CN112940915A - 一种质粒提取装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种质粒提取装置及方法，属于生物技术领域，包括分离容器、设置在分离容器内的电极、质粒吸附柱、搅拌器和试剂输送系统。分离容器内设有滤膜，滤膜将分离容器分隔为筛选区和集破碎与沉淀于一体的裂解区；试剂输送系统包括吸液导管和出液导管；质粒吸附柱设置在吸液导管和出液导管之间；吸液导管用于将试剂导入至质粒吸附柱和/或试剂输送系统；出液导管用于将试剂导入分离容器内和/或分离容器外。本装置使整个流程能够实现从菌液上样到质粒收集的全自动化，全过程无需离心，解决了现有自动化设备提取质粒过程中必须人工进行样本转移及离心等问题，实现了质粒提取的真正全自动化。

Description

一种质粒提取装置及方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种质粒提取装置及方法。

背景技术

质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。质粒可以在细菌体外被人工有目的地加入已知的或未知的DNA片段，形成重组的“质粒DNA”，再将这种人工合成的新的重组的“质粒DNA”打入到细菌体内并随着细菌的大量繁殖而繁殖，然后收集这种大量的细菌，用特殊的方法将新的重组的“质粒DNA”从细菌体内提取或分离出来，从而获得相对大量的(几微克或几克)的有生物活性的新的重组的“质粒DNA”。

重组的“质粒DNA”多通过试剂盒进行提取，在其提取的过程需要反复离心以及反复漂洗，提取流程的复杂性使得重组“质粒DNA”的提取难以自动化完成，目前现有质粒提取自动化设备基本都是需要人工参与到其中的多个离心或者是其他的一些步骤。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种质粒提取装置，能够实现从菌液上样到质粒收集的全自动化流程，全过程无需离心，解决了现有自动化设备提取质粒过程中必须人工进行样本转移及离心等问题。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种质粒提取装置，包括分离容器、设置在分离容器内用于质粒电泳的电极、质粒吸附柱和试剂输送系统，还包括控制器和设置在分离容器下部且通过控制器自动启停的搅拌器；所述电极与所述控制器电性连接；

所述分离容器内还设有滤膜；所述滤膜将所述分离容器分隔为筛选区和集破碎与沉淀于一体的裂解区；

所述试剂输送系统包括至少一个吸液导管和至少一个出液导管；所述质粒吸附柱设置在所述吸液导管和出液导管之间；所述吸液导管用于将试剂导入至质粒吸附柱和/或试剂输送系统；所述出液导管用于将试剂导入分离容器内和/或分离容器外；

每个所述吸液导管和每个所述出液导管上均设有液体控制阀。

进一步的，所述吸液导管至少包括：

质粒分离液吸液导管，与所述筛选区连接，并将质粒输送至质粒吸附柱；

洗液导管，用于导入洗液至质粒吸附柱对质粒进行清洗；

脱液导管，用于导入洗脱液至质粒吸附柱使质粒脱离；

电解液吸液导管，用于输送电解液于分离容器并为分离容器提供电泳环境

分离试剂吸液导管，用于输送裂解液、沉淀剂至所述裂解区使细菌破裂、沉淀分离。

进一步的，所述出液导管包括：

废液导管，与质粒吸附柱连接并将清洗后的洗液导出至分离容器外；

质粒收集导管，与质粒吸附柱连接并将脱离后的质粒导出至分离容器外收集；

输送导管，与分离容器连接并输送电解液和试剂至分离容器；所述输送导管包括与所述电解液吸液导管连通的电解液出液导管，和与所述分离试剂吸液导管连通并输送至分离容器裂解区的分离试剂出液导管。

进一步的，所述分离试剂吸液导管包括裂解液吸液导管和沉淀试剂吸液导管。

进一步的，所述滤膜包括筛选滤膜和阻拦滤膜，所述筛选滤膜和阻拦滤膜之间为筛选区。

进一步的，所述电极包括负极电极片和正极电极片，所述筛选区靠近所述负极电极片设置；所述阻拦滤膜设置在负极电极片和筛选滤膜之间；所述筛选滤膜与正极电极片之间为裂解区。

进一步的，所述搅拌器为磁力搅拌器，所述磁力搅拌器与所述控制器电连。

进一步的，所述试剂输送系统上设有通过所述控制器自动启停的输液泵，所述液体控制阀为通过控制器控制定时开关的电控阀门。

进一步的，所述质粒吸附柱为硅胶材质；所述阻拦滤膜为孔径0.01um的PVDF膜；所述筛选滤膜为孔径0.45um的PVDF膜。

本发明利用质粒提取装置提取质粒的方法，包括；

S1：将菌液加入至裂解区，控制器依次控制电解液进入筛选区、裂解液进入裂解区，并同时启动磁力搅拌器进行搅拌；

S2：向S1中裂解后的菌液中加入沉淀试剂，并同时启动磁力搅拌器进行搅拌；

S3：控制器控制电极启动使质粒电泳并筛滤至筛选区；再控制分离液吸液导管中的液体控制阀启动，吸附质粒至质粒吸附柱吸附；

S4：控制器依次控制洗液和洗脱剂进入质粒吸附柱中对质粒进行清洗和脱液；脱液后通过质粒收集导管收集。

本发明质粒提取装置及方法，其有益效果在于：

将分离后的质粒在分离容器内通过阻拦滤膜和筛选滤膜进行初分离，再通过输液泵将分离后的质粒输送至质粒吸附柱上，在质粒吸附柱上对质粒进行反复的清洗提纯后，再解析。整个流程通过控制器对各个液体控制阀的定时控制，使整个流程特定循环，能够实现从菌液上样到质粒收集的全自动化，解决了现有自动化设备提取质粒过程中必须人工进行样本转移及离心等问题，实现了质粒提取的真正全自动化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的结构示意图；

图2是本发明的控制结构示意图；

图3是本发明中液体控制阀结构示意图；

1外壳，2负极电极片，3阻拦滤膜，4筛选滤膜，5磁力搅拌子，6正极电极片，7质粒分离液吸液导管,8洗液导管，9脱液导管，10电解液吸液导管，11裂解液吸液导管，12沉淀试剂吸液导管，13电解液出液导管，14分离试剂出液导管，15废液导管，16质粒收集导管，24输液泵，29质粒吸附柱，30裂解区，31筛选区，32磁力搅拌器，33阀体，34疏流垫，35钢珠，36阻塞胶圈，37电磁铁，38进液口,39出液口；

其中，17、18、19、20、21、22、23、25、26、27、28均为液体控制阀。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图来进一步详细说明本发明。

实施例1

一种质粒提取装置，如图1，图2和图3所示，包括分离容器、设置在分离容器内用于质粒电泳的电极、硅胶材质的质粒吸附柱29和试剂输送系统，还包括控制器和通过控制器自动启停的磁力搅拌器32。分离容器内设有滤膜，滤膜将分离容器分隔为筛选区31和集破碎与沉淀于一体的裂解区30；

试剂输送系统包括吸液导管和出液导管；质粒吸附柱29设置在吸液导管和出液导管之间；吸液导管用于将试剂导入至质粒吸附柱29和试剂输送系统；出液导管用于将试剂导入分离容器内和分离容器外。

本实施例中，每个吸液导管和每个出液导管上均设有液体控制阀，液体控制阀为通过控制器控制定时开关的电控阀门。如用东方安(DFA)智能定时器开关，控制在规定间隔时间启停，从而实现整个流程的自动化。试剂输送系统上设有通过控制器自动启停的输液泵24，控制器中也可设定为对输液泵24进行定时启停。

液体控制阀包括阀体33和设置在阀体外侧的电磁铁37，阀体33的两端设有进液口38和出液口39，阀体33内中心处设有具有磁性的钢珠35，阀体内靠近进液口处设有堵塞胶圈36，阀体内靠近出液口处设有疏流垫34；电磁铁37设置在靠近进液口处。钢珠的直径小于阀体的内径。

电控阀门通过控制器启动电磁铁37，从而使钢珠受磁力吸附与堵塞胶圈36结合关闭阀门，阻塞液体。通过控制器关闭电磁铁37，与此同时启动输液泵24，输液泵24中的流体从进液口进入，进入后流体带动钢珠37向出液口方向移动。而出液口设有疏流垫34，能够液体顺利通行。

磁力搅拌器32带动磁力搅拌子5转动，对内部的菌液搅拌，使裂解液与菌液充分混合，达到充分裂解；同时在后续的沉淀过程中也可使裂解后的菌液与沉淀剂充分混合，达到充分沉淀分离。磁力搅拌器与控制器电连，通过控制器定时控制磁力搅拌器的启停，使其在特定的流程中开启。

示例性的，吸液导管至少包括：

质粒分离液吸液导管7，与筛选区31连接，并将质粒输送至质粒吸附柱29；

洗液导管8，用于导入洗液至质粒吸附柱29对质粒进行清洗；

脱液导管9，用于导入洗脱液至质粒吸附柱29使质粒脱离；

电解液吸液导管10，用于输送电解液于分离容器并为分离容器提供电泳环境

分离试剂吸液导管，用于输送裂解液、沉淀剂至所述裂解区30使细菌破裂、沉淀分离。

示例性的，出液导管包括：

废液导管15，与质粒吸附柱29连接并将清洗后的洗液导出至分离容器外；

质粒收集导管16，与质粒吸附柱29连接并将脱离后的质粒导出至分离容器外收集；

输送导管，与分离容器连接并输送电解液和试剂至分离容器；所述输送导管包括与所述电解液吸液导管10连通的电解液出液导管13，和与所述分离试剂吸液导管连通并输送至分离容器裂解区30的分离试剂出液导管14。

其中，分离试剂吸液导管包括裂解液吸液导管11和沉淀试剂吸液导管12。

本实施例中，电极包括负极电极片2和正极电极片6，负极电极片2和正极电极片6主要设定在分离容器的两端。电极主要用于电解质的电解，同时促进分离后质粒的定向移动，使质粒能够穿过筛选滤膜4分离后聚集在负极电极片2周围，达到初步分离。

本实施例中，滤膜包括筛选滤膜4和阻拦滤膜3，阻拦滤膜3为孔径0.01um的PVDF膜；筛选滤膜4为孔径0.45um的PVDF膜。分离容器主要包括裂解区30和筛选区31，而裂解区30和筛选区31通过筛选滤膜4分隔。筛选区31靠近负极电极片2设置；阻拦滤膜3设置在负极电极片2和筛选滤膜4之间，主要用于阻挡质粒，避免质粒被负极电极片2吸附。

筛选滤膜4与正极电极片6之间为裂解区30，裂解区30内设有搅拌装置，本发明中优选为磁力搅拌。裂解区30主要用于质粒的反应，如加入裂解液，在磁力搅拌的作用下使细菌被裂解。另外还可加入沉淀试剂，使裂解后溶解在电解质中的基因组以及蛋白质析出为絮状沉淀，便于筛选滤膜4对基因组、蛋白质与质粒之间的分离。

本实施例中，试剂输送系统上设有输液泵24和液体控制阀。输液泵24主要提供动力作用，便于液体流动。而液体控制阀主要用于控制流向。

实施例2

一种利用质粒提取装置提取质粒的方法，包括以下步骤：

(1)将200ml正常培养的菌液加入分离容器中的裂解区30，同时再加入RNase A到菌液中至RNase A在液体中的终浓度30ug/mL，运行装置，装置开启后所有定时器开始计时，所有液体控制阀处于关闭状态，防止液体流动。

(2)定时器运行到指定时间，启动输液泵24以及液体控制阀22和液体控制阀25结合运行将10ml电解液(试剂1)从电解液吸液导管10吸入运输经电解液出液导管13分离容器中用以提供电泳环境；其中液体控制阀、泵速10ml/min运行时间1.5min，筛选区的液面比裂解区的液面高1/5；

(3)定时器运行到指定时间，启动输液泵24以及液体控制阀21和液体控制阀26结合运行1.5min，将10ml裂解液(试剂2)从裂解液吸液导管11吸入运输经分离试剂出液导管14喷入分离容器中的菌液中，定时器运行到指定时间启动磁力搅拌器32，通过磁力带动搅拌子5以每秒1转旋转速度运行1min进行混匀，静置2min，细菌被裂解；细菌中的质粒、基因组、蛋白质等分散在电解液中。

(4)定时器运行到指定时间，启动输液泵24以及液体控制阀20和液体控制阀26结合运行将30ml沉淀试剂(试剂3)从沉淀试剂吸液导管12吸入运输经分离试剂出液导管14喷入分离容器中的菌液中，然后定时器运行到指定时间启动磁力搅拌器32带动搅拌子5以每秒2转旋转速度运行2min进行混匀，静置2min，使基因组以及蛋白质析出为絮状沉淀；

(5)定时器运行到指定时间启动开通外接电源正负极，在分离容器中负极电极片2和正极电极片6相互作用给出电泳环境，设定80V电压(5V/cm)开5s断1s间断电流电源运行5min，根据质粒、基因组、部分蛋白理化性质，质粒电泳经过筛选滤膜4进入阻拦滤膜3与筛选滤膜4之间的筛选区31，达到分离质粒目的；

(6)定时器运行到指定时间启动输液泵24以及液体控制阀17开启运行1min，由于筛选滤膜4阻碍使两侧溶液流动极慢。将分离容器中含质粒部分的溶液经过质粒分离液吸液导管7运输经过质粒吸附柱29，质粒被吸附，而废液则经废液导管15排出；

(7)定时器运行到指定时间启动输液泵24以及液体控制阀18、液体控制阀23和液体控制阀28结合运行，泵速10ml/min，运行1.5min；将10ml清洗液(试剂4)从洗液导管8吸入经过质粒吸附柱29进行杂质清洗，废液经废液导管15排出；

(8)定时器运行到指定时间启动输液泵24以及液体控制阀19、液体控制阀23和液体控制阀27结合运行，泵速10ml/min，运行1min；将3ml洗脱液(试剂5)从脱液导管9吸入运输经过质粒吸附柱29进行洗脱，洗脱液经质粒收集导管16排出最终收集。

本发明中，电解液、裂解液、沉淀试剂、清洗液、洗脱液等为质粒提取中的常规试剂，是本领域技术人员的公知常识，因此其具体名称在此不做赘述。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种质粒提取装置，包括分离容器、设置在分离容器内用于质粒电泳的电极、质粒吸附柱和试剂输送系统，其特征在于：还包括控制器和设置在分离容器下部且通过控制器自动启停的搅拌器；所述电极与所述控制器电性连接；

所述分离容器内还设有滤膜；所述滤膜将所述分离容器分隔为筛选区和集破碎与沉淀于一体的裂解区；

所述试剂输送系统包括至少一个吸液导管和至少一个出液导管；所述质粒吸附柱设置在所述吸液导管和出液导管之间；所述吸液导管用于将试剂导入至质粒吸附柱和/或试剂输送系统；所述出液导管用于将试剂导入分离容器内和/或分离容器外；

每个所述吸液导管和每个所述出液导管上均设有液体控制阀。

2.根据权利要求1所述质粒提取装置，其特征在于：所述吸液导管至少包括：

质粒分离液吸液导管，与所述筛选区连接，并将质粒输送至质粒吸附柱；

洗液导管，用于导入洗液至质粒吸附柱对质粒进行清洗；

脱液导管，用于导入洗脱液至质粒吸附柱使质粒脱离；

电解液吸液导管，用于输送电解液于分离容器并为分离容器提供电泳环境

分离试剂吸液导管，用于输送裂解液、沉淀剂至所述裂解区使细菌破裂、沉淀分离。

3.根据权利要求2所述质粒提取装置，其特征在于：所述出液导管包括：

废液导管，与质粒吸附柱连接并将清洗后的洗液导出至分离容器外；

质粒收集导管，与质粒吸附柱连接并将脱离后的质粒导出至分离容器外收集；

输送导管，与分离容器连接并输送电解液和试剂至分离容器；所述输送导管包括与所述电解液吸液导管连通的电解液出液导管，和与所述分离试剂吸液导管连通并输送至分离容器裂解区的分离试剂出液导管。

4.根据权利要求3所述质粒提取装置，其特征在于：所述分离试剂吸液导管包括裂解液吸液导管和沉淀试剂吸液导管。

5.根据权利要求1所述质粒提取装置，其特征在于：所述滤膜包括筛选滤膜和阻拦滤膜，所述筛选滤膜和阻拦滤膜之间为筛选区。

6.根据权利要求1所述质粒提取装置，其特征在于：所述电极包括负极电极片和正极电极片，所述筛选区靠近所述负极电极片设置；所述阻拦滤膜设置在负极电极片和筛选滤膜之间；所述筛选滤膜与正极电极片之间为裂解区。

7.根据权利要求1所述质粒提取装置，其特征在于：所述搅拌器为磁力搅拌器，所述磁力搅拌器与所述控制器电连。

8.根据权利要求1所述质粒提取装置，其特征在于：所述试剂输送系统上设有通过所述控制器自动启停的输液泵，所述液体控制阀为通过控制器控制定时开关的电控阀门。

9.根据权利要求1所述质粒提取装置，其特征在于：所述质粒吸附柱为硅胶材质；所述阻拦滤膜为孔径0.01um的PVDF膜；所述筛选滤膜为孔径0.45um的PVDF膜。

10.一种利用根据权利要求1-9任一项所述质粒提取装置提取质粒的方法，其特征在于：包括；

S1：将菌液加入至裂解区，控制器依次控制电解液进入筛选区、裂解液进入裂解区，并同时启动磁力搅拌器进行搅拌；

S2：向S1中裂解后的菌液中加入沉淀试剂，并同时启动磁力搅拌器进行搅拌；

S3：控制器控制电极启动使质粒电泳并筛滤至筛选区；再控制分离液吸液导管中的液体控制阀启动，吸附质粒至质粒吸附柱吸附；

S4：控制器依次控制洗液和洗脱剂进入质粒吸附柱中对质粒进行清洗和脱液；脱液后通过质粒收集导管收集。

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