CN108660101B

CN108660101B - 表达天维菌素b的重组微生物、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN108660101B
Application number: CN201710216023.XA
Authority: CN
Inventors: 黄隽; 余贞; 周亚娜; 林甲壇; 周小华; 李美红
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Tianwei Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-04-01
Filing date: 2017-04-01
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-04-01
Also published as: WO2018177146A1; CN108660101A

Abstract

本发明涉及一种单组分天维菌素B基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在天维菌素产生菌Streptomyces avermitilis MA220的基因组中将milA1基因的AT0结构域置换成红霉素合成基因簇的AT0结构域而获得。所述天维菌素B工程菌发酵后，只产生单一组分的天维菌素B。

Description

表达天维菌素B的重组微生物、制备方法及其用途

技术领域

本发明属于基因工程及微生物发酵领域，具体涉及表达天维菌素B的重组微生物及其制备方法，以及利用所述重组微生物生产天维菌素B的方法。

背景技术

天维菌素类化合物是从阿维菌素产生菌除虫链霉菌MA-4680出发进行基因改造，结合阿维菌素、伊维菌素和米尔贝霉素的化学结构和各自生物学特性(抗虫活性、抗虫谱以及生物毒性)上的优势，设计得到的一组十六元大环内酯类新化合物(Jun Huang,An-LiangChen,Hui Zhang,et al.Gene Replacement for the Generation of Designed NovelAvermectin Derivatives with Enhanced Acaricidal and NematicidalActivities.Applied and Environmental Microbiology,August 2015,Volume 81,Number 16.)。该类化合物具有广谱、高效、无残留毒性，对环境友好等特征。初步的活性试验结果也表明，天维菌素对多种常见害虫，如红蜘蛛、烟粉虱、稻飞虱、蓟马、猪鞭虫等等的抗虫活性要远远高于阿维菌素、伊维菌素、米尔贝霉素、甲维盐等主流农药和兽药，而毒性则低于目前市面上常用的农药和兽药，具有进一步开发成新型高效农药和兽药的潜力。

天维菌素类化合物一般包括天维菌素A(TEVA)和天维菌素B(TEVB)，具体结构通式如下：

R为CH₃时为天维菌素A；R为C₂H₅时为天维菌素B。

专利PCT/CN2015/073960公开了一种天维菌素类化合物的制备方法，其通过失活除虫链霉菌MA4680中的aveD基因，并且用功能性milA1基因替换链霉菌基因组中的aveA1基因从而获得了一种可以生产天维菌素的基因工程菌MA220。但是在其发酵代谢产物中，天维菌素B的含量较低，根据其公开的技术内容来看，天维菌素A和天维菌素B的比例(质量比)为7:3、8:2或9:1。而天维菌素B组分抗朱砂叶螨、小菜蛾、棉铃虫，松材线虫病，水稻螟虫等农林作物害虫活性要优于组分A，因此有必要开发一种可生产高含量天维菌素B的工程菌种。

发明内容

本发明的第一方面是提供一种表达天维菌素B的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea NRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。

在一个实施方案中，本发明的重组链霉菌是将除虫链霉菌MA220中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea NRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。所述除虫链霉菌MA220可通过专利PCT/CN2015/073960公开的相关方法进行制备。

在另一个实施方案中，所述重组链霉菌只表达天维菌素B而不表达天维菌素A。

在一个具体实施方案中，所述milA1AT0结构域基因编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述eryA1AT0结构域基因编码序列如SEQ IDNO:3所示；所述置换是通过将DNA片段S导入到除虫链霉菌MA220中，使DNA片段S与出发菌MA220中的milA1基因发生同源重组而完成。

本发明的第二方面是提供本发明的重组链霉菌用于生产天维菌素B的用途。

本发明的第三个方面是提供一种生产天维菌素B的方法，其包括培养所述重组链霉菌，以及从培养物中回收天维菌素B。

本发明的第四个方面是提供一种构建所述重组链霉菌的方法，所述方法包括：

(1)提供待改造的链霉菌；

(2)将所述待改造链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea NRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。

在一个实施方案中，所述待改造的链霉菌是除虫链霉菌，优选地是除虫链霉菌MA220。

在另一个实施方案中，所述置换是通过将DNA片段S导入到除虫链霉菌MA220中，使DNA片段S与出发菌MA220中的milA1基因发生同源重组而完成。

在又一个实施方案中，所述eryA1AT0结构域基因编码片段包含eryA1中完整AT0结构域基因编码序列948bp核苷酸；编码序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。所述milA1AT0结构域基因编码序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在一个具体的实施方案中，所述DNA片段S，自5’端到3’端分别为同源臂T1、eryA1AT0结构域基因编码片段和同源臂T2；所述同源臂T1和同源臂T2能与milA1基因的相应位置发生同源重组。

更具体地来说，所述同源臂T1与milA1基因中AT0结构域的上游序列同源重组；进一步优选地，所述同源臂T1包括milA1基因编码序列5’端306bp核苷酸。所述同源臂T2与milA1基因中AT0结构域的下游序列同源重组；进一步优选地，所述同源臂T2包括milA1基因编码序列中端1360bp核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述片段S的序列如SEQ ID NO:5所示。

同源重组的原理是本领域技术人员已知的。

所述DNA片段S分别在同源臂T1和同源臂T2包括milA1AT0基因编码序列的上游和下游序列。当T1、T2与除虫链霉菌MA220的milA1AT0的上下游发生同源重组时，所述DNA片段S将被重组至除虫链霉菌MA220的基因组中，从而使出发菌中milA1AT0被DNA片段S所携带的eryA1AT0置换，使eryA1AT0在构建的基因工程菌中表达。本领域技术人员可以理解，当milA1AT0基因的上游和下游分别被扩增后，需要将二者连接起来以形成完整的DNA片段。通常情况下，本领域技术人员将使用限制性内切酶识别序列来连接两个片段。限制性内切酶的选择、包含限制性内切酶识别序列的引物设计、PCR扩增以及扩增片段的回收和连接等都是本领域技术人员根据所使用的质粒、菌株和实验条件可以选择和判断的。

本公开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个实施方案中所记载的一个或更多个技术特征可以与任意的一个或更多个其它实施方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本公开内容中具体记载一样。

通过以上至少一个方面，本发明的重组链霉菌可以高效地生产天维菌素B，并且该重组链霉菌并不表达天维菌素A。从而解决了现有技术中现有链霉菌株表达天维菌素B含量过低，生产困难的技术问题。本发明的重组链霉菌发酵生产天维菌素B的稳定性好，得率高，较化学合成方法更为环境友好和简单，还极大地节省了生产成本。

附图说明

下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

图1：用于milA1基因双交换的重组质粒SAT-TUeatTD构建过程示意图；

图2：重组质粒SAT-TAT0U的结构及酶切位点示意图；

图3：构建的质粒SAT-TAT0U的酶切电泳检测图；其中M是DNA Ladder(Fermentas#SM0333)，泳道1是PvuⅡ和Xho I双酶切质粒SAT-TAT0U后的电泳图；

图4：重组质粒SAT-TAT0UD的结构及酶切位点示意图；

图5：重组质粒SAT-TUeatTD的结构及酶切位点示意图；

图6：构建的质粒SAT-TAT0UD、SAT-TUeatTD的酶切电泳检测图；其中M是DNALadder，泳道5、10、15是质粒SAT-TAT0UD分别以BamHⅠ、SmaⅠ、SphⅠ酶切后的电泳图，泳道1～4分别是构建的4个SAT-TUeatTD质粒以BamHⅠ酶切后的电泳图，泳道6～9分别是构建的4个SAT-TUeatTD质粒以SmaⅠ酶切后的电泳图，泳道11～14分别是构建的4个SAT-TUeatTD质粒以SphⅠ酶切后的电泳图；

图7：milA1基因双交换原理及AT0基因置换示意图；

图8：milA1AT0基因被eryA1AT0置换重组子PCR筛选的电泳图；其中1～15泳道是待检测菌株TWB-1#～TWB-15#；16泳道是出发菌株MA220(负对照)；17是质粒SAT-TUeatTD(正对照)；M是DNA ladder(TaRaKa，货号D501A)。

图9：出发菌MA220的发酵产物天维菌素A(出峰时间为6.7-7.3min)以及天维菌素B(出峰时间为8.2-8.7min)的HPLC图谱。图10：除虫链霉菌TWB-13#工程菌的发酵产物天维菌素B(出峰时间为8.2-8.7min)的HPLC图谱。

具体实施方式

本申请所用术语具有与现有技术中该术语相同的含义。为了清楚地表明所用术语的含义，以下给出一些术语在本申请中的具体含义。当以下定义与该术语的常规含义有冲突时，以以下定义为准。

通过大量研究努力，发明人发现，天维菌素组分A和B是由milA1基因Loadingmodule(LD模块)的AT结构域(milA1AT0)决定。该结构域能以乙酰辅酶A和丙酰辅酶A为启始单元，最后分别得到天维菌素A和天维菌素B。经CSDB(http://csdb.bioserv.pbf.hr/csdb/ClustScanWeb.html)数据库查询，发现红霉素合成基因簇中eryA1基因的LD模块与milA1基因的LD模块结构一致，均为AT-ACP结构域，而红霉素合成基因簇中的eryA1AT0结构域是以丙酰辅酶A为启始单元。因此在之前发明专利基础上，发明人通过将milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea NRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列，成功获得了一种稳定表达天维菌素B的重组链霉菌。

实施例1用于置换milA1-AT0基因的重组质粒SAT-TUeatTD的构建

构建过程如图1所示，具体步骤如下：

a)放线菌基因组的分离：取放线菌冻存管菌液200μl接种于30ml TSB培养基(Bacto TM Tryptic Soy Broth.BD公司，货号211825)，28℃，220rpm培养48hr后，于50ml离心管中，4000rpm离心10分钟，去上清，沉淀用30ml蔗糖-Tris缓冲液(10.3％蔗糖，10mMTris-HCl，pH 8.0)洗涤2遍后，以5ml蔗糖-Tris缓冲液悬浮。加入100mg/ml溶菌酶溶液20μl，37℃水浴2hr。加入10％SDS溶液500μl，温和颠倒直至基本澄清。加酚-氯仿-异戊醇(25:24:1，pH8.0)溶液5ml，温和颠倒数次后，4000rpm离心10分钟。取上层溶液4ml，加酚-氯仿-异戊醇(25:24:1，pH8.0)溶液4ml，温和颠倒数次后4000rpm离心10分钟。取上层溶液3ml，加入3mol/L的HAc/NaAc缓冲液(pH 5.3)300μl，异丙醇3ml，温和颠倒数次后，将结团的沉淀用吸头挑到1.5ml离心管中。沉淀用70％乙醇洗涤2遍后，室温干燥。加入500μl Tris-HCl(pH 8.0)溶解，得到放线菌的总DNA。

b)milA1-AT0结构域编码基因上游片段的扩增和克隆：引物为：266TUF:AAATCTAGATCTGGTGCACATCGACGAGTACGCCGGAATGATCG(SEQ ID NO:6)；267TUR:AAATCTAGAGAACGCGACCCCGTCGCCGCCCGC(SEQ ID NO:7)。

按以下配比配制反应液：

(PrimeSTAR试剂盒，TaKaRa)

进行PCR反应，程序为：

95℃×5分钟，

(98℃×15秒、68℃×1分钟20秒)×25个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物以PCR产物回收试剂盒(康宁生物技术有限公司)回收后，以XbaⅠ酶切，回收产物与以XbaⅠ酶切的载体SupAmT连接，得到重组质粒SAT-TAT0U。

质粒SAT-TAT0U的结构及酶切位点如图2所示。利用PvuⅡ和Xho I双酶切构建的质粒以检测是否正确。质粒SAT-TAT0U的酶切电泳图如图3所示。

c)milA1-AT0结构域编码基因下游片段的扩增和克隆：引物为：268TDF:AAATCTAGAGACCATCGGGCGGCGTTCTCGGTG(SEQID NO:8)269TDR:AAATCTAGATCCGGATGACCTGTTGCTGTGATGGACCGCTG(SEQ ID NO:9)

按以下配比配制反应液：

进行PCR反应，程序为：

95℃×5分钟，

(98℃×15秒、68℃×1分钟20秒)×25个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物以PCR产物回收试剂盒(康宁生物技术有限公司)回收后，以XbaⅠ酶切，回收产物与以XbaⅠ酶切的质粒SAT-TAT0U连接，得到重组质粒SAT-TAT0UD。

d)eryA1-AT0结构域编码基因片段的扩增和克隆：引物为：272EAF:GACGGGGTCGCGTTCGTCTTCCCGGGCCAGGGCGCGCAATGG(SEQ ID NO:10)；273EAR:CGCCGCCCGATGGTCGACGGCCACGCCGCCGGTGAACGCCTGGG(SEQ ID NO:11)

按以下配比配制反应液：

进行PCR反应，程序为：

95℃×5分钟，

(98℃×15秒、68℃×1分钟)×25个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物以PCR产物回收试剂盒(康宁生物技术有限公司)回收后，回收产物与以XbaⅠ酶切的质粒SAT-TAT0UD以

PCR克隆试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司，货号L00339)连接，得到重组质粒SAT-TUeatTD。

质粒SAT-TAT0UD、SAT-TUeatTD的结构及酶切位点分别如图4、5所示。分别用BamHⅠ、SmaⅠ、SphⅠ酶切构建的质粒以检测质粒是否正确。质粒SAT-TAT0UD、SAT-TUeatTD的酶切电泳图如图6所示。

进一步通过测序检验SAT-TUeatTD质粒中引物266TUF和269TDR之间的序列，其中从序TGGTGCACATCGACGAGTACGCCGGAATGATC(引物266TUF部分序列)开始至序列CAGCGGTCCATCACAGCAACAGGTCATCCGG(引物269TDR的反向互补序列的部分序列)之间的序列即为SEQ ID NO:5所示的连接片段S的序列。

实施例2将milA1-AT0基因置换的重组质粒SAT-TUeatTD转化到宿主菌天维菌素生产菌MA220

a)将重组质粒SAT-TUeatTD转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)：取1μl重组质粒SAT-TUeatTD加入到100μl大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞(以CaCl2法制备)中，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，再迅速放到冰上冷却1分钟，加入900μl LB 培养，37℃水浴50分钟。取100μl涂布于含25μg/ml氯霉素(Cm)、50μg/ml卡那霉素(Km)、50μg/ml安普霉素(Am)的固体LB培养上，37℃培养过夜，长出转化子，挑选其中一个转化子并鉴定已转入质粒SAT-TUeatTD，命名为ET12567(pUZ8002,SAT-TUeatTD)。

b)大肠杆菌ET12567(pUZ8002,SAT-TUeatTD)的培养：挑一个转化子单菌落于3ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Am的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养过夜，菌液300μl接种于30ml含Cm、Km、Am的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养4-6h，至OD600为0.4-0.6之间。收集菌液，离心后，以LB培养基洗涤2遍，最后以3ml LB培养基悬浮，备用。

c)宿主菌MA220的准备：从平板上刮下除虫链霉菌MA220的孢子到1000μl 2×YT培养基中悬浮，50℃热激10min，自然冷却，备用。

d)接合转移：取500μl b)的菌液加入到1000μl c)的孢子悬液中，混匀后离心去掉800μl上清。以剩余的上清悬浮菌体，并涂布于MS培养基。28℃培养16-20h后，以含有500μgAm和500μg萘啶酮酸(Nal)的1ml无菌水覆盖，28℃培养6-7d，长出转化子。

双交换过程的原理图如图7所示。

实施例3milA1-AT0被eryA1-AT0基因置换的除虫链霉菌工程菌的筛选培养及鉴定

a)挑一个转化子，在含有25μg/ml Am和25μg/ml Nal的YMS培养基上划线，28℃培养5-6d。将生长的菌落在不含抗生素的YMS 培养基上28℃连续培养2代后，再在不含抗生素的YMS培养基上划线分离单菌落，28℃培养5-6d。

b)用牙签将a)得到的单菌落分别于含和不含25μg/ml Am的YMS培养基上点种，28℃培养5-6d。挑选在含25μg/ml Am的YMS培养基上不生长而在不含Am的YMS培养基上生长的菌落，在不含抗生素的YMS培养基上进行放大培养。

c)利用PCR方法对放大培养的菌株进行筛选，所用的引物为：273EAR:CGCCGCCCGATGGTCGACGGCCACGC CGCCGGTGAACGCCTGGG(SEQ ID NO:11)；270TCF:AGAACGAGTTCGCAGTGGCCGGTCATCCGTGGATC(SEQ ID NO:12)。

按以下配比配制反应液：

15μl/管分装，分别用牙签挑取步骤b)所筛选的菌落为模版进行PCR反应，并以1.0μl MA220总DNA和重组质粒SAT-TUeatTD分别为负对照和正对照。PCR反应程序为：

95℃×5分钟，

(94℃×30秒、68℃×1分钟20秒)×25个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物大小为1238bp的是milA1-AT0被eryA1-AT0基因成功置换的工程菌；无PCR产物或者PCR产物大小非1238bp的均为回复突变，即其基因型与出发菌MA220相同，milA1-AT0未被eryA1-AT0置换。图8是PCR筛选的电泳图。选择第13#菌，命名为TWB-13#，对该菌进行测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO:13所示。PCR电泳结果与测序结果说明该菌株即是本发明预期的菌株。

实施例4基因工程菌TWB-13#的发酵检验

将eryA1-AT0基因置换的天维菌素工程菌TWB-13#在YMS培养基上28℃培养5-6天后，将面积为1cm²左右菌落挖到30ml种子培养基(玉米淀粉2.5％，黄豆饼粉0.8％，花生饼粉1％，酵母粉0.95％，CoCl₂ 0.003％，pH 7.2-7.4)中，28℃，250rpm培养40hr，以6％的接种量转接于发醉培养基(玉米淀粉14％，淀粉酶0.003％，黄豆饼粉2.0％，酵母粉1％，沸石粉0.2％，MnSO₄ 0.0024％,Na₂MoO₄ 0.0024％,CoC1₂·6H₂0 0.002％，pH 7.2-7.4)，28℃，250rpm，培养8d。取1ml发酵液，加入4ml无水甲醇浸泡，超声1h后，过滤。滤液直接用于HPLC分析。HPLC分析的条件为：色谱柱：C18Hypersil ODS2 4.6×250×5(大连依利特)；流动相：甲醇：乙醇：水＝81:7:12；流速：1ml/min；吸收波长：240nm。

检测结果如图9、图10所示。图9：出发菌株MA220的发酵液HPLC图谱；图10：基因工程菌TWB-13#的发酵液HPLC图谱。从图谱可见，天维菌素A和B组分的保留时间分别是6.95和8.39分钟。结果表明，与出发菌株MA220相比，以eryA1-AT0置换milA1-AT0的天维菌素工程菌TWB-13#只产生天维菌素B单组分，不再产生天维菌素A组分。

序列表

<110> 浙江海正药业股份有限公司

<120> 表达天维菌素B的重组微生物、制备方法及其用途

<130> MP1619312

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> milA1 AT0结构域基因编码序列

<400> 1

gtcttccccg gccagggcac ccagtggccc ggtatggccg ccgatctgct gacggtctcc 60

cccgccttca gccgggcggt cgacgcctgc gccgaggcgt tcgaaccgta tgtctcctgg 120

tcaccggagg ccgtgctgcg gggcgctccg ggcgcgccgc ccctggaggg gaccgatgtg 180

gtgcagccga cgctgttcgc cgtcatggtg gggctggccg agctgtggcg gactcttggg 240

gtgagcccga cgtcgatcgt gggccactgc atcggggaga tcgcggcagc ccatctctgc 300

ggcgccctgt cgctgtccga cgcggcgcgc gtggtgatcg agagcagccg ggcccaggcg 360

acgctctccg ggtcgggtgc gctgatcgcg gtcgcgcggt ccgaggcgca gctgcttccg 420

ttgctgcggc ggtggccggg caggctgacg atcgccgcggt caacggcccg atggccacg 480

gtcgtctccg gcgatcggcc ggccgccgac gagctgttgg cggagttcgc ccgtgccggt 540

gtccgggccc gcgaggtggc gatcgacatc cccgcgcact cgccgttcat ggcccccctc 600

agggacggtc tgctcgactc gctgtcatcg gtcaccgcgg gtgcgtcgcg gctgccgttc 660

cactcctcgg tcatcggggg gccgctggag acccaagggc tcgacgcggc ttactggtac 720

cggaacctcg ccgacacggt ccgcttcgaa agcgtcgtca cggggctgct gcggcagggc 780

acacgctgct tcgtggagct gagcccgcac ccgatgctga ccatgtgtgt gcaggccacc 840

gccgaggagg tggtcggcgg tgagcgcgtc gtgatcctgc cgacgctgca tcgcgggcag 900

gccgccgtcg agtccgttcg caccacgctg gccgagctgt acgtacgggg cgcactggat 960

<210> 2

<211> 320

<212> PRT

<213> milA1-AT0编码的氨基酸序列

<400> 2

Val Phe Pro Gly Gln Gly Thr Gln Trp Pro Gly Met Ala Ala Asp 15

Leu Leu Thr Val Ser Pro Ala Phe Ser Arg Ala Val Asp Ala Cys 30

Ala Glu Ala Phe Glu Pro Tyr Val Pro Trp Ser Pro Glu Ala Val 45

Leu Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Pro Leu Glu Gly Thr Asp Val 60

Val Gln Pro Thr Leu Phe Ala Val Met Val Gly Leu Ala Glu Leu 75

Trp Arg Thr Leu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Val Gly His Cys 90

Ile Gly Glu Ile Ala Ala Ala His Leu Cys Gly Ala Leu Ser Leu 105

Ser Asp Ala Ala Arg Val Val Ile Glu Ser Ser Arg Ala Gln Ala 120

Thr Leu Ser Gly Ser Gly Ala Leu Ile Ala Val Ala Arg Ser Glu 135

Ala Gln Leu Leu Pro Leu Leu Arg Arg Trp Pro Gly Arg Leu Thr 150

Ile Ala Ala Val Asn Gly Pro Met Ala Thr Val Val Ser Gly Asp 165

Arg Pro Ala Ala Asp Glu Leu Leu Ala Glu Leu Ala Arg Ala Gly 180

Val Arg Ala Arg Glu Val Ala Ile Asp Ile Pro Ala His Ser Ala 195

Phe Met Ala Pro Leu Arg Asp Gly Leu Leu Asp Ser Leu Ser Ser 210

Val Thr Ala Gly Ala Ser Arg Leu Pro Phe His Ser Ser Val Ile 225

Gly Gly Pro Leu Glu Thr Gln Gly Leu Asp Ala Ala Tyr Trp Tyr 240

Arg Asn Leu Ala Asp Thr Val Arg Phe Glu Ser Val Val Thr Gly 255

Leu Leu Arg Gln Gly Thr Arg Cys Phe Val Glu Leu Ser Pro His 270

Pro Met Leu Thr Met Cys Val Gln Ala Thr Ala Glu Glu Val Val 285

Gly Gly Glu Arg Val Val Ile Leu Pro Thr Leu His Arg Gly Gln 300

Ala Ala Val Glu Ser Val Arg Thr Thr Leu Ala Glu Leu Tyr Val 315

Arg Gly Ala Leu Asp 320

<210> 3

<211> 948

<212> DNA

<213> 红色糖多孢菌eryA1-AT0编码序列

<400> 3

ttcgtcttcc cgggccaggg cgcgcaatgg gccgggatgg cgggcgaact cctcggcgag 60

tcaagggttt tcgccgccgc gatggacgcg tgcgcgcggg cgttcgagcc cgtgaccgac 120

tggacgctgg cgcaggtcct ggactctccc gagcagtcgc gccgcgtcga ggtcgtccag 180

cccgccctgt tcgcggtgca gacgtcgctg gccgcgctct ggcgctcctt cggcgtgacc 240

cccgacgccg tggtgggcca cagcatcggc gagctggccg ccgcgcacgt gtgcggtgcg 300

gccggtgccg ccgacgccgc gcgcgccgcc gcgctgtgga gccgcgagat gattccgttg 360

gtgggcaacg gcgacatggc agccgtcgcg ctctccgccg acgagatcga gccgcgcatc 420

gcccggtggg acgacgacgt ggtgctggcc ggggtcaacg gtccgcgctc ggttctgctg 480

accgggtcgc cggaaccggt cgcgcgccgg gtccaggagc tctcggccga gggggtccgc 540

gcacaggtca tcaatgtgtc gatggcggcg cactcggcgc aggtcgacga catcgccgag 600

gggatgcgct cggccctggc gtggttcgcg cccggtggct cggaggtgcc cttctacgcc 660

agcctcaccg gaggtgcggt cgacacgcgg gagctggtgg ccgactactg gcgccgcagc 720

ttccggctgc cggtgcgctt cgacgaggcg atccggtccg ccctggaggt cggtcccggc 780

acgttcgtcg aagcgagccc gcacccggtg ctggccgccg cgctccagca gacgctcgac 840

gccgagggct cctcggccgc ggtggtcccg acgctgcaac gcgggcaggg cggcatgcgg 900

cggttcctgc tggccgcggc ccaggcgttc accggcggcg tggccgtc 948

<210> 4

<211> 316

<212> PRT

<213> 红色糖多孢菌eryA1-AT0编码氨基酸序列

<400> 4

Phe Val Phe Pro Gly Gln Gly Ala Gln Trp Ala Gly Met Ala Gly 15

Glu Leu Leu Gly Glu Ser Arg Val Phe Ala Ala Ala Met Asp Ala 30

Cys Ala Arg Ala Phe Glu Pro Val Thr Asp Trp Thr Leu Ala Gln 45

Val Leu Asp Ser Pro Glu Gln Ser Arg Arg Val Glu Val Val Gln 60

Pro Ala Leu Phe Ala Val Gln Thr Ser Leu Ala Ala Leu Trp Arg 75

Ser Phe Gly Val Thr Pro Asp Ala Val Val Gly His Ser Ile Gly 90

Glu Leu Ala Ala Ala His Val Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Asp 105

Ala Ala Arg Ala Ala Ala Leu Trp Ser Arg Glu Met Ile Pro Leu 120

Val Gly Asn Gly Asp Met Ala Ala Val Ala Leu Ser Ala Asp Glu 135

Ile Glu Pro Arg Ile Ala Arg Trp Asp Asp Asp Val Val Leu Ala 150

Gly Val Asn Gly Pro Arg Ser Val Leu Leu Thr Gly Ser Pro Glu 165

Pro Val Ala Arg Arg Val Gln Glu Leu Ser Ala Glu Gly Val Arg 180

Ala Gln Val Ile Asn Val Ser Met Ala Ala His Ser Ala Gln Val 195

Asp Asp Ile Ala Glu Gly Met Arg Ser Ala Leu Ala Trp Phe Ala 210

Pro Gly Gly Ser Glu Val Pro Phe Tyr Ala Ser Leu Thr Gly Gly 225

Ala Val Asp Thr Arg Glu Leu Val Ala Asp Tyr Trp Arg Arg Ser 240

Phe Arg Leu Pro Val Arg Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ser Ala Leu 255

Glu Val Gly Pro Gly Thr Phe Val Glu Ala Ser Pro His Pro Val 270

Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gln Thr Leu Asp Ala Glu Gly Ser Ser 285

Ala Ala Val Val Pro Thr Leu Gln Arg Gly Gln Gly Gly Met Arg 300

Arg Phe Leu Leu Ala Ala Ala Gln Ala Phe Thr Gly Gly Val Ala 315

Val 316

<210> 5

<211> 3674

<212> DNA

<213> 阿维链霉菌

<400> 5

tggtgcacatcgacgagtacgccggaatgatcgccgacgccgggctggaactgcatgagc 60

tgaccgacatcggcgatcaggtcgtcggcccctctttcgccgcgctgcgtgaccacgtga 120

acgagcacctcgacgagtacgcggcggccttcgggatcggcgtcgcggagatgcggaagg 180

tggttgcacagtgcacgacgctcccctggacgccggacatcggctatgtcgtgctgaccg 240

cccggcgcccgggcgatctcccggatcacctgtgcggggctgggcatgtgcaggagacac 300

tccagggcccacgccgcgtcgaaggacccgtcgggaaacggcagttccatcgcgtcggca 360

cgggtgaacacgacccggtccgccacgtgcgactgcttcgcgagagcggtcgccagcccg 420

acctgaacctcgctcaccgtcacgccgacgacatcgacgggcgcgctcagggcgagccgc 480

accgccggctttccggaaccgcagccgacgtccaggacccggcggcccgtgatgcctctc 540

agcttgccgatgaggagatcggtgagccggtcggcggccttgcccggtgaactgccgtcc 600

cccggctgcggccagtatccgaggtgggtgttcccacccagcgcacgattcatgaggtcg 660

gtcaaacggtcgtagtagtcccccacttccagggaagagggcggggtctgctccgggacg 720

gccatcatggtcgggaacctccgcaatccgggccgggcggcccagctgtcgtggcgatct 780

actccaggaaacgtagacctttttctgccacttgtccgagctatgcagacaccccgatcc 840

cctaagaaatgaacacccttgggaacggcacagcccaggggtggataggggtattcgccg 900

ccgccgcgccgtcattagctttgaagagttgaagacgttcaagacattgatgcccggccg 960

tcagcggatttctcgcgctcctttcattcttcgacgctgcattgcagctctcatcatgtc 1020

cgcacggccgccgagcattgcctagcggtgaggacacagctcagttgcccaaagcccaga 1080

acgagttcgcagtggccggtcatccgtggatcctctccgggcacaccggaaccgcgctgc 1140

gggcccaggcacgccggctccacgaccatgtcgccgaccaccctcggctccgtccggaag 1200

acatcgcccacacgctggcgagcagcggcccggcgctcacccatcgcgcggcggtgatcg 1260

cggcggaccgggaaggacatctccgggggctcgacgcggtggcccggggtgaggacaccc 1320

ccggtgtcgtacggggcacggcggccgcgggcggcgacggggtcgcgttcgtcttcccgg 1380

gccagggcgcgcaatgggccgggatggcgggcgaactcctcggcgagtcaagggttttcg 1440

ccgccgcgatggacgcgtgcgcgcgggcgttcgagcccgtgaccgactggacgctggcgc 1500

aggtcctggactctcccgagcagtcgcgccgcgtcgaggtcgtccagcccgccctgttcg 1560

cggtgcagacgtcgctggccgcgctctggcgctccttcggcgtgacccccgacgccgtgg 1620

tgggccacagcatcggcgagctggccgccgcgcacgtgtgcggtgcggccggtgccgccg 1680

acgccgcgcgcgccgccgcgctgtggagccgcgagatgattccgttggtgggcaacggcg 1740

acatggcagccgtcgcgctctccgccgacgagatcgagccgcgcatcgcccggtgggacg 1800

acgacgtggtgctggccggggtcaacggtccgcgctcggttctgctgaccgggtcgccgg 1860

aaccggtcgcgcgccgggtccaggagctctcggccgagggggtccgcgcacaggtcatca 1920

atgtgtcgatggcggcgcactcggcgcaggtcgacgacatcgccgaggggatgcgctcgg 1980

ccctggcgtggttcgcgcccggtggctcggaggtgcccttctacgccagcctcaccggag 2040

gtgcggtcgacacgcgggagctggtggccgactactggcgccgcagcttccggctgccgg 2100

tgcgcttcgacgaggcgatccggtccgccctggaggtcggtcccggcacgttcgtcgaag 2160

cgagcccgcacccggtgctggccgccgcgctccagcagacgctcgacgccgagggctcct 2220

cggccgcggtggtcccgacgctgcaacgcgggcagggcggcatgcggcggttcctgctgg 2280

ccgcggcccaggcgttcaccggcggcgtggccgtcgaccatcgggcggcgttctcggtgc 2340

cgggcggccgcctgatcaccctgcctctcgagccgcccgcggacacgtccgtagagctcg 2400

ccgacgccccggacccggcggaggcctgccggccccccttggtggagcggcttgcccggc 2460

tctccaccgcggagcggaagcggcggctgcgcgagctggtgggcgtcgaggcggccaagg 2520

tcctcgaggacgtcgccggggcggacgcgccgggccacggcatcgcggagcaggagcact 2580

tcgtcacttcgggcttcgactccgcggccgcggtcgcgctgcgcaaccgcctgaacgacg 2640

ccaccggtttgctgctgcccttcaccctggccttcgaccatccgacacccgccgccgtcg 2700

ccgaccatctgcactcccggctcttcgatcaccagggcggcgggcagccgggcgccgacg 2760

gccggcccgaccccgcggcggcggccggtccggccagggccgacgacgagccgatcgccg 2820

tcatcggcatggcgggccgcttccccgggggcgcccgtaccccggaggagctgtgggaac 2880

tggtcgccgaaggcaccgacgccctctcgcccttcccggagggccggggctgggatccgc 2940

tgcggctctacgatccggaccccgcccggcccggcacgtactaccagcgcgaagcgggat 3000

tcctccacgacgccgacaagttcgacgccgagttcttcggcatcgcgccacgcgaggcca 3060

ccgcaatggatccccagcagcggctgctcctggagacctcctgggaggcgctcgaacggg 3120

cgcggatcgacccgaccgcgctgcgcggcagccgcaccggggtgttcgtcggcgtggccc 3180

cgctggactacagcccccgaatgcaccaggcgtcgccggagctggagggccatctgctga 3240

ccggcaacatcggcgccgcggcctcggggcggatctcctacgtactcgggcttgaggggc 3300

ccgcggtgtccgtggacacggcgtgctcgtcgtccctggtcgccctgcatctggcggccc 3360

aggcgctgcgggccggggagtgctcgctggccctggtcggcggggcgacggtcctctcga 3420

cccccggcatgttcatcgagttctcgcggcagcgcggtctggctccggacggccgctgca 3480

aggcgtacgcggccgccgcggacggcaccggctggtccgagggtgtgggcatgctgctcg 3540

tcgagcggctgtccgacgcgcgacggctcggacaccaggtgcttgcggtggtacggggct 3600

ccgccgtcaaccaggacggggcgagcaacggcttcacggcgcccagcggtccatcacagc 3660

aacaggtcatccgg 3674

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成266TUF

<400> 6

aaatctagat ctggtgcaca tcgacgagta cgccggaatg atcg 44

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成267TUR

<400> 7

aaatctagag aacgcgaccc cgtcgccgcc cgc 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成268TDF

<400> 8

aaatctagag accatcgggc ggcgttctcg gtg 33

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成269TDR

<400> 9

aaatctagat ccggatgacc tgttgctgtg atggaccgct g 41

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成272EAF

<400> 10

gacggggtcg cgttcgtctt cccgggccag ggcgcgcaat gg 42

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成273EAR

<400> 11

cgccgcccga tggtcgacgg ccacgccgcc ggtgaacgcc tggg 44

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成270TCF

<400> 12

agaacgagtt cgcagtggcc ggtcatccgt ggatc 35

<210> 13

<211> 3592

<212> DNA

<213> 测序结果

<400> 13

ccgggctggaactgcatgagctgaccgacatcggcgatcaggtcgtcggcccctctttcg 60

ccgcgctgcgtgaccacgtgaacgagcacctcgacgagtacgcggcggccttcgggatcg 120

gcgtcgcggagatgcggaaggtggttgcacagtgcacgacgctcccctggacgccggaca 180

tcggctatgtcgtgctgaccgcccggcgcccgggcgatctcccggatcacctgtgcgggg 240

ctgggcatgtgcaggagacactccagggcccacgccgcgtcgaaggacccgtcgggaaac 300

ggcagttccatcgcgtcggcacgggtgaacacgacccggtccgccacgtgcgactgcttc 360

gcgagagcggtcgccagcccgacctgaacctcgctcaccgtcacgccgacgacatcgacg 420

ggcgcgctcagggcgagccgcaccgccggctttccggaaccgcagccgacgtccaggacc 480

cggcggcccgtgatgcctctcagcttgccgatgaggagatcggtgagccggtcggcggcc 540

ttgcccggtgaactgccgtcccccggctgcggccagtatccgaggtgggtgttcccaccc 600

agcgcacgattcatgaggtcggtcaaacggtcgtagtagtcccccacttccagggaagag 660

ggcggggtctgctccgggacggccatcatggtcgggaacctccgcaatccgggccgggcg 720

gcccagctgtcgtggcgatctactccaggaaacgtagacctttttctgccacttgtccga 780

gctatgcagacaccccgatcccctaagaaatgaacacccttgggaacggcacagcccagg 840

ggtggataggggtattcgccgccgccgcgccgtcattagctttgaagagttgaagacgtt 900

caagacattgatgcccggccgtcagcggatttctcgcgctcctttcattcttcgacgctg 960

cattgcagctctcatcatgtccgcacggccgccgagcattgcctagcggtgaggacacag 1020

ctcagttgcccaaagcccagaacgagttcgcagtggccggtcatccgtggatcctctccg 1080

ggcacaccggaaccgcgctgcgggcccaggcacgccggctccacgaccatgtcgccgacc 1140

accctcggctccgtccggaagacatcgcccacacgctggcgagcagcggcccggcgctca 1200

cccatcgcgcggcggtgatcgcggcggaccgggaaggacatctccgggggctcgacgcgg 1260

tggcccggggtgaggacacccccggtgtcgtacggggcacggcggccgcgggcggcgacg 1320

gggtcgcgttcgtcttcccgggccagggcgcgcaatgggccgggatggcgggcgaactcc 1380

tcggcgagtcaagggttttcgccgccgcgatggacgcgtgcgcgcgggcgttcgagcccg 1440

tgaccgactggacgctggcgcaggtcctggactctcccgagcagtcgcgccgcgtcgagg 1500

tcgtccagcccgccctgttcgcggtgcagacgtcgctggccgcgctctggcgctccttcg 1560

gcgtgacccccgacgccgtggtgggccacagcatcggcgagctggccgccgcgcacgtgt 1620

gcggtgcggccggtgccgccgacgccgcgcgcgccgccgcgctgtggagccgcgagatga 1680

ttccgttggtgggcaacggcgacatggcagccgtcgcgctctccgccgacgagatcgagc 1740

cgcgcatcgcccggtgggacgacgacgtggtgctggccggggtcaacggtccgcgctcgg 1800

ttctgctgaccgggtcgccggaaccggtcgcgcgccgggtccaggagctctcggccgagg 1860

gggtccgcgcacaggtcatcaatgtgtcgatggcggcgcactcggcgcaggtcgacgaca 1920

tcgccgaggggatgcgctcggccctggcgtggttcgcgcccggtggctcggaggtgccct 1980

tctacgccagcctcaccggaggtgcggtcgacacgcgggagctggtggccgactactggc 2040

gccgcagcttccggctgccggtgcgcttcgacgaggcgatccggtccgccctggaggtcg 2100

gtcccggcacgttcgtcgaagcgagcccgcacccggtgctggccgccgcgctccagcaga 2160

cgctcgacgccgagggctcctcggccgcggtggtcccgacgctgcaacgcgggcagggcg 2220

gcatgcggcggttcctgctggccgcggcccaggcgttcaccggcggcgtggccgtcgacc 2280

atcgggcggcgttctcggtgccgggcggccgcctgatcaccctgcctctcgagccgcccg 2340

cggacacgtccgtagagctcgccgacgccccggacccggcggaggcctgccggcccccct 2400

tggtggagcggcttgcccggctctccaccgcggagcggaagcggcggctgcgcgagctgg 2460

tgggcgtcgaggcggccaaggtcctcgaggacgtcgccggggcggacgcgccgggccacg 2520

gcatcgcggagcaggagcacttcgtcacttcgggcttcgactccgcggccgcggtcgcgc 2580

tgcgcaaccgcctgaacgacgccaccggtttgctgctgcccttcaccctggccttcgacc 2640

atccgacacccgccgccgtcgccgaccatctgcactcccggctcttcgatcaccagggcg 2700

gcgggcagccgggcgccgacggccggcccgaccccgcggcggcggccggtccggccaggg 2760

ccgacgacgagccgatcgccgtcatcggcatggcgggccgcttccccgggggcgcccgta 2820

ccccggaggagctgtgggaactggtcgccgaaggcaccgacgccctctcgcccttcccgg 2880

agggccggggctgggatccgctgcggctctacgatccggaccccgcccggcccggcacgt 2940

actaccagcgcgaagcgggattcctccacgacgccgacaagttcgacgccgagttcttcg 3000

gcatcgcgccacgcgaggccaccgcaatggatccccagcagcggctgctcctggagacct 3060

cctgggaggcgctcgaacgggcgcggatcgacccgaccgcgctgcgcggcagccgcaccg 3120

gggtgttcgtcggcgtggccccgctggactacagcccccgaatgcaccaggcgtcgccgg 3180

agctggagggccatctgctgaccggcaacatcggcgccgcggcctcggggcggatctcct 3240

acgtactcgggcttgaggggcccgcggtgtccgtggacacggcgtgctcgtcgtccctgg 3300

tcgccctgcatctggcggcccaggcgctgcgggccggggagtgctcgctggccctggtcg 3360

gcggggcgacggtcctctcgacccccggcatgttcatcgagttctcgcggcagcgcggtc 3420

tggctccggacggccgctgcaaggcgtacgcggccgccgcggacggcaccggctggtccg 3480

agggtgtgggcatgctgctcgtcgagcggctgtccgacgcgcgacggctcggacaccagg 3540

tgcttgcggtggtacggggctccgccgtcaaccaggacggggcgagcaacgg 3592

Claims

1.一种表达天维菌素B的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌中的milA1基因AT0结构域编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea NRRL23338) eryA1基因AT0结构域编码序列；其中所述表达天维菌素B的重组链霉菌是将除虫链霉菌MA220中的milA1基因AT0结构域编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraeaNRRL23338) eryA1基因AT0结构域编码序列而得到；并且所述milA1基因AT0结构域编码序列如SEQ ID NO: 1所示，所述eryA1基因AT0结构域编码序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1的重组链霉菌，所述重组链霉菌只表达天维菌素B而不表达天维菌素A。

3.权利要求1或2所述的重组链霉菌用于生产天维菌素B的用途。

4.一种生产天维菌素B的方法，其包括培养权利要求1或2所述重组链霉菌，以及从培养物中回收天维菌素B。

5.一种构建权利要求1或2所述重组链霉菌的方法，所述方法包括：

(1) 提供待改造的除虫链霉菌MA220；

(2) 将所述待改造的除虫链霉菌MA220中的milA1基因AT0结构域编码序列置换成红色糖多孢菌 (Saccharopolyspora erythraea NRRL23338) eryA1基因AT0结构域编码序列；

其中所述milA1基因AT0结构域编码序列如SEQ ID NO: 1所示，所述eryA1基因AT0结构域编码序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求5的方法，其中所述置换是通过将DNA片段S导入到除虫链霉菌MA220中，使DNA片段S与出发菌MA220中的milA1基因发生同源重组而完成。

7.根据权利要求5或6的方法，其中所述eryA1基因AT0结构域编码片段包含eryA1中完整AT0结构域编码序列948bp核苷酸；编码序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述milA1基因AT0结构域编码序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

8.根据权利要求7的方法，所述DNA片段S，自5’端到3’端分别为同源臂T1、eryA1基因AT0结构域编码片段和同源臂T2；所述同源臂T1和同源臂T2能与milA1基因的相应位置发生同源重组。

9.根据权利要求8的方法，所述同源臂T1与milA1基因AT0结构域的上游序列同源重组；所述同源臂 T2与milA1基因AT0结构域的下游序列同源重组。

10.根据权利要求9的方法，其中所述同源臂T1包括milA1基因编码序列5’端306bp核苷酸。

11.根据权利要求9的方法，其中所述同源臂T2包括milA1基因编码序列中端1360bp核苷酸。

12.根据权利要求8或9的方法，所述片段S的序列如SEQ ID NO:5所示。