[go: up one dir, main page]

CN110540944B - 一种天维菌素产生菌及其应用 - Google Patents

一种天维菌素产生菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110540944B
CN110540944B CN201810526194.7A CN201810526194A CN110540944B CN 110540944 B CN110540944 B CN 110540944B CN 201810526194 A CN201810526194 A CN 201810526194A CN 110540944 B CN110540944 B CN 110540944B
Authority
CN
China
Prior art keywords
streptomyces avermitilis
fermentation
powder
strain
ivermectin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810526194.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110540944A (zh
Inventor
林甲壇
常宗明
黄隽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Tianwei Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Tianwei Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Tianwei Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Shenzhen Tianwei Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN201810526194.7A priority Critical patent/CN110540944B/zh
Publication of CN110540944A publication Critical patent/CN110540944A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110540944B publication Critical patent/CN110540944B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一株产天维菌素的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，其产天维菌素B的质量占天维菌素A+B总质量的86％～92％。本发明的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)B107‑169‑21于2018年03月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”，其保藏编号为CGMCC No.15433。本发明的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)B107‑169‑21是以天维菌素产生菌MA220为出发菌株，通过NTG诱变结合ARTP诱变筛选得到的，其产天维菌素(包括天维菌素A和天维菌素B)的摇瓶效价可达7000mg/L，5T罐的效价达6000mg/L。

Description

一种天维菌素产生菌及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种天维菌素高产的除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)及利用该菌株生产天维菌素的方法。
背景技术
阿维菌素是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有 杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌 Streptomycesavermitilis发酵产生。1981年阿维菌素作为兽药投入市场，1985年阿维 菌素作为农药投入市场，随后伊维菌素、多拉菌素相继被开发出来并投入市场。直 至目前，在国内，阿维菌素和伊维菌素仍是占据最大市场份额的农用及兽用杀虫抗 生素。
阿维菌素属于高毒杀虫抗生素，随着阿维菌素应用的不断普及，害虫对阿维菌 素产品抗药性增加，其用药量在加大，对环境的危害也在不断加深。
目前全球的政策法规正引领农药向高效、低毒、低残留、环境污染小的方向发 展。因此，开发新的高效、低毒、低残留的农药新品种，已成为当务之急。
WO2015135242A1和WO2015135467A1公布了基因工程菌MA220的构建过程。CN201610211064.5和WO2017173957公开了天维菌素对农林作物中的有害昆虫，例 如烟粉虱、西花蓟马、灰飞虱、褐飞虱、白背飞虱、稻纵卷叶螟、水稻二化螟、水 稻三化螟和台湾乳白蚁，以及对水生生物中的寄生虫，例如孢子虫、绦虫、线虫、 艾美虫、肺吸虫、血吸虫、指环虫或锚头鲺具有显著的灭杀效果。CN201610213645.2 和WO2017173956公开了天维菌素对常见动物寄生虫病害如鞭虫、蛔虫、螨虫等具 有极强的杀灭作用。因此，天维菌素的开发应用，对提高我国农产品的质量和品质， 提升粮食安全，具有十分重要的意义。
但是，现有的天维菌素发酵工艺存在效价较低的突出问题，WO2015135242A1 和WO2015135467A1公布的基因工程菌MA220，其产天维菌素的效价为1500mg/L， 达不到产业化生产的要求，因此，提高天维菌素的效价是急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够产生天维菌素的高产菌株除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)B107-169-21，以解决上述问题。
本发明的一个方面在于提供一种天维菌素高产微生物菌株。该菌株为除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)B107-169-21，于2018年03月09日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中 国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC NO.15433，分类命名为除虫链霉 菌Streptomycesavermitilis，并登记入册，证明存活。本发明的除虫链霉菌B107-169-21 的发酵产物天维菌素中，天维菌素B的质量占天维菌素A+B总质量的86％～92％， 优选天维菌素B质量占天维菌素A+B总质量的88％～92％。
本发明的另一方面是提供除虫链霉菌B107-169-21在生产天维菌素或含有天维菌素的药物组合物中的应用。
本发明的另一方面是提供一种利用除虫链霉菌B107-169-21生产天维菌素的方法，该方法包括将除虫链霉菌B107-169-21在含有可同化的碳源和/或氮源的培养基 里进行发酵。
优选地，上述可同化的碳源为玉米淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、淀粉酶、甘油、果糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘氨酸、鼠李糖、水杨苷、 肌醇、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、木聚糖、菊粉中的一种或几种。
优选地，上述可同化的氮源为黄豆饼粉、酵母粉、尿素、酵母抽提物、棉籽饼 粉、花生饼粉、玉米浆干粉、铵盐、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、麸皮、酵母浸膏、 牛肉浸膏、硝酸盐中的一种或几种。
优选地，所述培养基还包括无机盐，所述无机盐为FeCl3，FeSO4，ZnSO4，MnSO4，CoCl2，Na2MoO4，MgSO4，MgCl2，CaCO3，(NH4)2SO4，CuSO4，NiSO4，KNO3， K2HPO4，KH2PO4，NaCl，KCl中的一种或几种。
优选地，所述培养基含有玉米淀粉120～160g/L，淀粉酶0.02～0.2g/L，黄豆饼 粉10～40g/L，花生饼粉0～10g/L，酵母粉5～20g/L，(NH4)2SO4 0～4g/L，MnSO4 0～0.024g/L，Na2MoO4 0～0.024g/L，CoCl2 0.01～0.04g/L，CaCO3 3～7g/L。
优选地，所述培养基含有玉米淀粉140g/L，淀粉酶0.2g/L，黄豆饼粉20g/L， 花生饼粉5g/L，酵母粉10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，MnSO4 0.024g/L，Na2MoO4 0.024 g/L，CoCl20.02g/L，CaCO3 7g/L。
优选地，所述发酵的温度为20℃-40℃，更优选为25℃-30℃，最优选为28℃；pH为6.0-8.0，更优选为6.5-7.5，最优选为7.0-7.2；发酵时间为288-312小时；通气 量为0.6-1.1vvm。
在本发明中，“通气量”表示每分钟内通过单位体积培养液的经过滤除菌的无菌空气的量。
在本发明中，所述天维菌素为CN201410208660.9公开的如下式(I)的化合物：
Figure BDA0001674989430000031
其中R为CH3或C2H5，当R为CH3时为天维菌素A，当R为C2H5时为天维菌 素B。
本发明中，天维菌素通过以下HPLC方法进行检测：
色谱柱为C18柱，5μm，4.6×250mm；
流动相为甲醇：乙腈：水＝81:7:12(体积比)；
流速：1ml/min；
检测波长：240nm；
进样量：10μl。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明筛选得到的除虫链霉菌B107-169-21的发酵产物天维菌素中，天维菌 素B的质量占天维菌素A+B总质量的86％～92％，避免了高纯度天维菌素B的制备 过程，使生产成本大幅降低。
2、WO2015135242A1公布的基因工程菌MA220，其产天维菌素的效价为1500 mg/L，杂质伊维菌素B1b的效价为200mg/L。而本发明筛选得到的除虫链霉菌 B107-169-21在摇瓶中产天维菌素的效价可达7000mg/L，在5T发酵罐中效价可达 6000mg/L；且本发明除虫链霉菌B107-169-21发酵液中伊维菌素B1b的效价为100 mg/L，杂质少。除虫链霉菌B107-169-21产天维菌素的效价高且杂质少，使得天维 菌素的提纯工艺更为简单。
附图说明：
图1：除虫链霉菌B107-169-21和出发菌株MA220发酵产物对比图，上图为出 发菌株MA220在实施例1中产生的发酵液HPLC图谱，下图为除虫链霉菌 B107-169-21在实施例1中产生的发酵液HPLC图谱。其中A为天维菌素A，B为 天维菌素B，C为伊维菌素B1b。
图2：实施例1中本发明除虫链霉菌B107-169-21的选育系谱图。
具体实施方式
以下各实施例中，如无特殊说明，所使用的试剂、仪器都是本领域常用试剂、 仪器，可以从化学或生物制品/制剂公司购买；以下实施例中使用的方法都是本领域 常规方法，本领域技术人员根据现有技术或生产商提供的操作手册可以毫无疑义地 知道这些实验的操作过程并获得相应结果。
实施例1除虫链霉菌B107-169-21的筛选
以天维菌素产生菌MA220(其制备方法参见WO2015135242A1和 WO2015135467A1)为出发菌株。取存有天维菌素产生菌MA220孢子的甘油管，吸 取适量孢子，接种到YMS斜面上，28℃培养7d。用pH6.0的磷酸盐缓冲液将MA220 的新鲜斜面制成孢子悬液。采用下述亚硝基胍(NTG)诱变和常压室温等离子体 (ARTP)诱变两种诱变方法，按如图2所示的选育系谱图，进行多轮诱变，并按下 述发酵验证方法，累计筛选诱变菌20000株，最终获得一株高产菌株，其发酵产物 中，天维菌素B的质量占天维菌素A+B总质量的86％～92％，该高产菌株命名为除 虫链霉菌B107-169-21。
亚硝基胍(NTG)诱变：
取1.8ml孢子悬浮液，加入0.2ml 10mg/ml的NTG溶液置于34℃、250rpm 下震荡1h；各加8ml生理盐水，于4000rpm下离心10min，去上清；再各加10ml 生理盐水洗涤孢子，4000rpm下离心10min，去上清；收集得到的孢子加入1.8ml 生理盐水，制成孢子悬浮液，经稀释后涂布于YMS(酵母抽提物4g/L，葡萄糖4g/L， 麦芽抽提物10g/L，微量元素溶液5ml/L，琼脂20g/L)固体培养基上，28℃培养 5d。挑取菌落直径较大，产孢丰富的灰色单菌落转接到YMS固体平板培养基上， 28℃培养6d。
常压室温等离子体(ARTP)诱变：
取存有待诱变菌孢子的甘油管，吸取适量孢子，接种到YMS斜面上，28℃培 养7d。刮取新鲜斜面孢子于生理盐水中，制成孢子悬浮液，取10ul孢子悬液滴加 在无菌的载片上，放于等离子体室照射。照射条件设定为：以氦气为发生气，流量 为12.5L/min，发射口与盛样品载片间距离2mm，照射功率100W，照射时间30s。 照射完毕后，用无菌镊子将样品载片取出，放置于装有1ml生理盐水的2ml无菌 EP管中，利用漩涡混合器剧烈震荡2min，将载片上的样品彻底洗下并悬浮于生理 盐水中。经梯度稀释后，涂布于YMS固体培养基平板，28℃培养5d。挑取菌落直 径较大，产孢丰富的灰色单菌落转接到YMS固体平板培养基上，28℃培养6d。
发酵验证方法如下：
(1)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉25，黄豆饼粉8，花生饼粉10，酵母粉9.5， CoCl20.03，消前pH7.2，经121℃灭菌20分钟。将培养好的孢子用接种铲刮取约1 cm2的菌苔转接种子培养基中，在28℃、250rpm下振荡培养40小时。此时培养液 pH6.66，菌丝浓度为45％(体积百分比)。
(2)发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉120，淀粉酶0.2，黄豆饼粉25，酵母粉5， MnSO40.024，Na2MoO4 0.024，CoCl2 0.01，CaCO3 3，消前pH7.2，经121℃灭菌 20分钟。种子按6.7％移种量(体积百分比)移种到发酵摇瓶中。置28℃、250rpm 下振荡培养12天。此时发酵液pH6.80，菌丝浓度为42％(体积百分比)。
(3)高液相色谱方法(HPLC)测定发酵液的效价
发酵液浸泡：取发酵液0.5ml，加入4.5ml无水乙醇浸泡，超声1h后，4000rpm 离心10min。上清直接用于HPLC分析。HPLC分析条件为：色谱柱：C18 Hypersil ODS2 4.6×250×5(大连依利特)，流动相：甲醇：乙腈：水＝81:7:12(体积比)，流 速：1ml/min，吸收波长：240nm。
出发菌株MA220和除虫链霉菌B107-169-21用上述的发酵验证方法进行发酵， 出发菌株MA220生产天维菌素的效价为1500mg/L，其中天维菌素A的效价为1125 mg/L，天维菌素B的效价为375mg/L，天维菌素B的质量占天维菌素A+B总质量 的25％，出发菌株MA220的发酵产物中杂质较多，杂质伊维菌素B1b的效价为200 mg/L；除虫链霉菌B107-169-21生产天维菌素的效价为7000mg/L，其中天维菌素B 的效价为6300mg/L，天维菌素A的效价为700mg/L，天维菌素B的质量占天维菌 素A+B总质量的90％，除虫链霉菌B107-169-21的发酵产物中杂质较少，杂质伊维 菌素B1b的效价为100mg/L。结果如图1所示，其中上图是出发菌株MA220的发 酵液HPLC图谱，下图是除虫链霉菌B107-169-21的发酵液HPLC图谱。
实施例2除虫链霉菌B107-169-21的形态学和培养学特征
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》 等书中的有关内容进行实验。菌株的形态学和培养学特征实验采用ISP1、ISP2、ISP3、 ISP4、ISP5、ISP7、高氏一号、苹果酸钙和营养琼脂共9种培养基，28℃培养5～7 天后，观察菌丝体的颜色及色素情况。结果见表1。
表1菌株B107-169-21在9种不同培养基上的培养特征
培养基 生长情况 基质菌丝 气生菌丝 可溶性色素
ISP1 3 淡黄色 米灰色 褐色，孢子少
ISP2 4 米褐色 亮象牙色 无色素，无孢子
ISP3 4 米绿色 米灰色 无色素，孢子丰盛
ISP4 3 近于白色的浅灰 近于白色的浅灰 无色素，无孢子
ISP5 3 象牙色 象牙色 无色素，无孢子
ISP7 3 近于白色的浅灰 近于白色的浅灰 无色素，无孢子
高氏一号 3 近于白色的浅灰 近于白色的浅灰 无色素，无孢子
苹果酸钙 2 卵石灰 卵石灰 无色素，无孢子
营养琼脂 3 暗灰 暗灰 黑色素，无孢子
实施例3除虫链霉菌B107-169-21的生理生化特征
(1)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％(质量百分浓度)。其结果见表2。
(2)氮源的利用：采用配方为KH2PO4 1.36g/L，Na2HPO4 2.13g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCl2 0.005g/L，葡萄糖10g/L，FeSO4 0.0005g/L的培养基作为基础培养基，硝酸 钾和硫酸铵的浓度均为0.1％(质量百分浓度)。其结果见表2。
表2菌株B107-169-21的碳源和氮源的利用情况
Figure BDA0001674989430000061
Figure BDA0001674989430000071
(3)降解试验和NaCl耐受试验采用基础培养基为GYEA(pH 6.8)，表3所示：NaCl 耐受试验结果为：NaCl耐受性一般，4％的NaCl存在仍能生长；各种降解试验结果 见表4。
表3菌株对NaCl的耐受性
NaCl浓度 1％ 4％ 7％ 10％
菌株生长情况 2 2 0 0
表4菌株B107-169-21的降解试验结果
降解物 降解物浓度 结果 降解物 降解物浓度 结果
腺嘌呤 0.5％ 4，+ ISP7 1.0％ 3，+
鸟嘌呤 0.5％ 4，- Tween-40 1.0％ 2，-
次黄嘌呤 0.4％ 4，+ Tween-60 1.0％ 2，-
黄嘌呤 0.4％ 4，+ Tween-80 1.0％ 2，-
(4)生理生化试验、pH试验和温度试验：生理生化试验结果见表5。pH试验和温 度试验均采用高氏一号培养基，菌株生长pH实验结果见表6，菌株生长的温度实验 结果见表7。
表5菌株B107-169-21主要的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 - 牛奶胨化 - 纤维素利用 -
淀粉水解 - 硝酸盐还原 - 过氧化氢酶 +
牛奶凝固 + 硫化氢产生 + 氧化酶 -
V.P实验 - M.R实验 -
表6菌株B107-169-21生长的pH实验
pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
生长情况 0 0 0 0 4 4 4 4 4 4
表7菌株B107-169-21生长的温度实验
温度(℃) 7 14 28 37 45
生长情况 0 1 4 3 0
注：表1-7中的数字和符号分别代表：0：无生长；1：生长很弱；2：能生长； 3：生长良好；4：生长最好；+：阳性；-：阴性。
实施例4 16S rDNA序列分析以及菌种鉴定
收集待测菌株B107-169-21的新鲜菌体，采用溶菌酶法改进的Pitcher法(Lettersin Applied Microbiology,1989,8:151-156)提取总DNA模板，采用通用引物(27F和1495R)进行16S rDNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，直接进行序列测定， 测序由南京金斯瑞生物技术有限公司进行。所测的16S rDNA序列经校对后与 GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的 分类地位。
菌株B107-169-21(CGMCC NO.15433)16S rDNA序列(见序列表)与GenBank 中相关序列进行BLAST比较，结果见表8(表中只列出同源性较高的菌株)。
表8菌株B107-169-21和相关菌株的同源性
Figure BDA0001674989430000081
菌株B107-169-21(CGMCC NO.15433)通过16S rDNA区域测序发现其和除虫 链霉菌(Streptomyces avermitilis)有99％的同源性，同时对菌株B107-169-21(CGMCCNO.15433)进行表观特征试验，发现该菌株和除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis) 分类相关参数非常接近，故将菌株B107-169-21(CGMCC NO.15433)鉴定为除虫 链霉菌(Streptomyces avermitilis)。
实施例5天维菌素50L罐发酵
(1)斜面菌体的制备与培养
斜面采用YMS培养基(g/L)：酵母抽提物4，葡萄糖4，麦芽抽提物10，微量 元素溶液5ml/L，琼脂20，蒸馏水1000ml，消前pH 7.2，经121℃灭菌20分钟，冷 却到50-60℃摆斜面，接入菌株B107-169-21，28℃培养6d，共1根斜面。
(2)摇瓶种子液的制备与培养
摇瓶种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉20，花生饼粉10，酵母 粉9.5，CoCl2 0.03，消前pH7.2，经121℃灭菌20分钟。每瓶100ml，共1瓶。将 培养好的孢子用接种铲刮整根斜面的菌苔转接种子培养基中，置度28℃、250rpm下 振荡培养30小时。此时培养液pH6.66，菌丝浓度为45％(体积百分比)。
(3)种子罐种子液的制备
罐种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉20，花生饼粉10，酵母粉 9.5，CaCO3 1，CoCl2 0.03。
在15L种子罐中投入10L的罐种子培养基，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下 消1h，接入100ml摇瓶种子液，培养温度为28±1℃，搅拌转速100～250rpm，通气 量1.0vvm，培养24h，此时培养液pH 6.90，菌丝浓度22％(体积百分比)。
(4)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉140，淀粉酶0.2，黄豆饼粉20，花生饼粉5， 酵母粉10，(NH4)2SO4 2，MnSO4 0.024，Na2MoO4 0.024，CoCl2 0.02，CaCO3 7，发 酵罐体积50L，投料体积为30L，pH7.2，于121℃条件下蒸汽灭菌60min，冷却后， 接入约10L种子罐的种子液，发酵温度28±1℃，搅拌转速101-308rpm，通气量 0.6-1.1vvm，发酵培养12d，放罐，测得天维菌素效价为6600mg/L，其中天维菌素B 的效价为5676mg/L，天维菌素A的效价为924mg/L，伊维菌素B1b的效价为80mg/L， 发酵产物中，天维菌素B质量占天维菌素A+B质量的86％。
实施例6天维菌素5T罐发酵
(1)斜面菌体的制备与培养
斜面采用YMS培养基(g/L)：酵母抽提物4，葡萄糖4，麦芽抽提物10，微量 元素溶液5ml/L，琼脂20，蒸馏水1000ml，消前pH 7.2，经121℃灭菌20分钟， 冷却到50-60℃摆斜面，接入菌株B107-169-21，28℃培养6d，共3根斜面。
(2)种子液的制备与培养
摇瓶种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉20，花生饼粉10，酵母 粉9.5，CoCl2 0.03，消前pH7.2，经121℃灭菌20分钟。每瓶100ml，共3瓶。将 培养好的孢子用接种铲刮整根斜面的菌苔转接种子培养基中，置度28℃、250rpm 下振荡培养30小时。此时培养液pH6.66，菌丝浓度为45％(体积百分比)。
二级种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉20，花生饼粉10，酵母 粉9.5，CoCl2 0.03，消前pH7.2，经121℃灭菌20分钟。将培养好的孢子用接种铲 刮整根斜面的菌苔转接种子培养基中，置度28℃、250rpm下振荡培养30小时。此 时培养液pH6.66，菌丝浓度为45％(体积百分比)。
(3)种子罐种子液的制备
罐一级种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉20，花生饼粉10，酵 母粉9.5，CaCO3 1，CoCl2 0.03。
在50L种子罐中投入30L的罐一级种子培养基，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条 件下消1h，接入300ml摇瓶种子液，培养温度为28±1℃，搅拌转速100～250rpm， 通气量1.0vvm，培养24h，此时培养液pH 6.90，菌丝浓度22％(体积百分比)。
罐二级种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉20，花生饼粉10，酵 母粉9.5，CaCO3 1，CoCl2 0.03。
在500L种子罐中投入300L的罐二级种子培养基，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃ 条件下消1h，接入300ml摇瓶种子液，培养温度为28±1℃，搅拌转速100～250rpm， 通气量1.0vvm，培养24h，此时培养液pH 6.80，菌丝浓度25％(体积百分比)。
(4)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉140，淀粉酶0.2，黄豆饼粉20，花生饼粉5， 酵母粉10，(NH4)2SO4 2，MnSO4 0.024，Na2MoO4 0.024，CoCl2 0.02，CaCO3 7，发 酵罐体积5000L，投料体积为3000L，pH7.2，于121℃条件下蒸汽灭菌60min，冷 却后，接入约300L二级种子罐的种子液，发酵温度28±1℃，搅拌转速101-308rpm， 通气量0.6-1.1vvm，发酵培养12d，放罐，测得天维菌素效价为6000mg/L，其中天 维菌素B的效价为5520mg/L，天维菌素A的效价为480mg/L，伊维菌素B1b的效 价为90mg/L，发酵产物中，天维菌素B的质量占天维菌素A+B总质量的92％。
综上所述，本发明除虫链霉菌B107-169-21为天维菌素的高产菌株，其摇瓶效 价达到7000mg/L，5T罐的效价达到6000mg/L，发酵产物中，天维菌素B占天维 菌素A+B总质量的86％～92％，优选天维菌素B占天维菌素A+B总质量的88％～92％。
序列表
<110> 台州市劢康生物科技有限公司； 浙江海正药业股份有限公司
<120> 一种天维菌素产生菌及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1391
<212> DNA
<213> Streptomyces avermitilis
<400> 1
tgcaagtcga acgatgaagc ccttcggggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt 60
gggcaatctg ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggataata 120
ctctcgcagg catctgtaag ggttaaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta 180
tcagcttgtt ggtgaggtag tggctcacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg 240
cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg 360
ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta 480
ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt cacgtcgggt gtgaaagccc ggggcttaac 540
cccgggtctg cattcgatac gggctagcta gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg 600
tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg 660
ccattactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 720
tccacgccgt aaacggtggg aactaggtgt tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag 780
ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt 840
gacgggggcc cgcacaagca gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct 900
taccaaggct tgacatacac cggaaagcat tagagatagt gccccccttg tggtcggtgt 960
acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1020
gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga 1080
gaccgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg 1140
tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg atacaatgag ctgcgatacc gcaaggtgga 1200
gcgaatctca aaaagtcggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt 1260
tggagttgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320
cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caaccccttg 1380
tgggagggag c 1391

Claims (11)

1.一种除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）B107-169-21，其保藏编号为CGMCCNO.15433。
2.根据权利要求1所述的除虫链霉菌B107-169-21在生产天维菌素或含有天维菌素的药物组合物中的应用。
3.一种生产天维菌素的方法，该方法利用权利要求1所述的除虫链霉菌B107-169-21，在含有可同化的碳源和/或氮源的培养基里进行发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述可同化的碳源为玉米淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉酶、甘油、果糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘氨酸、鼠李糖、水杨苷、肌醇、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、木聚糖、菊粉中的一种或几种。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述可同化的氮源为黄豆饼粉、酵母粉、尿素、酵母抽提物、棉籽饼粉、花生饼粉、玉米浆干粉、铵盐、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、麸皮、酵母浸膏、牛肉浸膏、硝酸盐中的一种或几种。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述培养基还包括无机盐，所述无机盐为FeCl3，FeSO4，ZnSO4，MnSO4，CoCl2，Na2MoO4，MgSO4，MgCl2，CaCO3，(NH4)2SO4，CuSO4，NiSO4，KNO3，K2HPO4，KH2PO4，NaCl，KCl中的一种或几种。
7.根据权利要求3或4任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基含有玉米淀粉120~160 g/L，淀粉酶0.02~0.2 g/L，黄豆饼粉10~40 g/L，花生饼粉0~10 g/L，酵母粉5~20 g/L，(NH4)2SO4 0~4 g/L，MnSO4 0~0.024 g/L，Na2MoO4 0~0.024 g/L，CoCl2 0.01~0.04 g/L，CaCO3 3~7 g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基含有玉米淀粉140 g/L，淀粉酶0.2 g/L，黄豆饼粉20 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉10 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，MnSO4 0.024g/L，Na2MoO4 0.024 g/L，CoCl2 0.02 g/L，CaCO3 7 g/L。
9.根据权利要求3或4任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为20℃- 40℃；pH为6.0-8.0；发酵时间为288-312小时；通气量为0.6-1.1 vvm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25℃-30℃；pH为6.5-7.5。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28℃，pH为7.0-7.2。
CN201810526194.7A 2018-05-28 2018-05-28 一种天维菌素产生菌及其应用 Active CN110540944B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810526194.7A CN110540944B (zh) 2018-05-28 2018-05-28 一种天维菌素产生菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810526194.7A CN110540944B (zh) 2018-05-28 2018-05-28 一种天维菌素产生菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110540944A CN110540944A (zh) 2019-12-06
CN110540944B true CN110540944B (zh) 2022-08-02

Family

ID=68701012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810526194.7A Active CN110540944B (zh) 2018-05-28 2018-05-28 一种天维菌素产生菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110540944B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114437974B (zh) * 2022-01-27 2023-06-20 有研资源环境技术研究院(北京)有限公司 芬氏纤维微菌属菌株及其在治理铬污染废水和土壤的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2940016A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant microorganism expressing avermectin analogue and use thereof
CN107260751A (zh) * 2016-04-07 2017-10-20 浙江海正药业股份有限公司 天维菌素用于控制人或动物寄生虫的用途
CN107258798A (zh) * 2016-04-07 2017-10-20 浙江海正药业股份有限公司 天维菌素用于控制农林作物中有害昆虫的用途
CN107513088A (zh) * 2016-06-17 2017-12-26 浙江海正药业股份有限公司 天维菌素衍生物及其抗寄生虫的用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2940016A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant microorganism expressing avermectin analogue and use thereof
CN106459885A (zh) * 2014-03-10 2017-02-22 浙江海正药业股份有限公司 表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途
CN107260751A (zh) * 2016-04-07 2017-10-20 浙江海正药业股份有限公司 天维菌素用于控制人或动物寄生虫的用途
CN107258798A (zh) * 2016-04-07 2017-10-20 浙江海正药业股份有限公司 天维菌素用于控制农林作物中有害昆虫的用途
CN107513088A (zh) * 2016-06-17 2017-12-26 浙江海正药业股份有限公司 天维菌素衍生物及其抗寄生虫的用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
大环内酯类新化合物天维菌素杀螨活性及田间防治效果;张绍勇等;《植物保护学报》;20170415(第02期);118-124 *
天维菌素酰化衍生物的合成及杀虫杀螨活性;陈浩等;《农药学学报》;20191108(第01期);35-47 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110540944A (zh) 2019-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108676757B (zh) 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用
FI57781C (fi) Foerfarande foer framstaellning av c-076-foereningar med antihelmintisk verkan
CN107099467B (zh) 一株铜绿假单胞菌xcs007及其在防治烟草黑胫病中的应用
US10526668B2 (en) Streptomyces and method for producing milbemycin A4 using same
US10287545B2 (en) Streptomyces and method for producing milbemycin A3 using same
CN101407775B (zh) 一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株
CN113564081A (zh) 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用
Nanjwade et al. Production of antibiotics from soil-isolated actinomycetes and evaluation of their antimicrobial activities
US9982314B2 (en) Bacterial strain of Actinoplanes sp. and application thereof
CN110832066B (zh) 一种伊维菌素B1b产生菌及其应用
CN112746036A (zh) 一种链霉菌及其发酵产假尿苷的方法
CN110540944B (zh) 一种天维菌素产生菌及其应用
CN109136097A (zh) 降解异丙甲草胺的草酸青霉及其应用
CN113930355A (zh) 一株白蚁来源的生防链霉菌w7及其应用
CN109182216B (zh) 一株对多肉植物茎腐病具有抑制作用的海洋链霉菌scfj-05
CN109880746B (zh) 一种座坚壳属真菌菌株及其应用
Allam et al. Biological activity of Streptomyces noursei against ochratoxin A producing Aspergillus niger
KR101100716B1 (ko) 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물
TALUKDAR et al. Antifungal Activity of Pyocyanin like Compound of Pseudomonas aeruginosa JT25 Isolated from Gloriosa superba L.
CN106190916A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌jnc2及其菌剂的制备方法和应用
CN114058557B (zh) 一株巨大芽孢杆菌多功能生防降解菌株及其应用
CN118546816B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN118995467A (zh) 一种5-酮基米尔贝霉素的产生菌及其应用
WO2006011156A1 (en) Process for producing tacrolimus (fk - 506) using vegetable oil as sole source of carbon
CN106282042B (zh) 一种波赛链霉菌及其生产表柔红霉素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210713

Address after: 518000 805, Changsheng building, 4014 Huaqiang North Road, Changcheng community, Yuanling street, Futian District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant after: Shenzhen Tianwei biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: Jiaojiang District of Taizhou City, Zhejiang province 318000 road outside No. 46

Applicant before: ZHEJIANG HISUN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant