CN109504676A - 一种dna大片段筛选回收试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA大片段筛选回收试剂盒及其使用方法，包括试剂盒A和试剂盒B，所述试剂盒A电泳液成分Tris 1240g，TAPS 1401.6g，EDTA 0.48g，seakem GOLD Agarose 75g；所述试剂盒B的成分DNA洗脱液NaI 40ml，醋酸钠400ul，磁珠100μl。本发明严格控制该DNA大片段筛选回收试剂盒及其使用方法的工艺步骤，通过严格控制试剂盒A和试剂盒B的成分，可筛选出大到1Mb的DNA片段大大提高了符合大片段测序的DNA片段筛查，可以回收430kb‑2Mb长度的DNA适合更长片段的第3代和第4代基因测序，可以满足超长测序的技术。
Description
技术领域
本发明涉及回收基因片技术领域，具体为一种DNA大片段筛选回收试剂盒，同时本发明还涉及一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法。
背景技术
传统的二代基因短读长测序技术通常产生150-300bp的读长长度，在大型基因组上难以使用传统技术进行测序。短读长测序无法跨越完整的DNA重复区域，由其产生的现有高比例基因组组装均显示对应重复区域和结构变异存在着许多不完整的间隙。2018年来自伦敦大学学院(UCL)神经病学研究所的克里斯托斯·普罗卡凯斯(Christos Proukakis)介绍了一种利用长测序GBA基因的方法。这种方法使用了包含所有编码区和内含子的扩增子，成功地对来自包括帕金森病和高雪氏症患者在内的17个个体的DNA样品进行了测序，桑格法测序或进行短读长靶向测序，这些方法会失败、遗漏变异、或无法提供所需要的所有信息。随着测序技术的发展，鉴于目前最长片段的筛选试剂盒为300kb，目前更长片段的筛选回收试剂盒缺乏，导致无法完成更多完整长片段测序。如葡糖脑苷酯酶长约8kb的基因，它附近有一个20kb的假基因；基因组61Mb的螺旋狸藻、152Gb的重楼百合等，更长的基因长度在的测序，变得非常有必要。在传统的DNA回收和制备中最长的回收基因片段仅未超过200Kb的长度，远远无法满足超长测序的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA大片段筛选回收试剂盒及其使用方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种DNA大片段筛选回收试剂盒，包括试剂盒A和试剂盒B，所述试剂盒A电泳液成分Tris 1240g，TAPS 1401.6g，EDTA 0.48g，seakem GOLD Agarose 75g；所述试剂盒B的成分DNA洗脱液NaI 40ml，醋酸钠400ul，磁珠100μl。
优选的，所述试剂盒A共10次反应，SYBR为5u；所述试剂盒B共10次反应，SYBR为50ul。
本发明还提供一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳；
S2：每次取Tris 124g,TAPS 140.16g，EDTA 0.48g，加1L的dH2O室温放置备用；
S3：琼脂糖凝胶的制备，称取琼脂糖放置，再取步骤2中液体中溶解，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀；
S4：取步骤2中液体50ml,seakem GOLD Agarose 75g，在950ml的dH2O内溶解；
S5：将冷却到60℃的seakem GOLD Agarose溶液轻轻倒入电泳槽水平板上；
S6：待seakem GOLD Agarose胶凝固后，在电泳槽内加入步骤2中溶液，然后拔出梳子；
S7：将DNA样品用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量；
S8：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至75V，电脉冲16h-20h，达到时间后停止电脉冲；
S9：加入SYBR 5ul到显影液中，放入凝胶遮光盖住，放置30分钟；
S10：取出凝胶在蓝光凝胶成像仪下快速切下所需要的片段琼脂糖胶块，加入400ul的NaI溶液，水浴10min；
S11：向步骤S10溶液中加入40ul的2.5mol/L醋酸钠和400ul无水乙醇，在-20℃条件下放置15-30min，在转速为10000rpm条件下离心10min；
S12：沉淀用70％酒精洗涤两次后再次倒入70％乙醇，液体中放置磁珠10ul静置2min，轻微搅拌1次，循环后去除磁珠，留取液体；
S13：沉淀用70％酒精洗涤1次，风干后加入dd H2O，并在2-8℃条件下放置。
优选的，所述步骤S3中制备的琼脂糖凝胶量为110ml。
优选的，所述步骤S8中电脉冲采用型号为Part No.PPI0200。
优选的，所述步骤S10中加入的NaI溶液的浓度为6mol/L。
优选的，所述步骤S10中的水浴温度条件为50-60℃。
优选的，所述步骤S12的循环次数为2次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明严格控制该DNA大片段筛选回收试剂盒及其使用方法的工艺步骤，通过严格控制试剂盒A和试剂盒B的成分，可筛选出大到1Mb的DNA片段大大提高了符合大片段测序的DNA片段筛查，可以回收430kb-2Mb长度的DNA适合更长片段的第3代和第4代基因测序，可以满足超长测序的技术。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种DNA大片段筛选回收试剂盒，包括试剂盒A和试剂盒B，所述试剂盒A电泳液成分Tris 1240g，TAPS 1401.6g，EDTA 0.48g，seakem GOLD Agarose75g；所述试剂盒B的成分DNA洗脱液NaI 40ml，醋酸钠400ul，磁珠100μl。
具体的，所述试剂盒A共10次反应，SYBR为5u；所述试剂盒B共10次反应，SYBR为50ul。
本发明还提供一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳；
S2：每次取Tris 124g,TAPS 140.16g，EDTA 0.48g，加1L的dH2O室温放置备用；
S3：琼脂糖凝胶的制备，称取琼脂糖放置，再取步骤2中液体中溶解，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀；
S4：取步骤2中液体50ml,seakem GOLD Agarose 75g，在950ml的dH2O内溶解；
S5：将冷却到60℃的seakem GOLD Agarose溶液轻轻倒入电泳槽水平板上；
S6：待seakem GOLD Agarose胶凝固后，在电泳槽内加入步骤2中溶液，然后拔出梳子；
S7：将DNA样品用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10μl，记录样品的点样次序和加样量；
S8：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至75V，电脉冲16h，达到时间后停止电脉冲；
S9：加入SYBR 5ul到显影液中，放入凝胶遮光盖住，放置30分钟；
S10：取出凝胶在蓝光凝胶成像仪下快速切下所需要的片段琼脂糖胶块，加入400ul的NaI溶液，水浴10min；
S11：向步骤S10溶液中加入40ul的2.5mol/L醋酸钠和400ul无水乙醇，在-20℃条件下放置15min，在转速为10000rpm条件下离心10min；
S12：沉淀用70％酒精洗涤两次后再次倒入70％乙醇，液体中放置磁珠10ul静置2min，轻微搅拌1次，循环后去除磁珠，留取液体；
S13：沉淀用70％酒精洗涤1次，风干后加入dd H2O，并在2℃条件下放置。
具体的，所述步骤S3中制备的琼脂糖凝胶量为110ml。
具体的，所述步骤S8中电脉冲采用型号为Part No.PPI0200。
具体的，所述步骤S10中加入的NaI溶液的浓度为6mol/L。
具体的，所述步骤S10中的水浴温度条件为50℃。
具体的，所述步骤S12的循环次数为2次。
实施例2
一种DNA大片段筛选回收试剂盒，包括试剂盒A和试剂盒B，所述试剂盒A电泳液成分Tris 1240g，TAPS 1401.6g，EDTA 0.48g，seakem GOLD Agarose75g；所述试剂盒B的成分DNA洗脱液NaI 40ml，醋酸钠400ul，磁珠100μl。
具体的，所述试剂盒A共10次反应，SYBR为5u；所述试剂盒B共10次反应，SYBR为50ul。
本发明还提供一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳；
S2：每次取Tris 124g,TAPS 140.16g，EDTA 0.48g，加1L的dH2O室温放置备用；
S3：琼脂糖凝胶的制备，称取琼脂糖放置，再取步骤2中液体中溶解，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀；
S4：取步骤2中液体50ml,seakem GOLD Agarose 75g，在950ml的dH2O内溶解；
S5：将冷却到60℃的seakem GOLD Agarose溶液轻轻倒入电泳槽水平板上；
S6：待seakem GOLD Agarose胶凝固后，在电泳槽内加入步骤2中溶液，然后拔出梳子；
S7：将DNA样品用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加15μl，记录样品的点样次序和加样量；
S8：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至75V，电脉冲18h，达到时间后停止电脉冲；
S9：加入SYBR 5ul到显影液中，放入凝胶遮光盖住，放置30分钟；
S10：取出凝胶在蓝光凝胶成像仪下快速切下所需要的片段琼脂糖胶块，加入400ul的NaI溶液，水浴10min；
S11：向步骤S10溶液中加入40ul的2.5mol/L醋酸钠和400ul无水乙醇，在-20℃条件下放置22.5min，在转速为10000rpm条件下离心10min；
S12：沉淀用70％酒精洗涤两次后再次倒入70％乙醇，液体中放置磁珠10ul静置2min，轻微搅拌1次，循环后去除磁珠，留取液体；
S13：沉淀用70％酒精洗涤1次，风干后加入dd H2O，并在5℃条件下放置。
具体的，所述步骤S3中制备的琼脂糖凝胶量为110ml。
具体的，所述步骤S8中电脉冲采用型号为Part No.PPI0200。
具体的，所述步骤S10中加入的NaI溶液的浓度为6mol/L。
具体的，所述步骤S10中的水浴温度条件为55℃。
具体的，所述步骤S12的循环次数为2次。
实施例3
一种DNA大片段筛选回收试剂盒，包括试剂盒A和试剂盒B，所述试剂盒A电泳液成分Tris 1240g，TAPS 1401.6g，EDTA 0.48g，seakem GOLD Agarose75g；所述试剂盒B的成分DNA洗脱液NaI 40ml，醋酸钠400ul，磁珠100μl。
具体的，所述试剂盒A共10次反应，SYBR为5u；所述试剂盒B共10次反应，SYBR为50ul。
本发明还提供一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳；
S2：每次取Tris 124g,TAPS 140.16g，EDTA 0.48g，加1L的dH2O室温放置备用；
S3：琼脂糖凝胶的制备，称取琼脂糖放置，再取步骤2中液体中溶解，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀；
S4：取步骤2中液体50ml,seakem GOLD Agarose 75g，在950ml的dH2O内溶解；
S5：将冷却到60℃的seakem GOLD Agarose溶液轻轻倒入电泳槽水平板上；
S6：待seakem GOLD Agarose胶凝固后，在电泳槽内加入步骤2中溶液，然后拔出梳子；
S7：将DNA样品用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20μl，记录样品的点样次序和加样量；
S8：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至75V，电脉冲20h，达到时间后停止电脉冲；
S9：加入SYBR 5ul到显影液中，放入凝胶遮光盖住，放置30分钟；
S10：取出凝胶在蓝光凝胶成像仪下快速切下所需要的片段琼脂糖胶块，加入400ul的NaI溶液，水浴10min；
S11：向步骤S10溶液中加入40ul的2.5mol/L醋酸钠和400ul无水乙醇，在-20℃条件下放置30min，在转速为10000rpm条件下离心10min；
S12：沉淀用70％酒精洗涤两次后再次倒入70％乙醇，液体中放置磁珠10ul静置2min，轻微搅拌1次，循环后去除磁珠，留取液体；
S13：沉淀用70％酒精洗涤1次，风干后加入dd H2O，并在8℃条件下放置。
具体的，所述步骤S3中制备的琼脂糖凝胶量为110ml。
具体的，所述步骤S8中电脉冲采用型号为Part No.PPI0200。
具体的，所述步骤S10中加入的NaI溶液的浓度为6mol/L。
具体的，所述步骤S10中的水浴温度条件为60℃。
具体的，所述步骤S12的循环次数为2次。
本发明提出的一种DNA大片段筛选回收试剂盒及其使用方法中，实验数据如下表1：
综上所述：本发明严格控制该DNA大片段筛选回收试剂盒及其使用方法的工艺步骤，通过严格控制试剂盒A和试剂盒B的成分，可筛选出大到1Mb的DNA片段大大提高了符合大片段测序的DNA片段筛查，可以回收430kb-2Mb长度的DNA适合更长片段的第3代和第4代基因测序，可以满足超长测序的技术。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种DNA大片段筛选回收试剂盒，包括试剂盒A和试剂盒B，其特征在于：所述试剂盒A电泳液成分Tris 1240g，TAPS 1401.6g，EDTA 0.48g，seakem GOLD Agarose 75g；所述试剂盒B的成分DNA洗脱液NaI 40ml，醋酸钠400ul，磁珠100μl。
2.根据权利要求1所述的一种DNA大片段筛选回收试剂盒，其特征在于：所述试剂盒A共10次反应，SYBR为5u；所述试剂盒B共10次反应，SYBR为50ul。
3.一种根据权利要求1-2任意一项所述的DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳；
S2：每次取Tris 124g,TAPS 140.16g，EDTA 0.48g，加1L的dH2O室温放置备用；
S3：琼脂糖凝胶的制备，称取琼脂糖放置，再取步骤2中液体中溶解，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀；
S4：取步骤2中液体50ml,seakem GOLD Agarose 75g，在950ml的dH2O内溶解；
S5：将冷却到60℃的seakem GOLD Agarose溶液轻轻倒入电泳槽水平板上；
S6：待seakem GOLD Agarose胶凝固后，在电泳槽内加入步骤2中溶液，然后拔出梳子；
S7：将DNA样品用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量；
S8：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至75V，电脉冲16h-20h，达到时间后停止电脉冲；
S9：加入SYBR 5ul到显影液中，放入凝胶遮光盖住，放置30分钟；
S10：取出凝胶在蓝光凝胶成像仪下快速切下所需要的片段琼脂糖胶块，加入400ul的NaI溶液，水浴10min；
S11：向步骤S10溶液中加入40ul的2.5mol/L醋酸钠和400ul无水乙醇，在-20℃条件下放置15-30min，在转速为10000rpm条件下离心10min；
S12：沉淀用70％酒精洗涤两次后再次倒入70％乙醇，液体中放置磁珠10ul静置2min，轻微搅拌1次，循环后去除磁珠，留取液体；
S13：沉淀用70％酒精洗涤1次，风干后加入dd H2O，并在2-8℃条件下放置。
4.根据权利要求1所述的一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤S3中制备的琼脂糖凝胶量为110ml。
5.根据权利要求1所述的一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤S8中电脉冲采用型号为Part No.PPI0200。
6.根据权利要求1所述的一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤S10中加入的NaI溶液的浓度为6mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤S10中的水浴温度条件为50-60℃。
8.根据权利要求1所述的一种DNA大片段筛选回收试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤S12的循环次数为2次。
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