CN105925642B - 用微生物发酵法工业化生产海藻糖的方法 - Google Patents
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Abstract
用微生物发酵法工业化生产海藻糖的方法，包括如下步骤：海藻糖水解酶和海藻糖生成酶（X/Y）的发酵、淀粉液化、催化反应、糖化反应、脱色过滤、离子交换、浓缩、结晶、离心、干燥、膜分离。本发明的有益效果：1、本发明以淀粉为原料，酶法催化生产海藻糖，使海藻糖能够大量的、廉价地进行工业法生产。2、酶活力高，用量少，降低了生产成本。3、离心的海藻糖母液通过膜分离，海藻糖含量提高，可以回配结晶，进一步提高海藻糖收率。4、创新的海藻糖结晶工艺，海藻糖含量在50%以上，葡萄糖含量在20%以下，一次结晶海藻糖成品含量可达98.5%以上。5、与用麦芽糖转化海藻糖工艺相比较有很大优势，收率高，生产成本低。
Description
技术领域
本发明属于淀粉糖生产技术领域，具体涉及一种用微生物发酵法工业化生产海藻糖的方法。
背景技术
2000年11月联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）食品添加剂联合专家委员会（JECFA）确认海藻糖作为组织形成剂、稳定剂、保湿剂、甜味剂的功能，对海藻糖的每日允许摄入量不作限制；2005年3月，我国卫生部批准海藻糖为新能源食品。海藻糖生产成为热门的开发项目，其生产方法引起国内外淀粉糖生产企业的广泛关注。报道有多种生产方法，能够工业化生产，低成本生产的方法还很少。
海藻糖在冻结，干燥、高渗透压等严酷的环境下对生物体膜、膜蛋白、DNA等发挥着保护功效，与生命的保存和再生有着很深的关系，是极受注目的天然物质，现在已广泛应用于食品、医药、化妆品领域，以后随着人们对海藻糖独有功能与特性的应用研究，其用途开发将向更加深广发展，应用领域将更为扩展，将是淀粉糖类中用量更大，应用前景更为广阔的新一代糖品。
目前有报道的海藻糖的一般制法（微生物抽提法、微生物发酵法、酶法制造、基因重组法）都只是小型实验或理论，不能够进行工业化生产，而且成本非常高。还有一种用麦芽糖转化的工业化生产方法，但是收率低，生产成本高。
发明内容
本发明目的在于提供一种用微生物发酵法工业化生产海藻糖的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
用微生物发酵法工业化生产海藻糖的方法，包括如下步骤：
（1）海藻糖水解酶和海藻糖生成酶（X/Y）的发酵：通过基因构建得到的重组大肠杆菌菌种，采用LB培养基对宿主菌进行培养，包括两个步骤：
①种子的活化与制备：将上述重组大肠杆菌菌种接至LB培养基中，37℃培养12h,获得摇瓶种子液；所述LB培养基包括:细菌学蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、Nacl10g/L；调节PH值到7.4，121℃灭菌20min；
②上罐发酵：将摇瓶种子液接种至装有TB培养基的发酵罐中，37℃培养至OD（细菌的生长情况）长到0.6，加入诱导剂乳糖，使乳糖浓度达到4mg/ml，然后在32℃诱导培养24—36h，获得含有X/Y酶的发酵液；发酵液经两次高压均质机打破细胞细胞壁，然后灌桶冷藏备用；所述TB培养基由蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4ml组成，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mol/L的磷酸二氢钾和0.72mol/L磷酸氢二钾的溶液；
（2）淀粉液化：配淀粉浆浓度14--15Be,PH值调到5.0—6.0，加耐高温淀粉酶400ml/吨淀粉；一次喷射温度105—108℃，保温20—40分钟，碘试反应合格后，再二次喷射灭酶温度130—135℃，生产成液化液；通过板式换热器降温到44—46℃，进糖化罐催化、糖化；
（3）催化反应:在糖化罐中调好液化液温度44—46℃，每立方液化液加普鲁兰酶200ml，海藻糖生成酶Y酶7000ml（酶发酵液），海藻糖水解酶2000ml(酶发酵液)；保温催化反应30--36小时，生成糖液；
（4）糖化反应：催化反应后的糖液升温到62℃，用盐酸调PH4.2—4.5.每立方糖液加复合糖化酶250ml.保温糖化24小时，检测糊精反应合格后，升温到80--85℃灭酶，生成糖化液；如果糊精反应不合格，补加糖化酶，延长糖化时间直到合格后灭酶；
（5）脱色过滤：灭酶后的糖化液送到脱色罐，按糖化液含固型物的3%加活性炭、2%加珍珠岩助滤剂，脱色搅拌30分钟，回流清澈、透明、无异物送到离子交换前贮罐；
（6）离子交换：过滤好的糖化液依次通过再生好的阳--阴--阳--阴离子交换柱，先打回流，控制好流量，电导率小于20us/cm，PH大于4.5，送到浓缩前罐；
（7）浓缩：离子交换好的糖化液用四效浓缩器浓缩到浓度72%—73%，送到结晶前调浓罐，生产成浓糖；
（8）结晶：浓糖通过板式换热降温进结晶机，温度控制46—50℃，按总重量的3%加干晶种，养晶4—8小时，降温曲线控制从46℃经60小时降到16℃，高温区46—30℃温度降慢，低温区30—16℃降快；
（9）离心：采用上悬式机械卸料自动离心机，结晶好的糖糕用转子泵送到离心机上分配槽，开启离心机离心，用温度低于20℃的蒸馏水按糖糕量的5%洗糖，检测海藻糖含量大于98.5%，若含量不够再用以上的办法洗糖一次，直到达到合格；
（10）干燥：用沸腾流化床干燥机或气流干燥机组干燥，一次热风温度控制到65—75℃，二次热风温度控制到75—85℃，冷风温度小于20℃，成品糖温度小于37℃包装；
（11）膜分离:离心后的母液含葡萄糖21%，含海藻糖20%，采用特定孔经的有机分子膜，将母液中的葡萄糖与海藻糖分离；海藻糖含量大于80%可回配到离子交换液中浓缩结晶，葡萄糖含量大于95%可用于生产果葡糖浆。
本发明的有益效果：1、本发明以淀粉为原料，酶法催化生产海藻糖，使海藻糖能够大量的、廉价地进行工业法生产，也是对淀粉工业很大的促进和发展。2、酶活力高，用量少，而且可以用发酵液直接用来催化生产，降低了生产成本。3、离心的海藻糖母液通过膜分离，海藻糖含量提高，可以回配结晶，进一步提高海藻糖收率。4、创新的海藻糖结晶工艺，通过催化反应后的糖化液，通过脱色、离子交换等精制工序，海藻糖含量在50%以上，葡萄糖含量在20%以下，通过设置合理的结晶控制指标，降温曲线、进糖饱和度、进糖温度等重要指标，一次结晶海藻糖成品含量可达98.5%以上。5、与用麦芽糖转化海藻糖工艺相比较有很大优势，收率高，生产成本低。
具体实施方式
下面的实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：
称取玉米淀粉1200kg，加水搅拌并调节PH值5.68，淀粉浆浓度14Be，一次喷射温度106℃，保温40分钟，检查碘色反应合格，二次喷射温度135℃；得到液化液4.06M³，浓度23.6Bx,液化DE值9.83%；降温到46℃，加普鲁兰酶800ml，加海藻糖生成酶Y酶28kg（酶发酵液），海藻糖水解酶Z酶8kg（酶发酵液），催化反应30h；升温到61℃，用盐酸调PH4.4，加糖化酶400ml，糖化反应24h，检查糊精反应合格；升温到85℃灭酶保温30分钟，加活性炭脱色过滤，得到浓度23.5%，电导率1365us/cm，体积3.97M³的脱色清液；通过阳阴离子交换，电导率降到21us/cm，PH5.8；浓缩到浓度72.2%，体积1.03M³，海藻糖含量71.22%，葡萄糖含量28.10%；在1.2M³结晶机内，加晶种3kg，温度从48℃降到16℃；离心得到潮糖480kg。用沸腾流化床干燥机或气流干燥机组干燥，一次热风温度控制到65—75℃，二次热风温度控制到75—85℃，冷风温度小于20℃，成品糖温度小于37℃包装；将离心出的海藻糖母液，用膜分离后，一种含葡萄糖95.5%，生产成果葡糖浆，另一种含海藻糖78.5%，与前工段离子交换来糖回配到浓缩再进行结晶，浓度72.5%，体积1.10M³，海藻糖含量75.12%，葡萄糖含量24.21%，在1.2M³结晶机内加晶种3kg，温度从48度降到16度，离心得到潮糖502kg。
按结晶海藻糖国标GB/T23529—2009检测结果如下表所示：
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.用微生物发酵法工业化生产海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）海藻糖水解酶和海藻糖生成酶的发酵：通过基因构建得到的重组大肠杆菌菌种，采用LB培养基对宿主菌进行培养，包括两个步骤：
①种子的活化与制备：将上述重组大肠杆菌菌种接至LB培养基中，37℃培养12h,获得摇瓶种子液；所述LB培养基包括:细菌学蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、Nacl10g/L；调节PH值到7.4，121℃灭菌20min；
②上罐发酵：将摇瓶种子液接种至装有TB培养基的发酵罐中，37℃培养至细菌OD到0.6，加入诱导剂乳糖，使乳糖浓度达到4mg/ml，然后在32℃诱导培养24—36h，获得含有海藻糖水解酶和海藻糖生成酶的发酵液；发酵液经两次高压均质机打破细菌细胞壁，然后灌桶冷藏备用；所述TB培养基由蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4ml组成，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mol/L的磷酸二氢钾和0.72mol/L磷酸氢二钾的溶液；
（2）淀粉液化：配淀粉浆浓度14--15Be,PH值调到5.0—6.0，加耐高温淀粉酶400ml/吨淀粉；一次喷射温度105—108℃，保温20—40分钟，碘试反应合格后，再二次喷射灭酶温度130—135℃，生产成液化液；通过板式换热器降温到44—46℃，进糖化罐催化、糖化；
（3）催化反应:在糖化罐中调好液化液温度44—46℃，每立方液化液加普鲁兰酶200ml，海藻糖生成酶7000ml，海藻糖水解酶2000ml；保温催化反应30--36小时，生成糖液；
（4）糖化反应：催化反应后的糖液升温到62℃，用盐酸调PH4.2—4.5，每立方糖液加复合糖化酶250ml，保温糖化24小时，检测糊精反应合格后，升温到80--85℃灭酶，生成糖化液；如果糊精反应不合格，补加糖化酶，延长糖化时间直到合格后灭酶；
（5）脱色过滤：灭酶后的糖化液送到脱色罐，按糖化液含固型物的3%加活性炭、2%加珍珠岩助滤剂，脱色搅拌30分钟，回流清澈、透明、无异物送到离子交换前贮罐；
（6）离子交换：过滤好的糖化液依次通过再生好的阳--阴--阳--阴离子交换柱，先打回流，控制好流量，电导率小于20us/cm，PH大于4.5，送到浓缩前罐；
（7）浓缩：离子交换好的糖化液用四效浓缩器浓缩到浓度72%—73%，送到结晶前调浓罐，生产成浓糖；
（8）结晶：浓糖通过板式换热降温进结晶机，温度控制46—50℃，按总重量的3%加干晶种，养晶4—8小时，降温曲线控制从46℃经60小时降到16℃，高温区46—30℃温度降慢，低温区30—16℃降快；
（9）离心：采用上悬式机械卸料自动离心机，结晶好的糖糕用转子泵送到离心机上分配槽，开启离心机离心，用温度低于20℃的蒸馏水按糖糕量的5%洗糖，检测海藻糖含量大于98.5%，若含量不够再用以上的办法洗糖一次，直到达到合格；
（10）干燥：用沸腾流化床干燥机或气流干燥机组干燥，一次热风温度控制到65—75℃，二次热风温度控制到75—85℃，冷风温度小于20℃，成品糖温度小于37℃包装；
（11）膜分离:离心后的母液含葡萄糖21%，含海藻糖20%，采用特定孔径的有机分子膜，将母液中的葡萄糖与海藻糖分离；海藻糖含量大于80%可回配到离子交换液中浓缩结晶，葡萄糖含量大于95%可用于生产果葡糖浆。
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