包含现在的无色圆盘)填充5mMTCEP溶液；等待5min；在220V电泳4min。
运行7：如运行6，但是在添加TCEP后电泳8min。
运行8：对照(未处理)A 6.35圆盘(全血的亮红色)未进一步处理。
通过溶解琼脂糖圆盘并在分析SDS PAGE上运行可溶材料，确定脱蛋白程度
运行的圆盘通过与80uL TUS缓冲液，用于SDS PAGE(invitrogen)的10uL 4X LDS样品缓冲液和1uL 500mM TCEP溶液混合溶解(solubilixed)，并在85℃加热6min。
(TUS缓冲液通过合并3g硫脲；260uL 50X TE(USB biochemicals)；2.6mL 10％SDS；和水制作至13mL；该溶液在42℃下可溶。该缓冲液约为3M硫脲，1X TE，2％SDS。)
20uL溶解材料上载于4-20％梯度的SDS凝胶(Genscript,ExpressPlus PAGE凝胶，4-20％，15孔；目录号No:M42015)。
用于凝胶分析的对照
A:5uL全血+80uL TUS，10uL 4X LDS，1uL TCEP
B：1uL全血+80uL TUS，10uL 4X LDS，1uL TCEP
C:2uL 20mg/mL蛋白酶K++80uL TUS，10uL 4X LDS，1uL TCEP
凝胶在19w恒定功率运行，直到示踪染料到达底部；凝胶用水浸渍并用考马斯蓝(Thermofisher目录#24620，PageBlue蛋白染色溶液)染色，用水退色，并使用光箱拍照(透射照明)。图像用Capture NX软件(尼康)分析。
上载图9A和9B中的样品。
道 样品，20uL TUS溶解蛋白/琼脂糖，除非另有注明
1 无
2 10uL Lonza目录#193837四色蛋白标签
3 运行1，圆盘用SarE缓冲液培养
4 运行2，圆盘用STCP缓冲液培养
5 运行4，圆盘在220V脱蛋白4min
6 运行5，圆盘在220V脱蛋白8min
7 运行6，圆盘在220V+TCEP脱蛋白8min
8 运行7，圆盘在220V+TCEP脱蛋白12min
9 10uL上样对照B，等同于约0.11uL全血
10 20uL上样对照C，约9ug蛋白酶K
11 10uL Lonza目录#193837四色蛋白标签
12 10uL运行3，圆盘用SDS培养
13 无
14 5uL运行8，圆盘未进行脱蛋白
15 5uL上样对照A，约0.26uL全血
图9A显示了考马斯染色的SDS PAGE凝胶。
第9道是约0.1uL未处理的全血。第14道是未处理的全血/琼脂糖(凝胶上样等同于约0.26uL全血)。
第3和4道显示了通过仅用洗涤剂和蛋白酶K培养进行脱蛋白的圆盘(未经电泳除去蛋白)；用于消化的蛋白酶K混合物本身在第10道。
第5-8道显示了用电泳脱蛋白的圆盘。
图9B显示了相同的凝胶，增强以显示微弱条带。
结果
图9A和9B显示了可通过在SDS缓冲液中使琼脂糖塞经电泳，使植入凝胶样品塞的全血快速脱蛋白(图9A和9B，第5-8道)。样品塞的蛋白含量的减少至少为100X(5-8道与14道对比)。
重要的是，识别用于脱蛋白的电泳条件与那些用于实例1的试验1样品的相似。如上实例1所示，从未限制电泳脱蛋白样品(图8A和8B的“TE”样品)的DNA太大而不能从凝胶样品塞进行电泳(远大于在图8使用的电泳条件下的250kb)。因此，可能能够找到合适条件，使植入琼脂糖的血细胞的DNA能够通过电泳快速纯化，在该条件下，DNA在凝胶样品塞中保持非常高分子量。而且，DNA分子的绝大部分似乎是完整的双链DNA，其通过被各种限制性内切酶处理的能力进行评估。
电泳样品制备
在一些实施方式中，提供用于样品制备的方法，其在构建库之前通过从样品物理消减DNA从而降低成本。在这些实施方式中，可移除样品高达90％或更多的核酸，造成每个样品需要测序的量减少(并因此，相应地降低了每个样品的测序成本)。因此，在一些实施方式中提供用于从全血样品消减WBC DNA的快速和规模化方法。
使用电泳裂解方法从全血快速纯化HMW DNA
图10A-G显示了一次性盒设备(1)的横截面图，根据一些实施方式，其包含用电泳缓冲液(5)填充的塑料容器(2)和适用于分离大分子的电泳凝胶骨架(3)。盒的凝胶部分也具有样品孔(6)，其通过凝胶在任意一侧与电泳缓冲液腔室隔离。如图10H的概要俯视图可见，凝胶部分(3)横向填充盒容器(2)，因而在凝胶任意一侧创造两个隔离的缓冲液腔室(5)。
凝胶材料可包括淀粉、琼脂、琼脂糖和聚丙烯酰胺，但许多具有相似性能的其他基质也可使用。在一些实施方式中，凝胶材料是琼脂糖。
通常而言，可使用通常用于DNA和蛋白电泳的电泳缓冲液，pH范围为7-9。对于涉及酶处理样品的特定实施方式(下文描述)，可使用具有特定pH和离子组分的缓冲液。
对于使用预填充的凝胶盒的实施方式，可使用在相对低离子强度时具有高缓冲能力的缓冲液。在该方面，Liu,Li和Sommer(Anal.Biochem.1999,v270,pp112-122)描述的缓冲液(和缓冲液设计原理)在构想中。
电泳缓冲液可具有EDTA作为螯合剂，可在纯化过程中限制核酸酶活性。在一些实施方式中，高浓度EDTA(5-50mM)可有利于快速使细胞裂解物中的核酸酶失活，然而，至少1mM EDTA可用于电泳缓冲液中。在一些实施方式中，可用小于1mM EDTA。
为了在盒中施加电泳电压，电极(4)可插入凝胶任意侧的缓冲液腔室中。电极可以是盒的一次性部件，或者是设计为支撑和运行一次性盒的仪器的可重复使用部分。实例可见于美国专利8,361,298和8,361,299，以及美国专利公开2014/0284213和2015/0101932，其所有内容通过引用并入本文。
样品可包括细胞液体悬浮液。细胞悬浮液上载于样品孔(6)中，如图10A所示(圆环象征细胞)。将样品组分致密化，使得细胞和上样溶液具有大致相同的密度。通过阻止细胞在处理过程中在孔中沉淀或浮动，有助于保持样品均匀分布于整个样品孔空间。
样品组分可配置成对细胞样品等渗的，使得在电泳诱导裂解前不会发生细胞裂解。另外，样品的离子强度可保持较低，使得在处理中电泳加热保持最低水平。在一些实施方式中，样品的离子强度可大约等于电泳缓冲液。
在启动纯化过程前，裂解试剂(8，图10A)可添加至两个电泳缓冲液腔室中的一个。该裂解试剂可以是阴离子型洗涤剂如SDS，浓度为约0.1-约10％(wt/vol)。可使用其他裂解试剂，包括阴离子型洗涤剂和与洗涤剂相容的蛋白酶的混合物，例如SDS和蛋白酶K(例如蛋白酶K浓度为约50-约10000ug/ml)。
在一些实施方式中，可在样品上样后并正好在电泳过程开始前添加裂解试剂，使得裂解试剂没有时间扩散至电泳缓冲液腔室和样品孔之间的整个凝胶屏障。这个处理顺序有助于保证样品裂解和HMW DNA电泳纯化快速、同步发生。
为了启动纯化过程，施加至整个盒的电泳电压如图10C-10D所示，使得驱动裂解试剂穿过凝胶进入样品孔，其中试剂促进细胞裂解。裂解反应的发生没有混合和粘性剪力，能够回收非常高分子量的DNA分子。在电泳缓冲液和样品上样溶液中使用高浓度EDTA以螯合二价离子，并从而阻止细胞裂解过程中的核酸酶活性。
随着电泳的持续进行，极其高分子量的DNA分子在远离(-)电极的样品孔中聚集并被缠住。在连续或交变电场条件下，HMW DNA分子太大而不能进入凝胶，并保持在样品孔壁上。在用于下述实例的条件下，被缠住的固定的HMW DNA分子尺寸似乎大于2百万碱基，其通过分析脉冲电场凝胶电泳来估计。
在电泳裂解过程中，所有其他带电物种，包括细胞蛋白、裂解试剂、洗涤剂胶团的脂质以及盐经电泳快速移出样品孔。大多数移动至(+)电极，其为具有如SDS的阴离子裂解洗涤剂的复合物，如图10E所示。
有几种方式回收纯化的HMW DNA碎片，包括(例如)图10F-10G显示的方法。通过交换容器中的缓冲液将污染物从盒移除。对盒施加反向场电压，以将HMW DNA移出样品孔的壁。该反向场电泳的条件经过仔细校准用于每个盒和凝胶类型，因为如果电泳持续太长时间，DNA可在对侧壁上缠结。然后释放的DNA可通过自动或人工移液装置从样品孔的液体电泳缓冲液移出(图10G)。
用于自动电泳DNA提取和酶处理的过程和设备
图11的一次性盒(显示了盒的俯视图；也见于美国专利公开2015/0101932)除了包括样品孔(16)，还包括样品孔上游的试剂孔(15)。试剂孔可置于样品孔和(-)分离缓冲液腔室之间。还包括分离电极(4)，可从一个方向至另一个方向移动带负电分析物，如DNA；当分析物完成需要的分离，关闭分离电极，还包括洗脱通道电极(13)，将其激活以向上移动分离的带负电分析物进入填充有缓冲液的洗脱模块(10)。洗脱模块用PES超滤膜(截止值10kDa)封装于(+)电极侧，其将基因组DNA分子保留在洗脱模块内。
图12显示了试剂和样品孔(15、16，图11)的功能，沿着盒的矢状切面观察，如图11中的虚线14所示。图12A显示了填充有细胞悬浮液的样品孔(16)和填充有如SDS的带负电裂解试剂的试剂孔。图12A显示了即将激活电泳电压之前的孔的构造。图12B、12C和12D显示了激活电泳后孔的状态。在图12B中，试剂移动进样品孔以启动细胞裂解。在图12C中，裂解差不多完成；HMW DNA聚集在样品孔(+)面，污染物和裂解试剂经电泳朝(+)分离电极向右进入分离凝胶。在图12D中，高度纯化的HMW DNA(9)缠结于样品孔壁上，且污染物从样品孔进一步向右移动。如上图10E所述，DNA(9)稳固地连接至样品孔的(+)面。电泳缓冲液可从样品孔移除而不干扰凝胶缠结的DNA层，如图12E所示，且样品孔可人工或自动的用包含DNA修饰酶(18)的缓冲液重新填充，如图12F所示。
显示于图12的酶处理涉及通过双链核酸内切酶的固定HMW DNA的受控剪切，以产生尺寸分布范围为100kb-1000kb的随机片段HMW DNA。在发酵周期后，例如足够产生所需尺寸分布的周期时间，分离电极重新激活，并且经处理的DNA片段(17)经电泳移出样品孔并向右进入分离通道。用于处理的核酸酶可通过在启动分离电泳前添加SDS至样品孔或者至试剂孔而灭活。SDS变性的处理核酸酶(18)迁移远远领先更大的经处理DNA片段，如图12H中的侧视图图示所示。图13A显示了分离电泳阶段后盒的俯视图，如图11H所示。在该阶段，经处理的DNA片段置于洗脱通道前。分离电极失活，且洗脱电极激活，因而将经处理的DNA从分离凝胶电洗脱至缓冲液填充的洗脱模块(如图13B图示所示)，其中经处理的DNA可人工或自动回收。
在一些实施方式中，用于从样品孔释放固定HMW DNA的试剂包括非特异性双链核酸内切酶，例如在Mn++离子存在下的脱氧核糖核酸酶I和片段化酶(New EnglandBiolabs)。也可使用其他试剂，例如加载有合成寡核苷酸连接体双联体的转座酶，其实例包括突变体Tn5转座酶，Nextera(Illumina)，该突变体Tn5转座酶产自Kapa Biosystem，和突变体Mu转座酶试剂，MuSeek(Thermo Life)。其他试剂包括限制性内切酶。当使用限制性内切酶时，消化条件可仅允许非常有限程度的消化，使得释放的DNA产品非常大。尤其优选的DNA剪切试剂是限制性内切酶如CviKI-1(New England Biolabs)，其具有非常低的序列特异性并对基因组DNA的甲基化状态不敏感。通过CviKI-1和类似低特异性酶的限制性消化可产生几乎随机的剪切位点组。
图12的图解流程也可用于使用如Nextera(Illumina)的基于转座酶试剂系统的NGS库构建。在这种流程中，携带连接至转座酶结合位点的测序连接体的转座酶分子与基因组DNA反应。转座酶反应同时破碎基因组DNA并将测序连接体连接至片段基因组DNA的末端。用于NGS库构建的转座酶试剂可从Illumina(Nextera，基于突变体Tn5转座酶)和ThermoFisher(MuSeek套装，基于Mu转座酶)购得。转座酶调节的库流程可与图12显示的那个类似地工作，条件是用于图12F-G的酶(18)是载有特异性测序连接体的合适的转座酶。以这种方法，显示于图12和13的流程能够直接从全血样品产生NGS库，其使用单一的一次性盒，三种或四种自动液体处理步骤，以及简单的可编程电泳电力供应。
应注意的是，当通过电泳缠结固定于琼脂糖样品孔表面时，HMW DNA可用于执行HMW DNA上的多种其他酶或化学修饰反应。通常，HMW DNA在样品孔壁上的可逆固定提供方便的液体支撑，其很好地适应于DNA的系列酶处理。原则上，任何一组不会减少DNA尺寸太多使得其从支撑脱出的处理可通过在样品孔中交换试剂混合物来执行。在一些实施方式中，电泳纯化可在反应步骤之间执行，以从样品孔除去残留的带电的反应组分并进入分离凝胶。
作为非限制性实例，在序列特异性的产生切口的核酸内切酶位点的DNA荧光标记，一种用于HMW DNA光学作图的方法(例如，见Bionano Genomics流程)，可用作替代性处理流程。在HMW DNA的电泳纯化后，如上所述和图12所述，样品孔可重填DNA修复混合物，以封装所有在纯化反应中引入的随机切口。在修复后，样品孔可清空、浸渍和重填包含产生切口的核酸内切酶的反应混合物，该核酸内切酶在特异性碱基序列引入单链切口(见NEBexpressions July 2006,vol 1.2,By Siu-hong Chan,Ph.D.and Shuang-yong Xu,Ph.D.,New England Biolabs,Inc；https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/nicking-endonucleas es-the-discovery-and-engineering-of-restriction-enzyme-variants,which is hereby expressly incorporated by reference)。在产生切口后，样品孔可清空、浸渍并然后重填处于合适缓冲液中的Taq DNA聚合酶和荧光核苷酸的混合物。在将凝胶盒的温度升至约50℃后，聚合酶可在切口位点进行切口翻译反应，因而荧光标记在切口位点的序列用于光学作图。在整个产生切口和标记反应中，DNA仍可为HMW形式，并仍可与琼脂糖孔壁缠结。在标记反应后，DNA可通过非特异性双链核酸内切酶轻微碎片化。如上所述和图12所述，并电泳纯化，如上所述和如图12和13所述。
图12A-D的图解性流程，也可用于完整基因组DNA的物理消减，例如支持NGS诊断方法，该方法寻求通过检测非人序列临床样品检测感染性病原体。例如，使用图12A-D所示的流程，可限制几乎所有来自血液样品的未损坏的人序列，固定于样品孔的(+)壁上。较小的病原体DNA基因组(尺寸小于800kb以保证进入凝胶)和所有RNA分子(宿主和病原体)可保持电泳移动并迁移出样品孔。这些较小的分子可被电洗脱和回收用于NGS库制备，如图13图示。因为RNA分子小于基因组DNA，且尺寸不同，用于gDNA消减RNA的盒可能需要更高的琼脂糖浓度，以及更大的洗脱通道区域。这可提供更广的收集尺寸范围，可使用如描述于美国专利公开2015/0101932(通过引用并入本文)的那些盒。
如图16F-J所示，在一些实施方式中，来自相同样品的复合分析物可被纯化和/或分离。这些图显示了来自图13所示的类似盒的分离凝胶和洗脱模块。图16F显示了具有上样于样品孔(1502a)的细胞悬浮液和上样于试剂孔(1502b)的裂解试剂。用于该实施方式的裂解试剂可以是阴离子型洗涤剂如SDS，浓度为约0.1-约10％(wt/v)。在第一阶段(从图16F至16F)进行分离电泳使得带负电的物种从盒顶部迁移至底部。带负电的SDS向下迁移通过样品孔，裂解细胞。HMW基因组DNA由于其尺寸大保持固定于样品孔(+)侧。然而，细胞RNA和SDS涂覆的细胞蛋白从样品孔释放并朝(+)电极向下迁移分离凝胶。在2％和以下的凝胶浓度，琼脂糖胶具有对蛋白-SDS复合物非常小的阻滞。因此，大多数细胞蛋白将与高移动性SDS胶团共同迁移(图16G，括号1602区域)。大多数细胞RNA分子量大体较大，尺寸在约600-约3000碱基(200-1000kDa)，并因而将作为部分分解的条带(图16G，括号1601区域)迁移至刚好处于SDS-蛋白条带上方。在施加洗脱电压后(第2阶段，从图16G-16H)，RNA和SDS-蛋白碎片洗脱进洗脱模块，在此处其在电泳缓冲液中回收。取决于凝胶系统和电泳条件，在小RNA碎片(600碱基以下的RNA)和SDS-蛋白碎片之间有重叠，如图中括号1601和1602之间的重叠所表明。如有需要，SDS可从电泳蛋白碎片使用市售的洗涤剂清除柱(如HiPPR离心柱，ThermoLife)或者乙腈沉淀进行清除。
使用两部分离凝胶可实现盒的多分析物应用中的快速移动核酸碎片和SDS-蛋白复合物之间的分辨率提高。例如，包括包含试剂和样品孔的区域的凝胶柱的上部可包含相对低浓度的琼脂糖胶，例如，约0.75％或更低，而凝胶的下半部可包含更高浓度的琼脂糖胶，例如约2％或更高，其将允许更好的区分洗涤剂-蛋白复合物和较低分子量核酸碎片之间的移动性。
盒的多分析物应用中的分辨率提高也可通过使用电泳叠加实现，又称为等速电泳。在这些实施方式中，示例性盒，例如显示于图16K中的盒，其中的上部缓冲液腔室(图16K，1601)在运行时间被替换成与凝胶(1610)、下部缓冲液腔室(1602)和洗脱缓冲液通道(1609)中含有的缓冲液不同的缓冲液。上部缓冲液可包含阴离子洗涤剂，适合用于裂解样品孔(1603)中的细胞样品。另外，运行时间的上部缓冲液包括离子型组分，适用于实现选择性叠加洗涤剂-蛋白复合物，DNA或RNA。适合这类叠加应用的缓冲液设计的实例可见于Laemmli,Naturevol 227,680-685,1970；Ornstein and Davis,Annal.NY Acad.Sci,1964；Persat et al.Anal.Chem.Vol 81,pp9507-9511,2009；Schoch et al.Lab on a Chip vol9,pp2145-2152,2009。图16L显示了在使用设计为叠加蛋白的缓冲系统(例如Laemmli,Nature vol 227,680-685,1970)电泳纯化和分离细胞悬浮液后，盒的图示阐述。凝胶(1601)、下部缓冲液存储池(1602)和洗脱通道(1609)包含不含SDS的电泳缓冲液。在样品上样前，清空的上部缓冲液腔室(1601)重填适合样品裂解和电泳叠加蛋白-洗涤剂复合物的SDS缓冲液。施加电压至分离电极(1608)，且SDS向下迁移至盒，因而裂解保持在样品孔(1603)中的细胞悬浮液。基因组DNA(1605)限制于样品孔(+)侧，并由于其较大尺寸固定在那儿。RNA和洗涤剂-蛋白复合物经电泳进入分离凝胶。RNA(1606)基于尺寸在凝胶骨架中分离。由于琼脂糖胶的非限制性的较大孔径，蛋白-洗涤剂复合物通过缓冲系统叠加，并以紧凑的高移动性单一条带(1607)迁移通过分离凝胶。分离后，RNA和蛋白组分可洗脱为相对纯的碎片。如有需要，在片段化、分离和洗脱的第二循环中从样品孔回收基因组DNA，如上图16F-L所讨论。
在制备蛋白分析物很重要的情形下，裂解试剂可包含化学可降解或不稳定的阴离子洗涤剂。这类洗涤剂的实例包括RapiGest(Waters Corp.)和MaSDeS(Chang et al.,J.Proteome Res.Vol 14,pp1587,2015)。这些洗涤剂通过在酸性条件下(例如在25mM碳酸氢铵中的10％甲酸)培养洗涤剂-蛋白碎片灭活。这种可剪切洗涤剂可非常有用于使样品预工作流程流线化，以用于蛋白质谱分析。
在从盒洗脱和除去RNA和蛋白碎片后，样品孔和试剂孔可重填适合用于留在样品孔壁上的HMW DNA的受控片段化的试剂。在片段化后，试剂孔可填充纯化试剂，例如SDS缓冲溶液，浓度为约0.1％-约10％，且可进行第二轮纯化电泳以将片段化和纯化的基因组DNA移出样品孔(第3阶段，图16H-I)向下至一区域(图16I和16J，括号1603)，其中其可从分离凝胶洗脱成纯化形式(第4阶段，图16I-J)。
尽管图16F-J显示的多分析物纯化利用了两个分离电泳步骤和两个电洗脱步骤，以从相同样品产生纯化的基因组DNA、RNA和蛋白。在其他实施方式中，其中仅需要来自相同样品的RNA和蛋白碎片，或者其中仅需要来自相同样品的DNA和RNA碎片，仅涉及单个分离和洗脱循环的发明方法是足够的。
具有裂解试剂样品孔的盒
图14A-B显示了示例性盒1400的俯视图，其具有中央样品凝胶通道1401，样品孔1402，样品通道电泳电极1403(负极)和1404(正极)。如图14A所示，使用电极以电泳驱动样品(最初包含在样品孔1402中)沿着通道1401朝正电极1404移动。图14B阐明了通过负电极1406(负)和1407(正)之间的电泳，收集样品的不同碎片(例如DNA碎片)进入接收区域1405。
在一些实施方式中，如图15A所示，提供盒，该盒包括中央凝胶通道1501，样品孔1502a、试剂孔1502b、主要电泳电极1503(负)和1504(正)、碎片接收区域1505和用于每一个接收区域1506(负)和1507(正)的第二电泳电极。图15A的盒的示例性实施方式显示于图15C中。该实施方式基于美国申请公开号201150101932(通过引用整体并入本文)公开的、当前以SageELF名称(Sage Science)销售的盒。图15B显示了SageELF盒的上部，图15C显示了修饰版本，其中样品孔移至与洗脱模块更近的区域，且在样品孔上游提供更大体积的试剂孔(与负分离电极接近)。图16A-E阐明了一些实施方式所述的使用图15A-C(例如)任意一个盒制作DNA库的流程。如图16A所示，细胞悬浮液可上样于盒的样品孔1502a，另外，SDS和/或裂解试剂可上样于试剂孔1502b中。在主要电极1503/1504间施加电压偏置后，裂解试剂被电泳驱动进入和/或通过样品孔(图16C)。一旦进入样品孔，裂解试剂分解样品孔内的细胞，并沿凝胶持续前进。然而，DNA在样品孔中大体保持固定(例如在壁上)，这是由于DNA分子太大而不能进入凝胶。随着细胞分解，细胞残留物也被电泳驱动沿着凝胶移动。
在完成裂解过程后，按顺序地加入下述物质至样品孔(见图16D)：
-Tn和PacBio连接体(并进行培养)；
-T4pol、dNTPs、E.coli连接酶，和NAD(并进行培养)；
-核酸外切酶T5(并进行培养)。
在一些实施方式中，这些培养按顺序进行(如上所述)，但在其他实施方式中，培养可同时进行和/或并不使用所有这些培养。
如图16E所示，电泳和/或电洗脱使尺寸选择成为可能，以从样品产生DNA库。
本公开内容的一些实施方式的其他实例
实例：从全山羊血电泳提取基因组DNA。
2％琼脂糖胶(SeaKem Gold，Lonza)置于10mM Tris-HCl中，pH为7.6。凝胶大约11mm厚，样品孔为1.5mm厚x7mm深x11mm宽。凝胶置于微型凝胶盒，其包含0.5XKBB缓冲液(1XKBB＝50mM Tris，37mM TAPS，0.08mM EDTA，pH 8.7)和另外的5mM EDTA和1％SDS。浸渍凝胶使凝胶表面不会被淹没于缓冲液下(使得样品孔内容物不会与储存池中的缓冲液流体接触)；缓冲液覆盖凝胶边缘约75％的高度。在凝胶置于与电泳缓冲液接触后，样品尽快上样并激活电泳电源。在每一道中的样品是20ul新鲜全山羊血(用Lampire Biologicals的ACD抗凝)混合80ul TBSEG(50mM Tris-HCl，pH 7.6，150mM NaCl，5mM EDTA，10％甘油)。
图17A显示了将要启动电泳提取前的凝胶。电泳提取在10V/cm下进行35min。图17B显示了电泳7min后凝胶的外观，图17C显示了在35min提取过程结束的凝胶。凝胶从微型凝胶盒移除并短暂漂洗于未含SDS的200ml 0.5XKBB中，并然后用处于0.5XKBB中的0.5ug/ml溴化乙锭染色20min。图18A显示了刚好在电泳提取之后(无进一步处理)，乙啡啶染色的凝胶图像。在所有道中可见样品孔的(+)侧的DNA重带。乙啡啶染色的凝胶短暂漂洗于0.5XKBB，清空样品孔并重填以下物质：
第1道-仅一般限制性缓冲液
第2道-一般限制性缓冲液+50单元HindIII(NEB)
第3道-一般限制性缓冲液+50单元SalI(NEB)
第4道-0.5XKBB(不含SDS的电泳缓冲液)
一般限制性缓冲液是50mM Tris-HCl，pH 7.6，100mM NaCl，10mM MgCl2，100ug/ml羟丙基环糊精。
在室温下培养凝胶15min后，凝胶浸润于0.5XKBB中并在10V/cm电泳15min。凝胶依然在溴化乙锭中重染色，获得的图像显示于图18B中。从图18A可见，第1、3和4道看上去未变，显示了在下部样品凝胶壁上的HMW DNA并未因暴露于Mg++或SalI而改变。在Mg++道中缺乏剪切表明，在样品孔表面缠结的HMW DNA实质上未被核酸酶污染。第2道用HindIII消化，显示了DNA的一些提升的移动性，犹如已发生剪切。凝胶再另外进行一个小时的电泳、重染色、并且图6c显示了凝胶的俯视图，而6d显示了斜视图-从凝胶底端下的位置朝样品孔向上看，以更好地显示样品孔的横截面视图。如图18C-D所示，在孔2的大多数DNA被HindIII消化成足以通过2％凝胶的小片段。这表明固定在样品孔上的HMW DNA易受DNA处理酶影响。
实例：从山羊WBC快速电泳制备HMW DNA，然后用突变体Tn5转座酶在孔内与提取的DNA反应。
制备琼脂糖胶：
通过添加4g SeaKem gold琼脂糖(Lonza)、385g水和10mL pH为7.5的1M Tris醋酸盐和80uL 0.5M EDTA二钠制备琼脂糖溶液；溶液通过微波加热直至琼脂糖完全溶解，然后将溶液保持在70℃的热水浴中。
从Galileo 80-1214-C16-1.5梳子和0.75mm厚塑料片(图19A)取得两个孔框架，并用接合夹将其夹在一起，制作形成两排16孔的梳子。
梳子组件置于Galileo 80-1214凝胶盒的浇注托盘，然后加入80g琼脂糖；在胶化后，移除梳子，然后将凝胶浸没于缓冲液中(25mM Tris醋酸盐，pH 7.5；0.1mM Na2EDTA)。
获得的凝胶(图19B)具有两组0.75mm间隔的孔。
其中最接近(+)电极的孔是样品孔，而且最接近(-)电极的孔是试剂孔。
从山羊全血制备白血细胞(WBC)：
注意：所有步骤在室温下进行
将裂解缓冲液(155mM氯化铵；10mM NaHCO3；1mM Na2EDTA)加入到12mL全血(山羊，含有ACD抗凝剂，Lampire)，36mL红血细胞(RBC)。摇动溶液3min，400xg离心4min使白细胞成球。
轻轻倒出粉红色上清液，且红色小球在25mL RBC裂解缓冲液中涡旋重悬浮；在第二次旋转和轻倒出后，粉红色小球于900ul RBC裂解缓冲液中重悬浮。
通过Qubit测量WBC DNA浓度：
使用Qubit HS分析(Life Technologies)。
混合40uL WBC和160uL TE/50mM NaCl/1％SDS，然后在65℃下培养3min，裂解WBC。添加TE(800uL)，涡旋以减少粘性，然后根据供应商协议添加1或2.5uL DNA至199uL Qubit试剂。使用该方法，DNA在WBC溶液中的浓度评估为453ng/uL。
用WBC和裂解溶液上样于凝胶：
在琼脂糖胶(图20A，B)的每个试剂孔，添加40uL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，3％SDS，5％甘油，分别50ug/mL溴酚蓝和酚红)。
通过混合以下物质制备高负载WBC样品：
在RBC缓冲液中，浓度为453ng/uL的100uL分离的WBC。
300uL TBSEG(50mM Tris-HCl，pH 7.6，150mM NaCl，1mM EDTA，5％甘油)。
分别具有2mg/ml溴酚蓝和酚红的5uL溶液。
TBSEG中的20uL高负载WBC样品(相当于2000ng DNA)上样于样品孔3-9。
通过混合以下物质制备低负载WBC样品：
在RBC缓冲液中，浓度为453ng/uL的40uL分离的WBC。
300uL TBSEG。
分别具有2mg/ml溴酚蓝和酚红的5uL溶液。
TBSEG中的17uL低负载WBC样品(相当于800ng DNA/孔)上样于样品孔9-16。
提取和纯化WBC DNA，凝胶在100V直流电中运行74min。
用负载连接体的突变体Tn5转座酶在孔内处理电泳提取的DNA:
从容器中移除凝胶；倒出过量缓冲液，并且将凝胶置于平塑料表面。
在所有的32孔中加入40uL转座酶缓冲液(TB，25mM Tris Ac pH 7.5；20mM MnCl)。
制备1mL经修饰的转座酶缓冲液(mTB)：
Figure BDA0001320508360000211
Figure BDA0001320508360000221
如下表中所示，样品孔填充40uL经修饰的转座酶缓冲液或40uL 1x HMW缓冲液(Kapa Biosystems；1X HMW缓冲液是25mM Tris醋酸盐pH7.5；15％DMSO)或者25uL mTB或1xHMW+预载有合成双联DNA连接体(Kapa Biosystems)的突变体Tn5转座酶。
下表显示了上样于样品孔用于酶消化步骤的物质。
TB是转座酶缓冲液；所有的孔填充有该缓冲液。仅接收TB缓冲液而没有后续添加的孔标记为“TB”。
在添加TB缓冲液至所有的孔后，一些标记为“mTB”或“HMW”的孔接收经修饰的转座酶缓冲液或包含突变体Tn5转座酶的HMW缓冲液(道标记为“TnP”，180ng/ul，KapaBiosystems)。在上样前，转座酶用携带转座酶结合位点的双链测序连接体预培养，以产生满载转座酶，其能够在体外将连接体转座进白细胞HMW DNA靶体。
Figure BDA0001320508360000222
Figure BDA0001320508360000231
在室温下培养经上样的凝胶1小时。
标准品加入道1和2的样品孔(道1，5uL NEB 1kb延伸梯(目录#N3239S)；道2，一份NEBλ梯(目录#N0340S)。
凝胶在30V运行30min然后在100V运行90min，然后用溴化乙锭染色并用UV透照法拍照。
结果：上样于凝胶的WBC的DNA的转座酶活性
结果显示于图20.比较道12和14(800ng DNA/道，无转座酶)和道13、15和16(800ngDNA/道，具有转座酶)，我们看到存在DNA的剂量依赖剪切；没有转座酶，DNA保留在样品孔的壁上，表明其太大而不能进入凝胶。添加转座酶，可观察到，消化的DNA带具有明显大于几百kbp的移动性。由于负载有合成连接体的突变体Tn5转座酶已表明可容易的与HMWDNA反应，在插入合成连接体后将HMW目标DNA片段化，因此这是可期待的。
(图20B显示了如图20A 12-16的相同道，除了重标记以清楚显示用于每个道的转座酶的量)。
这表明限制在孔壁上的纯化的HMW DNA易受酶试剂影响和易被修饰，该酶试剂可上样于样品孔并接着进行电泳纯化。这还表明与利用转座酶调节的连接体添加和片段化反应的标准NGS库制备流程图的相容性。
实例：用于直接从哺乳动物白血细胞生产Pacific Biosciences SMRTbellTM测序库的快速电泳流程。
使用图15C所示的盒类型，含有溶于0.5XKBB缓冲液的0.75％琼脂糖。试剂和样品孔的总体积分别是350和90ul。
通过选择性裂解RBC从全血制备的山羊WBC，如前述实例所描述(见段落127-133)。
纯化的山羊WBC(包含12ug基因组DNA)上样于盒的空样品孔中的RBC裂解缓冲液(见例如第136段)。上样样品的总体积是80ul。裂解缓冲液(见例如第135段)，320ul，添加于空试剂孔中。细胞裂解和DNA纯化通过在SageELF仪器(Sage Science,Inc.)中电泳进行，其使用分离电极在100V运行40min。
在纯化电泳后，清空试剂和样品孔。试剂孔重装320ul Tris-HCl，pH 8.0，10mMMnCl2。样品孔重装包含0.72ug突变体Tn5转座酶(Kapa Biosystems)的相同缓冲液，其已经预装有在多联区域携带Tn5转座酶识别序列的发卡连接体，并还在单链发卡环中携带PacBio测序引物结合位点：
5'CTGTCTCTTATACACATCTTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTAGATGTGTATAAGAGACAG3'/
盒在37℃培养30min，以允许与固定的山羊基因组DNA进行转座反应。
在转座后，清空试剂和样品孔，试剂孔重填50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl2。样品孔填有70ul相同缓冲液，但另外还分别含有0.1mM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.06mMNAD+，3单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)以及10单位E.coli DNA连接酶。盒在37℃培养30min，以允许对将SMRTbellTM发卡连接体转座进山羊基因组DNA制造的缺口进行缺口填充和切口连接。
在缺口闭合后，添加400ng 3ul胰蛋白酶至样品孔中，以灭活T4聚合酶和连接酶。样品孔的内容物通过移液混合，盒在37℃培养30min。为了终止胰蛋白酶消化，添加1ug 1ul体积的大豆胰蛋白酶抑制剂。样品孔的内容物通过移液混合，盒在37℃另外培养15min。
为了去除未反应的连接体和未反应的山羊基因组DNA，添加30单位(3ul体积)的T5核酸外切酶(New England Biolabs)至样品孔，且样品孔内容物通过移液混合。核酸外切酶消化在37℃下进行30min。
在核酸外切酶消化后，清空试剂孔并重填裂解缓冲液。在分离模式下，在SageELF仪器中使用连续60V电泳场对盒进行电泳1h，然后使用波形脉冲场电泳分解5-430kb DNA历时2h，如Pippin Pulse User Manual(http://www.sagescience.com/product-support/pippin-pulse-support/)所描述的。在分离电泳后，在ELF仪器中使用50V电压进行电洗脱45min。在洗脱结束后，反向施加25V电场5s，以促进洗脱的DNA从洗脱模块的超滤膜释放。最终的SMRTbellTM库从电泳缓冲液的洗脱模块回收。
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当描述核酸处理时，术语例如连接、结合、连结、附着、互相作用等应理解为造成涉及的组分结合的连接，无论这些结合是永久的或可能可逆的。这些术语应解读为需要形成共价键，尽管有可能形成共价类型的键。
所有定义，如本文限定和使用的，应理解为受词典定义、通过引用结合的文档中的定义和/或定义术语的通常含义控制。
不定冠词“a”和“an”，如说明书和权利要求中使用的，除非另有相反指定，应理解为“至少一个”。
术语“和/或”如说明书和权利要求中使用的，应理解为结合元件的“一个或二者都”，即元件在一些情形下结合存在，在另一些情形下分离存在。使用“和/或”的多个元件应以相同方式解释，即结合元件的“一个或多个”。除了通过“和/或”子句具体明确的元件，其他元件可以可选的存在，不管是否与具体明确的那些元件相关。因此，作为非限制性实例，参考“A和/或B”，当与开放式语言例如“包含”结合使用时，可在一个实施方式中仅指A(可选地包含除了B的元件)；在另一个实施方式中，仅指B(可选地包括除了A的元件)；在另一实施方式中，指A和B(可选地包含其他元件)，等等。
如本文说明书和权利要求中使用的，“或者”应理解为具有与上述定义的“和/或”具有相同意思。例如，当拆开清单中的术语，“或者”或“和/或”应理解为包含，即包含多个或系列元件的至少一种，但也可包含多个或系列元件的一种以上，并可选地，包含其他未列术语。除非另有明确的相反指定，例如“仅一种”或“就一种”或当用于权利要求中的“由...组成”指包括多个或系列元件中的仅一种。通常的，当加上排他性术语例如“二者之一”、“其中一个”、“仅其中一个”、“就其中一个”，本文使用的术语“或”应仅理解为表明排他替代物(即“一个或另外一个，但非二者”)。当使用于权利要求中时，“主要由...组成”应具有专利法领域的通常含义。
如本文说明书和权利要求中使用的，关于一列一个或多个元件的术语“至少一个”应理解为指选自一列元件中的任意一个或多个元件的至少一个元件，但并非必须包括明确列入元件清单的每一个中的至少一个，也不排除元件清单中的元件的任何组合。该定义也可选地允许元件清单中明确指定的“至少一种”针对的元件以外的元件的存在，无论是否与明确指定的那些元件相关。因此，作为非限制性实例，“A和B的至少一个”(或者，等同的，“A或B的至少一个”，或者，等同的“A和/或B的至少一个”)可以是，在一种实施方式中指至少一个，可选地包含多于一个A，无B存在(并可选地包括除B之外的元件)；在另一种实施方式中，指至少一个，可选地包括多于一个B，无A存在(并可选地包括除A之外的元件)；在另一种实施方式中，指至少一个，可选地包括多于一个A和至少一个，可选地包括多于一个B(并可选地包含其他元件)，等等。
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡术语例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“包含”、“涉及”、“持有”、“由...组成”(“composed of”)等，应理解为开放式的，即指包括但不限于。仅过渡术语“由...构成”(“consisting of”)、“主要由...构成”应分别指封闭式或半封闭式术语，如美国专利局专利审查程序手册，2111.03部分所规定的。

Claims (32)

1.一种用于从样品分离核酸的系统，所述系统包含：
水凝胶骨架，其具有第一末端、第二末端、一长度、一宽度、第一纵向侧和第二纵向侧；
试剂孔，其靠近水凝胶骨架的第一末端并包含裂解试剂；
样品孔，其靠近水凝胶骨架的第一末端并在试剂孔和水凝胶骨架的第二末端之间，所述样品孔包含生物细胞样品；
电泳电极对的第一负极，其置于水凝胶骨架的第一末端；
电泳电极对的第一正极，其置于水凝胶骨架的第二末端；
以及
装置，用于释放非核酸成分后从水凝胶骨架中洗脱核酸；
其中：
裂解试剂，配置为：
与生物样品反应，以及
释放细胞的非核酸成分；
以及，
在电泳电极对之间施加第一偏置电压时，所述电泳电极对配置为驱动试剂从试剂孔进入和/或穿过样品孔。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，水凝胶骨架包含琼脂糖胶。
3.根据权利要求1所述的系统，进一步包含：
一种或多种自动化液体处理设备，配置成进行以下至少一种操作：将生物样品和包含水凝胶的熔融凝胶混合以制备水凝胶骨架，以及调节添加物和去除试剂。
4.根据权利要求1所述的系统，进一步包含：
载体，配置成与水凝胶骨架交叉的形状，以允许水凝胶骨架和载体的连接。
5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，水凝胶骨架包含大约相同等份体积的水凝胶和生物样品。
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，裂解试剂包含用于裂解的洗涤剂溶液，包含配置用于消化细菌、真菌和/或植物细胞壁的酶的溶液、蛋白酶溶液、包含DNA处理酶的溶液、包含制作测序库的酶和合成连接体的溶液和/或包含转座酶的溶液。
7.根据权利要求1所述的系统，进一步包含：
过滤膜，其促进核酸从水凝胶骨架电泳洗脱，所述过滤膜包含孔，所述孔的尺寸定为根据尺寸选择性保留核酸。
8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，控制电场以根据尺寸选择性回收核酸。
9.一种用于从包含核酸和非核酸成分的样品分离核酸的方法，包含：
提供权利要求1所述的系统，
将生物细胞样品和熔融水凝胶在样品孔中的温控容器中混合；
降低容器温度从而造成生物细胞样品和熔融凝胶的混合物的胶化以形成水凝胶骨架，
将水凝胶骨架配置为固定的生物样品；
将试剂孔中的裂解试剂引入水凝胶骨架，所述裂解试剂配置为扩散进水凝胶骨架从而与经固定的生物样品反应并释放非核酸成分；以及
在电泳电极对之间施加第一偏置电压，驱动试剂从试剂孔进入和/或穿过样品孔，在装置中从水凝胶骨架提取核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，水凝胶骨架包含琼脂糖胶。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，生物样品包含DNA分子。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，混合生物样品和熔融凝胶是通过自动化液体处理设备进行的。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过将携带水凝胶骨架的载体浸入试剂混合物，从而将试剂引入水凝胶骨架。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过电泳将试剂移进凝胶骨架，从而将试剂引入水凝胶骨架。
15.根据权利要求9所述方法，进一步包含：
通过过滤膜过滤核酸，所述过滤膜包含孔，所述孔的尺寸定为基于尺寸选择性保留核酸。
16.根据权利要求9所述方法，进一步包含：
在释放非核酸成分后从水凝胶骨架电泳移除非核酸成分。
17.一种电泳系统，包含：
电泳凝胶骨架，其具有第一末端、第二末端、一长度、一宽度、第一纵向侧和第二纵向侧；
试剂孔，其包含带负电的裂解试剂，所述裂解试剂置于靠近第一末端的电泳凝胶骨架部分内；
样品孔，其包含生物细胞样品，并置于靠近第一末端的电泳凝胶骨架中以及试剂孔和电泳凝胶骨架的第二末端之间；
电泳电极对的第一负极，其置于电泳凝胶骨架的第一末端；
电泳电极对的第一正极，其置于电泳凝胶骨架的第二末端；以及
其中：
在电泳电极对之间施加第一偏置电压时，所述电泳电极对配置为驱动试剂从试剂孔进入和/或穿过样品孔。
18.根据权利要求17所述的电泳系统，其特征在于，样品孔包括细胞悬浮液。
19.根据权利要求17所述的电泳系统，其特征在于，试剂孔包括带负电的裂解试剂。
20.根据权利要求19所述的电泳系统，其特征在于，由于裂解试剂的裂解，产生包含在细胞悬浮液中的细胞DNA分子。
21.根据权利要求20所述的电泳系统，其特征在于，DNA分子在样品孔的至少一侧聚集。
22.根据权利要求21所述的电泳系统，其特征在于，在电泳电极对间施加第二偏置电压时，所述电泳电极对配置为使聚集的DNA经电泳移出样品孔。
23.根据权利要求22所述的电泳系统，进一步包含：
沿凝胶第一纵向侧布置的多个洗脱接收区域或通道，每个接收区域具有邻近凝胶第一纵向侧布置的第一侧和与接收区域的第一侧间隔开的第二侧；以及
对应于每个洗脱接收通道的多个洗脱电极对，其中第一对洗脱电极的第一负洗脱电极置于凝胶的第二纵向侧附近，其在第一洗脱接收通道的第一侧对面，且所述第一对洗脱电极的第一正洗脱电极置于第一洗脱接收通道的第二侧附近；
其中，
第二偏置电压造成经电泳DNA的DNA片段在一个和/或另一个洗脱接收通道附近聚集；而且
在洗脱电极对的一个和/或另一个上施加偏置电压时，所述洗脱电极对的一个和/或另一个配置为将DNA片段驱动进入各自洗脱通道的一个和/或另一个。
24.一种电泳方法，包含：
提供权利要求17所述的系统；
在电泳电极对之间施加第一电压偏置，其中施加第一电压偏置造成试剂从试剂孔移动至样品孔，
其中，
试剂配置成造成悬浮液中的细胞裂解，以及
细胞DNA分子在样品孔的至少一侧聚集。
25.根据权利要求24所述的方法，进一步包含在样品孔中培养细胞悬浮液。
26.根据权利要求24所述的方法，进一步包含将DNA分子分解成片段。
27.根据权利要求24所述的方法，进一步包含电泳驱动DNA片段从样品孔进入多个洗脱通道。
28.根据权利要求25所述方法，其特征在于，培养包含：
添加第一添加剂至样品孔并在其中培养样品孔的内容物细胞；和/或
添加第二添加剂至样品孔并培养其中的细胞；和/或
添加第三添加剂至样品孔并培养其中的细胞，其中，
所述第一添加剂是Tn和PacBio连接体；
所述第二添加剂是T4pol、dNTPs、E.coli连接酶和NAD；和
所述第三添加剂是核酸外切酶T5。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，第一添加剂、第二添加剂和第三添加剂及其对应的培养按顺序进行。
30.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，第一添加剂包含与寡核苷酸组装的转座酶，所述寡核苷酸包含具有至少一个转座酶识别区域的第一部分和具有测序文库接头区域的第二部分。
31.一种用于从样品中分离核酸的系统，所述系统包含：
水凝胶骨架，其具有第一末端、第二末端、一长度、一宽度、第一纵向侧和第二纵向侧的，所述水凝胶骨架配置为固定包含核酸和非核酸成分的样品；
试剂孔，其靠近水凝胶骨架的第一末端并包含裂解试剂；
样品孔，其靠近水凝胶骨架的第一末端并在试剂孔和水凝胶骨架的第二末端之间，所述样品孔包含生物细胞样品；
裂解试剂，配置为：
扩散进水凝胶骨架，以及
与经固定的生物样品反应，以及
释放细胞的非核酸成分；
装置，用于稀释样品中的非核酸成分；以及
装置，用于在释放非核酸成分后从水凝胶骨架洗脱核酸。
32.一种用于从样品中分离核酸的系统，所述系统包含：
水凝胶骨架，其具有第一末端、第二末端、一长度、一宽度、第一纵向侧和第二纵向侧，所述水凝胶骨架配置为固定包含核酸和非核酸成分的样品；
试剂孔，其靠近水凝胶骨架的第一末端并包含裂解试剂；
样品孔，其靠近水凝胶骨架的第一末端并在试剂孔和水凝胶骨架的第二末端之间，所述样品孔包含生物细胞样品；
电泳电极对的第一负极，其置于水凝胶骨架的第一末端；
电泳电极对的第一正极，其置于水凝胶骨架的第二末端；
裂解试剂，配置为：
与经固定的生物样品反应，以及
释放细胞的非核酸成分；
以及，
在电泳电极对之间施加第一偏置电压，驱动试剂从试剂孔进入和/或穿过样品孔；
装置，用于稀释样品中的非核酸成分；以及
装置，用于在释放非核酸成分后从水凝胶骨架洗脱核酸。
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