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CN106459885B - 表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途 - Google Patents

表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途 Download PDF

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CN106459885B CN201480077055.0A CN201480077055A CN106459885B CN 106459885 B CN106459885 B CN 106459885B CN 201480077055 A CN201480077055 A CN 201480077055A CN 106459885 B CN106459885 B CN 106459885B
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Abstract

本发明涉及一种表达阿维菌素或其类似物的重组微生物及其构建方法。还涉及利用所述重组微生物生产阿维菌素或其类似物的方法，以及利用本发明方法获得的阿维菌素或其类似物。此外本发明还涉及所得阿维菌素或其类似物用作杀虫剂的用途。利用本发明的重组微生物生产阿维菌素或其类似物具有众多优点，例如至少包括以下一种：稳定性好、得率高，工艺简单，环境友好，极大地节省生产成本。

Description

表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途
技术领域
本发明属于基因工程及微生物发酵领域，具体涉及表达阿维菌素或其类似物的重组微生物以及利用所述重组微生物生产阿维菌素或其类似物的方法。
背景技术
阿维菌素(avermectins)和伊维菌素(ivermectin)是优秀的农药和兽药，近三十年来得到大范围的使用。其中阿维菌素是由除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的一类具有抗虫活性的大环内酯类衍生物，从除虫链霉菌发酵产物中分离的阿维菌素由一系列结构相似的成对存在的化合物组成，包括A组分和B组分，其中B组分的活性高于A组分。从结构上来说，A组分在阿维菌素的大环内酯环中的C5位上为甲氧基，而B组分在相同位置处为羟基。对于阿维菌素B组分来说，它包括两种成对的化合物，分别称为B1a和B1b，它们具有如下结构：
市售的阿维菌素农药通常包含主要由阿维菌素B1a和B1b组成的阿维菌素活性成分。伊维菌素由阿维菌素经过结构改造而来。但是经过近三十年的使用，因为产生抗药性的问题，在不久的将来会被淘汰。米尔贝霉素(milbemycin)是由吸水链霉菌(Streptomycesmilbemycinicus)发酵产生的一组新一代阿维菌素类似物，其抗虫活性高于阿维菌素和伊维菌素，而毒性则大大低于这两者。
美国专利US4,134,973公开了米尔贝霉素和13-羟基米尔贝霉素的碳水化合物衍生物以及通过一系列化学反应制备它们的方法，并证实了这些碳水化合物衍生物具有抗虫活性。然而，这些化学反应需要经过一系列的复杂过程，需要特殊的反应原料，而且由于专一性不够强会产生一系列副产物，这会带来环境问题并且还提高了生产成本。
为此需要一种通过生物合成方法生产阿维菌素或其类似物的替代方法。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种表达阿维菌素或其类似物的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌
(1)具有失活的或降低活性的aveD基因；和/或
(2)具有失活的或降低活性的aveA1基因，并且具有功能性的milA1基因。
在一个实施方案中，本发明的重组链霉菌是除虫链霉菌，优选地是除虫链霉菌AD28或除虫链霉菌MA220，更优选地是除虫链霉菌MA220。
在另一个实施方案中，通过PCR打靶(PCR targeting)技术使aveD基因失活或降低其活性。
在另一个实施方案中，用功能性milA1基因替换链霉菌基因组中的aveA1基因，以使aveA1基因失活或降低其活性，并使所述链霉菌获得功能性的milA1基因。在一个具体实施方案中，这种替换是通过细胞内基因重组实现的。
本发明的另一个方面是提供本发明的重组链霉菌用于生产阿维菌素或其类似物的用途。
在一个实施方案中，所述阿维菌素或其类似物是阿维菌素B1a和阿维菌素B1b。在另一个实施方案中，所述阿维菌素或其类似物是天维菌素，具体地是天维菌素A和天维菌素B。
本发明的第三个方面是提供一种生产阿维菌素或其类似物的方法，其包括培养权利要求1或2的重组链霉菌，以及从培养物中回收阿维菌素或其类似物。
在一个实施方案中，所述阿维菌素或其类似物是阿维菌素组分B1a和B1b。在另一个实施方案中，所述阿维菌素或其类似物是天维菌素，具体地是天维菌素A和天维菌素B。
本发明的第四个方面是提供一种构建权利要求1或2所述重组链霉菌的方法，所述方法包括：
(1)提供待改造的链霉菌；
并且所述方法还包括以下至少一个步骤：
(2)将所述待改造链霉菌中的aveD基因失活或降低其活性；和
(3)将所述待改造链霉菌中的aveA1基因失活或降低其活性，并且向所述待改造链霉菌中引入功能性的milA1基因。
在一个实施方案中，所述待改造的链霉菌是除虫链霉菌，优选地是除虫链霉菌MA-4680。
在另一个实施方案中，在步骤(2)中通过PCR打靶(PCR targeting)技术将aveD基因失活或降低其活性。
在另一个实施方案中，在步骤(3)中用功能性milA1基因替换链霉菌基因组中的aveA1基因，以使aveA1基因失活或降低其活性，并使所述链霉菌获得功能性的milA1基因。
本发明的第五个方面还提供根据本发明所述方法获得的阿维菌素或其类似物用作杀虫剂的用途。
本公开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个实施方案中所记载的一个或更多个技术特征可以与任意的一个或更多个其它实施方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本公开内容中具体记载一样。
通过以上至少一个方面，本发明的重组链霉菌可以高效地生产阿维菌素或其类似物。当用于生产阿维菌素时，可以特异性地生产阿维菌素B1a和B1b，而基本不含阿维菌素A组分或者其中所含阿维菌素A组分的含量显著降低。当用于生产阿维菌素类似物时，所述阿维菌素类似物可以是天维菌素，其中所述天维菌素包含天维菌素A和天维菌素B。还要指出的是，本发明在构建重组链霉菌时，通过PCR打靶技术高效地使aveD基因失活。本发明的重组链霉菌发酵生产阿维菌素或其类似物的稳定性好，得率高，较化学合成方法更为环境友好和简单，还极大地节省了生产成本。而且，本发明方法获得的阿维菌素或其类似物具有显著更好的抗虫活性。
本公开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个实施方案中所记载的一个或更多个技术特征可以与任意的一个或更多个其它实施方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本公开内容中具体记载一样。
附图说明
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
图1：利用吸水链霉菌体内重组系统构建重组质粒示意图；
图2：重组质粒pUAmT14的物理图谱；
图3：重组质粒pUAmT-kaveD的物理图谱；
图4：出发菌株除虫链霉菌MA-4680aveD基因失活过程示意图；
图5：发酵液HPLC图谱。A是出发菌株MA-4680的发酵液图谱，B是基因工程菌AD28的发酵液图谱；
图6：重组质粒pMA13aadMAD的构建流程图；
图7：出发菌株吸水链霉菌HS023到3-22#菌株的基因组变化示意图；
图8：重组质粒pUAmT-MA15AA1U的构建流程图；
图9：aveA1基因上游片段插入到3-22#菌株基因组的示意图；
图10：重组质粒pUAmT-AMA的构建流程图；
图11：基因工程菌AD28到MA220的基因组变化过程图；
图12：基因工程菌AD28和MA220的发酵产物比较。A为基因工程菌MA220的发酵样品HPLC图谱，B为基因工程菌AD28的发酵样品HPLC图谱；
图13：天维菌素A的质谱图；
图14：天维菌素A溶于CDCl3中的1H-NMR谱图；
图15：天维菌素A溶于CDCl3中的13C-NMR谱图；
图16：天维菌素A溶于CDCl3中的DEPT135图谱；
图17：天维菌素B的质谱图；
图18：天维菌素B溶于CDCl3中的1H-NMR谱图；
图19：天维菌素B溶于CDCl3中的13C-NMR谱图；
图20：天维菌素B溶于CDCl3中的DEPT135图谱。
具体实施方案
本申请所用术语具有与现有技术中该术语相同的含义。为了清楚地表明所用术语的含义，以下给出一些术语在本申请中的具体含义。当以下定义与该术语的常规含义有冲突时，以以下定义为准。
如本文所用，“功能性基因”是指能够在宿主生物中发挥其功能的基因。例如，如果所述基因编码一种或更多种酶，则宿主生物能够表达所述一种或更多种酶，能够检测到所述一种或更多种酶的活性，并且在宿主生物中执行所述酶的功能。相应地，“具有功能性的基因”是指宿主生物中包含所述基因，并且该基因在该宿主生物中发挥其功能。在此情况下，宿主生物可以仅包含所述功能性基因的必要部分，只要该必要部分能够使得该宿主生物表达所述功能性基因的功能即可。
如本文所用，“基因失活或降低活性”是指与未经特定处理的参照相比，经特定处理后的基因丧失了其功能或者其功能减弱，在宿主生物中无法表达该基因的活性或者所表达的该基因活性降低。这种失活或降低活性可以由众多原因导致。例如，可以是由于基因缺失、基因突变、反义抑制、基因沉默、添加抑制剂等导致基因失活或降低活性。
如本文所用，“阿维菌素或其类似物”是指具有阿维菌素或相似结构的大环内酯类抗虫化合物。它们包括但不限于阿维菌素、伊维菌素、米尔贝霉素、天维菌素等。具体地，阿维菌素或其类似物可以是阿维菌素B1a和B1b、天维菌素、或者天维菌素A和B。
阿维菌素和伊维菌素(ivermectin)是优秀的农药和兽药，近三十年来得到大范围的使用。伊维菌素是由阿维菌素经过结构改造而来。但是经过近三十年的使用，因为产生抗药性的问题，在不久的将来会被淘汰。因此需要相应的替代产品。米尔贝霉素(milbemycin)是由吸水链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)发酵产生的一组新一代抗虫化合物，其抗虫活性高于阿维菌素和伊维菌素，而毒性则大大低于这两者。以阿维菌素B1a和B1b以及相应的伊维菌素和米尔贝霉素结构为例，米尔贝霉素与阿维菌素和伊维菌素在结构上的差别很小，只在三个位置有区别，具体如下：
由此可见，伊维菌素与阿维菌素的差别仅在于C22-23位(结构式中2所示)的单键与双键，而抗虫活性则是伊维菌素高于阿维菌素。米尔贝霉素与阿维菌素的结构差别则在于C25位(结构式中1所示)的基团、C22-23位和C13位(结构式中3所示)。如上所述，由于米尔贝霉素相对于阿维菌素具有优越性，因此可以考虑将阿维菌素的结构进行改造，使其向米尔贝霉素靠近，但又保留自身的一些特征，如C13位的双糖，以此来改善阿维菌素的活性和毒性。
具体来说，在米尔贝霉素的大环内酯环上C13位处连接二糖结构能够得到具有如下结构的13-羟基米尔贝霉素的碳水化合物衍生物：
在本公开内容中，这种碳水化合物衍生物被称为天维菌素(tenvermectin)，其两种组分分别称为天维菌素A和天维菌素B。
通过大量的研究努力，发明人发现，在链霉菌基因组中，用米尔贝霉素生物合成途径中负责C22-C25位结构的milA1基因替换阿维菌素生物合成途径中的相应部分(即aveA1基因)，能够获得本发明期望的阿维菌素类似物(即天维菌素，包括天维菌素A和B)。
不限于任何理论，发明人认为，本发明的技术方案设计了一种新的生物合成途径，该新途径组合利用了阿维菌素生物合成途径和米尔贝霉素生物合成途径这二者，通过将阿维菌素产生菌中负责阿维菌素生物合成中大环内酯环C22-C25位结构合成的aveA1基因替换为负责米尔贝霉素生物合成途径中负责相应位置合成的milA1基因，完全通过生物合成路线获得了本发明的阿维菌素类似物(即天维菌素)。
阿维菌素和米尔贝霉素都属大环内酯类化合物，其主体结构在生物体内都是经过聚酮合酶途径(PKS途径)产生的。两者具有相似的主体结构，其PKS的结构也是相似的。比如：阿维菌素的C22-25位的构建是由包括装载区(LD)、模块1(SU1)和模块2(SU2)的aveA1基因(GenBank:AB032367.1)决定的。装载区负责C25位的基团结构，模块1负责C23-24位的结构，模块2负责C23位的还原程度。相应地，米尔贝霉素的C22-25位的结构是由包含装载区(LD)、模块1(SU1)和模块2(SU2)的milA1基因(GenBank:NC_016582.1(1146684..1159715))决定的。
然而，在具体的新生物合成途径设计中，为了实现基因替换，需要构建用于基因替换的重组质粒。由于将被替换的aveA1基因大小约为12kb，用于替换的milA1基因大小约为13kb。如此大的片段很难以酶切、PCR等常规的手段来完成重组质粒的构建：由于片段太大，很难找到合适的可操作的单酶切位点；而利用PCR扩增如此大的片段，一方面扩增效率低，另一方面也很容易引入突变。发明人发现，通过利用细胞内基因重组技术可以实现这种大片段替换，并保留了替换入的milA1基因能够正常发挥功能。
此外，阿维菌素有A和B两类组分，B组分的活性高于A组分，这是因为B组分的C5位是羟基，而A组分的C5位是氧甲基。希望能够获得A组分含量降低或基本不含A组分的阿维菌素。例如，所得阿维菌素主要由阿维菌素B1a和B1b组成。
通过大量研究努力，发明人发现，通过将阿维菌素产生菌中aveD基因失活或降低其活性，可以显著降低甚至基本上不产生阿维菌素A组分。不限于任何理论，发明人认为，这是因为aveD基因(GenBank:AB032524.1)编码的C5-氧甲基转移酶能够将甲基转移到B组分的C5位羟基从而将阿维菌素B组分转化成A组分。通过使aveD基因失活或显著降低其活性，能够抑制甚至失活这一代谢过程，从而抑制了阿维菌素A组分的产生，并相应获得了主要由阿维菌素B组分(B1a和B1b)组成的阿维菌素发酵产物。因此，本发明提供了一种技术方案，通过将aveD基因失活来阻断A组分的产生，由此进一步增强阿维菌素的活性并降低其毒性。
实施例1重组除虫链霉菌菌株MA220的构建
1.除虫链霉菌和吸水链霉菌基因组DNA的提取：
a)分别将除虫链霉菌MA-4680(Streptomyces avermitilis MA-4680.ATCCNo.31267)和吸水链霉菌HS023(Streptomyces milbemycinicus HS023.CGMCC No.7677)的孢子接种到30ml TSB培养基(Tryptic Soy Broth，BD公司货号211822)，30℃，220rpm培养30-48h。
b)离心收集菌丝体，以无菌水洗涤2次后，以菌丝体体积的4倍量的溶菌酶溶液(10.3％蔗糖，10mM Tris-HCl，pH8.0，4mg/ml溶菌酶)悬浮，37℃水浴1-2h。
c)加入1/10体积的10％SDS溶液，20mg/ml的蛋白酶K溶液至终浓度为100μg/ml，37℃水浴30min-1h。
d)加入等体积的苯酚-氯仿溶液(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，pH8.0)抽提2次。
e)上清加入1/10体积的3M NaAc-HAc溶液(pH5.3)，以及等体积的异戊醇，12000rpm离心5min以沉淀基因组DNA。
f)沉淀以70％乙醇洗涤2遍，室温干燥后，以含20μg/ml RNase的10mM Tirs-HCl溶液(pH8.0)溶解，得到基因组DNA溶液。
2.载体pUAmT14的构建：
质粒pIJ773(获自Plant Bioscience Limited,Norwich,UK；参见Gust B,et al.,PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain neededfor biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.(2003)Proc Natl AcadSci USA 100(4):1541-1546；和Gust B,et al.,REDIRECT Technology:PCR-targetingsystem in streptomyces coelicolor.Norwich:John Innes Centre.(2002))以Xba I(TaKaRa)和BstB I(TaKaRa)按说明书双酶切，电泳回收含aac(3)IV基因和oriT的1271bp片段，并以BKL试剂盒(TaKaRa)按说明书平末端化，得到片段1。pUC19载体以Dra I(TaKaRa)和Ssp I(TaKaRa)按说明书进行双酶切，电泳回收1748bp的载体片段，得到片段2。将片段1和片段2连接(以TaKaRa公司的Solution I溶液按说明书操作，下同)，得到重组质粒pUAmT14。pUAmT14的物理图谱如图2所示。
3.用于除虫链霉菌aveD基因失活的重组质粒pUAmT-kaveD的构建：
Cosmid 6-9(参见参考文献4：夏海洋，黄隽，胡敏杰等，构建有序排列的除虫链霉菌基因组的柯斯文库用于工业生产菌株的遗传改造，中国抗生素杂志，2009，34(7):403-405)所包含的DNA片段为Streptomyces avermitilis MA-4680基因组的第1124992-1167304位碱基位置。利用PCR targeting技术敲除aveD基因第442-521位碱基片段(SEQ IDNO：1)，并通过FLP重组酶去除抗性基因盒，得到81bp被新序列(SEQ ID NO：2)置换的重组质粒6-9kaveD。基本按照文献记载的方法实施PCR靶向(参见Gust B,et al.,PCR-targetedStreptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.(2003)Proc Natl Acad SciUSA 100(4):1541-1546；和Gust B,et al.,REDIRECT Technology:PCR-targeting systemin streptomyces coelicolor.Norwich:John Innes Centre.(2002))。具体过程如下：
PCR引物的设计：设计引物aveD59(SEQ ID NO：3)，其5'端的39bp与aveD基因的第403-441位碱基相同，3'端的20bp为模板抗性基因盒的“左臂”；设计引物aveD58(SEQ IDNO：4)，其5'端的39bp与aveD基因的第522-560位碱基反向互补，3'端的20bp为模板抗性基因盒的“右臂”(“左臂”和“右臂”为固定序列，参见Gust B,Kiser T,Chater K F.REDIRECTTechnology:PCR-targeting system in streptomyces coelicolor.Norwich:John InnesCentre.2002,第6页)。
PCR扩增抗性基因盒：以质粒pIJ773为模板进行PCR扩增，PCR所用的是TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶。
配制以下反应液：
PCR反应程序：
94℃,2min，
(98℃×10sec,50℃×45sec,72℃×1min30sec)×10cycles，
(98℃×10sec,68℃×1min30sec)×15cycles，
72℃×2min,16℃×1min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约1.4kb的目的片段，并以胶回收试剂盒(TaKaRa)按说明书进行回收。
文库质粒转化到大肠杆菌BW25113/pIJ790：大肠杆菌BW25113/pIJ790单菌落接种于10ml含25μg/ml氯霉素的LB培养基(胰蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.1％)，30℃，250rpm振荡培养过夜(14-18h，下同)。取100μl过夜菌液转接到10ml含25μg/ml氯霉素的SOB培养基(胰蛋白胨2.0％，酵母粉0.5％，NaCl 0.05％，每升加10ml 250mmol/L KCl溶液，使用前，每升加入5ml灭菌的2mol/L MgCl2)，于30℃，250rpm培养3-4h，至OD600为0.4左右。4℃下，4000rpm离心5min收集菌体，以10ml冰预冷的10％甘油洗涤2次，沉淀以100μl冰预冷的10％甘油悬浮沉淀，即为电转化感受态。在50μl感受态细胞中加入约100ng(2-3μl)文库质粒cosmid6-9，在0.2cm冰预冷的电击杯中进行电转化。电击参数为：200Ω，25μF，2.5kV。电击的持续时间在4.5-4.9ms之间。电击结束后，立即加入1ml冰预冷的LB培养基，30℃振荡培养1h。取50μl转化液涂布到含100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的LB平板(含1.5％琼脂粉的LB培养基)，30℃培养过夜，长出单菌落。
文库质粒的PCR targeting：随机挑一个含文库质粒cosmid6-9的大肠杆菌BW25113/pIJ790单菌落接种于10ml含100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的LB培养基，30℃，250rpm振荡培养过夜。取100μl过夜菌液转接于10ml含100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素和10mM L-阿拉伯糖的SOB培养基，30℃，250rpm振荡培养，按步骤c)的方法制备电转化感受态。在50μl感受态细胞中加入约100ng(2-3μl)步骤b)得到的PCR产物回收液，在0.2cm冰预冷的电击杯中进行电击。电击参数为：200Ω，25μF，2.5kV。电击的持续时间在4.5-4.9ms之间。立即加入1ml冷预冷的LB培养基，37℃振荡培养1h。简单离心后，去掉大部分上清，以残留的上清悬浮沉淀，并全量涂布于含100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨普霉素的LB平板，37℃培养过夜。挑单菌落于3ml含100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨普霉素的LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养6h左右，以Axygen小量质粒提取试剂盒按说明书提取质粒，并以限制性内切酶进行酶切检验，筛选出正确的质粒，得到重组质粒6-9daveD。
利用FLP去除抗性基因和oriT:大肠杆菌DH5α/BT340接种于10ml含25μg/ml氯霉素的LB培养基，30℃，250rpm振荡培养过夜。按步骤c)的方法制备电转化感受态。在50μl感受态细胞中加入约100ng(1-2μl)步骤d)得到的重组质粒6-9daveD，在0.2cm冰预冷的电击杯中进行击。电击参数为：200Ω，25μF，2.5kV。电击的持续时间在4.5-4.9ms之间。立即加入1ml冷预冷的LB培养基，30℃振荡培养1h。取50μl转化液涂布到含50μg/ml氨普霉素和25μg/ml氯霉素的LB平板，30℃培养48h，长出单菌落。随机挑一个单菌落于不含抗生素的LB平板上划线分离单菌落，42℃培养过夜，使其表达FLP重组酶并在随后丢失质粒BT340。挑20–30个单菌落分别于含50μg/ml氨普霉素的LB平板和含50μg/ml卡那霉素的LB平板上点种，37℃培养过夜。氨普霉素敏感而卡那霉素不敏感的克隆为去除了抗性基因盒的目的克隆。挑目的克隆提质粒，并以限制性内切酶酶切筛选正确的质粒，得到重组质粒6-9kaveD。
重组质粒pUAmT-kaveD的构建：重组质粒6-9kaveD以Cla I(TaKaRa)和BstB I(TaKaRa)按说明书进行双酶切，回收6984bp片段，与经BstB I酶切并去磷酸化(即在酶切反应液中直接加入FastAP(Fermentas)1μl，37℃水浴5-10min，下同)的载体pUAmT14连接，得到重组质粒pUAmT-kaveD，其物理图谱如图3所示。
4.除虫链霉菌MA-4680aveD基因的失活：
a)利用接合转移的方法将重组质粒pUAmT-kaveD转化到除虫链霉菌MA-4680：大肠杆菌ET12567(pUZ8002)按步骤3-c)所述的方法制备电转化感受态(培养温度为37℃，培养基中的抗生素终浓度为：氯霉素25μg/ml，卡那霉素25μg/ml)，在50μl感受态细胞中加入约100ng(1-2μl)重组质粒pUAmT-kaveD，在0.2cm冰预冷的电击杯中进行电转化。电击参数为：200Ω，25μF，2.5kV。电击结束后，立即加入1ml冰预冷的LB培养基，37℃振荡培养1h。取50μl转化液涂布到含50μg/ml氨普霉素、100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的LB平板，37℃培养过夜。随机挑一个转化子接种于10ml含有25μg/ml氯霉素、100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨普霉素的LB培养基，37℃，250rpm振荡培养过夜。将100μl过夜菌液转接到10ml含有25μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨普霉素的新鲜的LB培养基，37℃，250rpm振荡培养，至OD600在0.4左右。以10ml LB培养基洗涤两次，并悬浮于1ml LB培养基。取500μl菌液，与悬浮于500μl 2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％，酵母粉1.0％，NaCl 0.5％)，并经50℃热击10min的约108个细胞的除虫链霉菌MA-4680孢子混合，简单离心后，弃去大部分上清，以残留的上清悬浮细胞，并涂布于含10mM MgCl2的MS平板(黄豆饼粉2％，甘露醇2％，琼脂粉2％)，30℃培养16-20h。将含有0.5mg萘啶酮酸(nalidixic acid)和1.25mg氨普霉素的无菌水覆盖到平板上，30℃继续培养5d以上，长出转化子。
b)aveD基因失活突变株的筛选：转化子在含20μg/ml萘啶酮酸和25μg/ml氨普霉素的YMS(酵母抽提物0.4％，可溶性淀粉0.4％，麦芽抽提物1.0％，琼脂粉1.8％)平板上传代一次后，再在不含抗生素的YMS平板上传代两次，分离出单菌落。单菌落分别在含25μg/ml氨普霉素和不含抗生素的YMS培养基上培养，筛选出氨普霉素敏感的菌株。筛选到的氨普霉素敏感菌株按本实施例步骤1的方法提取基因组DNA，分别利用引物aveDF(SEQ ID NO：5)/aveDR(SEQ ID NO：6)和aveDF(SEQ ID NO：5)/aveDM(SEQ ID NO：7)以rTaq DNA聚合酶(TaKaRa，下同)按说明书进行PCR检验。前者能扩增出1094bp而后者不能扩增出目的条带的为目标菌株。以筛选到的编号为AD28的菌株作为进一步基因改造的目标菌株。图4所示为出发菌株除虫链霉菌MA-4680aveD基因失活的过程。
5.基因工程菌AD28的发酵验证：AD28单菌落接种于种子培养基(玉米淀粉2.5％，黄豆饼粉0.8％，花生饼粉1％，酵母粉0.95％，CoCl2 0.003％，pH7.2-7.4)，28℃，250rpm，培养40h。以6％的接种量转接于发酵培养基(玉米淀粉14％，淀粉酶0.003％，黄豆饼粉2.0％，酵母粉1％，沸石粉0.2％，MnSO4 0.0024％，Na2MoO4 0.0024％，CoCl2·6H2O0.002％，pH7.2-7.4)，28℃，250rpm，培养8d。取1ml发酵液，加入4ml无水甲醇浸泡，超声1h后，过滤。滤液直接用于HPLC分析。HPLC分析的条件为：色谱柱：C18Hypersil ODS2 4.6×250×5(大连依利特)；流动相：甲醇:乙醇:水＝81:7:12；流速：1ml/min；吸收波长：240nm。结果如图5：A是出发菌株MA-4680的发酵液HPLC图谱，B是基因工程菌AD28的发酵液HPLC图谱。结果表明，基因工程菌AD28发酵不再产生阿维菌素A组分。
6.用于置换吸水链霉菌milA1基因下游片段的重组质粒pMA13aadMAD的构建：以吸水链霉菌HS023基因组DNA为模板，利用引物MA13F1(SEQ ID NO：8)和MA13R2(SEQ ID NO：9)以PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa，下同)按说明书进行PCR反应，得到3212bp的目的片段3。重组质粒pUAmT14以Sma I酶切后，以FastAP去磷酸化，与经BKL试剂盒处理的片段3连接，得到重组质粒pUAmT-MA13'。以吸水链霉菌HS023基因组DNA为模板，利用引物MA1DF3(SEQ IDNO：10)和MA1DR4(SEQ ID NO：11)以PrimeSTAR DNA聚合酶进行PCR反应，得到3268bp的片段4。重组质粒pUAmT-MA13'以EcoR V(TaKaRa)酶切后，以FastAP去磷酸化，与经BKL试剂盒处理的片段4连接，得到重组质粒pMD-MA1D。重组质粒pUAmT-MA13'以Hind III+Nsi I按说明书(TaKaRa)进行双酶切，切胶回收6199bp片段，得到片段5；重组质粒pMD-MA1D以Hind III+Nsi I双酶切，切胶回收3258bp片段，得到片段6。将片段5和片段6连接得到重组质粒pUAmT-MA13D。以除虫链霉菌MA-4680基因组DNA为模板，利用引物AA1DF9(SEQ ID NO：12)和AA1DR10(SEQ ID NO：13)以PrimeSTAR DNA聚合酶进行PCR反应，得到3266bp的片段7。重组质粒pUAmT-MA13D以Nsi I(TaKaRa)按说明书酶切后回收，并以BKL试剂盒以处理，反应产物以FastAP去磷酸化，再与经BKL试剂盒处理片段7连接，得到用于置换吸水链霉菌milA1基因下游片段的重组质粒pMA13aadMAD。构建过程如图6所示。
7.吸水链霉菌milA1基因下游片段的置换：按步骤4-a)所描述的接合转移方法，将重组质粒pMA13aadMAD转化到吸水链霉菌HS023。转化子经两次无抗生素筛选的传代后，以牙签挑单菌落，分别在含25μg/ml氨普霉素和不含抗生素的YMS平板28℃培养5-6d。选择在含氨普霉素的YMS培养基上不生长的，而在不含氨普霉素的YMS培养基上生长的单菌落在YMS培养基上扩大培养，同时按步骤1的方法提取基因组DNA，利用引物milDF11(SEQ ID NO：14)和milDR12(SEQ ID NO：15)以rTaq DNA聚合酶进行PCR检验。PCR产物为3825bp的为目标菌株，PCR产物为1467bp的为回复突变株。从筛选结果中确定3-22#菌为milA1基因下游片段被成功置换的吸水链霉菌，并作为进一步操作的目标菌株。由出发菌株HS023到3-22#菌株的基因组变化示意如图7所示。
8.用于在吸水链霉菌milA1基因上游插入除虫链霉菌AD28的aveA1基因上游片段的重组质粒pUAmT-MA15AA1U的构建：以吸水链霉菌HS023基因组DNA为模板，利用引物MA15F13(SEQ ID NO：16)和MA15R14(SEQ ID NO：17)以PrimeSTAR DNA聚合酶进行PCR扩增，得到的3097bp片段以Pst I和Hind III按说明书(TaKaRa)进行双酶切，与经相同酶切的pUAmT14质粒连接，得到重组质粒pUAmT-MA15。以除虫链霉菌AD28基因组DNA(基因组DNA提取的方法同本实施例的步骤1)为模板，利用引物AA1UF15(SEQ ID NO：18)和AA1DR16(SEQID NO：19)以PrimeSTAR DNA聚合酶进行PCR扩增，得到的3103bp片段以EcoR I和Kpn I按说明书(TaKaRa)进行双酶切，与经同样酶切的重组质粒pUAmT-MA15连接，得到重组质粒pUAmT-MA15AA1U。构建过程如图8所示。
9.吸水链霉菌milA1基因上游除虫链霉菌aveA1基因上游片段的插入：按步骤4-a)所描述的方法，将步骤8得到的重组质粒pUAmT-MA15AA1U通过接合转移的方法转化到步骤7得到的3-22#菌株，长出转化子，即为目标菌株。aveA1基因上游片段插入到3-22#菌株基因组的示意如图9所示。
10.用于以吸水链霉菌milA1基因置换除虫链霉菌aveA1基因的重组质粒pUAmT-AMA的构建：步骤9得到的转化子挑一个单菌落接种于含20μg/ml萘啶酮酸和25μg/ml氨普霉素的TSB培养基，按步骤1所述的方法提取基因组DNA。提取的基因组DNA以Swa I(TaKaRa)按说明书进行酶切反应。反应结束后，加入1/10体积的3M NaAc-HAc溶液(pH5.3)，以及等体积的异戊醇，12000rpm离心5min以沉淀DNA。沉淀以70％乙醇洗涤2遍，室温干燥后，以20μl10mM Tirs-HCl溶液(pH8.0)溶解得到回收液。取3μl回收液连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(DH5α感受态细胞的制备方法以及电转化过程同步骤3-c)，但在培养基中不加抗生素，并且培养温度为37℃)，转化液离心去掉大部分上清后，以残留的液体悬浮沉淀，全量涂布于含25μg/ml氨普霉素的LB平板，以37℃培养16h，长出转化子。转化子提质粒后，即为用于以吸水链霉菌milA1基因置换除虫链霉菌aveA1基因的重组质粒pUAmT-AMA。pUAmT-AMA的构建过程如图10所示。
11.除虫链霉菌aveA1基因的置换：按步骤4a)中所述的接合转移方法将重组质粒pUAmT-AMA转化到步骤4得到的AD28菌株。转化子经两次无抗生素筛选的传代后，以牙签挑单菌落，分别在含25μg/ml氨普霉素和不含抗生素的YMS平板28℃培养5-6d。选择在含氨普霉素的YMS培养基上不生长的，而在不含抗生素的YMS培养基上生长的单菌落在YMS培养基上扩大培养，同时按本实施例步骤1的方法提取基因组DNA，利用引物025A1EF(SEQ ID NO：20)/026A1ER(SEQ ID NO：21)和引物027M1EF(SEQ ID NO：22)/028M1ER(SEQ ID NO：23)以rTaq DNA聚合酶进行PCR检验。引物025A1EF(SEQ ID NO：20)/026A1ER(SEQ ID NO：21)能扩增出2005bp的目的片段，而027M1EF(SEQ ID NO：22)/028M1ER(SEQ ID NO：23)不能得到目标片段的为替换成功的基因工程菌株。挑替换成功的基因工程菌株MA220作为目标菌株进行下一步试验。基因工程菌AD28到MA220的基因组变化过程如图11所示。
12.基因工程菌MA220的发酵及HPLC分析：方法同本实施例步骤5。HPLC结果如图12所示：A是基因工程菌MA220的发酵样品HPLC图谱，B是基因工程菌AD28的发酵样品HPLC图谱。结果表明基因工程菌MA220的发酵产物中产生了两个明显的新化合物(图中出峰时间分别为8.773和11.066)。
实施例2基因工程菌MA220的发酵产物的提取及鉴定
将发酵液用滤布过滤得到滤饼，滤饼用乙醇提取两次，得到乙醇提取液。乙醇提取液经过真空浓缩至干，即得含有天维菌素A和B的浸膏。浸膏硅胶拌样后，上硅胶柱，用90:10，80:20，70:30，6:40的石油醚/丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱流分，TLC检测，得到含有两个目标组分的洗脱液，并真空浓缩至干。上述组分在以下条件下进行反向色谱分离：
液相系统：Agilent 1100半制备高压液相色谱仪
色谱柱:ZORBAX.Eclipse XDB-C18(250mm*9.4mm)
洗脱剂：甲醇/乙腈/水＝46:46:8
流速：1.5mL/min
检测波长：λ＝240nm
收集保留时间为17.1min的峰得到化合物1；收集保留时间为21.5min的峰得到化合物2。
化合物1和化合物2的质谱分析以及NMR分析图谱见附图13-20。结果表明：分子量分别为832和846。结构分析结果表明为上述天维菌素所示结构，两个组分分别为天维菌素A(tenvermectin A,TEVA)和天维菌素B(tenvermectin B,TEVB)。
实施例3基因工程MA220产率及稳定性试验
将基因工程菌MA220的孢子梯度稀释涂布于YMS培养基，28℃培养6-8d，长出单菌落。随机选取15个形态相对一致的单菌落(即能产灰色而非白色或偏黑色的孢子，菌落大小相对一致的单菌落)，编号分别为MA220-1～MA220-15，于YMS平板上点种，28℃培养6-8d，菌落大小基本一致，都在0.7-0.8cm之间。将这些单菌落按实施例1步骤5的方法进行发酵，每个单菌落对应的种子液分别接种于3瓶发酵培养基做平行试验，同时设置对照MA220-CK，即以MA220在YMS平板上的菌苔进行发酵。发酵结果经HPLC检验，以实施例2得到的样品为标准品，计算发酵单位。结果如表1。
表1
结果表明，基因工程菌MA220的发酵比较稳定：发酵pH在7.0-7.3之间，TEVA/TEVB的值在3/1左右，总发酵单位基本都在1300μg/ml以上。
实施例4天维菌素对害虫和害螨的生物活性
1.天维菌素对朱砂叶螨的室内活性测定：以朱砂叶螨为试虫，对天维菌素的室内活性进行测定，并以阿维菌素为对照药剂，比较天维菌素和阿维菌素的活性。
供试生物：朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)：在人工气候室条件下[(26±1)℃，RH(70±5)％，H/D14]，接种于蚕豆苗上培养。
供试药剂：96％阿维菌素(河北威远生物化工股份有限公司)，98％天维菌素(TEVA:TEVB＝8:2(重量比))(根据本发明实施例2的方法制备得到)：分别称取1g 96％阿维菌素和98％天维菌素加入烧杯中，并加入93g甲醇和6g乳化剂OP10，制成浓度为10000mg/L的制剂，用水稀释成浓度为0.005、0.01、0.025、0.05mg/L的药液供试。
实验方法：采用叶碟浸虫浸液法：选择室内饲养、生理状态一致的成螨虫。选取生长一致的蚕豆叶片，用打孔器做成直径2cm叶碟，叶背朝上置于塑料皿中心的脱脂棉上，每皿3片叶蝶，用小号毛笔挑接成螨接种到叶碟上，每叶碟30头，并加适量水，放于(26±1)℃，光照强度3000～4500lx、14h/d，RH 50％～75％的培养室内。2h后于体视显微镜下检查成螨数，每皿叶碟上螨的数量不低于20头。制备好的质量浓度0.005、0.01、0.025、0.05mg/L的药剂放于烧杯中，用镊子夹住叶片从低浓度到高浓度依次浸药，浸药时间为5s，对照用蒸馏水处理雌成螨，每个质量浓度为一处理，每处理重复3次。待叶片上的药剂晾干，将处理过的叶碟置于(26±1)℃和14h光周期的人工气候室培养24h，并于培养皿中加少量水保湿。
浸药后螨虫非常活跃，处理后5-8h就开始减慢活动，12-24h后虫体静止。
死亡判定标准：检查时用毛笔轻触螨体，完全不动者判定为死亡。
实验结果如表2：
表2天维菌素和阿维菌素对朱砂叶螨的活性
结果表明，天维菌素对朱砂叶螨的LC50为0.0049mg/L，阿维菌素对朱砂叶螨的LC50为0.0083mg/L，天维菌素对朱砂叶螨的活性高于阿维菌素。
2.天维菌素对棉铃虫和粘虫的活性测定：以棉铃虫和粘虫为试虫，测定天维菌素的活性，并以米尔贝霉素和阿维菌素为对照药剂。
供试生物：棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)，3龄幼虫；粘虫(Mythimnaseparate Walker)，3龄幼虫。
供试药剂：0.5％天维菌素乳油，2％米尔贝霉素乳油，0.5％阿维菌素乳油。
制剂 有效成分 溶剂 乳化剂
0.5％天维菌素乳油 天维菌素：0.5g 甲醇：94.5g 壬基酚聚氧乙烯醚：5.0g
2％米尔贝霉素乳油 米尔贝霉素:2.0g 甲醇：93.0g 壬基酚聚氧乙烯醚：5.0g
0.5％阿维菌素乳油 阿维菌素:0.5g 乙酸乙酯:91.5g 月桂醇聚氧乙烯醚：8.0g
以水稀释为一定的浓度供试。
试验方法：采用饲料混药喂虫法，测定供试药剂对试虫的胃毒活性。试验结果：供试药剂对3龄棉铃虫和3龄粘虫的活性见表3和表4。
表3供试药剂对3龄棉铃虫的活性
表4供试药剂对3龄粘虫的活性
实验结果表明，在相同的药剂浓度下，天维菌素对棉铃虫和粘虫的活性高于米尔贝霉素，而与阿维菌素相近。
3.天维菌素对松材线虫的活性测定：以松材线虫为试虫，测定天维菌素、阿维菌素、伊维菌素、米尔贝霉素、甲维盐等十六元大环内酯类化合物的室内活性。以比较该类药剂对松材线虫活性差异。
试验药剂：0.5％阿维菌素乳油、0.5％天维菌素乳油、0.5％伊维菌素乳油、2％米尔贝霉素乳油、2.5％甲维盐微乳剂5种药剂。
试验方法：采用浸液法。每种药剂设立5个质量浓度2、5、10、20、50mg/L，每浓度重复3次，24h统计实验结果(见表5)。
表5几种十六元大环内酯类化合物对松材线虫的毒力测定
试验结果表明，在供试的十六元大环内酯类化合物中，天维菌素对松材线虫的活性最高。
参考文献
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Claims (7)

1.表达阿维菌素或其类似物的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌
(1)具有失活的或降低活性的aveD基因，具有失活的或降低活性的aveA1基因，并且具有功能性的milA1基因；或者
(2)具有失活的或降低活性的aveA1基因，并且具有功能性的milA1基因；
其中，所述阿维菌素或其类似物是阿维菌素B1a和阿维菌素B1b；或者所述阿维菌素或其类似物是天维菌素。
2.根据权利要求1的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌是除虫链霉菌。
3.根据权利要求1或2所述重组链霉菌用于生产阿维菌素或其类似物的用途；
其中，所述阿维菌素或其类似物是阿维菌素B1a和阿维菌素B1b；或者所述阿维菌素或其类似物是天维菌素。
4.一种生产阿维菌素或其类似物的方法，其包括培养权利要求1或2的重组链霉菌，以及从培养物中回收阿维菌素或其类似物；
其中，所述阿维菌素或其类似物是阿维菌素B1a和阿维菌素B1b；或者所述阿维菌素或其类似物是天维菌素。
5.一种构建权利要求1或2所述重组链霉菌的方法，所述方法包括：
(1)提供待改造的链霉菌；
并且所述方法还包括以下至少一个步骤：
(2)将所述待改造链霉菌中的aveD基因失活或降低其活性，将所述待改造链霉菌中的aveA1基因失活或降低其活性，并且向所述待改造链霉菌中引入功能性的milA1基因；和
(3)将所述待改造链霉菌中的aveA1基因失活或降低其活性，并且向所述待改造链霉菌中引入功能性的milA1基因。
6.根据权利要求5的方法，其中所述待改造的链霉菌是除虫链霉菌。
7.根据权利要求5或6的方法，其中在步骤(2)中通过PCR打靶将aveD基因失活或降低其活性。
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